MXPA06008670A

MXPA06008670A - Generacion de genes recombinantes en saccharomyces cerevisiae.

Info

Publication number: MXPA06008670A
Application number: MXPA06008670A
Authority: MX
Inventors: Kathleen Smith; Rhona Borts
Original assignee: Mixis France Sa
Priority date: 2004-01-30
Filing date: 2005-01-28
Publication date: 2007-04-17
Also published as: WO2005075654A1; US20090017451A1; EA009443B1; EP1709182B1; CN1938426B; EA200601398A1; JP4874124B2; CA2554885A1; EP1709182A1; NZ548444A; KR20070004652A; ATE486132T1; ES2353700T3; AU2011202192A1; CN1938426A; ZA200605753B; JP2007519411A; AU2005211487A1; DE602005024360D1

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en Saccharomyces cerevisiae, y plasmidos y celulas de Saccharomyces cerevisiae usados para realizar los metodos de la invencion.

Description

GENERACIÓN DE GENES RECOMB1NANTES EN SACCHAROMYCES CEREVISIAE MEMORIA DESCRIPTIVA En general, la presente invención se refiere a métodos para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en Saccharomyces cerevisiae, y plásmidos y células de S. cerevisiae usadas para realizar los métodos de la invención. Las secuencias de ADN para las cuales estos métodos son relevantes incluyen secuencias codificadoras de proteína y secuencias no codificadoras; también pueden consistir de tramos continuos más grandes que contienen más de una sola secuencia codificadora con secuencias intermedias no codificadoras, como las que pueden pertenecer a una ruta biosintética. La producción microbiana y enzimática de sustancias tales como enzimas y otras proteínas es un tópico económico importante. Las enzimas son proteínas biocatalíticamente activas responsables no sólo del metabolismo de compuestos naturales y organismos, sino que también se utilizan para la producción industrial de compuestos naturales y no naturales. Las enzimas o los compuestos producidos con la ayuda de las enzimas se pueden usar para la producción de fármacos, cosméticos, alimentos, etc. Sin embargo, el uso industrial de las enzimas ha sido obstaculizado en gran medida por su especificidad de objetivo y por las condiciones específicas bajo las cuales pueden funcionar. Otras proteínas tienen aplicaciones terapéuticas en los campos de la salud humana y animal. Las clases importantes de proteínas médicamente importantes incluyen citocinas y factores de crecimiento. Se pueden obtener proteínas, enzimas y rutas con funciones y propiedades novedosas y mejoradas, buscando entre las especies naturales principalmente desconocidas, o mejorando las proteínas o enzimas naturales actualmente conocidas. Este último enfoque puede ser más adecuado para crear las propiedades que los procesos evolutivos naturales probablemente no han seleccionado. Una estrategia prometedora para crear tales propiedades novedosas deseables y para rediseñar enzimas, otras proteínas, secuencias no codificadoras o rutas, es mediante la evolución molecular dirigida. Convencionalmente se ha logrado la evolución directa de las secuencias de ADN con técnicas tales como mutagénesis dirigida a sitio, mutagénesis de sitios múltiples o mutagénesis de cassette, mutagénesis aleatoria, y PCR susceptible de error. Recientemente ha llamado mucho la atención los enfoques de entremezclado de genes para optimizar o ajustar finamente las propiedades de las enzimas o proteínas. Estas técnicas evolutivas dirigidas pueden producir enzimas que pueden mejorar la tecnología existente, producir productos novedosos y expandir la capacidad de la química sintética. Existen varios métodos diferentes de mutagénesis, tales como mutagénesis aleatoria, mutagénesis dirigida a sitio, mutagénesis de cassette de oligonucleótido, o mutagénesis de punto mediante PCR susceptible de error. Por ejemplo, la mutagénesis aleatoria abarca la generación de un gran número de mutaciones de sustitución de nucleótido distribuidas aleatoriamente en fragmentos de ADN clonados, por tratamiento con agentes químicos tales como ácido nitroso, hidrazina, etc. La PCR susceptible de error ha sido desarrollada para introducir mutaciones de punto aleatorias en genes clonados. Las modificaciones que reducen la fidelidad de la reacción de PCR incluyen el aumento de la concentración de MgCI2, la adición de MnCI2, o la alteración de las concentraciones relativas de los cuatro dNTPs. Estos métodos tradicionales de mutagénesis se enfocan a la optimización de genes individuales que tienen fenotipos separados y seleccionables. La estrategia general es clonar un gen, identificar una función separada para el gen, establecer una prueba mediante la cual se le puede monitorear, mutar posiciones seleccionadas en el gen, y seleccionar las variantes del gen para el mejoramiento de la función conocida del gen. Entonces una variante que tiene una función mejorada se puede expresar en un tipo de célula deseado. Se pueden efectuar ciclos repetitivos de los métodos de mutagénesis para obtener propiedades deseables de la enzima. Cada uno de estos enfoques convencionales tiene una estrategia implícita de búsqueda de secuencia. Las estrategias empleadas en las técnicas anteriores de búsqueda de secuencia son muy diferentes. Realizar una búsqueda de mutagénesis dirigida a sitio saturante incluye un proceso de instalación de cada permutación posible en un sitio de interés. Para una proteína, este procedimiento consiste en reemplazar un aminoácido en un sitio de interés con los otros 19 aminoácidos y buscar en la colección resultante los mutantes mejorados. En términos de espacio de secuencia, esto significa que se ha examinado completamente una región muy pequeña. En comparación, la mutagénesis de cassette inserta una secuencia de péptido aleatoria en una región específica de una proteína, dando un muestreo menos completo de una región definida más grande de espacio de secuencia. La PCR susceptible de error implica el copiado repetido de una secuencia, con la introducción de un número pequeño pero significativo de errores. En este caso, se obtiene un muestreo disperso de una región menos definida de espacio de secuencia. En cada una de estas estrategias, el mejor mutante obtenido en cada ronda de selección se usa para iniciar la siguiente ronda. Sin embargo, los enfoques de mutagénesis tradicionales para desarrollar nuevas propiedades en las enzimas tienen varias limitaciones. En primer lugar, solamente son aplicables a genes o secuencias que han sido clonados y caracterizados funcionalmente. En segundo lugar, usualmente estos enfoques solo son aplicables a genes que tienen una función separada. Por lo tanto, usualmente los genes múltiples que confieren cooperativamente un solo fenotipo, no pueden ser optimizados de esta manera. Finalmente, estos enfoques pueden explorar solamente un número muy limitado del número total de permutaciones, incluso para un solo gen. En vista de estas limitaciones, los enfoques de mutagénesis convencionales son inadecuados para mejorar los genomas celulares con respecto a muchas propiedades útiles. Por ejemplo, el mejoramiento de la capacidad de una célula para expresar una proteína podría requerir alteraciones de la eficiencia de transcripción, modificaciones de traducción y posteriores a la traducción, secreción o degradación proteolítica de un producto de gen. Por lo tanto, sería necesario modificar los genes adicionales que tienen una función en uno o más de estos mecanismos celulares para expresar una proteína con propiedades nuevas. Tratar de optimizar individualmente todos los genes que tienen dicha función sería una tarea virtualmente imposible. La mayoría de los problemas asociados con los enfoques de mutagénesis convencionales pueden ser superados por los enfoques de entremezclado de genes. El entremezclado de genes abarca recombinar aleatoriamente diferentes secuencias de genes funcionales, permitiendo el mezclado molecular de genes naturalmente similares o mutados aleatoriamente. El entremezclado de ADN o gen, o variaciones de estas técnicas, se ha usado para mejorar la actividad, estabilidad, pliegue y propiedades de reconocimiento de substrato de las enzimas. En comparación con los enfoques de mutagénesis convencionales, el entremezclado de genes ofrece una probabilidad significativamente superior de obtener mutantes con genotipo mejorado. El entremezclado de genes es fundamentalmente diferente de las estrategias convencionales, ya que recombina mutaciones favorables de una manera combinatoria. Por lo tanto, buscará regiones mucho más grandes de espacio de secuencia, mucho más esparcidamente, y con una tendencia a producir secuencias funcionales. También permite que más mutaciones benéficas de cada ronda de selección sean retenidas en la siguiente ronda, puesto que permite a más de una fuente contribuir a la información de secuencia. Mientras las estrategias convencionales también permiten la fijación de mutaciones negativas, éste no es el caso de los enfoques de entremezclado de genes. Por lo tanto, no es sorprendente que las estrategias de entremezclado de genes han producido resultados mucho más notables. Los enfoques de entremezclado de ADN o genes se basan en eventos de recombinación entre regiones con una cierta homología o entre tramos de identidad. Un organismo clave usado en los experimentos para examinar la recombinación genética en eucariontes ha sido la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. El estudio de estos procesos en un organismo unicelular simple tiene la ventaja obvia de la facilidad de manipulación de las secuencias de ADN, y la posibilidad de estudiar eventos de recombinación específicos inducidos de manera sincrónica en una gran proporción de células. Además, durante las últimas décadas se ha acumulado una gran cantidad de experiencia tanto en la tecnología de fermentación como en la genética básica de este organismo, que es en la actualidad el eucarionte mejor estudiado a nivel molecular. Debido a su carácter no patógeno, su proeficiencia de secreción y su potencial de glicosilación, S. cerevisiae es un organismo hospedero preferido para la clonación de genes y su expresión. Por lo tanto, el problema técnico fundamental de la presente invención es proveer métodos y medios para la generación de genes de mosaico recombinantes en Saccharomyces cerevisiae. La presente invención resuelve este problema técnico fundamental suministrando un proceso para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en Saccharomyces cerevisiae, que comprende los pasos de: (a) generar primeras células diploides de S. cerevisiae que llevan en un locus definido de su genoma un primer cassette de recombinación, que comprende una primera secuencia de ADN por recombinar, que está flanqueada por lo menos por una primera y una segunda secuencia marcadora, y en una posición alélica un segundo cassette de recombinación que comprende una segunda secuencia de ADN por recombinar, que está flanqueada por lo menos por una tercera y una cuarta secuencia marcadora, (b) inducir la esporulación de las primeras células diploides obtenidas en (a), y (c) aislar las células haploides que contienen los cassettes de recombinación en los que las primeras secuencias de ADN recombinado están flanqueadas por la primera y la cuarta secuencia marcadora, y las células haploides que contienen los cassettes de recombinación en los que las segundas secuencias de ADN recombinado están flanqueadas por la segunda y la tercera secuencia marcadora. La presente invención provee un sistema basado en levadura para examinar eventos de recombinación entre por lo menos dos secuencias de ADN divergentes. El sistema se basa en el ciclo reproductivo sexual de S. cerevisiae, que alterna entre una fase haploide y una fase diploide. En el primer paso del proceso de la invención, se generan células diploides de S. cerevisiae, que son heterocigóticas para estos substratos de recombinación. Las secuencias de ADN por recombinar se integran en el genoma de las células diploides de S. cerevisiae en posiciones alélicas. Cada secuencia de ADN por recombinar es integrada en forma de un cásete de recombinación, que comprende, además de esta secuencia de ADN, por lo menos dos secuencias marcadoras que flanquean la secuencia de ADN, con lo cual los dos cassettes de recombinación comprenden por lo menos cuatro secuencias marcadoras diferentes. Las células diploides heterocigóticas así obtenidas se desarrollan entonces bajo condiciones que inducen el proceso de meiosis y la formación de esporas. En general, la meiosis se caracteriza por frecuencias elevadas de recombinación genética, que es iniciada mediante la formación y reparación subsiguiente de los productos de fractura de doble cadena (DSBs) inducidos tempranamente en la profase I de la meiosis. Por lo tanto, las células meióticas de levadura son de particular interés porque experimentan un alto grado de recombinación como resultado de la inducción de DSBs de todo el genoma. De esta manera, los productos de una primera ronda de meiosis, que son células haploides o esporas para cada evento de meiosis, cuatro producidas por una célula diploide original, pueden contener secuencias de ADN recombinado debido a la recombinación entre las dos secuencias de ADN divergentes. La recombinación entre las dos secuencias de ADN divergentes durante la meiosis también puede ocasionar un intercambio de las secuencias marcadoras de flanqueo. Por lo tanto, el presente proceso permite una identificación rápida y simple de las secuencias de ADN recombinado, mediante la selección de células o moléculas individuales en las que ha ocurrido un intercambio de las secuencias marcadoras que flanquean un substrato de recombinación. Los recombinantes obtenidos después de la primera ronda de meiosis, por lo tanto, se caracterizan porque contienen o expresan por lo menos una secuencia marcadora del primer cassette de recombinación, y por lo menos una secuencia marcadora del segundo cassette de recombinación. En particular, las esporas recombinantes pueden contener la primera secuencia marcadora del primer cassette de recombinación y la cuarta secuencia marcadora del segundo cassette de recombinación, o la segunda secuencia marcadora del primer cassette de recombinación y la tercera secuencia marcadora del segundo cassette de recombinación, con lo cual ambos tipos de esporas recombinantes contienen, además de esta combinación marcadora diferente, las secuencias ADN recombinante diferentes. Los dos tipos de esporas que contienen las secuencias recombinantes se pueden seleccionar y distinguir fácilmente bajo condiciones que permiten la selección de las nuevas configuraciones marcadoras recombinantes producidas por la recombinación durante la meiosis.

El proceso de la invención se puede realizar en células de S. cerevisiae de tipo silvestre o defectuosas en la reparación de errores de apareamiento (discordancias). Los procesos mediante los cuales el ADN dañado es reparado, y los mecanismos de recombinación genética, están relacionados íntimamente, y se sabe que la maquinaria de reparación de discordancias tiene efectos inhibidores sobre la frecuencia de recombinación entre secuencias divergentes, esto es, la recombinación homologa. Las mutaciones del sistema de reparación de discordancias, por lo tanto, aumentan en gran medida la frecuencia general de los eventos de recombinación en la levadura. Por otra parte, se sabe que las células de S. cerevisiae de tipo silvestre tienen un mecanismo de recombinación dependiente de la reparación de discordancias, que se basa en las discordancias espaciadas distantemente en dos substratos de recombinación. Dependiendo de las secuencias del ADN por recombinar, para obtener secuencias recombinadas se pueden usar células de S. cerevisiae de tipo silvestre o defectuosas en la reparación de discordancias. El proceso de la invención tiene la ventaja de que es iterativo, es decir, permite rondas adicionales de recombinación. Los productos de la primera ronda de meiosis, esto es, las células haploides de tipos de acoplamiento opuestos que comprenden diferentes secuencias de ADN recombinado, se acoplan nuevamente para obtener células diploides que son heterocigóticas para las secuencias del ADN recombinado. En las células diploides así obtenidas se induce nuevamente la meiosis, con lo cual las secuencias del ADN recombinado se recombinan una vez más, conduciendo nuevamente a un intercambio de los dos marcadores que flanquean cada substrato de recombinación. Los recombinantes haploides nuevos, obtenidos después de la segunda meiosis, se pueden identificar ahora fácilmente por la expresión conjunta de los genes marcadores que flanqueaban la primera secuencia de ADN en el primer cassette de recombinación original, o de los genes marcadores que flanqueaban la segunda secuencia de ADN en el segundo cassette de recombinación original. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la invención, las células haploides que contienen un cassette de recombinación con las primeras secuencias de ADN recombinado, obtenidas en la primera ronda del proceso de la invención, se acoplan con células haploides que contienen cassettes de recombinacíón con las segundas secuencias de ADN recombinado, obtenidas en la primera ronda del proceso de la invención, para generar segundas células diploides. En las segundas células diploides así obtenidas se induce esporulación, dando como resultado la generación de células haploides. En el siguiente paso se aislan las células haploides que contienen los casetes de recombinación en los que terceras secuencias de ADN recombinado están flanqueadas por lo menos por la primera y segunda secuencia marcadora, y células haploides que contienen los cassettes de recombinación en los que las cuartas secuencias de ADN recombinado están flanqueadas por lo menos por la tercera y cuarta secuencia marcadora. Se pueden generar secuencias de ADN recombinado adicionales sometiendo las células haploides que contienen la tercera y cuarta secuencia de ADN recombinado a uno o más ciclos adicionales de acoplamiento y meiosis/esporulación. Después de cada ronda de recombínación, los recombinantes se identifican por la presencia conjunta de por lo menos una secuencia marcadora que flanqueaba el primer substrato de recombinación, y por lo menos una secuencia marcadora que flanqueaba el segundo substrato de recombinación, o mediante la presencia conjunta de los dos marcadores que flanqueaban la primera o la segunda secuencia de ADN en los substratos de recombinación iniciales. Por lo tanto, una característica ventajosa del presente proceso es que es iterativo: la progenie haploide recombinante se selecciona individualmente o en masa y se acopla una con otra; los diploides resultantes se esporulan de nuevo y sus esporas de progenie se someten a condiciones de selección apropiadas para identificar nuevos eventos de recombinación. Con el proceso de la invención se puede generar fácilmente una gran colección de secuencias recombinadas mutadas, y entonces se pueden identificar variantes que han adquirido una función deseada usando un sistema apropiado de selección o examen. En una modalidad preferida de la invención, la primera célula diploide de S. cerevisiae se genera transformando simultánea o secuencialmente una célula diploide de S. cerevisiae con una molécula de ADN que comprende el primer cassette de recombinación y una molécula de ADN que comprende el segundo cassette de recombinación, y opcionalmente permitiendo la integración de los dos cassettes de recombinación en posiciones alélicas sobre cromosomas naturales del genoma de S. cerevisiae. Las moléculas de ADN usadas también pueden ser, por ejemplo, cromosomas artificiales de levadura (YAC). Los YAC's se caracterizan porque son moléculas de ADN lineal que contienen todas las secuencias necesarias para el mantenimiento estable en la célula de levadura, tales como un centrómero, origen de duplicación de ADN y telómeros, así como también marcadores seleccionables de levadura. Después de su introducción en una célula de levadura, los YACs se comportan de manera similar a los cromosomas naturales y por lo tanto se pueden considerar como parte del genoma de la levadura. En el contexto de la presente invención, el término "genoma" incluye todos los componentes hereditarios presentes dentro de una célula, que son mantenidos y heredados establemente. En caso de usar YACs como moléculas de ADN para la introducción del primer y segundo cásete de recombinación en células diploides de S. cerevisiae, no es necesario integrar los dos cassettes de recombinación en posiciones alélicas en cromosomas naturales. En caso de introducir casetes de recombinación en cromosomas naturales, es posible usar un vehículo de clonación, por ejemplo un plásmido, del cual se puede liberar un fragmento que lleva los cassettes de recombinación. Preferiblemente, las dos secuencias marcadoras respectivas de los dos cassettes de recombinación están flanqueadas por secuencias de dirección que son homologas a un locus definido del genoma de S. cerevisiae. Alternativamente, se puede usar una molécula de ADN que no contiene un origen de duplicación. En este caso, las moléculas de ADN deben ser capaces de integrarse en un componente del genoma y por lo tanto contener secuencias de dirección homologas a un locus definido del genoma de «S. cerevisiae. En otra modalidad preferida de la invención, las primeras células diploides de S. cerevisiae se generan fusionando células haploides que llevan el primer cassette de recombinación en un locus de su genoma, con células haploides de -S. cerevisiae que llevan el segundo cassette de recombinación en una posición alélica de su genoma. En otra modalidad preferida de la invención, las primeras células diploides de S. cerevisiae se generan acoplando células haploides que llevan el primer cassette de recombinacíón en un locus de su genoma, con células haploides de S. cerevisiae del tipo de acoplamiento opuesto que llevan el segundo cassette de recombinación en una posición alélica de su genoma. En el contexto de la presente invención, los términos "acoplamiento" y "fusión" denotan la combinación intencionada o aleatoria de dos células haploides que contienen diferentes cassettes de recombináción. Un acoplamiento o fusión intencionada de dos células haploides ocurre cuando se ponen en contacto dos células haploides seleccionadas o aisladas, de tipo de acoplamiento opuesto, que tienen las propiedades deseadas, bajo condiciones que estimulan el acoplamiento y la fusión, respectivamente. Las dos células haploides pueden derivar de la misma colección de células, que por ejemplo contienen secuencias de ADN por recombinar o secuencias de ADN ya recombinado, o de diferentes colecciones de células, que contienen por ejemplo secuencias de ADN por recombinar o secuencias de ADN ya recombinado. Un acoplamiento o fusión aleatoria de dos células haploides puede ocurrir cuando se ponen en contacto una pluralidad de células haploides diferentes bajo condiciones que estimulan el acoplamiento y la fusión, respectivamente. La pluralidad de células haploides puede derivar de la misma colección de células, que por ejemplo contienen secuencias de ADN por recombinar o secuencias de ADN ya recombinadas, o de diferentes colecciones de células, que por ejemplo pueden contener secuencias de ADN por recombinar o secuencias de ADN ya recombinado. El proceso de la invención para generar y detectar secuencias de ADN recombinado tiene la ventaja de que se pueden recombinar más de dos secuencias divergentes. Si por ejemplo se deben combinar cuatro secuencias de ADN divergentes, entonces en el primer paso del presente proceso se pueden generar dos series diferentes de células diploides de S. cerevisiae. Por ejemplo, se puede generar una primera serie de células diploides acoplando o fusionando células haploides que comprenden una primera y una segunda secuencia de ADN por recombinar, y se puede generar una segunda serie de células diploides acoplando o fusionando células haploides que comprenden una tercera y una cuarta secuencia de ADN por recombinar. Después de la esporulación de las dos series de células diploides, las células haploides obtenidas de la primer serie de células diploides, que contiene secuencias de ADN recombinado debido a la recombinación entre la primera y la segunda secuencia de ADN, se acoplan con las células haploides apropiadas obtenidas de la segunda serie de células diploides, que contienen secuencias de ADN recombinado debido a la recombinación entre la tercera y la cuarta secuencia de ADN. Los productos de este acoplamiento son células diploides que, después de esporulación, producen células haploides que llevan secuencias de ADN recombinadas que comprenden regiones de la primer secuencia de ADN, la segunda secuencia de ADN, la tercera secuencia de ADN y la cuarta secuencia de ADN. Si, por ejemplo, se deben recombinar tres secuencias de ADN divergentes, en el primer paso del presente proceso se generan células diploides de S. cerevisiae, por ejemplo acoplando o fusionando células haploides que comprenden una primera y una segunda secuencia de ADN por recombinar. Después de la esporulación de estas células diploides, las células haploides así obtenidas, que contienen secuencias de ADN recombinado debido a la recombinación entre la primera y la segunda secuencia de ADN, se pueden fusionar o acoplar con células haploides que comprenden una tercera secuencia de ADN por recombinar. Los productos de este acoplamiento son células diploides que, después de la esporulación, producen células haploides que llevan secuencias de ADN recombinado que comprenden regiones de la primera secuencia de ADN, la segunda secuencia de ADN y la tercera secuencia de ADN. De esta manera, también se pueden recombinar cinco, seis, o más secuencias de ADN divergente.

En una modalidad preferida, se generan células haploides de S. cerevisiae que llevan el primer o segundo cassette de recombinación: (a) insertando la primera secuencia de ADN por recombinar entre la primera y la segunda secuencia marcadora localizada adyacentemente, en un primer vehículo de clonación, e insertando la segunda secuencia de ADN por recombinar entre la tercera y la cuarta secuencia marcadora localizada adyacentemente, en un segundo vehículo de clonación, con lo cual las dos secuencias marcadoras respectivas son flanqueadas por secuencias de dirección que son homologas a un locus definido del genoma de S. cerevisiae, (b) extirpando de los vehículos de clonación obtenidos en (a) el primer cassette de recombinación y el segundo cassette de recombinación con secuencias de dirección flanqueantes, respectivamente, con lo cual cada fragmento extirpado comprende la secuencia de ADN por recombinar, que está flanqueada por las dos secuencias marcadoras respectivas y por secuencias de dirección, (c) transformando separadamente los fragmentos extirpados obtenidos en (b) en células diploides de S. cerevisiae, con lo cual las secuencias de dirección dirigen la integración de los cassettes en el locus con el que son homologas, para obtener células diploides heterocigóticas para el primer cassette, o el segundo cassette, d) induciendo separadamente la esporulación de las células diploides heterocigóticas obtenidas en (c), y e) aislando las células haploides que contienen el primer cásete flanqueado por la primera y segunda secuencia marcadora, y separadamente células haploides que contienen el segundo cassette flanqueado por la tercera y la cuarta secuencia marcadora. En una modalidad preferida de la invención, las dos secuencias marcadoras respectivas en el primer o segundo vehículo de clonación, están flanqueadas por secuencias de dirección que son homologas al locus BUD31- HCM1 del cromosoma lll del genoma de S. cerevisiae, y que dirigen la integración de los cassettes extirpados en ese locus. En una modalidad preferida de la invención, el vehículo de clonación usado para clonar los cassettes de recombinación es un plásmido. "Plásmido" significa un elemento extracromosómico que se puede duplicar de manera autónoma. El plásmido físicamente está desligado del genoma de la célula en donde está contenido. La mayoría de los plásmidos son moléculas de ADN circulares de doble cadena. En otra modalidad, el vehículo de clonación es un YAC. En particular, se prefiere usar como primer vehículo de clonación, en donde se clona el primer cassette de recombinación, el plásmido pMXY9. El plásmido pMXY9 comprende el gen marcador URA3 y el gen marcador CAN1. En este plásmido los dos genes marcadores están localizados adyacentemente. Entre los dos genes marcadores están dispuestos varios sitios de restricción, en particular sitios de reconocimiento para las enzimas de digestión Smal, Xbal, Bg\\\ y Pad, para insertar una secuencia de ADN por recombinar. Las dos secuencias marcadoras están flanqueadas por secuencias de dirección homologas al locus BUD31-HCM1 del cromosoma lll del genoma de S. cerevisiae. Además, se prefiere usar como segundo vehículo de clonación, en donde se clona el segundo cassette de recombinación, el plásmido pMXY12. El plásmido pMXY12 comprende el gen marcador TRP1 y el gen marcador CYH2. En este plásmido los dos genes marcadores están localizados adyacentemente. Entre los dos genes están dispuestos varios sitios de restricción, en particular sitios de reconocimiento para las enzimas de restricción Spel, Smal y Pací, para insertar una secuencia de ADN por recombinar. Las dos secuencias marcadoras están flanqueadas por secuencias de dirección homologas al locus BUD31-HCM1 del cromosoma lll del genoma de S. cerevisiae. En una modalidad preferida de la invención, las células diploides usadas para la transformación del cassette de recombinación extirpado son auxotróficas para al menos dos factores nutricionales, y resistentes a por lo menos dos antibióticos. Preferiblemente, las células diploides son homocigóticas para el alelo ura3-1 y el alelo trp1-1, lo que hace a las células auxotróficas para uracilo y triptófano, respectivamente. Además, se prefiere que las células diploides usadas para la transformación sean homocigóticas para el alelo can 1-100 y el alelo cyh2R, que las hace resistentes a la canavanina y la cicloheximida, respectivamente. En particular, para la transformación se prefiere usar células diploides de la cepa MXY47 de S. cerevisiae, que son homocigóticas para los alelos ura3-1, trp1-1, can1-100 y cyh2R, y heterocigóticas para la mutación msh2::KanMX. Cuando se usan células diploides de la cepa MXY47 para la transformación con el primer o segundo cásete de recombinación, que llevan los fragmentos extirpados y sus secuencias de dirección flanqueantes, entonces los transformantes obtenidos se pueden esporular para producir segregantes haploides de tipo silvestre o msh2 que llevan el cassette de recombinación respectivo. De acuerdo con la invención, puede ser preferible utilizar células de S. cerevisiae que tienen un sistema de reparación de discordancias funcional para el proceso de la invención. El sistema de reparación de discordancias pertenece a los principales contribuyentes para evitar las mutaciones debidas a los errores de la ADN polimerasa en la duplicación. La reparación de discordancias también promueve la estabilidad genética editando la fidelidad de la recombinación genética. Por lo tanto, se sabe que la maquinaria de reparación de discordancias tiene un efecto un poco inhibidor sobre la recombinación entre secuencias divergentes. Sin embargo, en un diploide de S. cerevisiae normal se detectó otro aspecto de la reparación de discordancias, denominado recombinación dependiente de la reparación de discordancias (Borts y Haber, Science, 237 (1987), 1459-1465). Se piensa que la reparación de discordancias ampliamente espaciadas, tales como las secuencias divergentes, conduce a nuevos rompimientos de la doble cadena que a su vez pueden estimular una segunda ronda de recombinación (dependiente de la reparación de discordancias). En particular, en algunas circunstancias, cuando se sabe que los dos substratos de recombinación usados tienen diferencias de bases ampliamente espaciadas, es útil emplear células de S. cerevisiae con un sistema de reparación de discordancias funcional para realizar el proceso de la invención. En otra modalidad preferida de la invención se utilizan células de S. cerevisiae que son deficientes en el sistema de reparación de discordancias. En S. cerevisiae se han identificado varios genes cuyos productos comparten homología con proteínas de reparación de discordancias bacterianas, que incluyen seis homólogos de la proteína MutS, esto es, Msh1 , Msh2p, Msh3p, Msh4, Msh5 y Mshdp, y cuatro homólogos de la proteína MutL, esto es, Mlhlp, Mlh2p, Mlh3p y Pms1. Se sabe que en particular los genes PMS1 y MSH2 establecen una barrera a la recombinación de secuencias divergentes. Por lo tanto, en los mutantes msh2 y pmsl se incrementa la recombinación meiótica entre las secuencias divergentes con respecto a la frecuencia de recombinación en las células de tipo silvestre. En el contexto de la presente invención, el término "deficiente en el sistema de reparación de discordancias" significa que el sistema de reparación de discordancias (MMR) de una célula está deteriorado transitoria o permanentemente. El MMR de una célula u organismo se puede deteriorar mediante cualquier estrategia que deteriore transitoria o permanentemente la reparación de discordancias, que incluyen, sin limitación, una mutación de uno o más genes implicados en la reparación de discordancias, tratamiento con un agente como la luz UV que produce deterioro global del MMR, tratamiento con un agente como 2-aminopurina o un heteroduplex que contiene una cantidad excesiva de discordancias, para saturar e inactivar transitoriamente el sistema MMR, y la expresión o represión inducible de uno o más genes implicados en la reparación de discordancias, por ejemplo mediante promotores regulables, que permitirían la inactivación transitoria, esto es, durante la meiosis, pero no durante el crecimiento vegetativo. En una modalidad preferida de la invención, la deficiencia en la reparación de discordancias de la célula de S. cerevisiae se debe a una mutación de por lo menos un gen implicado en el MMR. En una modalidad preferida, las células de S. cerevisiae son deficientes en el gen MSH2. Preferiblemente, las células diploides son homocigóticas para el alelo msh2, en el cual las secuencias de codificación de MSH2 están reemplazadas con la construcción KanMX. En el contexto de la presente invención, el término "cassette de recombinación" se refiere a una secuencia de ADN que comprende por lo menos un substrato de recombinación o una secuencia de ADN por recombinar, que está flanqueada por los menos por dos secuencias marcadoras diferentes. El primer y segundo cásete de recombinación difieren en las secuencias de ADN por recombinar y en las secuencias marcadoras flanqueantes, de tal manera que cualquier par de cassettes de recombinación comprende dos secuencias de ADN diferentes por recombinar y por lo menos cuatro secuencias marcadoras flanqueantes diferentes. En una modalidad preferida de la invención, tanto el primero como el segundo cassette de recombinación se generan insertando las secuencias de ADN respectivas por recombinar entre dos secuencias marcadoras que están localizadas cercanamente en un vehículo de clonación, y que a su vez están rodeadas por secuencias de dirección que son homologas a un locus definido del genoma de S. cerevisiae. Por lo tanto, las secuencias de dirección pueden dirigir la integración de un fragmento extirpado que contiene un cassette de recombinación en este locus definido. La inserción del ADN por recombinar entre las dos secuencias marcadoras se efectúa preferiblemente mediante métodos de ingeniería genética. En una modalidad preferida de la invención, las dos secuencias marcadoras en el vehículo de clonación están flanqueadas por secuencias de dirección que son homologas al locus BUD31-HCM1 del cromosoma lll del genoma de S. cerevisiae. Por lo tanto, las secuencias de dirección dirigen la integración de los fragmentos extirpados que contienen un cassette de recombinación en ese locus. En el contexto de la presente invención, los términos "secuencias de ADN por recombinar" y "substrato de recombinación", significan cualesquiera dos secuencias de ADN que se pueden recombinar como resultado de procesos de recombinación meiótica, con lo cual la recombinación entre estas secuencias se puede deber a la recombinación homologa o no homologa. Los eventos de recombinación homologa de varios tipos se caracterizan por el apareamiento de bases de una cadena de ADN dañada con un socio homólogo, en donde la magnitud de interacción puede implicar cientos de pares de bases apareadas casi perfectamente. El término "homología" denota el grado de identidad existente entre la secuencia de dos moléculas de ácido nucleico. En contraste, la recombinación ilegítima o no homologa se caracteriza por la unión de los extremos de ADN que comparten sólo algunos pares de bases complementarias, o ninguno. En la levadura, los eventos de reparación y recombinación no homologa ocurren a frecuencias significativamente menores que los eventos de recombinación homologa. La primera y segunda secuencia de ADN por recombinar son secuencias divergentes, esto es, que no son idénticas pero que muestran un cierto grado de homología. Esto significa que las secuencias de ADN por recombinar difieren por lo menos en un nucleótido. Preferiblemente, las secuencias de ADN por recombinar son secuencias que comparten por lo menos una o más regiones homologas, que pueden ser muy cortas. Las regiones homologas deben comprender por lo menos 5-10 nucleótidos, de preferencia más de 20-30 nucleótidos, de preferencia más de 30-40 nucleótidos, y muy de preferencia más de 50 nucleótidos. En una modalidad preferida de la invención, la primera y segunda secuencia de ADN por recombinar difieren por lo menos en un nucleótido, en particular en más de 0.1%, de preferencia más de 5%, hasta más de 50%. Esto significa que la primera y segunda secuencia de ADN por recombinar también pueden diferir en 55%, 60%, 65% o incluso más. Los substratos de recombinación o secuencias de ADN por recombinar pueden tener un origen natural o sintético. Las secuencias de ADN por recombinar, por lo tanto, se pueden derivar de cualquier fuente natural que incluye virus, bacterias, hongos, que incluyen S. cerevisiae, animales, plantas y seres humanos. En una modalidad preferida de la invención, la primera y segunda secuencia de ADN por recombinar derivan de organismos diferentes de S. cerevisiae. En una modalidad preferida de la invención, las secuencias de ADN por recombinar son secuencias codificadoras de proteína, por ejemplo secuencias que codifican enzimas que se pueden utilizar en la producción industrial de compuestos naturales y no naturales. Las enzimas o los compuestos producidos con la ayuda de las enzimas se pueden usar para la producción de fármacos, cosméticos, alimentos, etc. Las secuencias codificadoras de proteína también pueden ser secuencias que codifican proteínas que tienen aplicaciones terapéuticas en los campos de la salud humana y animal. Las clases importantes de proteínas médicamente importantes incluyen citocinas y factores de crecimiento. La recombinación de secuencias codificadoras de proteína permite la generación de secuencias mutadas nuevas que codifican proteínas con funciones alteradas, preferiblemente mejoradas, o funciones adquiridas de nuevo. De esta manera, es posible por ejemplo mejorar la termoestabilidad de una proteína, cambiar la especificidad de substrato de una proteína, mejorar su actividad, desarrollar nuevos sitios catalíticos para fusionar dominios de dos enzimas diferentes. Las secuencias de ADN codificadoras de proteína por recombinar pueden incluir secuencias de diferentes especies que codifican proteínas iguales o similares, que tienen en su contexto natural funciones similares o idénticas. Las secuencias de ADN codificadoras de proteína por recombinar pueden incluir secuencias de la misma familia de proteínas o enzimas. Las secuencias codificadoras de proteína por recombinar también pueden ser secuencias que codifican proteínas con funciones diferentes -por ejemplo, secuencias que codifican enzimas que catalizan diferentes pasos de una ruta metabólica dada. En una modalidad preferida de la invención, la primera y segunda secuencia de ADN por recombinar se seleccionan del grupo de secuencias del gen de la superfamilia Oxa de ß-lactamasas. En otra modalidad preferida de la invención, las secuencias de ADN por recombinar son secuencias no codificadoras, tales como secuencias que por ejemplo están implicadas dentro de su contexto celular natural en la regulación de la expresión de una secuencia codificadora de proteína. Ejemplos de secuencias no codificadoras incluyen, sin limitación, secuencias promotoras, secuencias que contienen sitios de unión de ribosoma, secuencias de intrón, secuencias de poliadenilación, etc. Recombinando estas secuencias no codificadoras es posible desarrollar secuencias mutadas, que en un medio celular alteran la regulación de un proceso celular -por ejemplo, una alteración de la expresión de un gen. De acuerdo con la invención, un substrato de recombinación o secuencia de ADN por recombinar, desde luego, puede comprender más de una secuencia codificadora de proteína o más de una secuencia no codificadora. Por ejemplo, un substrato de recombinación puede comprender una secuencia codificadora de proteína más una secuencia no codificadora, o una combinación de diferentes secuencias codificadoras de proteína y diferentes secuencias no codificadoras. En otra modalidad de la invención, las secuencias de ADN por recombinar, por lo tanto, pueden consistir de uno o más tramos de secuencias codificadoras con secuencias no codificadoras intermedias o flanqueantes. Eso significa que la secuencia de ADN por recombinar puede ser por ejemplo una secuencia de gen con secuencias reguladoras en su extremo 5', o una región 3' no traducida, o una secuencia de gen de mamífero con una estructura de exón/intrón. En otra modalidad de la invención, las secuencias de ADN por recombinar pueden consistir de tramos continuos más grandes que contienen más de una sola secuencia codificadora, con secuencias no codificadoras intermedias, tales como las que pueden pertenecer a una ruta biosintética o a un operón. Las secuencias de ADN por recombinar pueden ser secuencias que ya han experimentado uno o más eventos de recombinación, por ejemplo eventos de recombinación homologa o no homologa. Los substratos de recombinación pueden comprender secuencias de ADN no mutado de tipo silvestre o secuencias de ADN mutado. Por lo tanto, en una modalidad preferida, es posible recombinar secuencias de tipo silvestre con secuencias mutadas ya existentes para desarrollar nuevas secuencias mutadas. En el contexto de la presente invención, el término "secuencias marcadoras" se refiere a secuencias de ADN únicas que están colocadas en dirección 5' o 3' de un substrato de recombinación o una secuencia de ADN ya recombinada en células de Saccharomyces cerevisiae. La presencia de una secuencia marcadora en la misma molécula de ADN que el substrato de recombinación o en la secuencia de ADN ya recombinado, preferiblemente en combinación con otra secuencia marcadora colocada en el otro lado del substrato de recombinación, permite que el substrato de recombinación o la secuencia de ADN ya recombinado, sea reconocido y seleccionado, mediante métodos moleculares o genéticos. Por lo tanto, en una modalidad preferida de la invención, debe haber una o más secuencias marcadoras en dirección 5' de cada substrato de recombinación, y una o más secuencias marcadoras en dirección 3' de cada substrato de recombinación, de tal manera que en una célula heterocigótica para dos substratos de recombinación diferentes, haya por lo menos cuatro secuencias marcadoras diferentes en total. Esta disposición permite la selección de entrecruzamientos que involucran los substratos de recombinación. También permite efectuar rondas de recombinación de una manera iterativa. En otra modalidad preferida de la invención, se puede situar más de un marcador en cada lado del substrato de recombinación. Por ejemplo, se pueden introducir marcadores adicionales para aumentar la severidad de selección. Las secuencias marcadoras pueden comprender secuencias de ADN codificadoras de proteína o no codificadoras. En una modalidad preferida de la invención, las secuencias marcadoras codificadoras de proteína se seleccionan del grupo que consiste de marcadores nutricionales, marcadores de pigmento, marcadores de resistencia de antibiótico, marcadores de sensibilidad de antibiótico, y secuencias que codifican diferentes subunidades de una enzima, que funcionan solamente si las dos o más subunidades son expresadas en la misma célula. En una modalidad preferida adicional de la invención, las secuencias marcadoras no codificadoras moleculares incluyen sin limitación sitios de reconocimiento de iniciador, esto es, secuencias con las que se aparean los iniciadores de PCR y que permiten una amplificación de recombinantes, fronteras intrón/exón, secuencias promotoras, secuencias de gen reguladas en dirección 3' o sitios de enzima de restricción. Un "marcador nutricional" es una secuencia marcadora que codifica un producto de gen que puede compensar la auxotrofia de un organismo o célula, y de esta manera puede conferir prototrofía en ese organismo o célula auxotrófico. En el contexto de la presente invención, el término "auxotrofia" significa que un organismo o célula debe crecer en un medio que contiene un nutriente esencial que no puede ser sintetizado por el organismo auxotrófico mismo. El producto del gen marcador nutricional promueve la síntesis de este nutriente esencial que falta en la célula auxotrófica. Por lo tanto, después de la expresión del gen marcador nutricional, no es necesario agregar este nutriente esencial al medio en el que crece el organismo o célula, puesto que el organismo o célula ha adquirido prototrofia.

Un "marcador de pigmento" es un gen marcador en donde el producto del gen está implicado en la síntesis de un pigmento, que después de su expresión teñirá la célula en la que se expresa. Una célula sin el marcador de pigmento no sintetiza el pigmento y por lo tanto no se tiñe. Por lo tanto, el marcador de pigmento permite una detección fenotípica rápida de aquella célula que contiene el marcador de pigmento. Un "marcador de resistencia de antibiótico" es un gen marcador en donde el producto del gen confiere a una célula en la que ocurre la expresión del gen marcador de antibiótico, la capacidad de crecer en presencia de un antibiótico dado a una concentración dada, mientras que una célula sin el marcador de resistencia de antibiótico no lo puede hacer. Un "marcador de sensibilidad de antibiótico" es un gen marcador en donde después de su expresión, el producto del gen destruye la capacidad de una célula para crecer en presencia de un antibiótico dado a una concentración dada. En una modalidad preferida de la invención, cada uno de los productos génicos de la primera y tercera secuencia marcadora puede compensar una auxotrofia de una célula de S. cerevisiae. Preferiblemente, la primera secuencia marcadora es URA3, cuyo producto génico puede conferir prototrofia de uracilo a una célula de S. cerevisiae auxotrófica de uracilo. Preferiblemente, la tercera secuencia marcadora es TRP1, cuyo producto génico puede conferir prototrofia de triptófano a una célula de «S. cerevisiae auxotrófica de triptófano.

En otra modalidad preferida de la invención, los productos génicos de la segunda y cuarta secuencia marcadora confieren selectividad de un antibiótico a una célula de S. cerevisiae que es resistente a ese antibiótico. Preferiblemente, la segunda secuencia marcadora es CAN1, cuyo producto génico puede conferir sensibilidad a la canavanina a una célula de S. cerevisiae resistente a la canavanina. Preferiblemente, la cuarta secuencia marcadora es CYH2, cuyo producto génico puede conferir sensibilidad a la cicloheximida a una célula de S. cerevisiae resistente a la cicloheximida. En otra modalidad preferida de la invención, las secuencias marcadoras comprenden sitios de apareamiento para iniciadores de PCR. Preferiblemente, la primera, segunda, tercera y cuarta secuencia marcadora son reconocidas por los iniciadores KNS11 , KNS28, KNS16 y KNS29. En una modalidad preferida del proceso de la invención, se pueden identificar células haploides que contienen cassettes de recombinación con la primera, segunda, tercera o cuarta secuencia de ADN recombinado, por medio de procedimientos de PCR para detectar la presencia de la combinación marcadora respectiva. En otra modalidad preferida del proceso de la invención, se identifican células haploides que contienen cassettes de recombinación con la primera, segunda, tercera o cuarta secuencia de ADN recombinado, cultivando en placa las células haploides sobre medios que seleccionan la presencia de la combinación marcadora respectiva en la misma molécula de ADN. Esto significa que las células haploides que contienen las primeras secuencias de ADN recombinado se cultivan en placa sobre un medio que selecciona la presencia de la primera y la cuarta secuencia marcadora. Las células haploides que contienen las segundas secuencias de ADN recombinado se cultivan en placa sobre un medio que selecciona la presencia de la segunda y la tercera secuencia marcadora. Las células haploides que contienen las terceras secuencias de ADN recombinado se cultivan en placa sobre un medio que selecciona la presencia de la primera y la segunda secuencia marcadora. Las células haploides que contienen las cuartas secuencias de ADN recombinado se cultivan en placa sobre un medio que selecciona la presencia de la tercera y la cuarta secuencia marcadora. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un proceso de generación de proteínas novedosas, enzimas, rutas y secuencias no codificadoras con funciones y propiedades novedosas o mejoradas, en el que las secuencias codificadoras de proteína conocidas, o las secuencias no codificadoras conocidas, son sometidas a una o más rondas de recombinación usando el proceso de la invención, para generar y detectar secuencias de ADN recombinante en S. cerevisiae. Otro aspecto de la presente invención se refiere al plásmido pMXY9. El plásmido pMXY9 comprende el gen marcador URA3 y el gen marcador CAN1, que están localizados adyacentemente. Entre los dos genes marcadores está dispuesta una secuencia polienlazadora que comprende varios sitios de restricción para insertar una secuencia de ADN por recombinar. Los dos marcadores están flanqueados por secuencias de dirección, homologas al locus BUD31-HCM1 del cromosoma lll del genoma de S. cerevisiae. La secuencia polienlazadora entre los dos genes marcadores comprende sitios de restricción para las enzimas de restricción Smal, Xbal, BglW y Pad. Otro aspecto de la presente invención se refiere al plásmido pMXY12. El plásrnido pMXY9 comprende el gen marcador TRP1 y el gen marcador CYH2. Entre los dos genes marcadores está dispuesta una secuencia polienlazadora que comprende varios sitios de restricción para insertar una secuencia de ADN por recombinar. Los dos marcadores están flanqueados por secuencias de dirección, homologas al locus BUD31-HCM1 del cromosoma lll del genoma de S. cerevisiae. La secuencia polienlazadora comprende sitios de restricción para las enzimas de restricción Spel, Smal, y Pací. La presente invención también se refiere a la cepa de S. cerevisiae MXY47, caracterizada porque células diploides de la misma son homocigóticas para los alelos ura3-1 , trp1-1 , can1-100 y cyh2R, y heterocigóticas para la mutación msh2::KanMX. La presente invención también se refiere a la cepa de E. coli JM101 que contiene el plásmido pMXY9, y a la cepa de E. coli DH5a que contiene el plásmido pMXY12. Los plásmidos pMXY9 y pMXY12 y la cepa de Saccharomyces cerevisiae MXY47 se depositaron el 3 de enero de 2005 en el DSMZ (Deutsche Sammiung für Mikroorganismen und Zeilkulturen GmbH, Mascheroder eg 1 b, 38124 Braunschweig, Alemania), bajo los números de registro DSM 17010, DSM 17011 , y DSM 17026, respectivamente. Otro aspecto de la presente invención se refiere a un equipo que se puede usar para realizar el proceso de la invención para generar y detectar secuencias de ADN recombinado en Saccharomyces cerevisiae. En una primera modalidad, el equipo comprende por lo menos un primer recipiente que contiene células de la cepa de S. cerevisiae MXY47, un segundo recipiente que contiene células de la cepa de E. coli JM101 que lleva el plásmido pMXY9, y un tercer recipiente que contiene células de la cepa de E. coli DH5a que lleva el plásmido pMXY12. En una segunda modalidad, el equipo comprende por lo menos un primer recipiente que contiene células de la cepa de S. cerevisiae MXY47, un segundo recipiente que contiene ADN del plásmido pMXY9, y un tercer recipiente que contiene ADN del plásmido pMXY12. La presente invención se ilustra mediante el listado de secuencias, figuras y ejemplos que se dan más abajo. La figura 1 muestra un esquema del sistema de selección de recombinantes en los medios definidos. Células progenitoras diploides heterocigóticas para casetes de recombinación -aquí, el substrato de recombinación A flanqueado por los genes URA3 y CAN1, y el subsíraío de recombinación B, flanqueado por los genes TRP1 y CYH2- son inducidas a experimentar meiosis. Las esporas se cultivan en placas en un medio que carece de uracilo y contiene canavanina (-Ura+Can), y en un medio que carece de íriptófano y contiene cicloheximida (-Trp+Cyh), para seleccionar las células recombinantes 3 y 4, en las que ha ocurrido un entrecruzamiento que implica los substratos de recombinación A y B, indicado por (+). Los diploides progenitores y los haploides no recombinantes 1 y 2 no pueden crecer en cualquiera de estos medios, indicado por (-). En una ronda subsiguiente de meiosis se pueden usar los recombinantes 3 y 4 para construir un diploide nuevo que, cuando esporule, produzca células recombinantes nuevas que lleven las mismas configuraciones marcadoras flanqueante que las mostradas en las células 1 y 2. Las colonias de esporas recombinantes con estas configuraciones se pueden seleccionar en un medio que carece de uracilo y contiene cicloheximida (-Ura+Cyh), y en un medio que carece de triptófano y contiene canavanina (-Trp+Can), respectivamente. La figura 2 muestra los plásmidos pMXY9 y pMXY12 (arriba), que son vectores usados para dirigir los cassettes de recombinación al locus BUD31-HCM1 sobre el cromosoma lll del genoma de la levadura. Los dos plásmidos llevan secuencias homologas a este locus (indicado como 5' y 3'), que flanquean los marcadores URA3 y CAN1 (pMXY9) o los marcadores TRP1 y CYH2 (pMXY12). Entre cada par de secuencias marcadoras está localizada una secuencia corta que lleva sitios de restricción que permiíen clonar substratos de recombinación. Abajo, la integración de casseííes de recombinación en el locus BUD31-HCM1. Un derivado de pMXY9 que lleva el substrato de recombinación A se digiere con Not\ para liberar el cassette de recombinación flanqueado por las secuencias de dirección 5' y 3', y los productos de digestión se transforman en células MXY47. Los derivados Ura+ que contienen un inserto dirigido correctameníe se identifican para uso subsiguiente en la construcción de cepas heterocigóticas para cassettes de recombinación. Se construyen similarmente en pMXY12 casetes de recombinación que llevan los marcadores TRP1 y CYH2, y se transforman en MXY47, seguido por selección por prototrofia de triptófano. La figura 3 muestra la frecuencia de recombinación entre los genes Oxa en función de la identidad de secuencia en las cepas de tipo silvestre y msh2. Arriba se da la media ± desviación estándar de (n) experimentos independientes. Abajo se da una representación gráfica de estos datos. Se usaron las siguientes cepas: MXY60, MXY62, MXY64, MXY66, MXY99, y MXY102. La figura 4 muestra el efecto de la hiperrecombinación de msh2. Se calculó una relación de msrí2/wt para cada experimento independiente (número total = n) para pares de cepas con el porcentaje dado de homología Oxa compartida, y para cada condición de selección, y se muestra la media ± desviación estándar de estos valores sumados. Los datos se representan abajo gráficamente. Se usaron los siguientes pares de cepas: MXY60 y MXY62, MXY64 y MXY66, MXY99 y MXY102. La figura 5 muestra un análisis de recombinación entre las secuencias Oxa que comparten 78% de homología. Se derivaron colonias de esporas de diploides de tipo silvestre (MXY99) y msh2 (MXY102) por selección en medio que carece de uracilo y coníiene canavanina, o en medio que carece de triptófano y contiene cicloheximida. Se hizo una PCR de colonia sobre colonias de esporas seleccionadas que exhibieron fenotipos consistentes con los esperados para recombinantes entrecruzados. Arriba, se efectuaron dos reacciones para cada candidato de Ura+CanR de tipo silvestre y msh2, una con un par iniciador específico de progenitor (KNS16 + KNS28, productos mostrados en el primer carril de cada par, para cada candidato), y la otra con un par iniciador específico recombinante (KNS16 + KNS29, segundo carril). Abajo, se efectuaron reacciones similares para cada candidato de Trp+CyhR de tipo silvestre y msh2, una con un par iniciador específico de progenitor (KNS11 + KNS29, primer carril), y la otra con un par iniciador específico de recombinante (KNS11 + KNS28, segundo carril). Se efectuaron reacciones de control en moldes de ADN genómico apropiados que contienen configuraciones conocidas de secuencias marcadoras flanqueante, ya sea progenitoras (P) o recombinantes (R). (-) es un control sin ADN. La figura 6 muestra las frecuencias de recombinación de una segunda ronda de recombinación. Los haploides obtenidos de tipo silvestre y msh2 después de una primera ronda de recombinación con MXY64 y MXY66, se acoplaron para producir diploides de tipo silvestre (MXY81 , MXY82 y MXY83) y msh2 (MXY86, MXY87 y MXY88) con cassettes de recombinación con mosaico de Oxa7-Oxa11. A partir de la progenie recombinaníe de MXY60 y MXY62 íambién se consíruyeron diploides de tipo silvestre (MXY90) y msh2 (MXY92) homocigóticos para el substrato de recombinación Oxa11. Todos los diploides se esporularon y las esporas se culíivaron en placa sobre un medio para seleccionar los recombinaníes Ura+CanR y Trp+CyhR. El lisiado de secuencias comprende las siguienles secuencias: Las SEQ ID Nos. 1 y 2 muesíran las secuencias de los iniciadores MSH2UP y MSH2DN, respecíivameníe, para la amplificación de MSH2. Las SEQ ID No. 3 a SEQ ID No. 6 muestran las secuencias de los iniciadores MSH2A1 , MSH2A2, MSH2A3 y MSH2A4, respectivameníe, que son iniciadores analííicos específicos de MSH2. La SEQ ID No. 7 y la SEQ ID No. 8 muesíran las secuencias de los iniciadores K2KANMX y K3KANMX, respecíivamenfe, que son iniciadores analííicos específicos de KanMX. Las SEQ ID No. 9 y SEQ ID No. 10 muesíran las secuencias de los iniciadores LEU2UP y LEU2DN, respecíivameníe, que se usan para la amplificación de LEU2. Las SEQ ID No. 11 y SEQ ID No. 12 muesíran las secuencias de los iniciadores HIS3UP y HIS3DN, respecíivameníe, que se usan para la amplificación de HIS3. Las SEQ ID No. 13 y SEQ ID No. 14 muesíran las secuencias de los iniciadores KNS1 y KNS2, respecíivameníe, que se usan para la amplificación de la secuencia de dirección 3'. Las SEQ ID No. 15 a SEQ ID No. 17 muesíran las secuencias de los iniciadores KNS3, KNS4 y KNS6, respecíivameníe, que se usan para la amplificación de una secuencia de dirección 5'. Las SEQ ID No. 18 y SEQ ID No. 19 muesíran las secuencias de los iniciadores KNS7 y KNS8, respecíivameníe, que se usan para la amplificación de Oxa7. Las SEQ ID No. 20 y SEQ ID No. 21 muesfran las secuencias de los iniciadores KNS9 y KNS10, respecíivameníe, que se usan para la amplificación de Oxal 1. La SEQ ID No. 22 muesíra la secuencia del iniciador KNS12, que es un iniciador analííico para el exíremo 3' de BUD31. La SEQ ID No. 23 mueslra la secuencia del iniciador KNS13, que es un iniciador analífico para exfremo 5' de BUD31. La SEQ ID No. 24 muestra la secuencia del iniciador KNS14, que es un iniciador analítico específico de TRP1. La SEQ ID No. 25 muestra la secuencia del iniciador KNS15, que es un iniciador analítico específico de URA3. Las SEQ ID No. 26 y SEQ ID No. 27 muestran las secuencias de los iniciadores KNS17 y KNS 18, respecíivameníe, que son usados para la amplificación de CYH2. La SEQ ID No. 28 muesíra la secuencia del iniciador KNS30, que es un iniciador delaníero específico de TRP1 usado como iniciador de secuenciación. La SEQ ID No. 29 muesíra la secuencia del iniciador KNS31 , que es un iniciador inverso específico de CAN1 usado como iniciador de secuenciacion. La SEQ ID No. 30 muesíra la secuencia del iniciador KNS33, que es un iniciador inverso específico de CYH2 usado como iniciador de secuenciación. Las SEQ ID No. 31 y SEQ ID No. 32 muesíran las secuencias de los iniciadores KNS36 y KNS37, respecíivamente, que se usan para la amplificación de Oxa5. La SEQ ID No. 33 muestra la secuencia del iniciador KNS38, que es un iniciador delantero específico de URA3 usado como iniciador de secuenciación.

EJEMPLO Generación de genes de mosaico en mutantes de reparación de discordancias de Saccharomyces cerevisiae 1. Materiales y Métodos 1.1 Medios Se usó medio YPD enriquecido estándar (Bio101) para crecimiento de ruíina, y se usó medio de caída sinféíico (Bio101 ) para moniíorear los marcadores genéíicos y para seleccionar los recombinaníes.

Para la esporulación, las células se precultivaron durante la noche en SPS (50 mM de ftalato de potasio, pH 5.0, 0.5% de exíraclo de levadura (Difco), 1 % de bacíopepíona (Difco), 0.17% de base de niírógeno de levadura, 1% de aceíaío de poíasio, 0.5% de suifaío de amonio), más los suplementos nulricionales requeridos; se lavaron, se resuspendieron en 1% de aceíaío de polasio mas suplementos y se incubaron con agiíación duraníe 2 días. Todas las manipulaciones se hicieron a 30 °C. Para análisis de téírada, se digirieron aseas con B-glucuronidasa de Helix pomatia (Sigma) y se seccionaron usando un microscopio Nikon Eclipse E400 equipado con un micromanipulador TDM400 (Micro Video Insírumenls, Inc.). Oíros métodos genéíicos se realizaron como lo describen Ausubel y oíros en "Currení Proíocols in Molecular Biology" (1998), John Wiley and Sons, Inc., Nueva York. Todas las transformaciones de levadura se hicieron usando el método de LiAc de acuerdo con Agaíep y oíros, "Technical Tips On-line" (http://ito.trends.com). 1.2 Cepas de levadura Todas las cepas de levadura usadas o creadas en este estudio se indican en el cuadro 1 y el cuadro 2. Todas las cepas de levadura son isogénicas del antecedeníe W303 de fácil esporulación. El diploide MXY47, que sirve como un hospedero para íransformación con casseííes de recombinación, se consíruyó por íransformación y cruzas genéíicas, como sigue. El haploide D184-1 B (una donación de S. Gangloff, CEA, Francia) se íransformó con un fragmento LEU2 (obíenido por PCR preparafiva de la cepa de W303 U474 con el par iniciador LEU2UP/LEU2DN, que se indica en el lisiado de secuencias), para producir el haploide Leu+ MXY13. El haploide D184-1 C (una donación de S. Gangloff) se íransformó con un fragmento HIS3 (obíenido por PCR preparaíiva de ORD4369-25D con el par iniciador HIS3UP/HIS3DN) para producir el haploide His+ MXY25. Los haploides MXY18 y MXY22 son derivados resisíenles a la cicloheximida (cyh2R) de D184-1 B y D184-1C, respecíivameníe, seleccionados sobre 10 µg/ml de cicloheximida; la presencia de muíaciones que se proyecfan al locus CYH2 que confiere resistencia a la cicloheximida, fue confirmada por secuenciación (dos alteraciones diferentes de nucleóíidos dando como resulíado un cambio de la gluíamina 38 a lisina) y análisis de segregación. MXY18 y MXY25 se cruzaron para oblener el diploide MXY29; MXY13 y MXY22 se cruzaron para obíener el diploide MXY33. Los segregantes haploides MXY29-6D y MXY33-8C se cruzaron para obtener MXY38, que es heterocigótico para los marcadores Ieu2-3, 112 e his3-11, 15, y homocigótico para la mutación cyh2R. MXY38 se transformó con el cásete msh2::KanMX amplificado por PCR de RBT348 (una donación de R. Borts, Universiíy of Leicester), con los iniciadores MSH2UP y MSH2DN, para producir MXY47. Se seleccionaron transformantes sobre 200 µg/ml de G418 (Invitrogen) y se confirmó por PCR de colonia (véase abajo) con los iniciadores MSH2A1 , MSH2A2, MSH2A3 y MSH2A4, y por análisis de tetrada, esto es, análisis de las cuatro esporas, para confirmar la segregación del marcador.

CUADRO 1 Cepas de levadura haploides CUADRO 1 (Continuación) CUADRO 2 Cepas de levadura diploides CUADRO 2 (Continuación) 1.3 Construcción de plásmido Se usaron las cepas bacterianas XL1-Blue MRF' (?mcrA) 183 (mcrCB-hsdSMR-mrr) 173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F' proAB lacqZ?M15 Tn10 (Tef)J) y JM110 (rpsL [Síf] thr leu thi-1 ¡acYgalK gaIT ara tonA tsx dam dem supE4' 4 ?[lac-proAB] [F traD36 proAB lacPZ?MId]) como hospederos para clonación. Se usaron los métodos estándares para la construcción de los plásmidos (Ausubel y otros). Todos los plásmidos usados o creados en este estudio se indican en el cuadro 3. Las enzimas de restricción, ADN ligasa T4 y otras enzimas usadas en la clonación, se compraron a New England BioLabs. Los fragmentos de ADN y los plásmidos se purificaron usando equipos provistos por Qiagen y Macherey-Nagel. Secuencias de dirección 5' que corresponden al locus BUD31 se amplificaron por PCR preparativa a partir de ADN genómico de W303 con el par iniciador KNS3/KNS4, y se clonaron como un fragmento Kpn .lXho . en pKSII(+) digerido con KPnMXhol (Straíagene), para crear pMXY1 ; similarmente se amplificaron secuencias de dirección 3' con el par iniciador KNS1/KNS2, y se clonaron como un fragmento XbaMNot. en pKSII(+) digerido con XbaMNot. (Sfrafagene) para crear pMXY2. El marcador TRP1 se cortó de pJH53 (una donación de R. Borts) como un fragmento ßg/II/EcoRI, y se ligó en pMXY1 digerido con fía HI/EcoRI para crear pMXY3; y el marcador URA3 se cortó de pRED316 digerido con Xho\lHinD\\\ (una donación de R. Borts) y se ligó en pMXY1 digerido con XhoUHinDUi para crear pMXY4. El marcador CAN1 se aisló de pRED316 como un fragmento Smal y se ligó con pMXY2 digerido con Hpa1 para crear pMXY5. Las secuencias de dirección 5' en pMXY3 y pMXY4 se reemplazaron con secuencias reamplificadas de ADN genómico con el par iniciador KNS4/KNS6, y se ligaron como fragmentos KpnMXho . en los plásmidos respecfivos digeridos con KpnMXho' , para producir pMXY7 y pMXY6. Esíe paso se hizo para corregir la ausencia del iniciador KNS3 de los sitios de restricción requeridos en las últimas fases de la clonación. El fragmento Kpn\-Sma\ de pMXY6 que coníiene la secuencia de dirección 5' y el marcador URA3 se ligaron en pMXY5 digerido con Kpn\ISma\, para producir el vector pMXY9 del cassette de recombinación URA3-CAN1. El fragmento Kpn\ISpe\ de pMXY7 que confiene la secuencia de dirección 5' y el marcador TRPI se ligaron en pMXY2 digerido con pnl/Spel, para producir pMXY11. Finalmente, el marcador CYH2 se amplificó por PCR preparaíiva a partir de ADN genómico de W303 con el par iniciador KNS17/KNS18 digerido con fíamHI y Pvul, y se ligó en pMXY11 digerido con BglW/Pad, para crear el vecíor pMXY12 del cassette de recombinación TRP1-CYH2. Todas las consírucciones de plásmido se infrodujeron en hospederos bacterianos por elecíroporación y se verificaron por análisis de resíricción, y pMXY9 y pMXY12 se verificaron adicionalmenfe por secuenciación de todas las uniones de clonación. Subsíraíos de recombinación de b-lacíamasa se amplificaron por PCR preparafiva de plásmidos hospederos (provisíos por W. Schoenfeld), usando los pares iniciadores KNS36/KNS37 para Oxa5 (regislro X58272), KNS7/KNS8 para Oxa7 (regisfro X75562), y KNS9/KNS10 para Oxa11 (regisíro Z22590). Los productos de PCR de Oxa7 y Oxa11 se digirieron con Pací y se ligaron en pMXY9 digerido con Sma\/Pac\, para crear pMXY13 y pMXY14, respectivamente; y el producto de PCR de Oxa11 también se digirió con Spel y Pací y se ligó con pMXY12 digerido con Spel/Pacl, para crear pMXY22. Los producios de PCR de Oxa5 se digirieron con SamHI y Pací y se ligaron en pMXY9 digerido con BglW/Pad para crear pMXY24. Todas las construcciones se verificaron por análisis de restricción.

CUADRO 3 Plásmidos 1.4 Selección y caracterización de recombinantes Para la primera ronda de recombinación, los plásmidos que llevan los cassettes de recombinación se digirieron con Notl y los producios de la digestión completa se usaron para transformar MXY47. Se seleccionaron proíotrofos de uracilo (para los derivados de pMXY9) o triptófano (para los derivados de pMXY12), y se confirmó la inserción de una de las dos copias cromosómicas del locus BUD31-HCM1 dirigida por la construcción introducida por PCR de colonia, usando los iniciadores KNS12/KNS13/KNS15 para los derivados de URA3-CAN1 , y los iniciadores KNS12/KNS13/KNS14 para los derivados de TRP1-CYH2, que permite amplificar los fragmentos intactos y rotos de los locus BUD31- HCM1. Los heterocigotos transformados se esporularon y se efectuó un análisis de téirada para identificar los haploides de tipo silvestre o msh2 que llevan los casetes de recombinación. Haploides apropiados del íipo de acoplamiento opuesto se depositaron sobre placas YPD y se dejaron crecer durante la noche; se mezclaron juntos en la misma placa YPD y se dejaron acoplar durante la noche. La placa de acoplamiento se sembró por duplicado en una placa con medio Ura-Trp para seleccionar los diploides, que se inocularon al día siguiente en masa en SPS más suplementos y se culfivaron duraníe la noche. El preculíivo se cenírifugó y se lavó, y las células se resuspendieron en 1 %> de aceíaío de K más suplementos y se incubó durante dos días. Las células esporuladas se cosecharon y se cuantificaron, y en algunos casos se seccionaron para confirmar la segregación apropiada de iodos los marcadores. Se digirieron aseas con zymolyase-2QT (ICN Biomedicals) para liberar las esporas; la suspensión de esporas se someíió a sonicación (Branson Model 250 Digital Sonifier), y diluciones apropiadas se sembraron en placas con YPD para determinar la viabilidad celular, en medio de caída de uracilo que contenía 60 ug/ml de canavanina (Sigma) para seleccionar los recombinaníes Ura+CanR, y en medio de caída de fripíófano que contenía 3 ug/ml de cicloheximida (Sigma) para seleccionar los recombinanfes Trp+CyhR. Las colonias de esporas originadas en cada medio se confaron y someíieron a pruebas fenoíípicas y moleculares para determinar si represeníaban recombinanles verdaderos. Para los análisis fenoíípicos, un número representativo de recombinantes candidatos se volvió a estriar en el mismo medio usado para la selección y después se cultivó por duplicado en placas de prueba de íipo -Ura, -Trp, cicloheximida (10 µg/ml), canavanina (60, ug/ml), y de acoplamiento. Las esporas íambién se sembraron en placas con medio -Ura- Trp para determinar la frecuencia de los diploides para cada preparación de espora, que en iodos los casos fue menor del 4% del total de las células viables. Para análisis molecular, ADN genómico total se sometió a PCR analítica (véase más abajo) usando pares iniciadores apropiados que amplifican específicamente fragmentos progeniíores o recombinanfes. Las frecuencias de recombinación para una selección dada se expresan como la frecuencia de células viables en un medio de selección dado, corregido por la presencia de no recombinaníes que exhiben un fenoíipo falso posiíivo. En la mayoría de los casos, tales falsos positivos se originan por inactivación mutacional del marcador CAN1 o CYH2, como lo sugiere la PCR analítica. Para la segunda ronda de recombinación, se acoplaron los recombinantes apropiados derivados de la primera ronda de recombinación, y se seleccionaron los diploides Ura+Trp+. Se siguió el mismo procedimiento de esporulación que en la primera ronda de recombinación, excepto que las esporas se sembraron en placas YPD en medio de caída de uracilo que contenía cicloheximida, para seleccionar los recombinantes Ura+CyhR, y en medio de caída de íripíófano que contenía canavanina, para seleccionar los recombinaníes Trp+VanR. Los recombinaníes candidatos se someíieron similarmeníe a análisis fenotípico y molecular. 1.5 Métodos moleculares El ADN genómico usado como molde para PCR preparativa o analífica se preparó de culíivos YPD nocíurnos medianíe un procedimienío esfándar de minipreparación, de acuerdo con Ausubel y oíros. La PCR preparaíiva de los fragmentos usados en la clonación o la secuenciación se realizó con ADN plasmídico de Oxa (aproximadamente 50 pg) o ADN genómico de levadura (aproximadamente 0.5 µg) como un molde, en reacciones de 50 µl que contenían 2.5 U de Herculase polymerase (Stratagene), amortiguador de reacción Herculase 1x, 0.2 mM de cada dNTP y 100 ng de cada iniciador. La amplificación se realizó de la siguieníe manera: 94° C 2 min; 30 ciclos de 94°C 10 s, 55°C 30 s, 72°C 30 s; 68°C 10 min. Se empleó un procedimienío de PCR de colonia modificado para confirmar la integración de los caseíes de recombinación en el locus BUD31 (http://www. fhcrc.orq/labs/hahn/meíhods/mol_bio_meíh/pcr_yeasí_colony.híml), con las siguientes condiciones de amplificación: 95°C 5 min; 35 ciclos de 95°C 1 min, 55°C 1 min, 68°C 1 min; 72°C 10 min. La PCR analííica para caracterizar los insertos de Oxa se realizó en volúmenes de reacción de 100 µl que contenían aproximadameníe 0.5 µg de ADN genómico preparado de los recombinaníes candidaíos y cepas de conírol, 1.5 U de polimerasa Taq (Roche), amortiguador de reacción 1 x, 0.2 mM de cada dNTP, y 100 ng de cada iniciador, con las mismas condiciones de amplificación que en la PCR de colonia, excepto que la extensión se efecfuó a 68 °C duraníe 2 min. Todas las reacciones de amplificación se realizaron con un Masíercycler gradient 5331 (Eppendorf). Para análisis de secuencia de los insertos recombinantes de Oxa, se realizó una PCR preparativa con los pares iniciadores KNS16/KNS29 (para recombinantes Ura+CanR) o KNS11/KNS28 (para Trp+CyhR), seguida por purificación con el equipo Qiaquick PCR (Qiagen). Los producios de PCR fueron secuenciados por Genome Express (Meylan, Francia) con los iniciadores KNS30, KNS31 , KNS33 o KNS38, según fue apropiado. Las secuencias recombinaníes se alinearon y analizaron usando el software Clone Manager (Sci Ed Ceníral). Los oligonucleóíidos usados en la PCR y secuenciación (cuadro 3) se compraron a Proligo France. 2. Resuliados 2.1 Desarrollo de un sistema de recombinación homólogo meióiico de levadura Se ha desarrollado una esíraíegia que uíiliza la levadura Saccharomyces cerevisiae para promover la recombinación in vivo eníre secuencias de ADN divergentes. Las caracleríslicas crííicas de la esíraíegia incluyen el uso de células meióficas en las que ocurre un alio grado de recombinación de iodo el genoma, e inacíivación del sistema de reparación de discordancias (MMR), que normalmente resíringe la recombinación eníre secuencias divergentes. Las secuencias por recombinar, esto es, los substratos de recombinación, se introducen en uno de dos vectores que también llevan secuencias marcadoras flanqueante, a fin de crear cassettes de recombinación. Los cáseles de recombinación se iníroducen en el genoma de la levadura en un locus sobre el cromosoma lll (el intervalo BUD31-HCM1), que es una región conocida por ser recombinantemente activa en la meiosis. Los diploides heterocigólicos para los cáseles de recombinación se esporulan, y las esporas se cullivan en placas en medios que seleccionan las células con las configuraciones específicas de los marcadores flanqueante, permitiendo así la selección de recombinantes en los que ha ocurrido un entrecruzamiento que involucra los substratos de recombinación (figura 1 ). Se construyeron dos vectores de cassettes de recombinación general, pMXY9 y pMXY12, que contienen los marcadores URA3 y CAN1, y TRP1 y CYH2, respectivamente, que flanquean a sitios de restricción que se pueden usar para la introducción de substratos recombinantes (figura 2). El marcador URA3 confiere protoírofia de uracilo y el marcador CAN1 confiere sensibilidad a la canavanina. En ausencia de este marcador, las células son resistentes al fármaco. El marcador TRP1 confiere prototrofia de triptófano y el marcador CYH2 confiere sensibilidad a la cicloheximida. En ausencia de este marcador, las células son resistentes al fármaco. Cada uno de los dos casetes de recombinación, a su vez, esíá flanqueado por secuencias que permiten dirigir iodo el inserto al locus BUD31-HCM1 por transformación de células competentes (figura 2). También se construyó una cepa que sirve como hospedero primario para la transformación, MXY47 (cuadro 2). Este diploide es heterocigóíico para la mutación msh2::KanMX, y fenotípicameníe es de tipo silvestre con respecto, a MMR. También es homocigótico para los marcadores ura3-1, trp1-1, can1-100 y cyh2R, que permiten monitorear la presencia de marcadores de cassette de recombinación, y heterocigóíico para los marcadores his3-11,15 y Ieu2-3,112. MXY46 se íransforma con fragmentos que llevan casetes de recombinación; los transformantes primarios se seleccionan como prototrofos Ura+ o Trp+ (para los derivados de MXY9 y MXY12, respectivamente), y la dirección se confirma por PCR analítica usando iniciadores que reconocen las secuencias denfro de la consírucción infroducida o externas a la misma. Los íransformanles primarios se esporulan y se seccionan íéíradas que se culíivan en placa por duplicado para ideníificar los segregantes de íipo silvesíre o msh2 que llevan el cásete de recombinación. Los haploides adecuados se acoplan uno con oíro para generar los diploides MSH2/MSH2 (lipo silveslre) y msh2/msh2, heterocigóticos para los substratos de recombinación. En una primera ronda de recombinación meiótica para generar los recombinanles, estos diploides se esporulan y las esporas libres se culíivan en placa sobre medios que carecen de uracilo y que coníienen canavanina, para seleccionar los recombinantes con la configuración URA3-CYH2 de marcadores flanqueante (colonias de esporas Ura+CanR), o sobre medios que carecen de íriplófano y conlienen cicloheximida para seleccionar la configuración TRP1-CAN1 (colonias de esporas Trp+CyhR). Los diploides progeniíores y la progenie haploide no recombinante no pueden crecer sobre estos medios. Se determina la frecuencia de las colonias de esporas que se originan sobre los medios selecfivos; las colonias de esporas candidaíos a recombinaníes se caracterizan fenolípicameníe cultivándolas por duplicado en placas con medios de prueba, y molecularmente mediante PCR con los pares iniciadores apropiados; para la secuenciación se selecciona una muestra de los recombinantes ya confirmados. La estrategia es iterativa porque las células que llevan insertos recombinantes se pueden identificar y someter a rondas adicionales de recombinación meióíica para aumeníar la diversidad. En una segunda ronda, se acoplan los haploides Ura+CanR y Trp+CyhR, y se repite el proceso de esporulación y selección, excepto que se seleccionan recombinaníes nuevos sobre medios que carecen de uracilo y coníienen cicloheximida, para seleccionar los recombinaníes con la configuración URA3-CAN1 de los marcadores flanqueante (colonias de esporas Ura+CyhR), o sobre medios que carecen de íripíófano y coníienen canavanina para seleccionar la configuración TRP1-CYH2 (colonias de esporas Trp+CanR). La esírafegia aquí deíallada íambién se pueden modificar para incluir marcadores adicionales para aumeníar la severidad de la selección. Además, los recombinantes lambién se pueden seleccionar direcíamenle por PCR usando iniciadores específicos para flanquear las secuencias. 2.2 Selección fenoíípica para la recombinación eníre pares de genes Oxa de divergencia de secuencia variable Se eligieron genes que pertenecen a la superfamilia Oxa de beta-lactamasas como subsíraíos para probar la factibilidad del sistema para la selección de recombinantes. La recombinación entre los siguientes pares de Oxa se determinó en los antecedentes de íipo silvesíre y msh2: Oxa11-Oxa11 , que comparte 100% de homología en las 800 pb de ORF; Oxa7-Oxa11 , 95%; Oxa-5-Oxa11 , 78%. Se indujo la meiosis de diploides generados por cruzas eníre los haploides apropiados. De los culíivos meióíicos se prepararon esporas, y diluciones en serie de esías se culfivaron en placas YPD para determinar la viabilidad celular, y en medio que carece de uracilo y contiene canavanina (-Ura+Can), y en medio que carece de triptófano y contiene cicloheximida (-Trp+Cyh), para seleccionar los recombinantes. 2.3 Frecuencias de recombinación eníre los genes Oxa de homología de secuencia variable Los datos mosírados en la figura 3 demuesíran que en el antecedente de íipo silvesíre, el aumento de heíerología de secuencia íiene un fuerte efecto inhibidor sobre la recombinación cruzada, y este efecto es aliviado mas no abolido por la muíación de msh2. En general, la muíación msh2 causa un aumento de la frecuencia de recombinación de aproximadameníe un orden de magniíud por arriba de la observada en cepas de íipo silvesíre, en las dos divergencias probadas. Sin embargo, la inacíivación solo de MSH2 no compensa compleíameníe la inhibición de la recombinación enlre subslraíos de recombinación con mayores grados de heferología. Por ejemplo, las frecuencias de recombinación para una cepa msh2 con insertos de Oxa que comparten 78% de homología (MXY102) son por lo menos 10 veces (Ura+CanR) y 25 veces (Trp+CyhR) más bajas que las enconlradas para una cepa de íipo silveslre con insertos de Oxa de 100% de homología (MXY60), indicando que factores diferentes de la reparación de discordancias dependiente de MSH2 previenen la recombinación cruzada enlre más secuencias divergentes. También es digno de atención que la aparición de los recombinantes de msh2 a un nivel de 78% de divergencia, a frecuencias de aproximadameníe 2 x 10"4, indica que se puede lograr recombinación entre substratos aún más divergentes. 2.4 El efecto de hiperrecombinación de msh2 El efecto de msh2 sobre la recombinación homologa se cuantificó calculando primero la relación entre los recombinantes de msh2 y de tipo silvestre (wí) para un porceníaje dado de homología, para una selección dada para cada experimento, y después calculando la media y la desviación eslándar del íoíal de las relaciones así determinadas. Los datos se muesíran en la figura 4. La presencia de la muíación msh2 aumente la frecuencia de recombinación homologa para secuencias de 95% y 78% de homología, y hay un aumento menos pronunciado pero aún cuaníificable de recombinación eníre secuencias 100% idéníicas. Además, la magniíud del incremento de recombinación homologa de msh2 difiere de las dos selecciones: para cepas con insertos de Oxa homólogos, la inacíivación de MSH2 aumente la frecuencia de los recombinanfes Trp+CyhR en un mayor grado de lo que aumente la frecuencia de los recombinaníes Ura+CanR. En principio, las frecuencias de los dos íipos de recombinaníes (Ura+CanR y Trp+CyhR) serían equivalentes, pero estos números indican que hay sesgos en el sistema que son provocados o incremeníados por la mulación msh2, en conjunto con variaciones en la magniíud de divergencia de secuencias. Experimentos para probar las influencias relaíivas de los insertos y las secuencias marcadoras flanqueaníes sobre los íipos de recombinaníes obtenidos, indican que esíe sesgo es una propiedad de los marcadores flanqueaníes pero no pueden explicar la influencia de los subsfraíos de recombinación para dirigir los resulíados de los eventos de recombinación meióíica (datos no moslrados). 2.5 Análisis de PCR de recombinantes seleccionados En la figura 5 se muestra un ejemplo de análisis de PCR, aplicado a colonias de esporas Ura+CanR y Trp+CyhR derivadas de diploides de tipo silveslre y msh2, que conlienen genes Oxa de 22% de divergencia (MXY99 y MXY102, respecíivameníe). Para cada cepa se analizaron diez colonias de esporas que exhibieron cada fenofipo recombinanfe. Se usaron exíractos de cada colonia como moldes para amplificación, con pares iniciadores que amplifican específicamente moléculas progeniíoras, y con pares iniciadores que amplifican específicameníe moléculas recombinaníes. En cada caso solo se amplificó el inserto recombinaníe predicho, indicando que las colonias de esporas seleccionadas contenían secuencias producidas por recombinación entre los subsíraíos de recombinación de Oxa progenitores. Estos resulíados íambién demuesíran que las moléculas recombinaníes íambién se pueden recuperar direcíameníe de cullivos esporulados, incluso sin la imposición de un paso de selección genéíica. Aquí, los siíios de reconocimiento de iniciador localizados en los genes URA3, CAN1, TRP1 y CYH2, representen secuencias marcadoras moleculares que flanquean cada subsíraío de recombinación. 2.6 Análisis de secuencia de recombinaníes homólogos meióíicos de primera ronda: 5% y 22% de divergencia Los recombinanfes meióticos Oxa7-Oxa11 derivados de diploides de tipo silvestre y msh2 (MXY64 y MXY66, respeclivameníe), que coníienen subsíraíos de recombinación que comparten 95% de homología y que dieron resultados satisfactorios en las pruebas fenoíípicas y moleculares (PCR), se someíieron a análisis de secuencia. Los fragmentos recombinaníes se amplificaron con iniciadores específicos para los marcadores flanqueaníes, y se secuenciaron usando iniciadores cerca de los siíios de inicio y detención de íraducción. En íoíal, se analizaron 55 secuencias recombinaníes derivadas de la progenie haploide de los diploides Oxa7-Oxa11 : 14 recombinaníes Ura+CanR y 13 Trp+CyhR de MXY64, y 14 recombinaníes Ura+CanR y 14 Trp+CyhR de MXY66. El famaño de mueslra secuenciado permite hacer varias observaciones: (1 ) Para los dos recombinantes, de tipo silvestre y de msh2, la posición en la que ocurre el entrecruzamiento varió en toda la región codificadora, sin preferencia aparente por un intervalo específico. Los entrecruzamientos que ocurrieron en la región 5' fueron tan similares como los de la región 3'. También, para una cepa dada, no hubo diferencia aparente en las disíribuciones de los siíios de enírecruzamienío para las colonias de esporas obíenidas por selección de -Ura+Can o de -Trp+Cyh. (2) La longiíud de homología ininterrumpida en el intervalo de entrecruzamienío íampoco fue importante: los enírecruzamienfos se defecíaron eníre dos polimorfismos espaciados cercanamente (posiciones 543-552 para Trp+CyhR #7, #8 y #13 de MXY66, en donde la posición 1 represenía el residuo de adenosina del siíio de iniciación de íraducción ATG), y íambién eníre los dos polimorfismos espaciados más ampliamente (posiciones 163-265, por ejemplo Trp+CyhR #15 de MXY66). (3) Los insertos recombinanles de Oxa aislados de los antecedentes íanío de íipo silvesíre como de msh2 contenían secuencias recombinanfes de longiíud complete poíencialmeníe capaces de codificar nuevas proteínas Oxa funcionales. Esto es, iodos los enlrecruzamienfos ocurrieron de íal manera de preservar un ORF iníacío, sin una inserción ni supresión neía de nucleóíidos en el intervalo de enírecruzamienío, ni en cualquier oíro intervalo. (4) Aunque las eslrucíuras de la mayoría de las secuencias recombinaníes son consistentes con un enírecruzamienfo simple eníre las dos secuencias Oxa en regiones locales de homología, varios recombinantes aislados en el antecedente de msh2 exhibieron mayor complejidad. Las secuencias derivadas de cuaíro recombinaníes (Ura+CanR #16 y #31 de MXY66, y Trp+CyhR #5 y #9 de MXY66) exhibieron un mayor grado de formación de mosaico, como si fueran producidos por más de un evento de enírecruzamienío. En realidad, el análisis de dos de esíos recombinaníes fue complicado porque la inspección de los elecfroferogramas reveló la presencia de dos picos fraslapados en siíios múlíiples deníro de la región secuenciada, cada sifio correspondiente a un polimorfismo de Oxa7-Oxa11. Esía observación indica que la población de moléculas que fue secuenciada era heterogénea, para lo que la explicación más probable es la presencia de ADN heíeroduplex no reparado o parcialmente reparado preseníe en las esporas recombinanfes de msh2. Esía iníerpreíación es consistente con el conocido aumento de frecuencia de segregación postmeióíica (PMS) causado por la muíación msh2. En esíos dos casos, Ura+CanR #16 y #31 de MXY66, uno o más siíios reparados eslaba flanqueado por framos de helerodúplex no reparados, lo que es consistente con el desenmascaramienío de una acíividad de reparación de discordancias de parche corto en el antecedente de msh2, como lo sugieren Coic, Gluck y Fabre (EMBO J. 19: 3408). También se observaron oíros casos de PMS no asociados con reparación de discordancias de parche corto para secuencias recombinaníes de msh2, indicando que este sistema alíernaíivo de reparación de discordancias puede no ser muy eficiente para corregir las discordancias en ADN heíerodúplex. Considerando los elecíroferogramas de secuencia, la magniíud del heíerodúplex no corregido varió de una región corta de aproximadamente 50 ni a una región que casi cubre lodo el ORF. No se encontró evidencia de PMS ni reparación de discordancias de parche corto en las secuencias recombinaníes de íipo silvesíre. En general, esíos hallazgos sugieren que la magnitud de la diversidad creada es mayor en la meiosis de msh2 que en la meiosis de tipo silvestre. También se derivaron recombinantes meióticos de diploides de íipo silvesíre y msh2 que conlienen subsfraíos de recombinación que comparten 78% de homología (MXY99 y MXY102, respecíivameníe). En íofal, se analizaron 24 secuencias recombinaníes derivadas de la progenie de Oxa5-Oxa11 : cinco recombinaníes Ura+CanR y íres Trp+CyhR de MXY99, y nueve recombinaníes Ura+CanR y siete Trp+CyR de MXY102. La inspección de estas secuencias sugiere varias tendencias: (1 ) Las secuencias recombinantes de Oxa obtenidas en las dos cepas, de lipo silvesíre y msh2, por selección sobre -Trp+CyhR exhibieron entrecruzamientos en diferentes posiciones en todo el ORF, quizás con una ligera tendencia a la región media de 250 pb (ni 33- ni 573) de homología general compartida. En coníraste, los recombinaníes obtenidos en las dos cepas, de tipo silvestre y msh2, por selección sobre -Ura+CanR exhibieron un sesgo pronunciado en las posiciones de entrecruzamieníos: en 3 de 5 secuencias de tipo silvestre y en 8 de 9 secuencias de mash2 ocurrieron entrecruzamieníos deníro de los úlíimos 80 nt de la región de homología compartida, esto es, el último 10% del ORF. (2) Los intervalos de homología absoluta en los que se identificaron entrecruzamieníos, variaron de 11 a 20 ni para la selección -Trp+Cyh, indicando una preferencia por esías regiones relaíivamente más grandes de ¡denudad de secuencia. En contraste, los intervalos de entrecruzamienlo fueron más cortos para la selección -Ura+Can, que varían de 3 a 17 nt (13/14 de estos involucraron intervalos de 13 nt y más cortos). (3) En cuanto a la recombinación que involucra 95% de homología, las nuevas secuencias obtenidas íambién consisfían de ORF's iníaclos y pofencialmeníe codifican proteínas Oxa novedosas. (4) No se enconíraron casos de PMS, según una inspección de elecíroferogramas para los recombinaníes de íipo silvesíre, pero se enconíraron parches muy cortos de heterodúplex no reparado para unos pocos recombinantes de msh2, ¡ncluyendo 3 de los 7 recombinaníes Trp+CyhR. Esías regiones incluían cuando mucho 67 ni, más cortas que algunos de los fracíos observados para los recombinaníes de Oxa7-Oxa11. En resumen, esías observaciones indican que las secuencias recombinaníes se pueden seleccionar de subsíraíos de recombinación iniciales que varían en por lo menos 22%, y que esías secuencias codifican proteínas novedosas. 2.7 Análisis de secuencia de recombinaníes de Oxa7-Oxa11 de segunda ronda La capacidad del sistema de levadura para aumeníar la diversidad de secuencia de una manera iterativa se probó construyendo diploides de haploides recombinanfes de Oxa7-Oxa11 generados en una primera ronda de meíosis, y someíiendo esíos nuevos diploides a una segunda ronda de meiosis. Eníre la progenie Ura+CanR y Trp+CyhR secuenciada de MXY64 y MXY66, se seleccionaron pares de recombinaníes apropiados con enírecruzamieníos en el mismo iníervalo, para consíruir diploides nuevos en los que el grado general de homología de secuencia era nuevamente de 95%. Se crearon íres diploides de íipo silvesíre (MXY81 , MXY82 y MXY83) y fres de msh2 (MXY86, MXY87 y MXY88). También se consíruyeron diploides de conírol de íipo silvesíre y msh2 que contenían solo insertos de secuencia de Oxa11 de la progenie recombinaníe apropiada de MXY60 y MXY62, produciendo MXY90 y MXY92. Esíos diploides se esporularon y las esporas se sembraron en placas sobre un medio que carece de uracilo y que coníiene cicloheximida (-Ura+Cyh), y sobre un medio que carece de íripíófano y que contiene canavanina (-Trp+Can), para seleccionar los recombinantes de la segunda ronda. Como se muestra en la figura 6, las frecuencias de las colonias de esporas de -Ura+CyhR y Trp+CanR observadas en tedas estes cepas es consistente con el efecto de aníirrecombinación del gen MSH2. Los dos íipos de colonias se enconlraron eníre la progenie de MXY90 homocigóíico de fipo silvesíre a frecuencias superiores a 10"3, mienfras que esías frecuencias disminuyeron de 5 a 10 veces enfre la progenie de los diploides de íipo silvesíre con heíerología de inserto de Oxa (MXY81 , MXY82 y MXY83). La inacíivación del gen MSH2 en diploides con insertos de Oxa divergeníes (MXY86, MXY87 y MXY88) produce un aumento de 2 a 6 veces de la frecuencia de las colonias de esporas Ura+CyhR y Trp+CanR, similar a los valores observados para un diploide msh2 que lleva insertos de Oxa idéníicos (MXY92). Aunque los medios usados difieren de los usados para la selección de los recombinaníes de la primera ronda, las frecuencias a las que se seleccionaron los recombinaníes de íipo silvesíre y de msh de la segunda ronda, son comparables con las de los recombinanfes de la primera ronda. Se seleccionaron para secuenciación colonias de esporas de Ura+CyhR y Trp+CanR en los antecedentes íanío de íipo silvesíre (MXY81 y MXY83) como de msh2 (MXY86). En íoíal se secuenciaron 14 insertos de Oxa de íipo silvesíre y 7 de msh2. En la mayoría de los casos ocurrió un enfrecruzamienlo en un intervalo novedoso durante la segunda ronda de recombinación, nuevamente sin sesgo aparente con respecto a la posición o famaño del iníervalo: los enírecruzamieníos que implicaron intervalos diferentes se encontraron en todo el ORF de Oxa y ocurrieron en intervalos ían grandes como de 101 ni, y ían pequeños como de 5 nt. En un caso (un haploide Trp+CyhR de MXY83) ocurrió una segunda ronda de entrecruzamienío en el iníervalo de enírecruzamienío de la primera ronda, resíaurando así una secuencia compleía de Oxa11. Los recombinanles recuperados de los diploides msh2 fueron más diversos que los recuperados de las cepas de íipo silvesíre. Del diploide msh2 de MXY86 se observaron varias colonias de esporas que exhibieron una extensa PMS y formación de mosaico de secuencia, lo que es consisíeníe con la formación de íracíos largos de heíerodúplex en el intermediario recombinacional. Además, algunas discrepancias se repararon en el íracío heterodúplex, nuevamente consisteníe con una acfividad de reparación de discordancias de parche corto. En resumen, la segunda ronda de recombinación en el antecedente de msh2 es ían eficieníe como la primera ronda de recombinación, ambas cualifaíivameníe con respecto a la generación de diversidad de secuencia (por ejemplo, disfribución de intervalo de enírecruzamienío e incidencia de PMS), y cuaníiíalivamenle con respecte al aumento de la frecuencia general de recombinación homologa (5% de divergencia).

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- Un proceso para generar y detector secuencias de ADN recombinaníe en Saccharomyces cerevisiae, que comprende los pasos de: (a) generar primeras células diploides de S. cerevisiae que llevan en un locus definido de su genoma un primer cassette de recombinación, que comprende una primera secuencia de ADN por recombinar que esíá flanqueada por lo menos por una primera y una segunda secuencia marcadora, y en una posición alélica un segundo cassette de recombinación que comprende una segunda secuencia de ADN por recombinar, que esíá flanqueada por lo menos por una tercera y una cuarta secuencia marcadora; (b) inducir la esporulación de las primeras células diploides obíenidas en (a); y (c) aislar las células haploides que coníienen los cassettes de recombinación en los que las primeras secuencias de ADN recombinado esíán flanqueadas por al menos la primera y la cuarta secuencia marcadora, y las células haploides que coníienen los cassettes de recombinación en los que las segundas secuencias de ADN recombinado esíán flanqueadas por al menos la segunda y la tercera secuencia marcadora. 2.- El proceso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque también comprende los pasos de: (a) generar segundas células diploides acoplando las células haploides que coníienen las primeras secuencias de ADN recombinado obíenidas en 1c), con células haploides que coníienen las segundas secuencias de ADN recombinado obtenidas en 1c); (b) inducir la esporulación de las segundas células diploides obíenidas en (a); y (c) aislar las células haploides que coníienen los casseííes de recombinación en los que las terceras secuencias de ADN recombinado esíán flanqueadas por al menos la primera y la segunda secuencia marcadora, y las células haploides que coníienen los cuartos cassettes de recombinación en los que las cuartas secuencias de ADN recombinado están flanqueadas por al menos la tercera y la cuarta secuencia marcadora. 3.- El proceso de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracíerizado además porque se generan secuencias de ADN recombinado adicionales someíiendo las células haploides obíenidas en 2c) a por lo menos olro ciclo de acoplamiento con oirás células haploides, induciendo la esporulación de las células diploides obíenidas, y aislando las células haploides con secuencias de ADN recombinado en base al enlace molecular eníre dos secuencias marcadoras. 4.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracíerizado además porque la primera célula diploide se genera íransformando simulíánea o secuencialmeníe una célula diploide de S. cerevisiae con una molécula de ADN que coníiene el primer cassette de recombinación y una molécula de ADN que confiene el segundo cassette de recombinación, y opcionalmenfe permiliendo la integración de los dos cassettes de recombinación en posiciones alélicas del genoma de S. cerevisiae. 5.- El proceso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la molécula de ADN que comprende el primer o segundo cassette de recombinación es un cromosoma artificial de levadura (YAC). 6.- El proceso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la molécula de ADN que comprende el primer o segundo cassette de recombinación es un vehículo de clonación, con lo cual las dos secuencias marcadoras respectivas son flanqueadas por secuencias de dirección que son homologas para un locus definido del genoma de S. cerevisiae. 1 '.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque la primera célula diploide se genera fusionando una célula haploide de S. cerevisiae que lleva el primer cassette de recombinación en un locus de su genoma, con una célula haploide de S. cerevisiae que lleva el segundo cassette de recombinación en una posición alélica. 8.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracíerizado además porque la primera célula diploide se genera acoplando una célula haploide de S. cerevisiae que lleva el primer cassette de recombinación én un locus de su genoma, con una célula haploide de S. cerevisiae que lleva el segundo cassette de recombinación en una posición alélica. 9.- El proceso de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado además porque las células haploides que llevan el primer o segundo cassette de recombinación, se generan: (a) insertando la primera secuencia de ADN por recombinar entre la primera y la segunda secuencia marcadora localizada adyacentemente, en un primer vehículo de clonación, e insertando la segunda secuencia de ADN por recombinar eníre la tercera y la cuarta secuencia marcadora localizada adyacentemente, en un segundo vehículo de clonación, con lo cual las dos secuencias marcadoras respecíivas son flanqueadas por secuencias de dirección que son homologas a un locus definido del genoma de S. cerevisiae; (b) exlirpando de los vehículos de clonación obtenidos en (a) los fragmentos que llevan el primer cassette de recombinación y el segundo cassette de recombinación, respecíivamenfe, con lo que cada uno de los casseííes comprende la secuencia de ADN por recombinar, flanqueada por las dos secuencias marcadoras respecíivas, y a su vez cada cassette esíá flanqueado por secuencias de dirección; (c) íransformando separadamente los fragmentos que llevan los cassettes de recombinación con secuencias de dirección flanqueaníes obtenidos en (b), en células diploides de S. cerevisiae, con lo cual las secuencias de dirección dirigen la integración de los cassettes en el locus con el que son homologas, para obíener células diploides heíerocigóíicas para el primer cassette, o el segundo cassette; (d) induciendo separadamente la esporulación de las células diploides heíerocigóíicas obíenidas en (c); y (e) aislando las células haploides que coníienen el primer cassette y que expresan la primera y la segunda secuencia marcadora, y separadamente las células haploides que coníienen el segundo cassette y que expresan la tercera y la cuarta secuencia marcadora. 10.- El proceso de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el primer vehículo de clonación es el plásmido pMXY9, y el segundo vehículo de clonación es el plásmido pMXY12. 11.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-6, 9 o 10, caracterizado además porque las células diploides de S. cerevisiae usadas para la transformación son auxotróficas para al menos dos factores nutricionales. 12.- El proceso de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque las células diploides son homocigóíicas para el alelo ura3-1 y el alelo trp1-1, que las hacen auxoíróficas para uracilo y íripfófano, respectivamente. 13.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-6 o 9-12, caracterizado además porque las células diploides usadas para la fransformación son resisíeníes por lo menos a dos aníibióíicos. 14.- El proceso de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque las células diploides son homocigóíicas para el alelo can 1-100 y el alelo cyh2R, que las hacen resistentes a la canavanina y la cicloheximida, respecíivameníe. 15.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4-6 o 9-14, caracíerizado además porque se usan células diploides de la cepa MXY47 de S. cerevisiae para la íransformación, que son homocigóticas para los alelos ura3-1, trp1-1, can1-100 y cyh2R, y heferocigóficas para la muíación msh2::KanMX. 16.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado además porque las células de S. cerevisiae tienen un sisíema de reparación de discordancias funcional. 17.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracíerizado además porque las células de S. cerevisiae son transitoria o permanentemente deficientes en el sistema de reparación de discordancias. 18.- El proceso de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque la deficiencia íransiíoria o permanente del sisíema de reparación de discordancias se debe a una muíación, o la expresión o represión inducible de uno o más genes involucrados en el sisíema de reparación de discordancias, o a un iralamienío con un ageníe que saíura el sistema de reparación de discordancias, o a un fraíamienío con un ageníe que deteriora globalmenfe la reparación de discordancias. 19.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, caracíerizado además porque el primer y segundo cassette de recombinación se iníegran en el locus BUD31-HCM1 del cromosoma lll del genoma de S. cerevisiae. 20.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracíerizado además porque la primera y segunda secuencia de ADN por recombinar difieren por al menos 1 nucleótido. 21.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, caracterizado además porque la primera y segunda secuencia de ADN por recombinar se derivan de organismos que incluyen S. cerevisiae y otros diferentes. 22.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21 , caracíerizado además porque la primera y segunda secuencia de ADN por recombinar comprenden una o más secuencias no codificadoras o una o más secuencias codificadoras de proíeína. 23.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracierizado además porque las secuencias marcadoras se seleccionan del grupo que consisíe de marcadores nulricionales, marcadores de pigmento, marcadores de resistencia de antibiótico, marcadores de sensibilidad de antibiótico, sitios de reconocimiento de iniciador, fronteras intrón/exón, secuencias que codifican una subunidad particular de una enzima, secuencias promotoras, secuencias de gen reguladas en dirección 3', y siíios de enzima de resíricción. 24.- El proceso de conformidad con la reivindicación 23, caracíerizado además porque la primera y la íercera secuencia marcadora son marcadores nuíricionales cuyos producios génicos pueden compensar una auxoírofia de una célula de S. cerevisiae. 25.- El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la primera secuencia marcadora es URA3, cuyo producto génico puede conferir protoírofia de uracilo a una célula de S. cerevisiae auxotrófica de uracilo. 26.- El proceso de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la tercera secuencia marcadora es TRP1, cuyo producto génico puede conferir protoírofia de íriplófano a una célula de S. cerevisiae auxoírófica de íripíófano. 27.- El proceso de conformidad con la reivindicación 23, caracíerizado además porque la segunda y la cuarta secuencia marcadora son marcadores de sensibilidad de antibiótico, cuyos producios génicos pueden conferir sensibilidad a un aníibióíico a una célula de S. cerevisiae que es resistente a ese antibiótico. 28.- El proceso de conformidad con la reivindicación 27, caracíerizado además porque la segunda secuencia marcadora es CAN1, cuyo produelo génico puede conferir sensibilidad a la canavanina a una célula de S. cerevisiae resistente a la canavanina. 29.- El proceso de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la cuarta secuencia marcadora es CYH2, cuyo producto génico puede conferir sensibilidad a la cicloheximida a una célula de S. cerevisiae resistente a la cicloheximida. 30.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado además porque las células haploides que contienen los cassettes de recombínación con la primera, segunda, tercera o cuarta secuencia de ADN recombinado, se identifican mediante procedimientos de PCR para detectar la presencia de la combinación marcadora respectiva. 31.- El proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado además porque las células haploides que contienen los cassettes de recombinación con la primera, segunda, tercera o cuarta secuencia de ADN recombinado, se identifican cultivando las células haploides en placas con medios que seleccionan el enlace molecular en la misma molécula de ADN de la combinación marcadora respectiva. 32.- El proceso de conformidad con la reivindicación 31 , caracíerizado además porque las células haploides que coníienen las primeras secuencias de ADN recombinado se cultivan en placas con un medio que selecciona el enlace molecular en la misma molécula de ADN de la primera y cuarta secuencia marcadora. 33.- El proceso de conformidad con la reivindicación 31 , caracierizado además porque las células haploides que coníienen las segundas secuencias de ADN recombinado se cultivan en placas con un medio que selecciona el enlace molecular en la misma molécula de ADN de la segunda y tercera secuencia marcadora. 34.- El proceso de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizado además porque' las células haploides que contienen las terceras secuencias de ADN recombinado se cultivan en placas con un medio que selecciona el enlace molecular en la misma molécula de ADN de la primera y segunda secuencia marcadora. 35.- El proceso de conformidad con la reivindicación 31 , caracíerizado además porque las células haploides que coníienen las cuartas secuencias de ADN recombinado se cultivan en placas con un medio que selecciona el enlace molecular en la misma molécula de ADN de la íercera y cuarta secuencia marcadora. 36.- El plásmido pMXY9, que comprende adyacentemente el gen marcador URA3 y el gen marcador CAN1, con el cual las dos secuencias marcadoras flanquean una secuencia polienlazadora para insertar una secuencia de ADN por recombinar, y con el cual los dos marcadores son flanqueados por secuencias de dirección homologas al locus BUD31-HCM1 del cromosoma lll del genoma de S. cerevisiae. 37.- El plásmido pMXY9 de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado además porque la secuencia polienlazadora comprende sitios de restricción para las enzimas de restricción Smal, Xbal, Pací y Bgl\\. 38.- El plásmido pMXY12, que comprende adyacentemente el gen marcador TRP1 y el gen marcador CYH2, con el cual las dos secuencias marcadoras flanquean una secuencia polienlazadora para insertar una secuencia de ADN por recombinar, y con el cual los dos marcadores son flanqueados por secuencias de dirección homologas al locus BUD31-HCM1 del cromosoma lll del genoma de S. cerevisiae. 39.- El plásmido pMXY12 de conformidad con la reivindicación 38, caracíerizado además porque la secuencia polienlazadora comprende sitios de restricción para las enzimas de resíricción Smal, Spel y Pací. 40.- La cepa MXY47 de S. cerevisiae, caracterizada porque células diploides de la misma son homocigóticas para los alelos ura3-1, trp1-1, can1-100 y cyh2R, y heterocigóticas para la mufación msh2::KanMX. 41.- La cepa JM101 de E. coli, que coníiene el plásmido pMXY9. 42.- La cepa DH5a de E coli, que coníiene el plásmido pMXY12. 43.- Un equipo que comprende por lo menos un primer recipieníe que comprende células de la cepa MXY47 de S. cerevisiae, un segundo recipiente que comprende células de la cepa JM101 de E. coli que contiene el plásmido pMXY9, y un tercer recipieníe que comprende células de la cepa DH5a de E. coli que coníiene el plásmido pMXY12. 44.- Un equipo que comprende por lo menos un primer recipiente que comprende células de la cepa MXY47 de S. cerevisiae, un segundo recipieníe que comprende ADN del plásmido pMXY9, y un íercer recipieníe que comprende ADN del plásmido pMXY12.