CN1938426B - 在酿酒酵母中生成重组基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生成和检测重组DNA序列的方法，以及用于实施本发明方法的质粒和酿酒酵母细胞。

Description

在酿酒酵母中生成重组基因

发明领域

本发明主要涉及用于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生成和检测重组DNA序列的方法，以及用于实施本发明的质粒和酿酒酵母细胞。

这些方法所涉及的DNA序列包括蛋白质编码序列和非编码序列；它们也可以由包含一种以上编码序列及介于其中的非编码序列的较长连续区段组成，诸如属于生物合成途径的区段。

发明背景

通过微生物和酶促反应生产物质，诸如酶和其它蛋白质，是重要的经济话题。酶是具有生物催化活性的蛋白质，不仅负责天然化合物和有机体的新陈代谢，还用于天然和非天然化合物的工业生产。酶或借助酶生产的这些化合物可用于生产药品、化妆品、食品等。然而，酶的靶特异性及其发挥功能时的特定条件大大阻碍了酶的工业应用。其它蛋白质在人和动物保健领域具有治疗用途。医学上重要的蛋白质的重要类别包括细胞因子和生长因子。

具有新的或改良的功能和特性的蛋白质、酶和途径可以通过两种方式获得：或是在大多未知的天然物种中寻找，或是改造目前已知的天然蛋白质或酶。后一种方式可能更加适合于产生不太可能选择天然进化过程的特性。

定向分子进化是一种有希望的策略，用于产生这些新的所需性质，以及重新设计酶、其它蛋白质、非编码序列或途径。传统上，DNA序列的定向进化已通过下述技术实现，诸如定点诱变、多点或盒式诱变、随机诱变、及易错PCR。最近，通过基因改组技术来优化和微调酶或蛋白质的特性受到了广泛关注。这些定向进化技术可产生这样的酶，即能够改善现有工艺、生产新产品、和扩展化学合成的能力。

存在许多不同的诱变方法，诸如随机诱变、定点诱变、寡核苷酸盒式诱变、或通过易错PCR进行的点诱变。例如，随机诱变是通过用诸如亚硝酸、肼等化学制品进行处理，在克隆的DNA片段中生成大量的随机分布的核苷酸替代突变。易错PCR已经用于在克隆基因中引入随机点突变。降低PCR反应保真度的修改包括提高MgCl₂浓度、添加MnCl₂、或改变四种dNTP的相对浓度。

这些传统诱变方法集中于对具有离散的和可选择的基因型的单个基因进行优化。总体策略是克隆一种基因，鉴定基因的离散功能，建立可对其进行监测的测定法，突变基因中的选定位点，并选择改善基因已知功能的基因突变体。然后可在所需细胞类型中表达具有改良功能的突变体。诱变方法可进行重复循环，以获得所需的酶特性。

这些传统方法都隐含序列搜索策略。上述序列搜索技术中所采用的策略有很大不同。在进行饱和定向突诱变时，包括在目的位点处安置每一种可能的排列的过程。对于蛋白质，这种程序由将目的位点处的氨基酸用所有19种其它氨基酸替代，并对由此得到的文库搜索改良的突变体组成。就序列空间而言，这意味着对一个很小的区域进行了非常彻底的搜索。比较而言，盒式诱变是将随机肽序列插入蛋白质的特定区域，即对较大的确定的序列空间区域进行较不彻底的采样。易错PCR涉及重复拷贝序列，并引入较低但显著数量的错误。在这种情况中，是对较不确定的序列空间区域进行稀疏的采样。在以上每种策略中，将每一轮选择得到的最佳突变体用于起动下一轮。

然而，通过传统诱变方法来发展酶的新特性存在许多限制。首先，它们只适用于已经克隆且功能已经鉴定的基因或序列。其次，这些方法通常只适用于具有离散功能的基因。因此，协同赋予单一表型的多基因通常不能用这种方法来优化。最后，这些方法即便对于单个基因，也仅能探索排列总数中非常有限的数目。由于这些限制，传统诱变方法不适于着眼多种有用属性来改进细胞基因组。例如，改进细胞表达蛋白的能力可能需要改变转录效率、翻译和翻译后修饰、基因产物的分泌或蛋白水解降解。因此可能需要对在一种或多种上述细胞机制中发挥作用的其它基因进行修饰，以便表达具有新特性的蛋白质。试图对具有这些功能的所有基因进行单独优化几乎是不可能的任务。

与传统诱变方法有关的多数问题可以通过基因改组方法来克服。基因改组能够随机重组功能基因的不同序列，使天然相似基因或随机突变基因的分子混合。DNA或基因改组或者这些技术的变体，已经用于改进酶的活性、稳定性、折叠、及底物识别特性。与传统诱变方法相比，通过基因改组获得具有改良表型的突变体的机率显著更高。基因改组与传统方法有根本的不同，即基因改组以组合方式重组有利突变。因此它能以更加稀疏的方式搜索更加广阔的序列空间区域，而且更倾向于生成功能序列。由于它容许序列信息来自一种以上的来源，因此它能够使更多的每轮选择得到的有益突变在下一轮中得到保留。尽管传统方法还容许固定负面突变，然而基因改组方法并非如此。因此，基因改组策略得到更加引人注目的结果也就不令人惊讶了。

DNA或基因改组方法是基于具有一定同源性的区域之间或具有同一性的区段之间的重组事件。芽殖酵母酿酒酵母是用于检验真核生物中的遗传重组的实验中所采用的重要生物。在简单的单细胞生物中研究这些过程有一个明显的优点，就是容易操作DNA序列，而且有可能研究在大比例的细胞中同步诱导的特定重组事件。此外，近几十年来，在这种生物的发酵技术和基础遗传学中已经积累了大量的专业知识，它是目前在分子水平研究得最透彻的真核生物。由于它没有致病性，擅长分泌，且具有糖基化潜力，所以酿酒酵母是基因克隆和基因表达的优选宿主生物体。因此，本发明的潜在技术问题就是提供用于在酿酒酵母中生成重组镶嵌基因的方法和手段。

发明描述

本发明解决了这一潜在技术问题，即提供了用于在酿酒酵母中生成和检测重组DNA序列的方法，包括以下步骤：

a)生成第一二倍体酿酒酵母细胞，其基因组在特定基因座中携带包含第一待重组DNA序列的第一重组盒，该序列侧翼为至少第一和第二标记序列，并且在等位基因处携带包含第二待重组DNA序列的第二重组盒，该序列侧翼为至少第三和第四标记序列，

b)诱导a)中得到的第一二倍体细胞生成孢子，并

c)分离含有其中第一重组DNA序列侧翼为至少第一和第四标记序列的重组盒的单倍体细胞，及含有其中第二重组DNA序列侧翼为至少第二和第三标记序列的重组盒的单倍体细胞。

本发明提供了基于酵母系统来选择至少两种不同DNA序列之间的重组事件。该系统是基于酿酒酵母在单倍体期与双倍体期之间交替的有性生殖周期。在本发明方法的第一个步骤中，生成这些重组底物杂合子的二倍体酿酒酵母细胞。将待重组DNA序列整合到二倍体酵母细胞基因组的等位基因处。每种待重组DNA序列以重组盒的形式进行整合，重组盒中除了该DNA序列还包含至少两种位于DNA序列侧翼的标记序列，由此两种重组盒包含至少四种不同的标记序列。

然后使如此得到的杂合子二倍体细胞在诱导减数分裂和孢子形成的条件下生长。减数分裂的一般特点是遗传重组的频率升高，这是由早在减数分裂I前期诱导的双链断裂(DSB)的形成和后续修复起动的。因此酵母减数分裂细胞受到特别的关注，因为它们由于基因组范围的DSB诱导进行高水平的重组。由此，第一轮减数分裂的产物，作为亲本二倍体细胞每次减数分裂产生的四个单倍体细胞或孢子，可含有两种不同DNA序列之间重组产生的重组DNA序列。

减数分裂过程中两个不同DNA序列之间的重组还能导致侧翼标记序列的交换。因此，通过选择重组底物侧翼的标记序列发生了交换的个别细胞或分子，本方法能够快速且简单的鉴定重组DNA序列。因此，第一轮减数分裂后得到的重组体的特征是：它们含有和/或表达第一重组盒的至少一种标记序列和第二重组盒的至少一种标记序列。具体而言，重组孢子可以含有第一重组盒的第一标记序列和第二重组盒的第四标记序列，或者含有第一重组盒的第二标记序列和第二重组盒的第三标记序列，由此这两种类型的重组孢子不仅含有不同的标记组合，还含有不同的重组DNA序列。在容许选择通过减数分裂过程中的重组而产生的新重组标记配置的条件下，可容易的选择和辨别含有重组序列的这两类重组孢子。

本发明的方法可用于野生型或错配修复缺陷型酿酒酵母细胞。修复受损DNA的过程与遗传重组的机制是密切相关的，并且知道错配修复机制对不同序列之间(即部分同源重组)的重组频率具有抑制作用。因此错配修复系统的突变大大提高酵母中的总体重组频率。另一方面，已知野生型酿酒酵母细胞具有错配修复依赖性重组机制，它是基于两个重组底物中相隔较远的错配。根据将要重组的DNA序列，可使用野生型或错配修复缺陷型酿酒酵母细胞来获得重组序列。

本发明方法的优点是可以反复进行，即它允许进行多轮重组。第一轮减数分裂的产物，即包含不同重组DNA序列的相反交配型的单倍体细胞，可再次交配以获得重组DNA序列杂合的二倍体细胞。在如此获得的二倍体细胞中再次诱导减数分裂，由此重组DNA序列再次重组，导致每个重组底物侧翼的两种标记序列再次交换。通过最初的第一重组盒中第一DNA序列侧翼的标记基因或是最初的第二重组盒中第二DNA序列侧翼的标记基因的联合表达，可容易的鉴定第二次减数分裂后获得的新的单倍体重组体。

因此，在本发明的一个优选实施方案中，将在本发明方法第一轮中得到的含有具有第一重组DNA序列的重组盒的单倍体细胞与在本发明方法第一轮中得到的含有具有第二重组DNA序列的重组盒的单倍体细胞进行交配，得到第二二倍体细胞。诱导如此得到的第二二倍体细胞生成孢子，导致单倍体细胞的产生。随后，分离含有其中第三重组DNA序列侧翼为至少第一和第二标记序列的重组盒的单倍体细胞，以及含有其中第四重组DNA序列侧翼为至少第三和第四标记序列的重组盒的单倍体细胞。

通过使上述含有第三和第四重组DNA序列的单倍体细胞进一步进行一轮或多轮交配和减数分裂/生成孢子的循环，可以获得其它重组DNA序列。每轮重组后，通过第一重组底物侧翼的至少一种标记序列和第二重组底物侧翼的至少一种标记序列的联合表达，或者通过起始重组底物中第一或第二DNA序列侧翼的两种标记的联合表达来鉴定重组体。

因此，本发明方法的一个优点是可以重复将：可以个别的或一同的选择重组单倍体后代并相互交配，将如此得到的二倍体再次生成孢子，并将其后代孢子施加合适选择条件以鉴定新的重组事件。通过本发明的方法，可容易的生成大型重组突变序列库，然后可采用合适的选择或筛选系统来鉴定具有所需功能的变体。

在本发明的一个优选实施方案中，用含第一重组盒的DNA分子和含第二重组盒的DNA分子同时或依次转化二倍体酿酒酵母细胞，并任选使两个重组盒整合到酿酒酵母基因组天然染色体上的等位基因处，由此得到第一二倍体酿酒酵母细胞。所用的DNA分子也可以是例如酵母人工染色体(YAC)。YAC的特征为，它们是包含在酵母细胞中稳定维持所必需的所有序列的线性DNA分子，诸如着丝粒、DNA复制起点、端粒以及酵母选择标记。在导入酵母细胞后，YAC的表现与天然染色体相似，因此可视作酵母基因组的一部分。在本发明的内容中，术语“基因组”包括细胞内存在的稳定维持和遗传的所有遗传成分的整体。在将YAC作为DNA分子用于将第一和第二重组盒导入二倍体酿酒酵母细胞时，并非必需将两个重组盒整合到天然染色体的等位基因中。在将重组盒导入天然染色体的情况中，有可能使用克隆载体，例如质粒，可由此释放携带重组盒的片段。优选的是，两个重组盒的两个各自标记序列侧翼为与酿酒酵母基因组特定基因座同源的靶向序列。或者，可以使用不含复制起点的DNA分子。在这种情况中，DNA分子必须能够整合到基因组成分中，并因此含有与酿酒酵母基因组特定基因座同源的靶向序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，通过将其基因组在某基因座中携带第一重组盒的单倍体细胞与其基因组在等位基因处携带第二重组盒的酿酒酵母单倍体细胞融合，由此产生第一二倍体酿酒酵母细胞。

在本发明的另一个优选实施方案中，通过将其基因组在某基因座中携带第一重组盒的单倍体细胞与其基因组在等位基因处携带第二重组盒的相反交配型酿酒酵母单倍体细胞交配，由此产生第一二倍体酿酒酵母细胞。

在本发明的内容中，术语“交配”和“融合”指含有不同重组盒的两种单倍体细胞的有目的的或随机的组合。当选择和/或分离得到的、具有所需特性的两种反向交配型单倍体细胞在刺激交配或融合的条件下接触时，两种单倍体细胞分别发生有目的的交配或融合。这两种单倍体细胞可以衍生自相同细胞库，该细胞库例如含有待重组DNA序列或已重组DNA序列，或者衍生自不同细胞库，该细胞库例如含有待重组DNA序列或已重组DNA序列。

当多种不同的单倍体细胞在刺激交配和融合的条件下接触时，两种单倍体细胞分别可发生随机交配或融合。所述多种单倍体细胞可以衍生自相同细胞库，该细胞库例如含有待重组DNA序列或已重组DNA序列，或者衍生自不同细胞库，该细胞库例如含有待重组DNA序列或已重组DNA序列。

本发明用于生成和检测重组DNA序列的方法的优点是，可以重组多于两种不同序列。例如，如果要重组四种不同DNA序列，那么在本发明方法的第一步中可生成两组不同的二倍体酿酒酵母细胞。例如，可通过使含有第一和第二待重组DNA序列的单倍体细胞交配或融合，产生第一组二倍体细胞，且可通过使含有第三和第四待重组DNA序列的单倍体细胞交配或融合，产生第二组二倍体细胞。使两组二倍体细胞生成孢子后，使由第一组二倍体细胞获得的、含有因第一和第二DNA序列重组而形成的重组DNA序列的单倍体细胞与由第二组二倍体细胞获得的、含有因第三和第四DNA序列重组而形成的重组DNA序列的单倍体细胞交配。这次交配的产物是在生成孢子后产生携带重组DNA序列的单倍体细胞的二倍体细胞，该重组DNA序列包含第一DNA序列、第二DNA序列、第三DNA序列和第四DNA序列的区域。例如，如果要重组三种不同的DNA序列，那么在本发明方法的第一步中，通过例如使含有第一和第二待重组DNA序列的单倍体细胞进行交配或融合，由此生成二倍体酿酒酵母细胞。使这些二倍体细胞生成孢子后，可使如此获得的、含有因第一和第二DNA序列之间的重组而形成的重组DNA序列的单倍体细胞与含有第三待重组DNA序列的单倍体细胞融合或交配。这次交配的产物是在生成孢子后产生携带重组DNA序列的单倍体细胞的二倍体细胞，该重组DNA序列包含第一DNA序列、第二DNA序列和第三DNA序列的区域。这样，也可重组五种、六种或更多不同DNA序列。

在一个优选的实施方案中，携带第一或第二重组盒的单倍体酿酒酵母细胞是如下产生的：

a)将第一待重组DNA序列插入第一克隆载体上相邻的第一与第二标记序列之间，并将第二待重组DNA序列插入第二克隆载体上相邻的第三与第四标记序列之间，由此两种标记序列各自侧翼为与酿酒酵母基因组特定基因座同源的靶向序列，

b)由a)中得到的克隆载体中分别切下具有侧翼靶向序列的第一重组盒和第二重组盒的片段，由此每个切下的片段待重组DNA，其侧翼为各自两种标记序列，继而侧翼为靶向序列，

c)将b)中得到的切下片段分别转化到酿酒酵母二倍体细胞中，由此靶向序列引导重组盒整合到与其同源的基因座中，以获得第一盒或第二盒的杂合二倍体细胞，

d)分别诱导c)中得到的杂合二倍体细胞生成孢子，并

e)分别分离含侧翼为第一和第二标记序列的第一盒的单倍体细胞及含侧翼为第三和第四标记序列的第二盒的单倍体细胞。

在本发明的一个优选实施方案中，第一或第二克隆载体中各自两种标记序列侧翼为与酿酒酵母基因组染色体III上的BUD31-HCM1基因座同源并引导切下的盒整合到该基因座中的靶向序列。

在本发明的一个优选实施方案中，用于克隆重组盒的克隆载体是质粒。“质粒”指能够自主复制的染色体外元件。质粒在物理上与含有它的细胞的基因组不相连。多数质粒是环状双链DNA分子。在另一个实施方案中，克隆载体是YAC。

具体而言，优选使用质粒pMXY9作为克隆第一重组盒的第一克隆载体。质粒pMXY9含有URA3标记基因和CAN1标记基因。在该质粒中，两种标记基因相邻。在两种标记基因之间排列着一些限制性位点，具体是限制酶SmaI、XbaI、BglII和PacI的识别位点，用于插入待重组DNA序列。两种标记序列侧翼为与酿酒酵母基因组染色体III上的BUD31-HCM1基因座同源的靶向序列。

此外，优选使用质粒pMXY12作为克隆第二重组盒的第二克隆载体。质粒pMXY12含有TRP1标记基因和CYH2标记基因。在该质粒中，两种标记基因相邻。在两种基因之间排列着一些限制性位点，具体是限制酶SpeI、SmaI和PacI的识别位点，用于插入待重组DNA序列。两种标记序列侧翼为与酿酒酵母基因组染色体III上的BUD31-HCM1基因座同源的靶向序列。

在本发明的一个优选实施方案中，用于转化切下的重组盒的二倍体细胞对至少两种营养素是营养缺陷的，且对至少两种抗生素是有抗性的。优选的是，二倍体细胞是ura3-1等位基因和trp1-1等位基因的纯合子，它们分别使细胞对尿嘧啶和色氨酸是营养缺陷的。此外，优选的是，用于转化的二倍体细胞是can1-100等位基因和cyh2R等位基因的纯合子，它们分别使细胞对刀豆氨酸和环己酰亚胺是有抗性的。

具体而言，优选的是，将酿酒酵母菌株MXY47的二倍体细胞用于转化，该菌株是等位基因ura3-1、trp1-1、can1-100和cyh2R的纯合子，且是msh2::KanMX突变的杂合子。在将菌株MXY47的二倍体细胞用于携带重组盒及其侧翼靶向序列的第一或第二切下片段的转化时，则可使得到的转化体生成孢子，以生成携带各自重组盒的单倍体野生型或msh2分离体。

按照本发明，可能优选使用具有功能性错配修复系统的酿酒酵母细胞来实行本发明的方法。错配修复系统属于避免复制时由于DNA聚合错误而引起的突变的最大贡献者。通过编辑遗传重组的保真度，错配修复还提高遗传稳定性。因此知道错配修复机制对不同序列之间的重组有一定抑制作用。然而，在正常的酿酒酵母二倍体中，检测到错配修复的另一个方面，称为错配修复依赖性重组(Borts和Haber，Science 237：1459-1465，1987)。认为对较大距离的错配，诸如在不同序列中的，进行错配修复，产生新的双链断裂，继而可刺激第二轮(错配修复依赖性)重组。在某些情况中，具体是已知所使用的两种重组底物具有间隔较大的碱基差异时，因此采用具有功能性错配修复系统的酿酒酵母细胞进行本发明方法会很有用。

在本发明的另一个优选实施方案中，使用错配修复系统缺陷的酿酒酵母细胞。已经在酿酒酵母中鉴定出多个基因，其产物与细菌错配修复蛋白质享有同源性，包括MutS蛋白质的6种同系物，即Msh1、Msh2p、Msh3p、Msh4、Msh5和Msh6p，及MutL蛋白质的4种同系物，即Mlh1p、Mlh2p、Mlh3p和Pms1。特别是已知PMS1和MSH2基因对不同序列之间的重组设置了障碍。因此，在msh2和pms1突变体中，相对于野生型细胞中的重组频率，不同序列之间的减数分裂重组增加。

在本发明的内容中，术语“错配修复系统缺陷”是指细胞的错配修复系统(MMR)暂时的或永久的受损。任何能暂时或永久性损伤错配修复的策略均可实现细胞或生物体的MMR缺陷，包括但不限于参与错配修复的一种或多种基因的突变，用像紫外线般导致MMR全面受损的试剂处理，用像2-氨基嘌呤般的试剂或含有过量错配的异质双链处理以暂时饱和和灭活MMR系统，以及通过例如可调控启动子使其在减数分裂过程中而不是在营养生长过程中暂时失活来诱导参与错配修复的一种或多种基因的表达或遏制。

在本发明的一个优选实施方案中，酿酒酵母细胞的错配修复缺陷是由于参与MMR的至少一种基因的突变。在一个优选的实施方案中，酿酒酵母细胞的MSH2基因有缺陷。优选的是，二倍体细胞是msh2等位基因的纯合子，其中MSH2编码序列以KanMX构建物替换。

在本发明的内容中，术语“重组盒”指包含至少一种重组底物或一种待重组DNA序列且其侧翼为至少两种不同标记序列的DNA序列。第一和第二重组盒在待重组DNA序列及侧翼标记序列方面有不同，使得任何一对重组盒包含两种不同的待重组DNA序列和至少四种不同的侧翼标记序列。

在本发明的一个优选实施方案中，通过将各自的待重组DNA序列插入克隆载体上相邻的两种标记序列之间，继而由与酿酒酵母细胞基因组特定基因座同源的靶向序列围绕，由此产生第一和第二两种重组盒。靶向序列因此能够引导包含重组盒的切下片段整合到该特定基因座中。优选通过遗传工程方法将待重组DNA插入两种标记序列之间。在本发明的一个优选实施方案中，克隆载体中的两种标记序列侧翼为与酿酒酵母基因组染色体III上的BUD31-HCM1基因座同源的靶向序列。因此，靶向序列能够引导包含重组盒的切下片段整合到该基因座中。

在本发明的内容中，术语“待重组DNA序列”和“重组底物”指能够通过减数分裂重组过程而重组的任意两种DNA序列，由此这些序列之间的重组可归于同源或非同源重组。

几种类型的同源重组事件的特点是：受损DNA链与同源配偶体之间的碱基配对，其中相互作用的范围可涉及数以百计几乎完全匹配的碱基对。术语“同源性”是指两种核酸分子序列之间存在的同一性程度。相反，不合理或非同源重组的特点是：没有或仅有少数互补碱基对的DNA末端的结合。在酵母中，非同源修复和重组事件的发生频率要显著低于同源重组事件。

第一和第二待重组DNA是不同的序列，即两种序列不相同，但显示某种程度的同源性。这意味着待重组DNA序列至少有一个核苷酸不同。优选的是，待重组DNA序列是共享至少一个或多个同源区的序列，同源区可以很短。同源区应包含至少5-10个核苷酸，优选大于20-30个核苷酸，更优选大于30-40个核苷酸，且最优选大于50个核苷酸。在本发明的一个优选实施方案中，第一和第二待重组DNA序列至少有一个核苷酸不同，具体是大于0.1％，优选大于5％至大于50％。这意味着第一和第二待重组DNA序列可以有55％、60％、65％或甚至更多不同。

重组底物或待重组DNA序列可以具有天然的或合成的来源。因此待重组DNA序列可以衍生自任何天然来源，包括病毒、细菌、真菌包括酿酒酵母、动物、植物和人。在本发明的一个优选实施方案中，第一和第二待重组DNA序列衍生自酿酒酵母以外的生物体。

在本发明的一个优选实施方案中，待重组DNA序列是蛋白质编码序列，例如编码可用于工业生产天然和非天然化合物的酶的序列。酶或借助酶生产的那些化合物可用于生产药品、化妆品、食品等。蛋白质编码序列也可以是编码在人和动物保健领域具有治疗用途的蛋白质的序列。医学上重要的蛋白质的重要类别包括细胞因子和生长因子。蛋白质编码序列的重组可以生成新的突变序列，它编码的蛋白具有改变的、优选改进的功能和/或新获得的功能。这样有可能例如改善蛋白质的热稳定性，改变蛋白质的底物特异性，改善其活性，生成新的催化位点和/或融合来自两种不同酶的结构域。待重组蛋白编码DNA序列可以包括来自不同物种的序列，它们编码在其天然环境中具有相似或相同功能的相同或相似蛋白质。待重组蛋白编码DNA序列可以包括来自相同蛋白质或酶家族的序列。待重组的蛋白编码序列还可以包括编码具有不同功能的蛋白质的序列，例如编码催化指定代谢途径的不同步骤的酶的序列。在本发明的一个优选实施方案中，第一和第二待重组DNA序列选自β-内酰胺酶的Oxa超家族的基因序列。

在本发明的另一个优选实施方案中，待重组DNA序列是非编码序列，诸如例如在其天然细胞环境内参与调节蛋白质编码序列表达的序列。非编码序列的实例包括但不限于启动子序列、含核糖体结合位点的序列、内含子序列、聚腺苷酸化序列等。通过重组这些非编码序列，有可能生成突变序列，它在细胞环境中导致对某一细胞过程的调节改变，例如某一基因的表达改变。

根据本发明，重组底物或待重组DNA序列当然可以包含一种以上蛋白质编码序列和/或一种以上非编码序列。例如，重组底物可以包含一种蛋白质编码序列和一种非编码序列，或者不同蛋白质编码序列和不同非编码序列的组合。在本发明的另一个实施方案中，待重组DNA序列因此可由一种或多种编码序列区段及介于其中和/或侧翼的非编码序列组成。这意味着待重组DNA序列可以是例如在其5’端和/或非翻译3’区具有调节序列的基因序列，或者是具有外显子/内含子结构的哺乳动物基因序列。在本发明的另一个实施方案中，待重组DNA序列可由含有一种以上编码序列及介于其中的非编码序列的较长连续区段组成，诸如属于生物合成途径或操纵子的那些区段。待重组DNA序列可以是已经经历过一次或多次重组事件，例如同源和/或非同源重组事件，的序列。

重组底物可以包含未突变野生型DNA序列和/或已突变DNA序列。在本发明的一个优选实施方案中，有可能将野生型序列与已有的已突变序列进行重组，以生成新的突变序列。

在本发明的内容中，术语“标记序列”是指酿酒酵母细胞中位于重组底物或已重组DNA序列的上游或下游的独特DNA序列。标记序列在与重组底物或已重组DNA序列相同的DNA分子上的存在，优选连同重组底物另一侧上的另一种标记序列，使得可以通过分子或遗传方法识别和选择重组底物或已重组DNA序列。因此，在本发明的一个优选实施方案中，每种重组底物的上游必须有一种或多种标记序列，并且每种重组底物的下游也必须有一种或多种标记序列，使得在两种不同重组底物的杂合子细胞中，总共至少有四种不同的标记序列。这种排列能够选择出涉及重组底物的交换体。还可以以重复方式进行多轮重组。在本发明的另一个优选实施方案中，重组底物的每一侧上可以存在一种以上的标记。例如可以引入额外标记以提高选择的严谨性。

标记序列可以包含蛋白质编码或非编码DNA序列。在本发明的一个优选实施方案中，蛋白质编码标记序列选自营养标记、色素标记、抗生素抗性标记、抗生素敏感性标记、和编码酶不同亚基的序列，所述酶只有在两种或多种亚基在同一细胞中表达时才发挥功能。在本发明的另一个优选实施方案中，分子非编码标记序列包括但不限于引物识别位点即PCR引物与之退火并能够扩增重组体的序列、内含子/外显子边界、启动子序列、下游受调节基因序列或限制酶位点。

“营养标记”是指所编码基因产物能够补偿生物体或细胞的营养缺陷，从而可赋予该营养缺陷型生物体或细胞以原养型的标记序列。在本发明的内容中，术语“营养缺陷型”是指生物体或细胞必须在含有营养缺陷型生物体自身不能合成的必需营养素的培养基中培养。营养标记基因的基因产物促进营养缺陷型细胞合成这种缺乏的必需营养素。因此，营养标记基因一表达就不必向培养生物体或细胞的培养基中添加这种必需营养素，因为生物体或细胞已经获得了原养型。

“色素标记”是指其基因产物参与色素合成的标记基因，它一旦表达将使表达色素标记的细胞染色。没有色素标记的细胞不合成色素，因此也不会被染色。色素标记因此能够对含有色素标记的细胞进行快速的表型检测。

“抗生素抗性标记”是指一旦表达其基因产物就赋予表达抗生素标记基因的细胞以在指定浓度的指定抗生素存在时生长的能力的标记基因，而没有抗生素抗性标记的细胞则不能生长。

“ 抗生素敏感性标记”是指一旦表达其基因产物就破坏细胞在指定浓度的指定抗生素存在时生长的能力的标记基因。

在本发明的一个优选实施方案中，第一和第三标记序列的每一种基因产物能够补偿酿酒酵母细胞的营养缺陷。优选的是，第一标记序列为URA3，其基因产物能够赋予尿嘧啶缺陷型酿酒酵母细胞以尿嘧啶原养型。优选的是，第三标记序列为TRP1，其基因产物能够赋予色氨酸缺陷型酿酒酵母细胞以色氨酸原养型。

在本发明的另一个优选实施方案中，第二和第四标记序列的基因产物赋予对某抗生素有抗性的酿酒酵母细胞以对该抗生素的敏感性。优选的是，第二标记序列是CAN1，其基因产物能够赋予刀豆氨酸抗性酿酒酵母细胞以刀豆氨酸敏感性。优选的是，第四标记序列是CYH2，其基因产物能够赋予环己酰亚胺抗性酿酒酵母细胞以环己酰亚胺敏感性。

在本发明的另一个优选实施方案中，标记序列包含PCR引物的退火位点。优选的是，第一、第二、第三和第四标记序列受到引物KNS11、KNS28、KNS16和KNS29的识别。

在本发明方法的一个优选实施方案中，可通过PCR方法检测各自标记组合的存在，从而鉴定包含具有第一、第二、第三或第四重组DNA序列的重组盒的单倍体细胞。

在本发明方法的另一个优选实施方案中，包含具有第一、第二、第三或第四重组DNA序列的重组盒的单倍体细胞是如下鉴定的：将单倍体细胞涂布在选择存在各自标记组合的相同DNA分子的培养基上。这意味着将含有第一重组DNA序列的单倍体细胞涂布在选择存在第一和第四标记序列的培养基上。将包含第二重组DNA序列的单倍体细胞涂布在选择存在第二和第三标记序列的培养基上。将包含第三重组DNA序列的单倍体细胞涂布在选择存在第一和第二标记序列的培养基上。将包含第四重组DNA序列的单倍体细胞涂布在选择存在第三和第四标记序列的培养基上。

本发明的另一个方面涉及生成具有新的或改进的功能和特性的新蛋白质、酶、途径和非编码序列的方法，由此通过使用本发明的用于在酿酒酵母中生成和检测重组DNA序列的方法，对已知的蛋白质编码序列或已知的非编码序列进行一轮或多轮重组。

本发明的另一个方面涉及质粒pMXY9。质粒pMXY9包含相邻的URA3标记基因和CAN1标记基因。在两种标记基因之间排列的是多接头序列，包含用于插入待重组DNA序列的多个限制性位点。两种标记侧翼为与酿酒酵母基因组染色体III上的BUD31-HCM1基因座同源的靶向序列。两种标记基因之间的多接头序列包含限制酶SmaI、XbaI、BglII和PacI的限制性位点。

本发明的另一个方面涉及质粒pMXY12。质粒PMXY12包含TRP1标记基因和CYH2标记基因。在两种标记基因之间排列的是多接头序列，包含用于插入待重组DNA序列的多个限制性位点。两种标记侧翼为与酿酒酵母基因组染色体III上的BUD31-HCM1基因座同源的靶向序列。多接头序列包含限制酶SpeI、SmaI和PacI的限制性位点。

本发明还涉及酿酒酵母菌株MXY47，其特征是：其二倍体细胞是等位基因ura3-1、trp1-1、can1-100和cyh2R的纯合子且是msh2::KanMX特别的杂合子。

本发明还涉及含有质粒pMXY9的大肠杆菌菌株JM101及含有质粒pMXY12的大肠杆菌菌株DH5α。

质粒pMXY9和pMXY12及酿酒酵母菌株MXY47于2005年1月3日保藏于DSMZ(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH，Mascheroderweg 1b，38124 Braunschweig，Germany)，保藏号分别是DSM 17010、DSM 17011和DSM 17026。

本发明的另一个方面涉及可用于执行本发明方法即用于在酿酒酵母中生成和检测重组DNA序列的试剂盒。在第一个实施方案中，试剂盒至少包含装有酿酒酵母菌株MXY47的细胞的第一容器，装有携带质粒pMXY9的大肠杆菌菌株JM101的细胞的第二容器，和装有携带质粒pMXY12的大肠杆菌菌株DH5α的细胞的第三容器。

在第二个实施方案中，试剂盒至少包含装有酿酒酵母菌株MXY47的细胞的第一容器，装有质粒pMXY9的DNA的第二容器，和装有质粒pMXY12的DNA的第三容器。

本发明通过以下序列表、附图和实施例进行说明。

附图简述

图1显示了在确定成分培养基上选择重组体的选择系统示意图。重组盒杂合的二倍体亲本细胞经诱导发生减数分裂，这里重组盒是侧翼为URA3和CAN1基因的重组底物A，以及侧翼为TRP1和CYH2基因的重组底物B。将孢子涂布到缺乏尿嘧啶但含有刀豆氨酸的培养基(-Ura+Can)和缺乏色氨酸但含有环己酰亚胺的培养基(-Trp+Cyh)上，以选择重组细胞3和4，其中发生了涉及重组底物A和B的交换，用(+)表示。亲本二倍体和未重组的单倍体1和2不能在这两种培养基上生长，用(-)表示。下一轮减数分裂可使用重组体3和4，以构建新的二倍体，它在形成孢子后产生新的重组细胞，它们携带与细胞1和2中所示相同的侧翼标记配置。可在缺乏尿嘧啶但含有环己酰亚胺的培养基(-Ura+Cyh)和缺乏色氨酸但含有刀豆氨酸的培养基(-Trp+Can)上分别选择具有这些配置的重组孢子克隆。

图2显示了质粒pMXY9和pMXY12(上部)，它们是用于将重组盒靶向酵母基因组染色体III上的BUD31-HCM1基因座的载体。这两种质粒均携带与此基因座同源的序列(用5′和3′表示)，位于URA3和CAN1标记(pMXY9)或者TRP1和CYH2标记(pMXY12)的侧翼。每对标记序列之间存在含有限制性位点的一段短序列，用于克隆重组底物。下部显示了重组盒进入BUD31-HCM1基因座的整合。用NotI消化携带重组底物A的pMXY9衍生物，以释放侧翼为5′和3′靶向序列的重组盒，并将消化产物转化到MXY47细胞中。鉴定含有正确靶向插入物的Ura+衍生物，随后用于构建重组盒杂合子菌株。类似的在pMXY12中构建携带TRP7和CYH2标记的重组盒并转化到MXY47细胞中，随后选择色氨酸原养型。

图3显示了野生型和msh2菌株中Oxa基因之间的重组频率作为序列同一性的函数。上部是独立实验的平均值±标准偏差。下部是这些数据的图解。采用以下菌株：MXY60、MXY62、MXY64、MXY66、MXY99、和MXY102。

图4显示了msh2的超重组效果。对每个独立试验(总数＝n)对具有给定共享Oxa基因同源性百分比的菌株对，以及对每次选择条件，计算msh2/wt比率，并显示了这些总计值的平均值±标准偏差。下部是这些数据的图示。采用以下菌株对：MXY60和MXY62、MXY64和MXY66、MXY99和MXY102。

图5显示了享有78％同源性的Oxa序列之间重组的PCR分析。孢子克隆衍生自野生型(MXY99)和msh2(MXY102)二倍体，它们是在缺乏尿嘧啶但含有刀豆氨酸的培养基或者缺乏色氨酸但含有环己酰亚胺的培养基上选择得到的。对表现出符合预期交换重组体表型的选定孢子克隆进行菌落PCR。上部，对每种野生型和msh2 Ura+CanR候选物进行两个反应，一个使用亲本特异性引物对(KNS16+KNS28，产物显示在每种候选物的每对泳道中的第一泳道)，另一个使用重组体特异性引物对(KNS16+KNS29，第二泳道)。下部，对每种野生型和msh2 Trp+CyhR候选物进行类似反应，一个使用亲本特异性引物对(KNS11+KNS29，第一泳道)，另一个使用重组体特异性引物对(KNS11+KNS28，第二泳道)。对照反应是对含有已知侧翼标记序列配置的适宜亲本(P)或重组体(R)基因组DNA进行的。(-)是无DNA的对照。

图6显示了第二轮重组的重组频率。将第一轮重组后得到的野生型和msh2单倍体与MXY64和MXY66进行交配，以产生含有镶嵌Oxa7-Oxa11重组盒的野生型(MXY81、MXY82、和MXY83)和msh2(MXY86、MXY87、和MXY88)二倍体。Oxa11重组底物纯合的野生型(MXY90)和msh2

(MXY92)二倍体也可由MXY60和MXY62的重组后代构建而得。使所有二倍体形成孢子，并将孢子突变在用于选择Ura+CanR和Trp+CyhR重组体的培养基上。

序列表简述

序列表包括以下序列：

SEQ ID No.1和2分别显示了用于扩增MSH2的引物MSH2UP和MSH2DN的序列。

SEQ ID No.3至SEQ ID No.6分别显示了引物MSH2A1、MSH2A2、MSH2A3、和MSH2A4的序列，它们是MSH2特异性分析引物。

SEQ ID No.7和SEQ ID No.8分别显示了引物K2KANMX和K3KANMX的序列，它们是KanMX特异性分析引物。

SEQ ID No.9和SEQ ID No.10分别显示了用于扩增LEU2的引物LEU2UP和LEU2DN的序列。

SEQ ID No.11和SEQ ID No.12分别显示了用于扩增HIS3的引物HIS3UP和HIS3DN的序列。

SEQ ID No.13和SEQ ID No.14分别显示了用于扩增3′靶向序列的引物KNS1和KNS2的序列。

SEQ ID No.15和SEQ ID No.17分别显示了用于扩增5′靶向序列的引物KNS3、KNS4、和KNS6的序列。

SEQ ID No.18和SEQ ID No.19分别显示了用于扩增Oxa7的引物KNS7和KNS8的序列。

SEQ ID No.20和SEQ ID No.21分别显示了用于扩增Oxa11的引物KNS9和KNS10的序列。

SEQ ID No.22显示了引物KNS12的序列，它是BUD31下游分析引物。

SEQ ID No.23显示了引物KNS13的序列，它是BUD31上游分析引物。

SEQ ID No.24显示了引物KNS14的序列，它是TRP1特异性分析引物。

SEQ ID No.25显示了引物KNS15的序列，它是URA3特异性分析引物。

SEQ ID No.26和SEQ ID No.27分别显示了用于扩增CYH2的引物KNS17和KNS18的序列。

SEQ ID No.28显示了引物KNS30的序列，它是用作测序引物的TRP1特异性正向引物。

SEQ ID No.29显示了引物KNS31的序列，它是用作测序引物的CAN1特异性反向引物。

SEQ ID No.30显示了引物KNS33的序列，它是用作测序引物的CYH2特异性反向引物。

SEQ ID No.31和SEQ ID No.32分别显示了用于扩增Oxa5的引物KNS36和KNS37的序列。

SEQ ID No.33显示了引物KNS38的序列，它是用作测序引物的URA3特异性正向引物。

实施例

在酿酒酵母错配修复突变体中生成镶嵌基因

1.材料与方法

1.1培养基

用标准的丰富培养基YPD(Bio101)进行常规培养，用合成的撤除培养基(Bio101)监测遗传标记和筛选重组体。为了生成孢子，将细胞在添加所需营养补充物的SPS培养基(50mM邻苯二甲酸钾pH5.0、0.5％酵母提取物(Difco)、1％细菌用蛋白胨(Difco)、0.17％酵母氮基、1％醋酸钾、0.5％硫酸铵)中培养过夜，洗涤，在添加补充物的1％醋酸钾中重悬，并振摇温育2天。所有操作均在30℃进行。为了进行四分体分析，用盖罩大蜗牛(Helixpomatia)β-葡糖醛酸糖苷酶(Sigma)消化子囊，并用装配有TDM400显微操作器(Micro Video Instruments，Inc.)的Nikon Eclipse E400显微镜进行解剖。其它遗传方法均如Ausubel等人，《Current Protocols in Molecular Biology》，1998，John Wiley and Sons，Inc.，New York所述进行。所有酵母转化均依照Agatep等人的联机技术要点使用LiAc方法进行(http://tto.trends.com)。

1.2酵母菌株

本研究中采用的或生成的所有酵母菌株列于表1和表2。所有酵母菌株都是易于生成孢子的W303背景的同基因衍生物。作为重组盒的转化宿主，二倍体MXY47通过如下转化和遗传杂交构建。用LEU2片段(用序列表中所列的引物对LEU2UP/LEU2DN对W303菌株U474进行制备性PCR获得)转化单倍体D184-1B(S.Gangloff馈赠，CEA，France)，产生Leu+单倍体MXY13。用HIS3片段(用引物对HIS3UP/HIS3DN对ORD4369-25D进行制备性PCR获得)转化单倍体D184-1C(S.Gangloff馈赠)，产生His+单倍体MXY25。单倍体MXY18和MXY22分别是在10μg/ml环己酰亚胺上选择得到的D184-1B和D184-1C的隐性环己酰亚胺抗性(cyh2R)衍生物；通过测序和分离分析验证了赋予环己酰亚胺抗性的CYH2基因座存在突变图谱(两个不同核苷酸改变导致第38位谷氨酰胺变为赖氨酸)。将MXY18和MXY25杂交，得到二倍体MXY29；将MXY13和MXY22杂交，得到二倍体MXY33。将单倍体分离体MXY29-6D和MXY33-8C杂交，得到MXY38，它是leu2-3、112和his3-11、15标记的杂合子及cyh2R突变的纯合子。用引物MSH2UP和MSH2DN通过PCR由RBT348(R.Borts馈赠，University of Leicester)扩增得到msh2::KanMX盒，并用它转化MXY38，得到MXY47。在200μg/mlG418(Invitrogen)上选择转化体，并通过用引物MSH2A1、MSH2A2、MSH2A3、和MSH2A4进行的菌落PCR(见下文)和四分体分析，即分析四种孢子，进行验证，以确认标记分离。

表1：单倍体酵母菌株

名称	基因型	来源或来历
			D184-1B	a ura3-1 trp1-1 can1-100 his3-11，15leu2-3，112 ade2-1	S.Gangloff
D184-1C	αura3-1  trp1-1  can1-100 his 3-11，15leu2-3，112 ade2-1	S.Gangloff
			U474	αura3-1 trp1-1 can1-100 his3-11，15 ade2-1	S.Gangloff
ORD4369-25D
			MXY13	a ura3-1 trp1-1 can1-100 his3-11，15ade2-1	经LEU2 PCR产物转化的D184-1B
MXY18	a ura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R his3-11，15leu2-3，112 ade2-1	D184-1B cyhR衍生物

MXY22	αura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R his3-11，15leu2-3，112 ade2-1	D184-1C cyhR衍生物
			MXY25	α ura3-1frp1-1 can1-100 leu2-3，112 ade2-1	经HIS3 PCR产物转化的D184-1C
MXY29-6D	αura3-1 top1-1 can1-100 cyh2R leu2-3，1l2ade2-1	MXY29分离体
			MXY33-8C	aura3-1 trp1-1 canl-100 cyh2R his3-11，15ade2-1	MXY33分离体
MXY50-3D	αmsh2::KanMX ura3-1 trp1-1  cyh2Rcan1-100    leu2-3，112    ade2-1BUD31::URA3-CAN1	MXY50分离体

MXY22	αura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R his3-11，15leu2-3，112 ade2-1	D184-1C cyhR衍生物
			MXY50-7D	αura3-1 trp1-1 cyh2R can1-100 his3-11，15ade2-1 BUD31::URA3-CAN1	MXY50分离体
MXY51-2B	αmsh2::KanMX ura3-1 trp1-1  cyh2Rcan1-100    his3-11，15    ade2-1BUD31::URA3-Oxa7-CAN1	MXY51分离体
			MXY51-10C	αura3-1 trp1-1 cyh2R can1-100 leu2-3，112ade2-1 BUD31::URA3-Oxa7-CAN1	MXY51分离体
MXY52-2A	αmsh2::KanMX ura3-1 trp1-1 cyh2Rcan1-100    his3-11，15    ade2-1BUD31::URA3-Oxa11-CAN1	MXY52分离体
			MXY52-7D	αura3-1 trp1-1 cyh2R can1-100 leu2-3，112ade2-1 BUD31::URA3-Oxa11-CAN1	MXY52分离体
MXY53-11C	a ura3-1 trp1-1 cyh2R can1-100 leu2-3，112ade2-1 BUD31::TRP1-CYH2	MXY53分离体
			MXY53-11D	a msh2::KanMX ura3-1 trp-1 can1-100cyh2R    his3-11，15    ade2-1BUD31::TRP1-CYH2	MXY53分离体
MXY55-1C	a msh2::KanMX ura3-1 trp1-1 can1-l00cyh2R    his3-11，15    ade2-1	MXY55分离体

	BUD31::TRP1-Oxa11-CYH2
			MXY55-2B	aura3-1 trp1-1 can1-100 cyh2R his3-11，15ade2-1 BUD31::TRP1-Oxa11-CYH2	MXY55分离体
MXY55-13D	a msh2::KanMX ura3-1 trp1-1 can1-100cyh2R    leu2-3，112    ade2-1BUD31::TRP1-Oxa11-CYH2	MXY55分离体

	BUD31::TRP1-Oxa11-CYH2
			MXY79-3B	αura3-11 trp1-1 can1-100 cyh2R his3-11，15leu2-3，112    ade2-1BUD31::URA3-Oxa5-CAN1	MXY79分离体
MXY79-9A	αmsh2::KanMX ura3-1 trp1-1 can1-100cyh2R    leu2-3，112    ade2-1B UD31::URA3-Oxa5-CAN1	MXY79分离体
			RBT348	α msh2::KanMX ura3 cyhR met13-4 lys2-d	R.Borts

 表2：二倍体酵母菌株

名称	基因型	来源或来历
			MXY29	a/α ura3-1/″trpl-1/″cyh2R/CYH2 canl-100/″his3-11，15/HIS3 leu2-3，112/″ade2-1/″	MXY18    xMXY25
MXY33	a/α ura3-1/″trp1-1/″cyh2R/CYH2 can1-100/″his3-11，15/″leu2-3，112/LEU2 ade2-1/″	MXY22    xMXY13
			MXY38	a/α ura3-1/″trp1-1/″ cyh2R/″ can1-100/″his3-11，15/HIS3 leu2-3，112/LEU2 ade2-1/″	MXY33-8C  xMXY29-6D
MXY47	a/α msh2::KanMX/MSH2 ura3-1/″ trp1-1/″cyh2R/″    can1-100/″    his3-11，15/HIS3leu2-3，112/LEU2 ade2-1/″	经msh2::KanMXPCR产物转化的MXY38
			MXY50	a/α  msh2::KanMX/MSH2  ura3-1/″  trp1-1/″cyh2R/″    can1-100/″    his3-11，15/HIS3leu2-3，112/LEU2    ade2-1/″BUD31::URA3-CAN1/BUD31	经NotI消化pMXY9转化的MXY47
MXY51	a/α  msh2::KanMX/MSH2 ura3-1/″trp 1-1/″	经NotI消化

	cyh2R/″    can1-100/″    his3-11，15/HIS3leu2-3，112/LEU2    ade2-1/″BD31::URA3-Oxa 7-CAN1/BUD31	pMXY13转化的MXY47
			MXY52	a/α msh2::KanMX/MSH2 ura3/″trp1-1/″cyh2R/″can1-100/″  his3-11，15/HIS3  leu2-3，112/LEU2ade2-1/″BUD31::URA3-Oxa11-CAN1/BUD31	经NotI消化pMXY14转化的MXY47
MXY53	a/a msh2::KanMX/MSH2 ura3-1/″trp-1/″cyh2R/″can1-100/″  his3-11，15/HIS3  leu2-3，112/LEU2ade2-1/″BUD31::TRP-CYH2/BUD31	经NotI消化pMXY12转化的MXY47
			MXY55	a/α msh2::KanMX/″MSH2 ura3-1/″trp1-1/″cyh2R/″    can1-100/″    his3-11，15/HIS3leu2-3，112/LEU2    ade2-1/″BUD31::TRP1-Oxa11-CYH2/BUD31	经NotI消化pMXY22转化的MXY47
MXY57	a/α msh2::KanMX/″ura3-1/″trp1-1/″cyh2R/″can1-100/″  his3-11，15/HIS3  leu2-3，112/LEU2ade2-1/″BUD31::TRP1-CYH2/BUD31::URA3-CAN1	MXY50-3D  xMXY53-11D
			MXY59	a/α  ura3-1/″trp1-1/″  cyh2R/″  can1-100/″his3-11，15/HIS3  leu2-3，112/LEU2  ade2-1/″BUD31::TRP1-CYH2/BUD31::URA3-CAN1	MXY50-7D  xMXY53-11C
MXY60	a/α  ura3-1/″trp1-1/″  cyh2R/″  can1-100/″his3-11，15/HIS3  leu2-3，112/LEU2  ade2-1/″BUD31::TRP1-Oxa11-CYH2/BUD31::URA3-Oxa11-CAN1	MXY52-7D  xMXY5 5-2B
			MXY62	a/α msh2::KanMX/″ura3-1/″trp 1-1/″cyh2R/″can 1-100/″  his3-11，15/HIS3  leu2-3，112/LEU2ade2-1/″BUD31::TRP1-Oxa11-CYH2/BUD31::URA3-Oxa11-CAN1	MXY52-2A  xMXY55-1C
MXY64	a/α  ura3-1/″trp1-1/″  cyh2R/″  can1-100/″his3-11，15/HIS3  leu2-3，112/LEU2  ade2-1/″	MXY51-10C xMXY55-2B

	BUD31::URA3-Oxa 7-CAN1/BUD31::TRP1-Oxa11-CYH2
			MXY66	a/α msh2∷KanMX/″ura3-1/″trp1-1/″cyh2R/″can1-100/″  his3-11，15/HIS3  leu2-3，112/LEU2ade2-1/″BUD31∷TRP1-Oxa11-CYH2/BUD31∷URA3-Oxa7-CAN1	MXY51-2B  xMXY55-13D
MXY79	a/α  msh2::KanMX/MSH2  ura3-1/″trp1-1/″cyh2R/″    can1-100/″    his3-11，15/HIS3leu2-3，112/LEU2    ade2-1/″BUD31：URA3-Oxa5-CAN1/BUD31	经NotI消化pMXY24转化的MXY47
			MXY99	a/α  ura3-1/″trp1-1/″cyh2R/″  can1-100/″his3-11，15/″    leu2-3，112/LEU2    ade2-1/″BUD31::URA3-Oxa5-CAN1/BUD31::TRP1-Oxa11-CAN1	MXY79-3B  xMXY55-2B
MXY102	a/α msh2::KanMX/″ura3-1/″trp1-1/″cyh2R/″can1-100/can1 his3-11，15/HIS3 leu2-3，112/LEU2ade2-1/″BUD31::URA3-Oxa5-CAN1/BUD31::TRP1-Oxa11-CAN1	MXY79-9A  xMXY55-1C

1.3质粒构建

以细菌菌株XL1-Blue MRF′(ΔmcrA)183(mctCB-hsdSMR-mrr)173endA1supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F′proAB lacl^qZΔM15 Tn10 (Tet^r)])和JM110(rpsL[Str^r]thr leu thi-1 lacY galK galT ara tonA tsx dam dcm supE44Δ[lac-proAB][F’traD36 proAB lacl^q ZΔM15])作为克隆宿主。用标准方法构建质粒(Ausubel等人)。本研究中采用的或构建的所有质粒在表3中列出。克隆中所用的限制酶、T4 DNA连接酶和其它酶购自New England BioLabs。DNA片段和质粒用Qiagen和Macherey-Nagel的试剂盒纯化。

用引物对KNS3/KNS4通过制备性PCR由W303基因组DNA扩增对应于BUD31基因座的上游(“5′靶”)序列，并作为KpnI/XhoI片段克隆到经KpnI/XhoI消化的pKSII(+)(Stratagene)中，从而产生pMXY1；用引物对KNS1/KNS2类似扩增下游(“3′靶”)靶向序列，并作为XbaI/NotI片段克隆到经XbaI/NotI消化的pKSII(+)(Stratagene)中，从而产生pMXY2。作为BglII/EcoRI片段从pJH53(R.Borts馈赠)中切下TRP1标记，并与经BamHI/EcoRI消化的pMXY1连接，得到pMXY3；通过XhoI/HindIII消化从pRED316(R.Borts馈赠)中切下URA3标记，并与经XhoI/HindIII消化的pMXY1连接，得到质粒pMXY4。作为SmaI片段由pRED316分离CAN1标记，并与经HpaI消化的pMXY2连接，得到质粒pMXY5。将用引物对KNS4/KNS6由基因组DNA再次扩增得到的序列作为KpnI/XhoI片段连接到经KpnI/XhoI消化的pMXY3和pMXY4中，由此替换各自质粒中的5′靶向序列，得到pMXY7和pMXY6。通过这一步骤加入了克隆后期所需的引物KNS3中缺乏的限制性位点。将包含5′靶和URA3标记的pMXY6的KpnI/SmaI片段与经KpnI/SmaI消化的pMXY5连接，得到URA3-CAN1重组盒载体pMXY9。将包含5′靶和TRP1标记的pMXY7的KpnI/SpeI片段与经KpnI/SpeI消化的pMXY2连接，得到pMXY11。最后，用引物对KNS17/KNS18由W303基因组DNA通过制备性PCR扩增CYH2标记，用BamHI和PvuI消化，与经BglII/PacI消化的pMXY11连接，得到TRP1-CYH2重组盒载体pMXY12。所有质粒构建体通过电穿孔导入细菌宿主，并通过限制性分析加以证实，通过对所有克隆连接处进行测序进一步确认pMXY9和pMXY12。

通过制备性PCR由宿主质粒(W.Schoenfeld提供)扩增β-内酰胺酶重组底物，对于Oxa5(登记号X58272)使用引物对KNS36/KNS37，对于Oxa7(登记号X75562)使用引物对KNS7/KNS8，而对于Oxa11(登记号Z22590)使用引物对KNS9/KNS10。用PacI消化Oxa7和Oxa11的PCR产物，并与经SmaI/PacI消化的pMXY9连接，分别产生pMXY13和pMXY14。还用SpeI和PacI消化Oxa11的PCR产物，并与经SpeI/PacI消化的pMXY12连接，产生pMXY22。用BamHI和PacI消化Oxa5的PCR产物，并与经BglII/PacI消化的pMXY9连接，产生pMXY24。所有构建体通过限制性分析加以证实。

表3：质粒

名称	描述或插入物	来源
			pKSII(+)	亲本载体	Stratagene

pRED316	URA3和CAN1来源	R.Borts
			pJH53	TRP1来源	R.Borts
pMXY1	5′靶	这项工作
			pMXY2	3 ′靶	这项工作
pMXY3	5′靶-TRP1	这项工作
			pMXY4	5′靶-URA3	这项工作
pMXY5	CAN1-3′靶	这项工作
			pMXY6	5′靶-URA3	这项工作

pRED316	URA3和CAN1来源	R.Borts
			pMXY7	5′靶-TRP1	这项工作
pMXY9	5′靶-URA3-CAN1-3′靶	这项工作
			pMXY11	5′靶-TRP1-3′靶	这项工作
pMXY12	5′靶-TRP1-CYH2-3′靶	这项工作
			pMXY13	5′靶-URA3-Oxa7-CAN1-3′靶	这项工作
pMXY14	5′靶-URA3-Oxa11-CAN1-3′靶	这项工作
			pMXY22	5′靶-TRP1-Oxa11-CYH2-3′靶	这项工作
pMXY24	5′靶-URA3-Oxa5-CAN1-3′靶	这项工作

1.4重组体的筛选与鉴定

为了第一轮重组，用NotI消化携带重组盒的质粒，并将所有消化产物用于转化MXY47。选择尿嘧啶(对于pMXY9衍生物)或色氨酸(对于pMXY12衍生物)原养型，并通过菌落PCR证实所导入构建体对BUD31-HCM1基因座两个染色体拷贝其中之一的靶向，对于URA3-CAN1衍生物，使用引物KNS12/KNS13/KNS15，而对于TRP1-CYH2衍生物，使用引物KNS12/KNS13/KNS14，它们能由完整的或断裂的BUD31-HCM1基因座扩增片段。使经过转化的杂合子生成孢子，采用四分体分析来鉴定携带重组盒的野生型或msh2单倍体。将适合的对立交配型的单倍体涂布到YPD平皿上，培养过夜，在相同的YPD平皿上混合，并交配过夜。将交配平板以复制方式转接-Ura-Trp培养基，用来选择二倍体细胞，第二天将其大量接种到添加了补充物的SPS中并培养过夜。将预培养物离心，洗涤，将细胞重悬于添加了补充物的1％醋酸钾并温育2天。

收获孢子，定量，并在某些情况中解剖以确认所有标记的正确分离。用酶解酶-20T(ICN Biomedicals)消化子囊以释放孢子，将孢子悬浮液超声处理(Branson 250型数字超声仪)，并将适当稀释液涂布到YPD上以测定细胞活力，涂布到含有60ug/ml刀豆氨酸(Sigma)的尿嘧啶撤除培养基上以选择Ura+CanR重组体，和涂布到含有3ug/ml环己酰亚胺(Sigma)的色氨酸撤除培养基上以选择Trp+CyhR重组体。对每种培养基上生长的孢子菌落计数，并进行表型和分子检测以确定它们是否为真正的重组体。为了表型分析，将有代表性数量的候选重组体在与选择所用相同的培养基上再次划线，随后以复制方式转接-Ura、-Trp、环己酰亚胺(10μg/ml)、刀豆氨酸(60μg/ml)、和交配型检测平皿。

还将孢子涂布到-Ura-Trp培养基上以测定每份孢子制剂的二倍体频率，它在所有情况中低于活细胞总数的4％。为了分子分析，采用特异扩增亲本或重组片段的合适引物对对基因组总DNA进行分析PCR(见下文)。将特定选择的重组频率表述成特定选择培养基上活细胞的频率，并对展示假阳性表型的非重组体进行校正。在多数情况中，通过分析性PCR可知这种假阳性因CAN1或CYH2标记的突变失活引起。

为了第二轮重组，将第一轮重组衍生的合适重组体进行交配，并选择Ura+Trp+二倍体。生成孢子程序与第一轮重组相同，只是将孢子涂布到YPD、用于选择Ura+CyhR重组体的含环己酰亚胺的尿嘧啶撤除培养基、和用于选择Trp+CanR重组体的含刀豆氨酸的色氨酸撤除培养基上。对候选重组体同样进行表型和分子分析。

1.5分子生物学方法

依照Ausubel等人的标准微量制备程序由YPD过夜培养物制备基因组DNA，作为制备性或分析性PCR的模板。克隆或测序所用片段的制备性PCR如下进行：以Oxa质粒DNA(约50pg)或酵母基因组DNA(约0.5μg)作为模板，50μl反应体系含有2.5U Herculase聚合酶(Stratagene)、1 x Herculase反应缓冲液、0.2mM每种dNTP、和100ng每种引物。扩增如下进行：94℃2min；30个循环，94℃ 10s，55℃ 30s，72℃ 30s；68℃ 10min。用修改后的菌落PCR来验证重组盒整合到BUD31基因座处(http://www.fhcrc.orq/labs/hahn/methods/mol bio meth/pcr yeast colony.html)，扩增条件如下：95℃5min；35个循环，95℃ 1min，55℃ 1min，68℃ 1min；72℃10min。如下进行分析性PCR以鉴定Oxa插入物的特征，100μl反应体系含有约0.5μg由候选重组体和对照菌株制备的基因组DNA、1.5U Taq聚合酶(Roche)、1x反应缓冲液、0.2mM每种dNTP、和100ng每种引物，扩增条件与菌落PCR相同，只是延伸改为68℃2min。所有扩增反应均在Mastercycler gradient 5331(Eppendorf)上进行。

为了重组Oxa插入物的序列分析，先用引物对KNS16/KNS29(针对Ura+CanR重组体)或KNS11/KNS28(针对Trp+CyhR)进行制备性PCR，然后用Qiaquick PCR试剂盒(Qiagen)进行纯化。根据情况选择引物KNS30、KNS31、KNS33、或KNS38用Genome Express(Meylan，FR)对PCR产物进行测序。用Clone Manager软件(Sci Ed Central)比对和分析重组体序列。PCR和测序中使用的寡核苷酸(表3)均购自Proligo France。

2.结果

2.1酵母减数分裂同源重组系统的开发

开发了利用酿酒酵母来促进不同DNA序列之间体内重组的策略。这种策略的关键特色包括使用减数分裂细胞，其中发生高水平的基因组范围内的重组；还有灭活错配修复(MMR)系统，它通常限制不同序列之间的重组。将待重组序列，即重组底物，导入还携带侧翼标记序列的两种载体其中之一，生成重组盒。将这些重组盒导入酵母基因组，位于染色体III上的一个基因座(BUD31-HCM1间隔)，它位于已知在减数分裂中具有重组活性的区域中。使重组盒杂合的二倍体生成孢子，并将孢子涂布到选择具有特定侧翼标记配制的细胞的培养基上，由此能够选择其中发生了涉及重组底物的交换的重组体(图1)。

构建了两种通用重组盒载体，pMXY9和pMXY12，它们分别含有URA3和CAN1以及TRPI和CYH2标记，位于可用于导入重组底物的限制性位点的侧翼(图2)。URA3标记赋予尿嘧啶原养型，而CAN1标记赋予刀豆氨酸敏感性。如果缺乏此标记，细胞将对药物有抗性。TRP1标记赋予色氨酸原养型，而CYH2标记赋予环己酰亚胺敏感性。如果缺乏此标记，细胞将对药物有抗性。两种重组盒每种继而侧翼为能够通过转化感受态细胞将整个插入物靶向BUD31-HCM1基因座的序列(图2)。还构建了作为初始转化宿主的菌株MXY47(表2)。该二倍体是msh2::KanMX突变的杂合子，且在表型上是错配修复系统的野生型。它还是ura3-1、trp1-1、can1-100、和cyh2R标记的纯合子，它们能够用来监测重组盒标记的存在；而且是his3-11、15和leu2-3、112标记的杂合子。用携带重组盒的片段转化MXY47，作为Ura+或Trp+原养型来选择初始转化体(分别是MXY9和MXY12衍生物)，并用能够识别所导入构建物内部或外部序列的引物进行分析性PCR以验证靶向作用。使初始转化体生成孢子，解剖四分体孢子，并通过复制平板来鉴定携带重组盒的野生型或msh2分离体。将合适的单倍体互相交配，以生成重组底物杂合的MSH2/MSH2(野生型)和msh2/msh2二倍体。在生成重组体的第一轮减数分裂重组中，使这些二倍体生成孢子，并将游离孢子涂布到缺乏尿嘧啶但含有刀豆氨酸的培养基上，以选择具有URA3-CYH2侧翼标记配置的重组体(Ura+CanR孢子菌落)；或者涂布到缺乏色氨酸但含有环己酰亚胺的培养基上，以选择TRY1-CAN1配置(Trp+CyhR孢子菌落)。亲代二倍体和未重组单倍体子代不能在这些培养基上生长。测定选择性培养基上孢子菌落出现的频率，将候选重组孢子菌落通过复制平板在检测培养基上进行表型鉴定并采用适合引物对通过PCR进行分子鉴定，选择证实是重组体的样本进行测序。

本策略可以反复进行，因为可以鉴定携带重组插入物的细胞并进行多轮减数分裂重组从而增加多样性。在第二轮中，将Ura+CanR和Trp+CyhR单倍体进行交配，并重复孢子生成和选择过程，只是在用于选择具有URA3-CAN1侧翼标记配置的重组体(Ura+CyhR孢子菌落)的缺乏尿嘧啶但含有环己酰亚胺的培养基上或者在用于选择TRY1-CYH2配置(Trp+CanR孢子菌落)的缺乏色氨酸但含有刀豆氨酸的培养基上选择新的重组体。还可以修改本文详述的策略，从而包括更多的标记以增加选择的严谨性。此外，还可以通过用侧翼序列特异性引物进行的PCR直接选择重组体。

2.2对具有不同序列差异性的Oxa基因对之间的重组进行的表型选择

选择属于β-内酰胺酶Oxa超家族的基因做为底物来测试系统选择重组体的可行性。在野生型和msh2背景中评价了下列Oxa对之间的重组：Oxa11-Oxa11，它们在800bp的开放读框内享有100％同源性；Oxa7-Oxa11，95％；Oxa5-Oxa11，78％。诱导通过适合单倍体之间杂交生成的二倍体进入减数分裂。由减数分裂培养物制备孢子，将系列稀释液涂布到YPD上以测定细胞活力，并涂布到缺乏尿嘧啶但含有刀豆氨酸的培养基(-Ura+Can)上及缺乏色氨酸但含有环己酰亚胺的培养基(-Trp+Cyh)上以选择重组体。

2.3具有不同序列同源性的Oxa基因之间的重组频率

图3所示数据表明，在野生型背景中，序列异源性增加对交换重组具有强烈抑制效果，而且这种效应通过msh2突变受到减轻但未消除。一般来说，在所检测的两个差异性水平，msh2突变使重组频率相对于野生型菌株的观测结果升高了约一个数量级。然而，单独灭活MSH2不能完全补偿对具有较高程度异源性的重组底物之间重组的抑制作用。例如，含享有78％同源性的Oxa插入物的msh2菌株(MXY102)的重组频率比含具有100％同源性的Oxa插入物的野生型菌株(MXY60)的重组频率要低至少10倍(Ura+CanR)和25倍(Trp+CyhR)，这说明除了MSH2依赖性错配修复外，还有其它因素妨碍更高差异性序列之间的交换重组。值得注意的是，在78％差异性水平上，msh2重组体出现的频率仍有大约2×10^-4，说明在差异甚至更大的底物之间也可以发生重组。

2.4msh2超重组效应

msh2对同源和部分同源重组的影响可通过以下方法量化：首先计算每次实验中指定选择的指定同源性百分比的msh2与野生型重组体的比率，然后计算由此测定的比率全体的平均值和标准偏差。结果见图4。msh2突变的存在使同源性为95％和78％的序列的部分同源重组频率提高，而100％同一的序列之间的重组有较不显著但仍可定量的增加。此外，msh2增加部分同源重组的程度对两种选择有所不同：对于含有部分同源Oxa插入物的菌株，MSH2的失活提高Trp+CyhR重组体频率的程度远远高于它提高Ura+CanR重组体频率的程度。原则上，两种类型的重组体(Ura+CanR和Trp+CyhR)的频率应当相等，但这些数据显示，系统中存在由msh2突变结合序列差异性程度的变化引起的或增强的偏倚。用于测试插入物和侧翼标记序列对所获得重组体类型的相对影响的实验指出，这种偏倚是侧翼标记的特性，但是尚不能说明重组底物在指导减数分裂重组事件结果中的影响(数据未显示)。

2.5选定重组体的PCR分析

图5显示了对Ura+CanR和Trp+CyhR孢子菌落进行PCR分析的实例，所述孢子来自含具有22％差异性的Qxa基因的野生型和msh2二倍体(分别是MXY99和MXY102)。对于每种菌株，对10个表现出每种重组体表型的孢子菌落进行分析。以每个菌落的提取物作为扩增模板，使用特异性扩增亲本分子的引物对和特异性扩增重组分子的引物对。在每种情况中，只有预期的重组插入物得到了扩增，说明选定的孢子菌落含有通过亲代Oxa重组底物之间重组生成的序列。这些结果还说明重组分子可以由孢子生成培养物直接回收，甚至不需要进行遗传选择步骤。这里，位于UPA3、CAN1、TRP1、和CYH2基因中的引物识别位点代表位于每种重组底物侧翼的分子标记序列。

2.6第一轮减数分裂部分同源重组体的序列分析：差异度为5％和22％

对衍生自野生型和msh2二倍体(分别为MXY64和MXY66)的、含有共享95％同源性的重组底物且满足表型和分子(PCR)检验要求的Oxa7-Oxa11减数分裂重组体进行序列分析。用对侧翼标记特异的引物扩增重组片段，并用接近翻译起始和终止位点的引物进行测序。总共分析了55个衍生自Oxa7-Oxa11二倍体的单倍体后代：来自MXY64的14个Ura+CanR和13个Trp+CyhR重组体，及来自MXY66的14个Ura+CanR和14个Trp+CyhR重组体。在测序样品长度中观察到一些现象：1)对于野生型和msh2重组体二者，交换发生的位置遍及整个编码区，对特定区间没有明显偏爱。5′区发生的交换与3′区发生的交换同样可能。同时，对于指定菌株，通过-Ura+Can或经-Trp+Cyh选择得到的孢子菌落的交换位点的分布没有明显区别。2)交换区间中不中断的同源性的长度也不重要：在两个距离很近的多态性之间(MXY66 Trp+CyhR#7、#8、和#13的位点543-552，其中位点1指ATG翻译起始位点的腺苷残基)和两个间隔最远的多态性之间(例如MXY66 Trp+CyhR#15的位点163-265)都检测到交换。3)由野生型和msh2背景分离得到的重组Oxa插入物含有全长重组序列，有可能能够编码新的功能性Oxa蛋白质。也就是说，所有交换都以这种一种方式发生，即保留了完整的开放读码框，在交换区间中或在任何其它区间中没有净余的核苷酸插入或删除。4)尽管多数重组序列的结构与局部同源区中两个Oxa序列之间的简单交换一致，然而由msh2背景分离得到的一些重组体展示更大复杂性。衍生自四个重组体(MXY66 Ura+CanR#16和#31及MXY66Trp+CyhR#5和#9)的序列展示更高镶嵌程度，好象它们是由一次以上的交换事件产生的。实际上，对这其中两个重组体的分析是复杂的，因为对电泳图谱的检查揭示了在测序区域内的多个位点存在两个重叠峰，每个位点都对应于Oxa7-Oxa11多态性。这个观察结果说明测序的分子群是异质的，对此最可能的解释是msh2重组孢子中存在未修复或部分修复的异质双链DNA。这种解释与已知的msh2突变引起减数分裂后分离(PMS)频率升高是一致的。这MXY66 Ura+CanR#16和#31这两种情况中，一个或多个已修复位点侧翼为未修复的异质双链区段，这与、Gluck和Fabre(EMBOJ.19：3408)所揭示的msh2背景中小段错配修复活性是一致的。同时观察到msh2重组序列中与小段错配修复无关的PMS的一些其它例子，说明这种候选错配修复系统在矫正异质双链DNA中的错配时可能并不非高度有效。根据测序电泳图谱得出，未矫正的异质双链DNA的范围变化很大，从约50个碱基的小范围到几乎覆盖整个ORF的范围。在野生型重组序列中，尚未发现存在PMS或小段错配修复的证据。总之，这些发现提示在msh2减数分裂中产生的差异程度大于野生型减数分裂。

同样由含有共享78％同源性的重组底物的野生型和msh2二倍体(分别为MXY99和MXY102)衍生减数分裂重组体。总共分析了衍生自Oxa5-Oxa11二倍体的重组后代的24个重组序列：来自MXY99的5个Ura+CanR和3个Trp+CyhR重组体，及来自MXY102的9个Ura+CanR和7个Trp+CyhR重组体。通过对这些序列进行检查，提示以下几点趋势：1)在通过-Trp+cyhR选择从野生型和msh2两种菌株中得到的重组Oxa序列在整个ORF内不同位置展示交换，在整个共享同源性内可能轻微趋向于中间250bp区域(第333-573位核苷酸)。相反，在通过-Ura+CanR选择从野生型和msh2两种菌株中得到的重组体在交换位置上表现出显著的偏好：在5个野生型中的3个和9个msh2序列中的8个序列中，交换发生在共享同源性的区域的最后80个碱基内，即ORF的后10％。2)对于-Trp+Cyh选择，绝对同源性区间中的交换范围经鉴定为11至20个核苷酸，指示对具有序列同一性的这些较大区域的偏爱。相反，对于-Ura+Can选择，交换区间较短，范围为3至17个核苷酸(14个所涉及区间中的13个为13个核苷酸或更短)。3)对于所牵涉序列共享95％同源性的重组，得到的新序列同样由完整的ORF组成，且可能编码新的Oxa蛋白质。4)根据对电泳图谱的检查得出，在野生型重组体中未发现PMS的情况，但在一些msh2重组体中发现非常短的未修复异质双链，包括7个Trp+CyhR重组体中的3个。这些区域最多包括67个核苷酸，小于在Oxa7-Oxa11重组体中观察到的一些区域。总之，这些观察结果指实，能够由差异至少22％的重组底物选择得到的重组序列，且这些序列编码新的蛋白质。

2.7Oxa7-Oxa11第二轮重组体的序列分析

为了测试酵母系统以反复方式增加序列多样性的能力，用第一轮减数分裂得到的Oxa7-Oxa11重组单倍体细胞构建了二倍体，并将这些新的二倍体进行第二轮减数分裂。在MXY64和MXY66的经过测序的Ura+CanR和Trp+CyhR后代中，选择在相同区间发生交换的适当重组体对，构建新的二倍体，其中总的序列同源性水平又为95％。构建了3种野生型(MXY81、MXY82和MXY83)和3种msh2(MXY86、MXY87和MXY88)二倍体。同样由MXY60和MXY62的适当重组后代构建仅含Oxa11序列插入物的对照野生型和msh2二倍体，产生MXY90和MXY92。使这些二倍体生成孢子，并将孢子涂布到缺乏尿嘧啶但含有环己酰亚胺的培养基(-Ura+Cyh)或者缺乏色氨酸但含有刀豆氨酸的培养基(-Trp+Can)上，以选择第二轮重组体。如图6所示，在所有这些菌株中观察到的-Ura+CyhR和-Trp+CanR孢子菌落的频率与MSH2基因的抗重组作用是一致的。两种类型的菌落在野生型纯合子MXY90的后代中的发现频率大于10^-5，而在具有Oxa插入物异源性的野生型二倍体的后代(MXY81、MXY82和MXY83)中降低了5-10倍。具有不同Oxa插入物的MSH2基因的失活(MXY86、MXY87和MXY88)使Ura+CyhR和Trp+CanR孢子菌落的频率提高了2-6倍，与携带相同Oxa插入物的msh2二倍体(MXY92)水平相似。虽然所使用的培养基与第一轮重组体选择时所使用的不同，但是野生型和msh2第二轮重组体的选择频率与第一轮重组体的相当。

选择野生型(MXY81和MXY83)和msh2(MXY86)两种背景中的Ura+CyhR和Trp+CanR孢子菌落进行测序。共测了14个野生型和7个msh2的Oxa插入物。在多数情况中，交换在第二轮重组中发生在新的区间，就位置和区间大小而言同样没有明显偏好：在整个Oxa ORF中发现了涉及不同区间的交换，范围大到101个核苷酸，小到5个核苷酸。在一种情况(MXY83Trp+CyhR单倍体)中，第二轮交换发生在第一轮交换区间中，由此恢复了完整的Oxa11序列。由msh2二倍体回收得到的重组体比由野生菌株回收得到的重组体具有更大多样性。对于msh2二倍体MXY86，观察到一些孢子菌落表现出广泛的PMS和序列镶嵌现象，这与重组中间物中形成大段杂质双链体是一致的。而且，异质双链区段中的一些错配得到了修复，再次与小段错配修复活性是一致的。总之，在质量上，即在产生序列多样性方面(例如交换区间的分布和PMS的发生率，及在数量上，即在提高总体部分同源(5％差异性)重组频率方面，msh2背景中的第二轮重组都与第一轮重组同样有效。

Claims (37)

1.用于在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生成和检测重组DNA序列的方法，包括以下步骤：

a)  生成第一二倍体酿酒酵母细胞，其基因组在特定基因座中携带包含第一待重组DNA序列的第一重组盒，该序列处于至少第一和第二标记序列之间，并且在等位基因处携带包含第二待重组DNA序列的第二重组盒，该序列处于至少第三和第四标记序列之间，其中所述第一和第二待重组DNA序列共享包含大于50个核苷酸的同源区，且其中所述第一和第三标志序列同时分别处于所述第一和第二待重组DNA序列的上游，或者所述第一和第三标志序列同时分别处于所述第一和第二待重组DNA序列的下游；

b)  诱导a)中得到的第一二倍体细胞生成孢子，并

c)  分离含有其中第一重组DNA序列处于至少第一和第四标记序列之间的重组盒的单倍体细胞，及含有其中第二重组DNA序列处于至少第二和第三标记序列之间的重组盒的单倍体细胞。

2.依照权利要求1的方法，还包括以下步骤：

a)  通过将1c)中得到的含有第一重组DNA序列的单倍体细胞与1c)中得到的含有第二重组DNA序列的单倍体细胞进行交配，从而生成第二二倍体细胞，

b)  诱导a)中得到的第二二倍体细胞生成孢子，并

c)  分离含有其中第三重组DNA序列处于至少第一和第二标记序列之间的重组盒的单倍体细胞，并且分离含有其中第四重组DNA序列处于至少第三和第四标记序列之间的第四重组盒的单倍体细胞。

3.依照权利要求2的方法，其中通过将2c)中得到的单倍体细胞与其它单倍体细胞进行至少一轮新的交配，诱导所得到的二倍体细胞生成孢子，并根据两种标记序列间的分子连锁分离含有重组DNA序列的单倍体细胞，从而得到另一重组DNA序列。

4.依照权利要求1的方法，其中通过用含有第一重组盒的DNA分子和含有第二重组盒的DNA分子同时或相继转化二倍体酿酒酵母细胞，并任选使两种重组盒整合到酿酒酵母基因组的等位基因中，从而生成第一二倍体细胞。

5.依照权利要求4的方法，其中含有第一或第二重组盒的DNA分子是酵母人工染色体(YAC)。

6.依照权利要求4的方法，其中含有第一或第二重组盒的DNA分子是克隆载体，由此使各自两种标记序列由与酿酒酵母基因组特定基因座同源的靶向序列所围绕。

7.依照权利要求1的方法，其中通过将其基因组在某基因座中携带第一重组盒的单倍体酿酒酵母细胞与在等位基因处携带第二重组盒的单倍体酿酒酵母细胞进行融合，从而产生第一二倍体细胞。

8.依照权利要求1的方法，其中通过将其基因组在某基因座中携带第一重组盒的单倍体酿酒酵母细胞与在等位基因处携带第二重组盒的单倍体酿酒酵母细胞进行交配，从而产生第一二倍体细胞。

9.依照权利要求7的方法，其中携带第一或第二重组盒的单倍体细胞通过以下步骤生成：

a)  将第一待重组DNA序列插入第一克隆载体上相邻的第一与第二标记序列之间，并将第二待重组DNA序列插入第二克隆载体上相邻的第三与第四标记序列之间，由此使各自两种标记序列由与酿酒酵母基因组特定基因座同源的靶向序列所围绕，

b)  由a)中得到的克隆载体中分别切下携带第一重组盒和第二重组盒的片段，由此每个重组盒包含位于各自两种标记序列之间的待重组DNA序列，且每种盒继而被靶向序列所围绕，

c)  将b)中得到的携带侧翼为靶向序列的重组盒的片段分别转化到二倍体酿酒酵母细胞中，由此靶向序列引导所述盒整合到与其同源的基因座中，以获得第一盒或第二盒的杂合二倍体细胞，

d)  分别诱导c)中得到的杂合二倍体细胞生成孢子，并

e)  分别分离含第一盒并表达第一和第二标记序列的单倍体细胞及含第二盒并表达第三和第四标记序列的单倍体细胞。

10.依照权利要求9的方法，其中第一克隆载体是质粒pMXY9且第二克隆载体是质粒pMXY12。

11.依照权利要求4-6、9或10任一项的方法，其中用于转化的二倍体酿酒酵母细胞是至少两种营养素的营养缺陷型。

12.依照权利要求11的方法，其中二倍体细胞是ura3-1等位基因和trp1-1等位基因的纯合子，这分别使它们成为尿嘧啶和色氨酸的营养缺陷型。

13.依照权利要求4-6、9、10或12任一项的方法，其中用于转化的二倍体细胞对至少两种抗生素有抗性。

14.依照权利要求13的方法，其中二倍体细胞是can1-1OO等位基因和cyh2R等位基因的纯合子，这分别使它们对刀豆氨酸和环己酰亚胺有抗性。

15.依照权利要求4-6、9、10或12任一项的方法，其中转化使用酿酒酵母菌株MXY47的二倍体细胞，它们是等位基因ura3-1、trp1-1、can1-100和cyh2R的纯合子且是msh2::KanMX突变的杂合子。

16.依照权利要求1-9任一项的方法，其中酿酒酵母细胞具有功能性错配修复系统。

17.依照权利要求1-9任一项的方法，其中酿酒酵母细胞的错配修复系统存在暂时的或永久的缺陷。

18.依照权利要求17的方法，其中错配修复系统暂时的或永久的缺陷是由下述原因引起的：参与错配修复系统的一种或多种基因存在突变和/或可诱导表达或遏制，用饱和错配修复系统的试剂处理，和/或用全面损坏错配修复的试剂处理。

19.依照权利要求1-9任一项的方法，其中第一和第二重组盒整合到酿酒酵母基因组染色体III上的BUD31-HCM1基因座中。

20.依照权利要求1-9任一项的方法，其中第一和第二待重组DNA序列有至少一个核苷酸不同。

21.依照权利要求1-9任一项的方法，其中第一和第二待重组DNA序列衍生自酿酒酵母以外的生物体且包括酿酒酵母。

22.依照权利要求1-9任一项的方法，其中第一和第二待重组DNA序列包含一种或多种非编码序列和/或一种或多种蛋白质编码序列。

23.依照权利要求1-9任一项的方法，其中标记序列选自营养标记、色素标记、抗生素抗性标记、抗生素敏感性标记、引物识别位点、内含子/外显子边界、编码酶特定亚基的序列、启动子序列、下游受调节基因序列和限制酶位点。

24.依照权利要求23的方法，其中第一和第三标记序列是营养标记，其基因产物可补偿酿酒酵母细胞的营养缺陷。

25.依照权利要求24的方法，其中第一标记序列是URA3，其基因产物可赋予尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母细胞以尿嘧啶原养型。

26.依照权利要求24的方法，其中第三标记序列是TRP1，其基因产物可赋予色氨酸营养缺陷型酿酒酵母细胞以色氨酸原养型。

27.依照权利要求23的方法，其中第二和第四标记序列是抗生素敏感性标记，其基因产物可赋予对抗生素有抗性的酿酒酵母细胞以对该抗生素的敏感性。

28.依照权利要求27的方法，其中第二标记序列是CAN1，其基因产物可赋予刀豆氨酸抗性酿酒酵母细胞以对刀豆氨酸的敏感性。

29.依照权利要求27的方法，其中第四标记序列是CYH2，其基因产物可赋予环己酰亚胺抗性酿酒酵母细胞以对环己酰亚胺的敏感性。

30.依照权利要求1-9和24-29任一项的方法，其中通过PCR方法检测各自标记组合的存在，从而鉴定含有携带第一、第二、第三或第四重组DNA序列的重组盒的单倍体细胞。

31.依照权利要求1-9和24-29任一项的方法，其中通过将单倍体细胞涂布在选择相同DNA分子上各自标记组合的分子连锁的培养基上，从而鉴定含有携带第一、第二、第三或第四重组DNA序列的重组盒的单倍体细胞。

32.依照权利要求31的方法，其中将含第一重组DNA序列的单倍体细胞涂布在选择相同DNA分子上第一与第四标记序列的分子连锁的培养基上。

33.依照权利要求31的方法，其中将含第二重组DNA序列的单倍体细胞涂布在选择相同DNA分子上第二与第三标记序列的分子连锁的培养基上。

34.依照权利要求31的方法，其中将含第三重组DNA序列的单倍体细胞涂布在选择相同DNA分子上第一与第二标记序列的分子连锁的培养基上。

35.依照权利要求3 1的方法，其中将含第四重组DNA序列的单倍体细胞涂布在选择相同DNA分子上第三与第四标记序列的分子连锁的培养基上。

36.一种试剂盒，至少包含装有作为DSM 17026保藏的酿酒酵母菌株MXY47的细胞的第一容器，装有作为DSM 17010保藏的含有质粒pMXY9的大肠杆菌菌株JM101的细胞的第二容器，和装有作为DSM 17011保藏的含有质粒pMXY12的大肠杆菌菌株DH5α的细胞的第三容器。

37.一种试剂盒，至少包含装有作为DSM 17026保藏的酿酒酵母菌株MXY47的细胞的第一容器，装有作为DSM 17010保藏的质粒pMXY9的DNA的第二容器，和装有作为DSM 17011保藏的质粒pMXY12的DNA的第三容器。

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