JP4874124B2 - サッカロマイセス・セレビジエにおける組換え遺伝子の産生 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

（技術分野）
本発明は、一般に、サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）における組換えＤＮＡ配列を産生および検出する方法、ならびに、本発明の方法を行うために用いられるプラスミドおよびエス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞に関する。

これらの方法に関連するＤＮＡ配列は、タンパク質をコードしている配列および非翻訳配列を含む；それらはまた、生合成経路に属するような、介在する非翻訳配列を有する１以上の翻訳領域を含む、より大きな連続した範囲から構成されるものであってもよい。

（背景技術）
酵素や他のタンパク質などの物質の微生物的および酵素的な生産は、重要な経済的論題である。酵素は生体触媒として活性なタンパク質であり、天然の化合物および生体の代謝に責任を負うだけでなく、天然および非天然化合物の工業的な生産にも用いられている。酵素または酵素の助けにより生産されるこれらの化合物は、薬剤、化粧品、食品などの製造に用いることができる。しかしながら、酵素の工業的な使用は、それらの標的特異性とそれらが機能することができる特異的な条件のために大いに妨げられている。他のタンパク質は、ヒトおよび動物の健康の領域において治療上の効果を有する。医療上重要なタンパク質の重要なクラスに、サイトカイニンおよび成長因子がある。

新規なまたは改良された機能および特性を有するタンパク質、酵素および経路は、大部分が知られていない天然の種を調べたり、現在知られている天然のタンパク質や酵素を改良したりすることにより得ることができる。後者の試みは、天然の進化の過程が選択されそうにない性質を創作するのにより適しているであろう。

このような新規な望ましい特性を作り、酵素、他のタンパク質、非翻訳配列または経路を再設計するための有望な一つの戦略は、定方向分子進化を用いることである。従来法では、ＤＮＡ配列の定方向進化は、部位特異的変異導入法、多部位またはカセット変異導入法、ランダム変異導入法およびエラープローンＰＣＲなどの手法により達成されてきた。近年、酵素やタンパク質の性質を最適化または調整する遺伝子シャッフリングのアプローチが大いに注目されている。これらの定方向進化技術は、既存の技術を改良することができ、新しい製品を作ることができ、合成化学の能力を広げることができる酵素を製造することができる。

ランダム変異導入法、部位特異的変異導入法、オリゴヌクレオチドカセット変異導入法またはエラープローンＰＣＲによるポイント変異導入法などの多くの異なる変異導入法が存在する。例えばランダム変異導入法は、亜硝酸、ヒドラジンなどの化学薬品で処理することによって、クローン化ＤＮＡ断片中にランダムに分布するヌクレオチドの置換変異が多数生成する。エラープローンＰＣＲはランダムポイント変異をクローン化ＤＮＡに導入するために開発された。ＰＣＲ反応の正確さを減少させる変更には、ＭｇＣｌ_２濃度を増加させること、ＭｎＣｌ_２の添加または４つのｄＮＴＰの相対的な濃度を変化させることがある。

これらの従来の変異導入法は、別々の選択できる表現型を有する遺伝子の最適化に焦点を合わせている。一般的な戦略は、遺伝子をクローン化し、その遺伝子について個々の機能を特定し、それによりモニターすることができる測定法を確立し、遺伝子の選択した位置に変異を導入し、その遺伝子の既知の機能を改良するための遺伝子の変異体を選択する。改良された機能を有する変異体は、その後望まれる細胞型において発現されうる。
望ましい酵素特性を得るために変異導入法のサイクルを繰り返し行うことができる。

これらの従来の各アプローチは、間接的な配列探索戦略を持っている。配列探索の上記の技術において用いられるその戦略は、非常に異なっている。飽和している部位特異的変異導入法探索を行うことは、興味のある部位に全ての可能な変更をインストールする工程を含む。タンパク質に関しては、この手順は興味ある部位のアミノ酸を１９の他の全てのアミノ酸で置換すること、および、改良された変異体のために結果として生じるライブラリーを調査することからなる。配列空間の点からは、これは、非常に小さな領域を徹底的に調べることを意味する。比較すると、カセット変異導入法は、任意のポリペプチド配列をタンパク質の特定の部位に挿入し、配列空間のより広い、限定された範囲の徹底的でないサンプリングを与える。エラープローンＰＣＲは、配列を繰り返し複製し、少ないが重要な数の誤りを導入する。この場合、配列空間のあまり限定されない領域のまばらなサンプリングが達成される。これらの各戦略において、選択の各ラウンドにおいて得られた最も良い変異体が、次のラウンドを開始するために用いられる。

しかしながら、酵素における新しい性質を進化させるための伝統的な変異導入法のアプローチは、多くの限界を有している。第一に、それらはクローン化され、機能的に特徴づけられた遺伝子または配列にのみ適用することができる。第二に、これらのアプローチは通常個別的な機能を有する遺伝子に対してのみ適用することができる。それゆえ、協同して一つの表現型を与える複数の遺伝子は、通常この方法では最大限に利用することができない。最後に、これらのアプローチは、単一の遺伝子に対してさえ、変更の総数のなかの非常に限られた数しか調べることができない。これらの限界の観点から、従来の変異導入アプローチは、多くの有益な特性に関して細胞のゲノムを改良させるために適当でない。例えば、タンパク質を発現する細胞の能力を改良するためには、転写効率、翻訳および翻訳後修飾、遺伝子産物の分泌またはタンパク質分解を変化させる必要がある。このため、新たな性質を有するタンパク質を発現させるためには、これらの細胞メカニズムにおいて１または２以上の役割を有するさらなる遺伝子を改造する必要があるであろう。このような機能を有する全ての遺伝子を個々に最適化しようとしても、事実上不可能な作業であろう。

従来の変異導入アプローチに関する多くの問題点は、遺伝子シャッフリングのアプローチによって解決される。遺伝子シャッフリングは、機能性遺伝子の異なる配列のランダムな組換えを伴い、天然と同様のまたはランダムに変異された遺伝子の分子混合を可能にする。ＤＮＡもしくは遺伝子シャッフリングまたはこれらの技術の変形は、酵素の活性、安定性、折りたたみおよび基質認識特性を向上するために用いられてきた。従来の変異導入法のアプローチと遺伝子シャッフリングとを比較すると、改良された表現型を有する変異体を得られる可能性が著しく高い。遺伝子シャッフリングは、コンビナトリアル方法において好ましい変異体を組換える点において根本的に従来の戦略と異なっている。したがって、機能性配列の作製に向かって、非常にまばらな配列空間のはるかに広い領域を探索する。それはまた、配列情報が１より多い出所から与えられるのを許容するので、選択の各ラウンドからのより有益な変異が次のラウンドで保有されるのを許容する。従来の戦略はまた、ネガティブ変異の固定を許容するが、これは遺伝子シャッフリングアプローチにはあてはまらない。それゆえ、遺伝子シャッフリング戦略が非常に多くの劇的な結果を生み出していることは驚くべきことではない。

（発明の開示）
ＤＮＡまたは遺伝子シャッフリングアプローチは、ある相同性を有する部位間のまたは同一の範囲間の組換え現象に基づいている。真核生物における遺伝子組換えを調べるための実験で用いられる重要な生物は、出芽酵母のサッカロマイセス・セレビジエである。単純な単細胞生物におけるこれらの過程の研究は、ＤＮＡ配列の操作が容易であるという明白な利点と、細胞の大部分において同時に誘導される特異的な組換え現象を研究できる可能性を有する。さらに、先の数十年に渡って発酵技術およびこの生物の基礎的な遺伝子学における専門知識の財産が蓄積されてきた。そしてこれは、現在分子レベルで最も良く研究されている真核生物である。その非病原性の性質、その分泌の技量およびそのグリコシル化の潜在能力によって、エス・セレビジエは遺伝子クローニングおよび遺伝子発現のための好ましいホスト（宿主）生物である。それゆえ、本発明の基礎を成す技術的な問題は、サッカロマイセス・セレビジエにおける組換えモザイク遺伝子の産生のための方法および手段を提供することである。

本発明は、この根底にある技術的な問題を、
サッカロマイセス・セレビジエにおける組換えＤＮＡ配列の産生および検出方法であって、
ａ）ゲノムの定められた遺伝子座に、少なくとも第一のおよび第二のマーカー配列に隣接する組換えられるべき第一のＤＮＡ配列を含む第一の組換えカセット、および、対立遺伝子座に、少なくとも第三のおよび第四のマーカー配列に隣接する組換えられるべき第二のＤＮＡ配列を含む第二の組換えカセットを有している第一の二倍体エス・セレビジエ細胞を産生する工程、
ｂ）ａ）で得られた第一の二倍体細胞の胞子形成を誘導する工程、および、
ｃ）そこにおいて第一の組換えＤＮＡ配列が少なくとも第一のおよび第四のマーカー配列に隣接する組換えカセットを含む一倍体細胞、および、そこにおいて第二の組換えＤＮＡ配列が少なくとも第二のおよび第三のマーカー配列に隣接する組換えカセットを含む一倍体細胞を単離する工程：
を含む、方法を提供することにより解決する。

本発明は、少なくとも２つの異なるＤＮＡ配列間の組換え現象を調べるための酵母を基礎としたシステムを提供する。このシステムは、一倍体期と二倍体期とが交互に起こるエス・セレビジエの有性生殖を基礎としている。本発明の方法の第一の工程では、二倍体エス・セレビジエ細胞が産生され、そしてそれらはこれらの組換え基質に対してヘテロ接合性である。組換えられるべきＤＮＡ配列は、二倍体エス・セレビジエのゲノム中で対立遺伝子座に組み込まれる。

組換えられるべき各ＤＮＡ配列は組換えカセットの形態に組み込まれ、そしてそれはこのＤＮＡ配列に隣接する少なくとも２つのマーカー配列を、このＤＮＡ配列の近くに含み、これによってこの２つの組換えカセットは少なくとも４つの異なるマーカー配列を含む。

このように得られたヘテロ接合性の二倍体細胞を、次いで減数分裂および胞子形成の過程を誘導する環境下で生育させる。減数分裂は、遺伝子組換えの頻度を高めることが一般的な特徴であり、そしてそれは、減数分裂Ｉ分裂前期において早期に誘導される二重鎖切断（ＤＳＢ）の成立およびそれに続く修復を経て開始される。酵母の減数分裂細胞はそれゆえ特に興味深い。なぜなら、ゲノム全体にわたるＤＳＢの誘導の結果、高レベルの組換えを経験するからである。このように、減数分裂の第一ラウンドの産物は、各減数分裂現象について親の二倍体細胞により産生された４つの一倍体細胞または胞子であるが、２つの異なるＤＮＡ配列間の組換えによる組換えられたＤＮＡ配列を含みうる。

減数分裂の間に起こる２つの異なるＤＮＡ配列間の組換えは、フランキング（隣接する）マーカー配列の交換をも導く。したがって、本方法は組換え基質に隣接するマーカー配列の交換が起こった個々の細胞又は分子を選択することによって、敏速で簡単に組換えＤＮＡ配列の確認をすることができる。したがって、減数分裂の第一ラウンドの後得られた組換え体は、第一の組換えカセットの少なくとも１つのマーカー配列および第二の組換えカセットの少なくとも１つのマーカー配列を含む、および／または、発現するという特徴を有する。特に、組換え胞子は、第一の組換えカセットの第一のマーカー配列および第二の組換えカセットの第四のマーカー配列、または、第一の組換えカセットの第二のマーカー配列および第二の組換えカセットの第三のマーカー配列を含むことがであり、それにより、両方の型の組換え胞子はこの異なるマーカーの組合せの近くに、異なる組換えＤＮＡ配列をも含む。組換え配列を含む両方の型の胞子は、減数分裂の間の組換えにより産生された新しい組換えマーカーの配置の選択を可能とする条件下で容易に選択され、区別される。

本発明の方法は野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）またはミスマッチ（不適正塩基対）修復欠損エス・セレビジエ細胞のいずれにおいても行うことができる。損傷したＤＮＡが修復される過程および遺伝子組換えのメカニズムは深く関わっており、ミスマッチ修復の仕組みは、異なる配列間の組換え頻度に対して、すなわち相同的組換え（ｈｏｍｅｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に対して阻害効果のあることが知られている。したがって、ミスマッチ修復システムの変異は、酵母における組換えの全体的な頻度を大いに高める。一方、野生型のエス・セレビジエ細胞は、ミスマッチ修復依存の組換え機構をもっており、それは、２つの組換え基質中に離れて位置するミスマッチを基礎とするものである。組換えられるべきＤＮＡ配列によるが、野生型またはミスマッチ修復欠損エス・セレビジエ細胞のいずれも、組換え配列を得るために用いることができる。

本発明の方法は、反復的である、すなわち、さらなる組換えラウンドを許容するという利点を有する。減数分裂の第一ラウンドの産物、すなわち異なる組換えＤＮＡ配列を含む反対の交配型（ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ）の一倍体細胞は、組換えＤＮＡ配列にヘテロ接合性の二倍体細胞を得るために再度交配される。このように得られた二倍体細胞において、再度減数分裂が誘導され、それにより組換えＤＮＡ配列は、もう一度組換えられ、各組換え基質に隣接する２つのマーカーの交換が再度導かれる。２回目の減数分裂の後得られた新しい一倍体組換え体は、ここで最初の第一の組換えカセット中の第一のＤＮＡ配列に隣接するマーカー遺伝子または最初の第二の組換えカセット中の第二のＤＮＡ配列に隣接するマーカー遺伝子のいずれかの共発現によって、容易に確認されうる。

したがって本発明の好ましい実施形態においては、第二の二倍体細胞を産生するために、本発明の方法の第一ラウンドで得られた第一の組換えＤＮＡ配列を有する組換えカセットを含む一倍体細胞と、本発明の方法の第一ラウンドで得られた第二の組換えＤＮＡ配列を有する組換えカセットを含む一倍体細胞とを交配する。このように得られた第二の二倍体細胞において胞子形成が誘導され、結果として一倍体細胞が産生する。次の工程において、
そこにおいて第三の組換えＤＮＡ配列が少なくとも第一のおよび第二のマーカー配列に隣接する組換えカセットを含む一倍体細胞、および、そこにおいて第四の組換えＤＮＡ配列が少なくとも第三のおよび第四のマーカー配列に隣接する組換えカセットを含む一倍体細胞を単離する。

第三のおよび第四の組換えＤＮＡ配列を含む一倍体細胞について、さらなる交配および減数分裂／胞子形成のサイクルを１または２以上行うことにより、さらに組換えＤＮＡ配列を産生することができる。組換えの各ラウンドの後、組換え体はそれぞれ第一の組換え基質に隣接する少なくとも１つのマーカー配列および第二の組換え基質に隣接する少なくとも１つのマーカー配列が共に存在することにより、または、出発組換え基質において第一のまたは第二のＤＮＡ配列に隣接する２つのマーカーが共に存在することにより確認される。

したがって、本方法の有利な特性は、反復であることである：組換え一倍体の子孫は、個々にまたは全部一緒に選択され、そして互いに交配され、結果として生じた二倍体は再び胞子を形成し、そしてそれらの子孫胞子は、新しい組換え現象を特定するために適切な選択条件にかけられる。
本発明の方法を用いて、組換え変異配列の多量のライブラリーを容易に作製することができ、望まれる機能を有する変異体は、その後適切な選択またはスクリーニングシステムを用いることによって特定される。

本発明の好ましい実施形態においては、上記第一の二倍体エス・セレビジエ細胞が同時にまたは経時に第一の組換えカセットを含むＤＮＡ分子および第二の組換えカセットを含むＤＮＡ分子を用いて二倍体エス・セレビジエ細胞を形質転換することにより産生されたものであり、この２つの組換えカセットがエス・セレビジエ ゲノムの天然の染色体上の対立遺伝子座に組み込まれてもよい。用いられるＤＮＡ分子は、例えば、酵母人工染色体（ＹＡＣ）であってもよい。

ＹＡＣは、酵母細胞における安定維持に必要な全ての配列、酵母選択可能マーカーだけでなくセントロメア、ＤＮＡ複製起点およびテロメアなどを含む線状ＤＮＡ分子であるのが特徴である。酵母細胞に導入すると、ＹＡＣは天然の染色体と同じように作用するので、酵母ゲノムの一部とみなすことができる。本発明の文脈において、“ゲノム”の用語は細胞内に存在し、安定に維持され受け継がれる全ての遺伝性構成要素の全体を含む。ＹＡＣが第一のおよび第二の組換えカセットを二倍体エス・セレビジエ細胞に導入するためのＤＮＡ分子として用いられる場合、この２つの組換えカセットを天然の染色体の対立遺伝子座に組み込む必要がない。組換えカセットが天然の染色体に導入される場合、組換えカセットを有する断片を遊離することができるクローニング媒体、例えばプラスミドを用いることができる。好ましくは、上記２つの組換えカセットの２つのマーカー配列それぞれが、エス・セレビジエ ゲノムの定められた遺伝子座と相同の標的配列に隣接することである。また、複製起点を含まないＤＮＡ分子を用いることができる。この場合、ＤＮＡ分子はゲノムの構成要素に組み込まれなければならず、したがってエス・セレビジエ ゲノムの定められた遺伝子座と相同の標的配列を含まなければならない。

本発明の別の好ましい実施形態は、上記第一の二倍体エス・セレビジエ細胞がゲノムの定められた遺伝子座に第一の組換えカセットを有している一倍体細胞と、ゲノムの対立遺伝子座に第二の組換えカセットを有しているエス・セレビジエ一倍体細胞とを融合することにより産生されたものであることである。

本発明のさらに別の好ましい実施形態は、上記第一の二倍体エス・セレビジエ細胞がゲノムの定められた遺伝子座に第一の組換えカセットを有している一倍体細胞とゲノムの対立遺伝子座に第二の組換えカセットを有している反対の交配型の一倍体細胞とを交配することにより産生されたものであることである。

本発明の文脈において、“交配”および“融合”の単語は、異なる組換えカセットを含む２つの一倍体細胞の故意のまたはランダムな結合を意味する。望まれる性質を有する反対の交配型の選択されたおよび／または単離された２つの一倍体細胞を、交配および融合それぞれを刺激する条件下で接触させると、２つの一倍体細胞の故意の交配または融合が起こる。この２つの一倍体細胞は、例えば組換えられるべきＤＮＡ配列または既に組換えられたＤＮＡ配列を含む細胞の同じライブラリーに由来するものであってもよく、例えば組換えられるべきＤＮＡ配列または既に組換えられたＤＮＡ配列を含む細胞の異なるライブラリーに由来するものであってもよい。

多数の異なる一倍体細胞を交配および融合それぞれを刺激する条件下で接触させると、２つの一倍体細胞のランダムな交配または融合が起こる。多数の一倍体細胞は、例えば組換えられるべきＤＮＡ配列または既に組換えられたＤＮＡ配列を含む細胞の同じライブラリーに由来するものであってもよく、例えば組換えられるべきＤＮＡ配列または既に組換えられたＤＮＡ配列を含む細胞の異なるライブラリーに由来するものであってもよい。

組換えＤＮＡ配列を産生および検出する本発明の方法は、２以上の異なる配列を組換えることができるという利点を有する。例えば、４つの異なるＤＮＡ配列を組換えならば、本方法の第一の工程において異なる２組の二倍体エス・セレビジエ細胞が生成する。例えば、第一の組の二倍体細胞は、組換えられるべき第一のおよび第二のＤＮＡ配列を含む一倍体細胞を交配または融合することにより産生することができ、第二の組の二倍体細胞は、組換えられるべき第三のおよび第四のＤＮＡ配列を含む一倍体細胞を交配または融合することにより産生することができる。この２組の二倍体細胞が胞子を形成した後、第一のおよび第二のＤＮＡ配列の組換えによる組換えＤＮＡ配列を含む第一の二倍体細胞の組から得られた一倍体細胞と、第三のおよび第四のＤＮＡ配列の組換えによる組換えＤＮＡ配列を含む第二の二倍体細胞の組から得られた適切な一倍体細胞とを交配させる。この交配の産物は、胞子形成後、第一のＤＮＡ配列、第二のＤＮＡ配列、第三のＤＮＡ配列および第四のＤＮＡ配列の領域を含む組換えＤＮＡ配列を有する一倍体細胞を生じる二倍体細胞である。例えば、３つの異なるＤＮＡ配列を組換えるならば、本方法の第一の工程において、例えば、組換えられるべき第一のおよび第二のＤＮＡ配列を含む一倍体細胞を交配または融合することにより二倍体エス・セレビジエ細胞が生成する。これらの二倍体細胞が胞子を形成した後、このように得られた第一のおよび第二のＤＮＡ配列の組換えによる組換えＤＮＡ配列を含む一倍体細胞と、組換えられるべき第三のＤＮＡ配列を含む一倍体細胞とを交配または融合することができる。この交配の産物は、胞子形成後、第一のＤＮＡ配列、第二のＤＮＡ配列および第三のＤＮＡ配列の領域を含む組換えＤＮＡ配列を有する一倍体細胞を生じる二倍体細胞である。この方法で、５、６またはそれ以上の異なるＤＮＡ配列も組換えることができる。

好ましい実施形態では、第一のまたは第二の組換えカセットを有している一倍体エス・セレビジエ細胞が以下により産生されるものである：
ａ）組換えられるべき第一のＤＮＡ配列を、第一のクローニング媒体上に隣接して位置する第一と第二のマーカー配列の間に挿入し、組換えられるべき第二のＤＮＡ配列を第二のクローニング媒体上に隣接して位置する第三と第四のマーカー配列の間に挿入し、それにより２つのマーカー配列それぞれが、エス・セレビジエ ゲノムの定められた遺伝子座と相同の標的配列に隣接し、
ｂ）ａ）で得られたクローニング媒体から隣接する標的配列を有する第一の組換えカセットおよび第二の組換えカセットそれぞれを切り出し、それにより切り出した各断片がそれぞれの２つのマーカー配列および標的配列に隣接する組換えられるべきＤＮＡ配列を含み、
ｃ）第一のカセットまたは第二のカセットに対してヘテロ接合性の二倍体細胞を得るために、ｂ）で得られた断片を別々にエス・セレビジエ二倍体細胞に形質転換し、そこで、標的配列がそれらが相同である遺伝子座へのカセットの組み込みに作用し、
ｄ）ｃ）で得られたヘテロ接合性の二倍体細胞の胞子形成を別々に誘導し、および、
ｅ）第一のおよび第二のマーカー配列に隣接する第一のカセットを含む一倍体細胞、および、第三のおよび第四のマーカー配列に隣接する第二のカセットを含む一倍体細胞を別々に単離する。

本発明の好ましい実施形態では、第一のまたは第二のクローニング媒体中の２つのマーカー配列それぞれは、標的配列と隣接するが、この標的配列は、エス・セレビジエ ゲノムの染色体ＩＩＩ上のＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座と相同であり、切り出されたカセットのその遺伝子座への組み込みに作用するものである。

本発明の好ましい実施形態では、組換えカセットのクローニングに用いられるクローニング媒体は、プラスミドである。“プラスミド”は、自己複製することができる染色体外の構成要素である。プラスミドは物理的にそれが含まれている細胞のゲノムと非連結である。ほとんどのプラスミドは、二重鎖の環状ＤＮＡ分子である。他の実施形態では、クローニング媒体がＹＡＣである。

特に、第一の組換えカセットがクローンされる第一のクローニング媒体としてプラスミドｐＭＸＹ９を用いることが好ましい。プラスミドｐＭＸＹ９は、ＵＲＡ３マーカー遺伝子およびＣＡＮ１マーカー遺伝子を含む。このプラスミド中で、これらの２つのマーカー遺伝子は隣接して位置する。
この２つのマーカー配列の間には、組換えられるべきＤＮＡ配列を挿入するために、複数の制限部位、特に制限酵素ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩおよびＰａｃＩの認識部位が配置される。この２つのマーカー配列は、エス・セレビジエ ゲノムの染色体ＩＩＩ上のＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座と相同の標的配列に隣接する。

さらに、第二の組換えカセットがクローンされる第二のクローニング媒体としてプラスミドｐＭＸＹ１２を用いることが好ましい。プラスミドｐＭＸＹ１２は、ＴＲＰ１マーカー遺伝子およびＣＹＨ２マーカー遺伝子を含む。このプラスミド中で、これらの２つのマーカー遺伝子は隣接して位置する。この２つのマーカー配列の間には、組換えられるべきＤＮＡ配列を挿入するために、複数の制限部位、特に制限酵素ＳｐｅＩ、ＳｍａＩおよびＰａｃＩの認識部位が配置される。この２つのマーカー配列は、エス・セレビジエ ゲノムの染色体ＩＩＩ上のＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座と相同の標的配列に隣接する。

本発明の好ましい実施形態では、切り出された組換えカセットの形質転換に用いられる上記二倍体細胞が少なくとも二つの栄養因子に対する栄養要求性であり、少なくとも２つの抗生物質に耐性である。好ましくは、上記二倍体細胞が該細胞をウラシルおよびトリプトファンそれぞれに対する栄養要求性にするｕｒａ３−１対立遺伝子およびｔｒｐ１−１対立遺伝子に対してホモ接合性である。さらに、形質転換に用いられる上記二倍体細胞が該細胞をカナバニンおよびシクロヘキサミドそれぞれに耐性にするｃａｎ１−１００対立遺伝子およびｃｙｈ２Ｒ対立遺伝子に対してホモ接合性であることが好ましい。

特に、対立遺伝子ｕｒａ３−１、ｔｒｐ１−１、ｃａｎ１−１００およびｃｙｈ２Ｒに対してホモ接合性であり、ｍｓｈ２：：ＫａｎＭＸ変異に対してヘテロ接合性であるエス・セレビジエ菌株ＭＸＹ４７の二倍体細胞が形質転換に用いられることが好ましい。菌株ＭＸＹ４７の二倍体細胞が、組換えカセットおよびそれらに隣接する標的配列を有する切り出された第一のおよび第二の断片を用いた形質転換に用いられると、得られる形質転換体は胞子を形成し、各組換えカセットを有する一倍体の野生型またはｍｓｈ２分離個体を産生することができる。

本発明においては、本方法のために機能的ミスマッチ修復システムを有するエス・セレビジエ細胞を用いることが好ましい。ミスマッチ修復システムは、複製におけるＤＮＡポリメラーゼの間違いによる変異を回避するのに最も広く貢献するものに属する。ミスマッチの修復はまた、遺伝子組換えの正確さを校正することにより遺伝的な安定性を増進する。したがって、ミスマッチ修復の仕組みは、異なる配列間の組換えにいくぶん阻害効果を示すことが知られている。しかしながら、正常なエス・セレビジエ二倍体においてミスマッチ修復依存性組換えと呼ばれるミスマッチ修復の別の態様が発見されている(BortsおよびHaber, Science, 237 (1987), 1459-1465)。別の配列におけるような広い範囲にわたるミスマッチのミスマッチ修復は、新たな二重鎖の破壊を導くので、順番に(ミスマッチ修復依存性)組換えの第二ラウンドを刺激すると考えられている。

ある環境においては、特に、用いられる２つの組換え基質が広いスペースにわたる塩基の相違を有することが分かっているときには、それゆえ本発明の方法を行うために機能的ミスマッチ修復システムを有するエス・セレビジエ細胞を用いることが有用である。

本発明の別の好ましい実施形態においては、ミスマッチ修復システムを欠損しているエス・セレビジエが用いられる。エス・セレビジエにおいては、いくつかの遺伝子について、その産物がＭｕｔＳタンパク質の６つの相同体、すなわちＭｓｈ１、Ｍｓｈ２ｐ、Ｍｓｈ３ｐ、Ｍｓｈ４、Ｍｓｈ５およびＭｓｈ６ｐ、ならびに、ＭｕｔＬタンパク質の４つの相同体、すなわちＭｌｈ１ｐ、ＰＪｌＩｈ２ｐ、Ｍｌｈ３ｐおよびＰｍｓ１を含むバクテリアのミスマッチ修復タンパク質と相同性を有することが確認されている。特に、ＰＭＳ１およびＭＳＨ２遺伝子は異なる配列の組換えに障害をもたらすことが知られている。したがって、ｍｓｈ２およびｐｍｓ１変異体では、野生型の細胞における組換え頻度と比較して、異なる配列間の減数分裂の組換えが増加する。

本発明の文脈において“ミスマッチ修復システムにおける欠損”の用語は、細胞のミスマッチ修復システム（ＭＭＲ）が一過的にまたは持続的に損なわれていることを意味する。細胞または生物体のＭＭＲ欠損は、一過的または持続的にミスマッチ修復を損なわせるどのような手段によっても行うことができ、ミスマッチ修復に関わる１または２以上の遺伝子の変異、結果として包括的にミスマッチ修復を損なわせる紫外線のような手段を用いた処理；ＭＭＲシステムを一過的に飽和および不活性化するための２−アミノプリンまたは過度の量のミスマッチを含むヘテロ二重鎖のような薬剤による処理、およびミスマッチ修復に関わる１または２以上の遺伝子の誘導的な発現または抑圧、例えば、一過的に不活化できる、すなわち減数分裂の間は不活性化するが、栄養成長の期間は不活性化しない調節可能なプロモーターによるものを含むがこれらに限定されない。

本発明における好ましい実施形態では、エス・セレビジエ細胞のミスマッチ修復の欠損がＭＭＲに関わる少なくとも１つの遺伝子の変異によるものである。好ましい実施形態においては、エス・セレビジエ細胞がＭＳＨ２遺伝子を欠損している。好ましくは、二倍体細胞がｍｓｈ２対立遺伝子にホモ接合性であり、そこではＭＳＨ２をコードしている配列がＫａｎＭＸコンストラクトにより置換されている。

本発明の文脈において、“組換えカセット”の用語は、少なくとも２つの異なるマーカー配列と隣接している、少なくとも１つの組換え基質を含むＤＮＡ配列または組換えられるべきＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を意味する。第一のおよび第二の組換えカセットは、組換えられるべきＤＮＡ配列およびフランキングマーカー配列が異なるので、組換えカセットのどの一対も、２つの異なる組換えられるべきＤＮＡ配列および少なくとも４つの異なるフランキングマーカー配列を含む。

本発明の好ましい実施形態では、第一のおよび第二の組換えカセットはいずれも、それぞれの組換えられるべきＤＮＡ配列を、クローニング媒体上に近接して位置する２つのマーカー配列の間に挿入することによって産生され、順番にエス・セレビジエ ゲノムの定められた遺伝子座と相同の標的配列によって取り囲まれる。したがって、標的配列は、この組換えカセットを含む切り出された断片が定められた遺伝子座に組み込まれるように作用する。組換えられるべきＤＮＡの２つのマーカー配列の間への挿入は、遺伝子工学方法によって好適に達成される。本発明の好ましい実施形態において、クローニング媒体中の２つのマーカー配列は、エス・セレビジエ ゲノムの染色体ＩＩＩ上のＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座と相同の標的配列に隣接する。したがって、標的配列は組換えカセットを含む切り出された断片のその遺伝子座への組み込みに作用する。

本発明の文脈において、“組換えられるべきＤＮＡ配列”および“組換え基質”の用語は、減数分裂の組換え過程の結果として組換えられる２つのＤＮＡ配列どれをも意味し、そこでこれらの配列間の組換えは、相同的または非相同的組換えとなる。

いくつかの型の相同的組換え現象は、損傷したＤＮＡ分子が相同の相手と塩基対を形成することにより特徴づけられ、そして相互作用の範囲は、ほぼ完全に一致する何百個もの塩基対を含む。“相同性”の用語は、２つの核酸分子の配列間に存在する同一性の度合いを意味する。反対に、非正統的または非相同的組換えは、相補的塩基対を全く共有しないかまたはわずかに共有するＤＮＡ末端の接合により特徴付けられる。酵母では、非相同的修復および組換え現象は、相同的組換え現象より非常に低い頻度で起こる。

組換えられるべき第一のおよび第二のＤＮＡ配列は配列が異なる、すなわちそれらの配列は同一ではないが、ある程度の相同性を示す。これは、組換えられるべきＤＮＡ配列が少なくとも１ヌクレオチド異なるものであることを意味する。好ましくは、組換えられるべきＤＮＡ配列が、少なくとも１または２以上の、非常に短くてもよい相同性領域を共有する配列であることである。相同性領域は、少なくとも５−１０ヌクレオチド、好ましくは２０−３０ヌクレオチドより以上、より好ましくは３０−４０ヌクレオチドより以上、そして最も好ましくは５０ヌクレオチドより以上を含む。本発明の好ましい実施形態において、組換えられるべき第一のおよび第二のＤＮＡ配列が少なくとも１ヌクレオチド異なるものであり、特に０．１％より以上、好ましくは５％より以上から５０％より以上までである。これは、組換えられるべき第一のおよび第二のＤＮＡ配列が５５％、６０％、６５％またはさらに多く異なっていてもよいことを意味する。

組換え基質または組換えられるべきＤＮＡ配列は、天然または合成由来のものであってもよい。したがって、組換えられるべきＤＮＡ配列は、ウイルス、バクテリア、エス・セレビジエを含む菌類、動物、植物および人を含むいかなる天然の出所に由来するものであってもよい。
本発明の好ましい実施形態では、組換えられるべき第一のおよび第二のＤＮＡ配列が、エス・セレビジエ以外の生物体由来のものである。

本発明の好ましい実施形態では、組換えられるべきＤＮＡ配列がタンパク質をコードしている配列、例えば、天然または非天然化合物の工業的生産に用いることができる酵素をコードしている配列であることである。酵素または酵素の助けにより製造される化合物は、薬剤、化粧品、食品などの製造に使用することができる。タンパク質をコードしている配列はまた、ヒトおよび動物の健康の領域において治療上の効果を有するタンパク質をコードする配列であってもよい。

医療上重要なタンパク質のクラスに、サイトカイニンおよび成長因子がある。タンパク質をコードしている配列が組換えられると、変化した、好ましくは改良された機能および／または新たに獲得した機能を有するタンパク質をコードする新しい変異配列が生成する。この方法において、例えば、タンパク質の熱安定性の改良の達成、タンパク質の基質特異性の変化、その活性の改良、新しい触媒部位の開発および／または２つの異なる酵素からのドメインの融合が可能となる。

タンパク質をコードしている組換えられるべきＤＮＡ配列は、自然の状態では類似かまたは同一の機能を有する同じまたは類似するタンパク質をコードする異なる種由来の配列を含んでいてもよい。タンパク質をコードしている組換えられるべきＤＮＡ配列は、同じタンパク質または酵素ファミリー由来の配列を含んでいてもよい。タンパク質をコードしている組換えられるべき配列はまた、異なる機能を有するタンパク質の配列、例えば、代謝経路の異なる工程を触媒する酵素をコードしている配列であってもよい。本発明の好ましい実施形態では、組換えられるべき第一のおよび第二のＤＮＡ配列はＢ−ラクタマーゼのＯｘａスーパーファミリーの遺伝子配列の群から選択されるものである。

本発明の別の好ましい実施形態では、組換えられるべきＤＮＡ配列が非翻訳配列、例えば、自然の細胞状態でタンパク質をコードしている配列の発現の調節に関する配列であってもよい。
非翻訳配列の例としては特に限定されず、プロモーター配列、リボゾーム結合部位を含む配列、イントロン配列、ポリアデニル化配列などが挙げられる。このような非翻訳配列の組換えによって、細胞の環境において、結果として細胞の経過の調節を変化させる、例えば、遺伝子発現を変化させる変異配列を発展させることができる。

本発明において、組換え基質または組換えられるべきＤＮＡ配列はもちろん１より以上のタンパク質をコードしている配列および／または１より以上の非翻訳配列を含んでいてもよい。例えば、組換え基質として、あるタンパク質をコードしている配列に加えて非翻訳配列、または、種々のタンパク質をコードしている配列および種々の非翻訳配列の組合せを含んでいてもよい。したがって本発明の別の態様では、組換えられるべきＤＮＡ配列は非翻訳配列が介在するおよび／または隣接するコード配列の範囲１または２以上を含んでいてもよい。これは、例えば、その５´末端および／または非翻訳の３´領域に調節配列を有する遺伝子配列、または、エクソン／イントロン構造を有する哺乳類の遺伝子配列であってもよいことを意味する。また、本発明の他の実施形態では、組換えられるべきＤＮＡ配列は、生合成経路またはオペロンに関するような非翻訳配列が介在する１以上のコード配列を含むより大きな連続した範囲からなるものであってもよい。組換えられるべきＤＮＡ配列は、例えば、相同的および／または非相同的組換え現象のような１または２以上の組換え現象を既に経たものであってもよい。

組換え基質は、非変異の野生型ＤＮＡ配列および／または変異したＤＮＡ配列を含んでいてもよい。したがって好ましい実施形態では、新しい変異配列を開発するために既に変異配列が存在する野生型配列を組換えることも可能である。

本発明の文脈において“マーカー配列”の用語は、サッカロマイセス・セレビジエ細胞における組換え基質または既に組換えられたＤＮＡ配列の上流または下流に位置する特有のＤＮＡ配列を意味する。組換え基質または既に組換えられたＤＮＡ配列のようなＤＮＡの同じ分子上のマーカー配列は、組換え基質の他の側に位置する別のマーカー配列と一緒に存在することが好ましく、これにより分子法であろうと遺伝子法であろうと組換え基質または既に組換えられたＤＮＡ配列が認識され、選択されることになる。したがって、本発明の好ましい実施形態の一つでは、２つの異なる組換え基質に対してヘテロ接合性の細胞内に全部で少なくとも４つの異なるマーカー配列が存在するように、各組換え基質の上流に１または２以上のマーカー配列があり、各組換え基質の下流に１または２以上のマーカー配列がある必要がある。この配置では、組換え基質が関わる交叉の選択が起こる。また、反復型でさらなる組換えラウンドが行われる。本発明の別の好ましい実施形態では、１以上のマーカーを組換え基質の各側面に置くことができる。
例えば、マーカーを追加すると、選択の厳密性を増進させることができる。

マーカー配列は、タンパク質をコードしているまたは非翻訳のＤＮＡ配列を含んでいてもよい。本発明の好ましい実施形態では、タンパク質をコードしているマーカー配列が、栄養マーカー、色素マーカー、抗生物質耐性マーカー、抗生物質感受性マーカー、同じ細胞内で両方またはより多くのサブユニットが発現する場合にのみ機能する酵素の種々のサブユニットをコードしている配列からなる群より選択されるものである。本発明のさらに好ましい実施形態における分子非翻訳マーカー配列としては、プライマー認識部位、すなわちＰＣＲプライマーがアニールし、組換え体を増幅させる配列、イントロン／エクソン境界、プロモーター配列、下流調節遺伝子配列（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）および制限酵素部位が挙げられるがこれに限定されるものではない。

“栄養マーカー”は、生物または細胞の栄養要求性を補うことができる遺伝子産物をコードするマーカー配列であり、このように栄養要求性の生物または細胞に原栄養性を付与することができる。本発明の文脈において“栄養要求性”の用語は、栄養要求性の生物がそれ自身で合成できない必須栄養成分を含む培地で生物または細胞が生育されなければならないことを意味する。栄養マーカーの遺伝子産物は、栄養要求性細胞において欠損しているこの必須栄養成分の合成を促進する。したがって栄養マーカー遺伝子が発現すると生物や細胞は原栄養性を獲得するので、生物や細胞が生育する培地にこの必須栄養成分を添加する必要はない。

“色素マーカー”は、その遺伝子産物が色素の合成に関わるマーカー遺伝子であり、発現すると、色素マーカーが発現した細胞が染色される。色素マーカーがない細胞は色素を合成しないので、染色されない。したがって色素マーカーを用いると、色素マーカーを含む細胞の敏速な表現型の検出ができる。

“抗生物質耐性マーカー”は、その遺伝子産物が、抗生物質マーカー遺伝子の発現が起こった細胞に、特定の抗生物質が特定濃度で存在する場合に生育できる能力の発現を付与するが、抗生物質耐性マーカーをもたない細胞は生育できない。

“抗生物質感受性マーカー”は、その遺伝子産物が、特定の抗生物質が特定濃度で存在する場合に細胞が生育できる能力の発現を破壊するマーカー遺伝子である。

本発明の好ましい実施形態では、上記第一のおよび第三のマーカー配列の各遺伝子産物がエス・セレビジエ細胞の栄養要求性を補うことができる。好ましくは、上記第一のマーカー配列がＵＲＡ３であり、その遺伝子産物がウラシル栄養要求性エス・セレビジエ細胞にウラシル原栄養性を付与することができることである。好ましくは、上記第三のマーカー配列がＴＲＰ１であり、その遺伝子産物がトリプトファン栄養要求性エス・セレビジエ細胞にトリプトファン原栄養性を付与することができることである。

本発明の別の好ましい実施形態では、上記第二のおよび第四のマーカー配列の遺伝子産物がその抗生物質に耐性のエス・セレビジエ細胞に抗生物質への感受性を付与することができる。好ましくは、上記第二のマーカー配列がＣＡＮ１であり、その遺伝子産物がカナバニン耐性エス・セレビジエ細胞にカナバニン感受性を付与することができることである。好ましくは、上記第四のマーカー配列がＣＹＨ２であり、その遺伝子産物がシクロヘキサミド耐性エス・セレビジエ細胞にシクロヘキサミド感受性を付与することができることである。

本発明の別の好ましい実施形態では、マーカー配列がＰＣＲプライマーのためのアニーリング部位を含む。好ましくは、第一の、第二の、第三のおよび第四のマーカー配列がプライマーＫＮＳ１１、ＫＮＳ２８、ＫＮＳ１６およびＫＮＳ２９により認識される。

本発明の方法の好ましい実施形態では、第一の、第二の、第三のおよび第四のいずれかの組換えＤＮＡ配列を有する組換えカセットを含む一倍体細胞が、各マーカーの組合せの存在を検出するためにＰＣＲ法により確認される。

本発明の方法の別の好ましい実施形態では、第一の、第二の、第三のまたは第四のいずれかの組換えＤＮＡ配列を有する組換えカセットを含む一倍体細胞が、該一倍体細胞をそれぞれのマーカー配列の組合せと同じＤＮＡ分子上の存在を選択する培地上に植えられることにより確認される。これは、第一の組換えＤＮＡ配列を含む一倍体細胞が、第一のおよび第四のマーカー配列の存在を選択する培地上に植えられることを意味する。第二の組換えＤＮＡ配列を含む一倍体細胞が、第二のおよび第三のマーカー配列の存在を選択する培地上に植えられる。第三の組換えＤＮＡ配列を含む一倍体細胞が、第一のおよび第二のマーカー配列の存在を選択する培地上に植えられる。第四の組換えＤＮＡ配列を含む一倍体細胞が、第三のおよび第四のマーカー配列の存在を選択する培地上に植えられる。

本発明の別の態様は、新規なまたは改良された機能および性質を有する、新規なタンパク質、酵素、経路および非翻訳配列を産生する方法に関し、そこでは、本発明のエス・セレビジエにおける組換えＤＮＡ配列の産生または検出方法を用いて、既知のタンパク質をコードしている配列または既知の非翻訳配列について、１または２以上の組換えラウンドを行う。

本発明の別の態様は、プラスミドｐＭＸＹ９に関する。
プラスミドｐＭＸＹ９は、隣接するＵＲＡ３マーカー遺伝子およびＣＡＮ１マーカー遺伝子を含む。上記２つのマーカー遺伝子の間に、組み込まれるべきＤＮＡ配列を挿入するための数個の制限部位を含むポリリンカー配列が配置される。上記２つのマーカーは、エス・セレビジエ ゲノムの染色体ＩＩＩ上のＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座と相同の標的配列に隣接する。
２つのマーカー遺伝子の間のポリリンカー配列は、制限酵素ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＢｇｌＩＩおよびＰａｃＩの制限部位を含む。

本発明の別の態様は、プラスミドｐＭＸＹ１２に関する。
プラスミドｐＭＸＹ１２は、ＴＲＰ１マーカー遺伝子およびＣＹＨ２マーカー遺伝子を含む。この２つのマーカー遺伝子の間に、組み込まれるべきＤＮＡ配列を挿入するための数個の制限部位を含むポリリンカー配列が配置される。上記２つのマーカーは、エス・セレビジエ ゲノムの染色体ＩＩＩ上のＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座と相同の標的配列に隣接する。ポリリンカー配列は、制限酵素ＳｐｅＩ、ＳｍａＩおよびＰａｃＩの制限部位を含む。

本発明はまた、エス・セレビジエ菌株ＭＸＹ４７であって、その二倍体細胞が対立遺伝子ｕｒａ３−１、ｔｒｐ１−１、ｃａｎ１−１００およびｃｙｈ２Ｒに対してホモ接合性であり、ｍｓｈ２：：ＫａｎＭＸ変異に対してヘテロ接合性であることを特徴とするエス・セレビジエ菌株ＭＸＹ４７に関する。

本発明はまた、プラスミドｐＭＸＹ９を含むイー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）菌株ＪＭ１０１およびプラスミドｐＭＸＹ１２を含むイー・コリ菌株ＤＨ５αに関する。

プラスミドｐＭＸＹ９およびｐＭＸＹ１２およびサッカロマイセス・セレビジエ菌株ＭＸＹ４７は、２００５年１月３日にＤＳＭＺ(Deutsche Sammiung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroderweg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)にそれぞれ受け入れ番号ＤＳＭ １７０１０、ＤＳＭ １７０１１およびＤＳＭ １７０２６で預けられている。

本発明の別の態様は、本発明のサッカロマイセス・セレビジエにおける組換えＤＮＡ配列の産生および検出の方法を行うために用いられるキットに関する。第一の実施形態では、上記キットは、少なくとも、エス・セレビジエ菌株ＭＸＹ４７の細胞を含む第一のコンテナ、プラスミドｐＭＸＹ９を含むイー・コリ菌株ＪＭ１０１の細胞を含む第二のコンテナおよびプラスミドｐＭＸＹ１２を含むイー・コリ菌株ＤＨ５αを含む第三のコンテナを含む。

第二の実施形態では、上記キットは、少なくとも、エス・セレビジエ菌株ＭＸＹ４７の細胞を含む第一のコンテナ、プラスミドｐＭＸＹ９のＤＮＡを含む第二のコンテナおよびプラスミドｐＭＸＹ１２のＤＮＡを含む第三のコンテナを含む。

本発明は、以下の配列リスト、図面及び実施例により説明される。

図１は、定められた培地上の組換え体の選択のための選択システムを模式的に示したものである。組換えカセット−ここではＵＲＡ３およびＣＡＮ１遺伝子に隣接する組換え基質Ａ、および、ＴＲＰ１およびＣＹＨ２遺伝子に隣接する組換え基質Ｂ−にヘテロ接合性の二倍体親細胞が、減数分裂を起こすように誘導される。胞子は、ウラシル欠乏カナバニン含有（−Ｕｒａ＋Ｃａｎ）培地上およびトリプトファン欠乏シクロヘキサミド含有（−Ｔｒｐ＋Ｃｙｈ）培地上に、組換え型細胞３および４を選択するために植えられた。組換え型細胞３および４では、（＋）で示すように、組換え基質ＡおよびＢが関係する交叉が起こっている。親の二倍体および非組換え型の一倍体１および２は、（−）で示すようにこれらのいずれの倍地上でも生育できない。次の減数分裂のラウンドは、新しい二倍体を作製するために組換え体３および４を用いることができる。この新しい二倍体は胞子を形成すると、細胞１および２において示されたのと同じフランキング（隣接する）マーカーの配置を有する新しい組換え型細胞を産生する。これらの配置を有する組換え型胞子のコロニーは、ウラシル欠乏シクロヘキサミド含有（−Ｕｒａ＋Ｃｙｈ）培地上およびトリプトファン欠乏カナバニン含有（−Ｔｒｐ＋Ｃａｎ）培地上でそれぞれ選択される。

図２は、プラスミドｐＭＸＹ９およびｐＭＸＹ１２を示す（上）。これらは酵母ゲノムの染色体ＩＩＩ上のＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座に組換えカセットをターゲティングするために用いられるベクターである。どちらのプラスミドも、ＵＲＡ３およびＣＡＮ１マーカー（ｐＭＸＹ９）またはＴＲＰ１およびＣＹＨ２（ｐＭＸＹ１２）マーカーと隣接するこの遺伝子座（５´および３´として示される）と配列相同性を有する。組換え基質をクローニングするための制限部位を有する短い配列がマーカー配列の各組の間に位置している。下は、組換えカセットのＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座への組み込みである。組換え基質Ａを有するｐＭＸＹ９誘導体は、５´および３´標的配列に隣接する組換えカセットを遊離させるためにＮｏｔＩを用いて消化され、そして消化生成物はＭＸＹ４７細胞に形質転換される。正確にターゲティングされた挿入断片を含むＵｒａ＋誘導体は、次に組換えカセットに対してヘテロ接合性の菌株を作製するのに用いるために確認される。ＴＲＰ１およびＣＹＨ２マーカーを有する組換えカセットが、同様にｐＭＸＹ１２において作製され、ＭＸＹ４７に形質転換され、次いでトリプトファン原栄養性に関して選択される。

図３は、Ｏｘａ遺伝子間の組換え頻度を野生型とｍｓｈ２菌株における配列の同一性の関数として示す。
上は、個々の実験の平均±標準偏差（ｎ）である。下は、これらのデータのグラフ表示である。
以下の菌株が用いられた：ＭＸＹ６０、ＭＸＹ６２、ＭＸＹ６４、ＭＸＹ６６、ＭＸＹ９９およびＭＸＹ１０２。

図４は、ｍｓｈ２の過度の組換え効果を示す。ｍｓｈ２／ｗｔ（野生型）比は、共有されるＯｘａ相同性が特定割合である菌株の対についての個々の独立した実験（総数＝ｎ）に対して、および、各選択条件に対して計算され、これらの合計値の平均±標準偏差が示される。データは、下にグラフで示した。以下の菌株の対が用いられた：ＭＸＹ６０およびＭＸＹ６２、ＭＸＹ６４およびＭＸＹ６６、ＭＸＹ９９およびＭＸＹ１０２。

図５は、７８％相同性を共有するＯｘａ配列間の組換えのＰＣＲ分析を示す。胞子コロニーは、ウラシル欠乏カナバニン含有培地上、または、トリプトファン欠乏シクロヘキサミド含有培地上での選択により、野生型（ＭＸＹ９９）およびｍｓｈ２（ＭＸＹ１０２）二倍体から発生した。予想された交叉組換え体と一致する表現型を示す選択された胞子コロニーについて、コロニーＰＣＲが行われた。上は、野生型およびｍｓｈ２ Ｕｒａ＋ＣａｎＲ候補それぞれについて２つの反応を行い、一方の反応は親に特異的なプライマー対（ＫＮＳ１６＋ＫＮＳ２８、生成物は、各候補についてのレーンの各対の第一番目に示した）を用い、もう一方の反応は組換え体に特異的なプライマー対（ＫＮＳ１６＋ＫＮＳ２９、第二レーン）を用いた。下は、同様の反応を野生型およびｍｓｈ２ Ｔｒｐ＋ＣｙｈＲ候補それぞれについて行い、一方の反応は親に特異的なプライマー対（ＫＮＳ１１＋ＫＮＳ２９、第一レーン）を用い、もう一方の反応は組換え体に特異的なプライマー対（ＫＮＳ１１＋ＫＮＳ２８、第二レーン）を用いた。
コントロールの反応は、フランキングマーカー配列の既知の配置を含む適当なゲノムＤＮＡテンプレートについて親の（Ｐ）または組換え体（Ｒ）、ＤＮＡがないコントロール（−）のいずれについても行われた。

図６は、第二ラウンドの組換えに関する組換え頻度を示す。ＭＸＹ６４およびＭＸＹ６６を用いた第一ラウンドの組換えの後得られた野生型およびｍｓｈ２一倍体を交配させて、モザイクＯｘａ７−Ｏｘａ１１組換えカセットを有する野生型（ＭＸＹ８１、ＭＸＹ８２およびＭＸＹ８３）およびｍｓｈ２（ＭＸＹ８６、ＭＸＹ８７およびＭＸＹ８８）二倍体を作製した。Ｏｘａ１１組換え基質に対してホモ接合性の野生型（ＭＸＹ９０）およびｍｓｈ２（ＭＸＹ９２）二倍体も、ＭＸＹ６０およびＭＸＹ６２の組換え体子孫から作製された。全ての二倍体は胞子を形成し、胞子はＵｒａ＋ＣａｎＲおよびＴｒｐ＋ＣｙｈＲ組換え体を選択するために倍地上に植えられた。

配列のリストは、以下の配列を含む：
配列番号１および２はそれぞれ、ＭＳＨ２の増幅に用いられるプライマーＭＳＨ２ＵＰおよびＭＳＨ２ＤＮの配列を示す。
配列番号３から配列番号６はそれぞれ、ＭＳＨ２特異的分析プライマーであるプライマーＭＳＨ２Ａ１、ＭＳＨ２Ａ２、ＭＳＨ２Ａ３およびＭＳＨ２Ａ４の配列を示す。
配列番号７および配列番号８はそれぞれ、ＫａｎＭＸ特異的分析プライマーであるプライマーＫ２ＫＡＮＭＸおよびＫ３ＫＡＮＭＸの配列を示す。
配列番号９および配列番号１０はそれぞれ、ＬＥＵ２の増幅に用いられるプライマーＬＥＵ２ＵＰおよびＬＥＵ２ＤＮの配列を示す。

配列番号１１および配列番号１２はそれぞれ、ＨＩＳ３の増幅に用いられるプライマーＨＩＳ３ＵＰおよびＨＩＳ３ＤＮの配列を示す。
配列番号１３および配列番号１４はそれぞれ、３´標的配列の増幅に用いられるプライマーＫＮＳ１およびＫＮＳ２の配列を示す。
配列番号１５から配列番号１７はそれぞれ、５´標的配列の増幅に用いられるプライマーＫＮＳ３、ＫＮＳ４およびＫＮＳ６の配列を示す。
配列番号１８および配列番号１９はそれぞれ、Ｏｘａ７の増幅に用いられるプライマーＫＮＳ７およびＫＮＳ８の配列を示す。
配列番号２０および配列番号２１はそれぞれ、Ｏｘａ１１の増幅に用いられるプライマーＫＮＳ９およびＫＮＳ１０の配列を示す。
配列番号２２は、ＢＵＤ３１下流分析プライマーであるプライマーＫＮＳ１２の配列を示す。

配列番号２３は、ＢＵＤ３１上流分析プライマーであるプライマーＫＮＳ１３の配列を示す。
配列番号２４は、ＴＲＰ１特異的分析プライマーであるプライマーＫＮＳ１４の配列を示す。
配列番号２５は、ＵＲＡ３特異的分析プライマーであるプライマーＫＮＳ１５の配列を示す。
配列番号２６および配列番号２７は、それぞれＣＹＨ２の増幅に用いられるプライマーＫＮＳ１７およびＫＮＳ１８の配列を示す。

配列番号２８は、シークエンシングプライマーとして用いられるＴＲＰ１特異的フォワード（順方向）プライマーであるプライマーＫＮＳ３０の配列を示す。
配列番号２９は、シークエンシングプライマーとして用いられるＣＡＮ１特異的リバース（逆方向）プライマーであるプライマーＫＮＳ３１の配列を示す。
配列番号３０は、シークエンシングプライマーとして用いられるＣＹＨ２特異的リバースプライマーであるプライマーＫＮＳ３３の配列を示す。
配列番号３１および配列番号３２はそれぞれ、Ｏｘａ５の増幅に用いられるプライマーＫＮＳ３６およびＫＮＳ３７の配列を示す。
配列番号３３は、シークエンシングプライマーとして用いられるＵＲＡ３特異的フォワードプライマーであるプライマーＫＮＳ３８の配列を示す。

実施例−サッカロマイセス・セレビジエ ミスマッチ修復変異体におけるモザイク遺伝子の生成
１． 材料および方法
１．１ 培地
標準的なリッチ培地ＹＰＤ（Ｂｉｏ１０１社）を通常の生育のために用い、合成のドロップアウト培地（Ｂｉｏ１０１社）を遺伝子マーカーのチェックおよび組換え体の選択のために用いた。胞子形成のため、細胞をＳＰＳ（５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ５．０、０．５％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ社）、１％バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ社）、０．１７％酵母窒素塩基、１％酢酸カリウム、０．５％硫酸アンモニウム）に必要な栄養成分を添加した中で終夜前培養し、洗浄し、１％酢酸カリウムに栄養成分を添加した中に再懸濁し、２日間振とうしながらインキュベートした。全ての操作を３０℃で行った。四分子分析のため、子嚢をエスカルゴ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）Ｂ−グリコシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社）を用いて消化し、ＴＤＭ４００マイクロマニュピュレーター（微調整装置）（Micro Video Instruments社）を備えたNikon Eclipse E400 microscopeを用いて詳しく調べた。

他の遺伝子的手法は、Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology (1998),John Wiley and Sons, Inc., New Yorkに記載されているように行った。全ての酵母の形質転換は、Agatepら、Technical Tips On-line (http://tto.trends.com)に従うＬｉＡｃ法を用いて行った。

１．２ 酵母菌株
本研究において用いられたまたは作製された全ての酵母の菌株を、表１および表２に一覧にした。全ての酵母菌株は、速やかに胞子を形成するＷ３０３から出た同質遺伝子的な誘導体である。組換えカセットを用いる形質転換のホストとして役立つ二倍体ＭＸＹ４７が、以下のように形質転換および遺伝子の交叉により作製された。一倍体Ｄ１８４−１Ｂ(S. Gangloff、CEA、フランス、の寄贈品)は、配列リストに載っているＬＥＵ２断片（プライマー対ＬＥＵ２ＵＰ／ＬＥＵ２ＤＮを用いたＷ３０３菌株Ｕ４７４の予備的なＰＣＲにより得られた）を用いて形質転換され、Ｌｅｕ＋一倍体ＭＸＹ１３が生じた。一倍体Ｄ１８４−１Ｃ(S. Gangtoffの寄贈品)は、ＨＩＳ３断片（プライマー対ＨＩＳ３ＵＰ／ＨＩＳ３ＤＮを用いたＯＲＤ４３６９−２５Ｄの予備的なＰＣＲにより得られた）を用いて形質転換され、Ｈｉｓ＋一倍体ＭＸＹ２５が生じた。一倍体ＭＸＹ１８およびＭＸＹ２２は、それぞれＤ１８４−１ＢおよびＤ１８４−１Ｃの劣性シクロヘキサミド耐性（ｃｙｈ２Ｒ）誘導体で、１０μｇ／ｍｌシクロヘキサミド上で選択された；シクロヘキサミド耐性を与えるＣＹＨ２遺伝子座への変異地図の存在は、配列決定（２つの異なるヌクレオチドの変化が、グルタミン３８をリジンに変化させる）および分離解析によって確認された。二倍体ＭＸＹ２９を得るためにＭＸＹ１８およびＭＸＹ２５を交雑させた；二倍体ＭＸＹ３３を得るためにＭＸＹ１３およびＭＸＹ２２を交雑させた。ＭＸＹ３８を得るために一倍体分離個体ＭＸＹ２９−６ＤおよびＭＸＹ３３−８Ｃを交雑させた。ＭＸＹ３８はｌｅｕ２−３、１１２およびｈｉｓ３−１１、１５マーカーに対してヘテロ接合性であり、ｃｙｈ２Ｒ変異に対してホモ接合性である。ＭＸＹ３８は、ＲＢＴ３４８（R. Borts, University of Leicesterの寄贈品）からプライマーＭＳＨ２ＵＰおよびＭＳＨ２ＤＮを用いたＰＣＲにより増幅したｍｓｈ２：：ＫａｎＭＸカセットを用いて形質転換され、ＭＸＹ４７を生じた。形質転換体は２００μｇ／ｍｌＧ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）上で選択され、マーカーの分離を確かめるために、プライマーＭＳＨ２Ａ１、ＭＳＨ２Ａ２、ＭＳＨ２Ａ３およびＭＳＨ２Ａ４を用いるコロニーＰＣＲ（下記を参照）および四分子分析、すなわち４つの胞子の分析により確認された。

１．３ プラスミドの作製
クローニングのホストとして、バクテリア菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ＭＲＦ´（ΔｍｃｒＡ）１８３（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７３ ｅｎｄＡ１ ｓｕｐＥ４４ ｔｈｉ−１ ｒｅｃＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｌＡ１ ｌａｃ ［Ｆ´ ｐｒｏＡＢ ｌａｃｌ^ｑＺΔＭ１５ Ｔｎ１０ （Ｔｅｔ´）］）およびＪＭ１１０（ｒｐｓＬ ［Ｓｔｒ´］ ｔｈｒ ｌｅｕ ｔｈｉ−１ ｌａｃＹ ｇａｌｋ ｇａｌＴ ａｒａ ｔｏｎＡ ｔｓｘ ｄａｍ ｄｃｍ ｓｕｐＥ４４ Δ［ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ］［Ｆ´ ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ ｌａｃｌ^ｑＺΔＭ１５］）が用いられた。プラスミドの作製には、標準的な方法を用いた(Ausubelら)。この実験で用いられたまたは作製されたすべてのプラスミドを、表３に一覧にして示す。クローニングに用いられた制限酵素、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼおよびその他の酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ社から購入した。ＤＮＡ断片およびプラスミドは、Ｑｉａｇｅｎ社およびＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ社により供給されたキットを用いて精製した。

ＢＵＤ３１遺伝子座に相当する上流（“５’ターゲット”）配列を、プライマー対ＫＮＳ３／ＫＮＳ４を用いて予備的なＰＣＲによりＷ３０３ゲノムＤＮＡから増幅させ、ｐＭＸＹ１を作製するためにＫｐｎ１／Ｘｈｏ１断片としてＫｐｎ１／Ｘｈｏ１消化ｐＫＳＩＩ（＋）（Stratagene社）にクローン化した。；下流（“３’ターゲット”）標的配列を同様にプライマー対ＫＮＳ１／ＫＮＳ２を用いて増幅させ、ｐＭＸＹ２を作製するためＸｂａ１／Ｎｏｔ１断片としてＸｂａ１／Ｎｏｔ１消化ｐＫＳＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中にクローン化した。ＴＲＰ１マーカーは、ｐＪＨ５３（Ｒ．Ｂｏｒｔｓの寄贈品）からＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ断片として切り出され、ｐＭＸＹ３を作製するためにＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐＭＸＹ１と連結され、ＵＲＡ３マーカーはＸｈｏＩ／ＨｉｎＤＩＩＩ消化ｐＲＥＤ３１６（R. Bortsの寄贈品）から切り出され、ｐＭＸＹ４を作製するためにＸｈｏＩ／ＨｉｎＤＩＩＩ消化ｐＭＸＹ１と連結された。ＣＡＮ１マーカーは、ｐＲＥＤ３１６からＳｍａ１断片として単離され、ｐＭＸＹ５を作製するためにＨｐａ１消化ｐＭＸＹ２と連結された。ｐＭＸＹ３およびｐＭＸＹ４中の５´標的配列は、プライマー対ＫＮＳ４／ＫＮＳ６を用いてゲノムＤＮＡから再度増幅された配列で置換され、ｐＭＸＹ７およびｐＭＸＹ６を作製するためにＫｐｎ１／Ｘｈｏ１断片としてそれぞれＫｐｎ１／Ｘｈｏ１消化プラスミド中に連結された。この工程は、クローニングの後の工程で必要となる制限部位がプライマーＫＮＳ３にないのを調整するために行われた。５´ターゲットおよびＵＲＡ３マーカーを含むｐＭＸＹ６のＫｐｎＩ−ＳｍａＩ断片は、ＵＲＡ３−ＣＡＮ１組換えカセットベクターｐＭＸＹ９を作製するためにＫｐｎＩ／ＳｍａＩ消化ｐＭＸＹ５と連結された。５´ターゲットおよびＴＲＰＩマーカーを含むｐＭＸＹ７のＫｐｎＩ／ＳｐｅＩ断片は、ｐＭＸＹ１１を作製するためにＫｐｎＩ／ＳｐｅＩ消化ｐＭＸＹ２と連結された。最後に、ＣＹＨ２マーカーを、プライマー対ＫＮＳ１７／ＫＮＳ１８を用いて予備的なＰＣＲによりＷ３０３ゲノムＤＮＡから増幅させ、ＢａｍＨＩおよびＰｖｕＩで消化し、ＴＲＰ１−ＣＹＨ２組換えカセットベクターｐＭＸＹ１２を作製するためにＢｇｌＩＩ／ＰａｃＩ消化ｐＭＸＹ１１と連結した。すべてのプラスミドコンストラクトは、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）によりバクテリアのホストに導入され、制限分析により確認され、そしてｐＭＸＹ９およびｐＭＸＹ１２は、さらにすべてのクローニング接合部を配列決定することにより確認された。

Ｂ−ラクタマーゼ組換え基質は、Ｏｘａ５（目録Ｘ５８２７２）に対してＫＮＳ３６／ＫＮＳ３７、Ｏｘａ７（目録Ｘ７５５６２）に対してＫＮＳ７／ＫＮＳ８、Ｏｘａ１１（目録Ｚ２２５９０）に対してＫＮＳ９／ＫＮＳ１０をプライマー対に用いて、予備的なＰＣＲによりホストプラスミド（W. Schoenfeldから提供された）から増幅させた。Ｏｘａ７およびＯｘａ１１ＰＣＲ産物をＰａｃＩで消化し、ｐＭＸＹ１３およびｐＭＸＹ１４それぞれを作製するためにＳｍａＩ／ＰａｃＩ消化ｐＭＸＹ９と連結させた。またＯｘａ１１ＰＣＲ産物を、ＳｐｅＩおよびＰａｃＩで消化し、ｐＭＸＹ２２を作製するためにＳｐｅＩ／ＰａｃＩ消化ｐＭＸＹ１２と連結させた。Ｏｘａ５ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＰａｃＩで消化し、ｐＭＸＹ２４を作製するためにＢｇｌＩＩ／ＰａｃＩ消化ｐＭＸＹ９と連結させた。すべてのコンストラクトは、制限分析で確かめられた。

１．４ 組換え体の選択および特徴づけ
組換えの第一ラウンドのために、組換えカセットを有するプラスミドをＮｏｔ１で消化し、すべての消化生成物をＭＸＹ４７の形質転換に用いた。ウラシル（ｐＭＸＹ９誘導体用）またはトリプトファン（ｐＭＸＹ１２誘導体用）原栄養株が選択され、コンストラクトの導入によるＢＵＤ３１−ＨＣＭ遺伝子座の２つの染色体の複製物のうちの１つのターゲティングが、無傷のまたは破壊されたＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座からの断片を増幅させるプライマー、ＵＲＡ３−ＣＡＮ１誘導体に対してプライマーＫＮＳ１２／ＫＮＳ１３／ＫＮＳ１５を、ＴＲＰ１−ＣＹＨ２誘導体に対してプライマーＫＮＳ１２／ＫＮＳ１３／ＫＮＳ１４を用いたコロニーＰＣＲにより確認された。形質転換されたヘテロ接合体は胞子を形成し、組換えカセットを有する野生型またはｍｓｈ２一倍体を同定するために四分子分析を行った。反対の交配型（ｏｐｐｏｓｉｔｅ ｍａｔｉｎｇ ｔｙｐｅ）の適切な一倍体をＹＰＤプレート上に撒き、終夜生育させ、同じＹＰＤプレート上で混合し、そして終夜交配させた。交配プレートは、二倍体を選択するためにＵｒａ−Ｔｒｐ培地に対してレプリカプレートとし、後日補助栄養素を添加したＳＰＳに多量に接種され、終夜培養された。前培養を遠心沈殿し、洗浄し、そして細胞を１％酢酸カリウムに補助栄養素を添加した中に再懸濁し、２日間インキュベートした。

胞子を形成した細胞は集められ、定量され、すべてのマーカーが適当に分離したかを調べるために分析された。胞子を遊離させるためにザイモリエース（ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）２０Ｔ（ICN Biomedicals社）を用いて子嚢を消化し、胞子の懸濁液を超音波処理し（Branson社 Model 250 Digital Sonifier）、適当な希釈液を、細胞の生存率を決定するためにＹＰＤ上に、Ｕｒａ＋ＣａｎＲ組換え体を選択するために６０μｇ／ｍｌカナバニン（ＳＩＧＭＡ社）を含むウラシルドロップアウト培地上に、Ｔｒｐ＋ＣｙｈＲ組換え体を選択するために３μｇ／ｍｌシクロヘキサミド（ＳＩＧＭＡ社）を含むトリプトファンドロップアウト培地上に植えた。各培地上に生じた胞子コロニーを計測し、それらが真の組換え体であるかどうかを決定するために表現型および分子テストを行った。表現型分析のために、候補組換え体の代表的な番号を選択のために用いたのと同じ倍地上に再度スロリークし、その後−Ｕｒａ（ウラシル）、−Ｔｒｐ（トリプトファン）、シクロヘキサミド（１０μｇ／ｍｌ）、カナバニン（６０μｇ／ｍｌ）、および交配型テスタープレートにレプリカプレートとした。

胞子も、各胞子調製物について二倍体の発生頻度を決定するために−Ｕｒａ−Ｔｒｐ培地上に植えられ、それはほとんどの場合生存可能な全細胞の４％未満であった。分子分析のために、ゲノムのＤＮＡすべてについて、親または組換え断片を特異的に増幅させる適切なプライマーを用いる分析ＰＣＲ（下記を参照）を行った。特定の選択に対する組換えの発生頻度は、特定の選択培地上の生存可能な細胞の発生頻度として表され、偽陽性表現型を示す非組換え体の存在に対して修正された。
多くの場合、このような偽陽性は、分析ＰＣＲにより示唆されるように変異によるＣＡＮまたはＣＹＨ２マーカーの不活性化により生じる。

組換えの第二ラウンドのために、組換えの第一ラウンドから生じた適当な組換え体を交配し、そしてＵｒａ＋Ｔｒｐ＋二倍体が選択された。胞子が、ＹＰＤ上、Ｕｒａ＋ＣｙｈＲ組換え体を選択するためにシクロヘキサミドを含むウラシルドロップアウト培地上、Ｔｒｐ＋ＣａｎＲ組換え体を選択するためにカナバニンを含むトリプトファンドロップアウト倍地上に植えられたことを除いて、組換えの第一ラウンドと同じ胞子形成方法が次いで行われた。候補組換え体について、同様に表現型および分子分析を行った。

１．５ 分子法
予備的なまたは分析ＰＣＲのためのテンプレートとして用いられるゲノムのＤＮＡは、Ａｕｓｕｂｅｌらの標準的なミニプレップ手順に従って、終夜のＹＰＤ培養物から調製された。クローニングまたは配列決定で用いられる断片の予備的なＰＣＲが、テンプレートとしてＯｘａプラスミドＤＮＡ（約５０ｐｇ）または酵母ゲノムのＤＮＡ（約０．５μｇ）を用いて、２．５ＵのHerculase polymerase （Stratagene社）、１ｘ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ 反応バッファー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰおよび１００ｎｇの各プライマーを含む５０μｌの反応液中で行われた。増幅は、以下のように行われた：９４℃ ２分；９４℃ １０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を３０サイクル；６８℃ １０分。組換えカセットがＢＵＤ３１遺伝子座に組み込まれたことを確認するために、変更したコロニーＰＣＲを以下の増幅条件で行った（http://www.fhcrc.org/labs/hahn/methods/mol bio meth/pcr yeast colony. html）。：Ｏｘａの挿入断片を特徴づけるための分析ＰＣＲは、候補組換え体およびコントロール菌株から調製された約０．５μｇのゲノムのＤＮＡ、１．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ社）、１ｘ反応バッファー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰおよび１００ｎｇの各プライマーを含む１００μｌの反応体積で、伸長反応を６８℃で２分行う以外はコロニーＰＣＲと同じ増幅条件で行った。
すべての増幅反応は、Mastercycler gradient 5331(Eppendorf社)を用いて行った。

組換えＯｘａ挿入断片の配列分析のため、プライマー対ＫＮＳ１６／ＫＮＳ２９（Ｕｒａ＋ＣａｎＲ組換え体に対して）またはＫＮＳ１１／ＫＮＳ２８（Ｔｒｐ＋ＣｙｈＲに対して）を用いて予備的なＰＣＲを行い、その後Qiaquick PCR kit(Qiagen社)を用いて精製した。プライマーＫＮＳ３０、ＫＮＳ３１、ＫＮＳ３３またはＫＮＳ３８を適宜用いて、Genome Express (Meylan社, FR)によってＰＣＲ産物の配列を決定した。Clone Manager software (Sci Ed Central社)を用いて組換え配列を整列させ、分析した。ＰＣＲおよび配列決定に用いたオリゴヌクレオチド（表３）は、フランスのＰｒｏｌｉｇｏ社から購入した。

２． 結果
２．１ 酵母減数分裂の相同的組換え（ｈｏｍｅｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）システムの開発
インビボでの異なるＤＮＡ配列間の組換えを促進するために酵母サッカロマイセス・セレビジエを利用する戦略を開発した。この戦略の重要な特性は、ゲノムワイドな組換えが高レベルで起こっており、通常は異なる配列間の組換えを制限するミスマッチ修復（ＭＭＲ）システムが不活化している減数分裂の細胞の使用を含むことである。

組換えられるべき配列、すなわち組換え基質は、組換えカセットを作るために、フランキングマーカー配列も有する２つのベクターのうちの１つに導入された。組換えカセットは、減数分裂において組換えが活性であると知られている領域にある酵母ゲノムの染色体ＩＩＩ上の遺伝子座（ＢＵＤ３１−ＨＣＭ１区間）に導入される。組換えカセットにヘテロ接合性の二倍体は胞子を形成し、胞子は、フランキングマーカーの特異的な配置を有する細胞を選択する倍地上に撒かれ、そこで、組換え基質が関わる交叉が起こった組換え体の選択が行われる（図１）。

２つの一般的な組換えカセットベクターｐＭＸＹ９およびｐＭＸＹ１２が作製された。これらは、組換え基質の導入に用いることができる制限部位に隣接するＵＲＡ３およびＣＡＮ１、および、ＴＲＰＩおよびＣＹＨ２マーカーをそれぞれ含む（図２）。ＵＲＡ３マーカーはウラシル原栄養性を付与し、ＣＡＮ１マーカーはカナバニン感受性を付与する。このマーカーがないと、細胞はこの薬剤に耐性である。ＴＲＰマーカーはトリプトファン原栄養性を付与し、ＣＹＨ２マーカーはシクロヘキサミド感受性を付与する。このマーカーがないと、細胞はこの薬剤に耐性である。２つの各組換えカセットは、コンピテントセルの形質転換によってＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座に挿入断片全体をターゲティングする配列に順番に隣接している（図２）。形質転換の最初のホストとして有用である菌株ＭＸＹ４７も作製された（表２）。この二倍体はｍｓｈ２：：ＫａｎＭＸ変異にヘテロ接合性であり、ＭＭＲに関しては、表現型的には野生型である。これはまた、ｕｒａ３−１、ｔｒｐ１−１、ｃａｎ１−１００およびｃｙｈ２Ｒマーカーに対してホモ接合性であり、これは組換えカセットマーカーの存在をモニターすることを可能とし、そしてｈｉｓ３−１１、１５およびｌｅｕ２−３、１１２マーカーに対してヘテロ接合性である。

ＭＸＹ４７は、組換えカセットを有する断片を用いて形質転換された。最初の形質転換体は、Ｕｒａ＋またはＴｒｐ＋原栄養性として選択され（それぞれＭＸＹ９およびＭＸＹ１２誘導体として）、導入したコンストラクトの範囲内および範囲外の配列を認識するプライマーを用いる分析ＰＣＲによってターゲティングが確認される。最初の形質転換体は胞子を形成し、４分子は切断され、組変えカセットを有する野生型かまたはｍｓｈ２分離個体かを確認するためにレプリカプレートされた。組換え基質にヘテロ接合性を有するＭＳＨ２／ＭＳＨ２（野生型）およびｍｓｈ２／ｍｓｈ２二倍体を産生するために、好適な一倍体を他の一倍体と交配する。組換え体を産生する減数分裂の第一ラウンドにおいて、これらの二倍体は胞子を形成し、フランキングマーカーのＵＲＡ３−ＣＹＨ２配置を有する組換え体（Ｕｒａ＋ＣａｎＲ胞子コロニー）を選択するためにウラシル欠乏カナバニン含有培地上に、または、ＴＲＩ−ＣＡＮＤＩ配置（Ｔｒｐ＋ＣｙｈＲ胞子コロニー）を選択するためにトリプトファン欠乏シクロヘキサミド含有倍地上に、遊離の胞子を植えた。

親の二倍体および非組換え型の一倍体の子孫は、これらの配置で生育することができない。選択培地上に生じる胞子コロニーの発生頻度が測定され、候補の組換え胞子コロニーは試験培地上にレプリカプレートされて表現型的に、および、適当なプライマー対を用いたＰＣＲにより分子的に特徴づけられ、確認された組換え体のサンプルが配列決定のために選択された。

この戦略は、組換え挿入断片を有する細胞が同定され、そして多様性を増大させる減数分裂の組換えのさらなるラウンドが行われる点において反復的である。フランキングマーカーのＵＲＡ３−ＧＡＮ１配置を有する組換え体（Ｕｒａ＋ＣｙｈＲ胞子コロニー）を選択するためにウラシル欠乏シクロヘキサミド含有培地上で、または、ＴＲＰ１−ＣＹＨ２配置（Ｔｒｐ＋ＣａｎＲ胞子コロニー）を選択するためにトリプトファン欠乏カナバニン含有倍地上で、新しい組換え体が選択されることを除いて、第二のラウンドにおいて、Ｕｒａ＋ＣａｎＲおよびＴｒｐ＋ＣｙｈＲ一倍体を交配し、胞子形成および選択過程を繰り返す。ここで詳細に記載された戦略は、選択の厳格さを増大させるために更なるマーカーを含むように変更することができる。さらに、組換え体は、フランキング配列に特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって直接選択されうる。

２．２ 配列の相違が異なるＯｘａ遺伝子対間の組換えに対する表現型の選択
ベータラクタマーゼのＯｘａスーパーファミリーに属する遺伝子が、組換え体の選択のためのシステムの可能性をテストするための基質として選択された。以下のＯｘａ対間の組換えが、野生型およびｍｓｈ２の出のものにおいて評価された：Ｏｘａ１１−Ｏｘａ１１、これらは８００ｂｐ ＯＲＦ（翻訳領域）の初めから終わりまで１００％の相同性を共有する；Ｏｘａ７−Ｏｘａ１１、９５％；Ｏｘａ５−０ｘａ１１、７８％。適当な一倍体間の交雑によって生成した二倍体が、減数分裂に入るように誘導された。減数分裂の培地から胞子が調製され、続く希釈物が、細胞の生育能力を測定するためにＹＰＤ上に植えられ、組換え体を選択するために、ウラシル欠乏カナバニン含有（−Ｕｒａ＋Ｃａｎ）倍地上およびトリプトファン欠乏シクロヘキサミド含有（−Ｔｒｐ＋Ｃｙｈ）培地上に植えられた。

２．３ 配列の相同性が異なるＯｘａ遺伝子間の組換えの頻度
図３に示されるデータは、野生型の出のものにおいて配列の異種性が増加すると、交叉組換えへの強い阻害効果があることを証明しており、そしてこの効果はｍｓｈ２変異によって軽減されるが、止めることはできない。一般に、ｍｓｈ２変異は、試験された相違の２つのレベルにおいて野生型菌株で観察されるより組換えの頻度を約１桁増加させる。しかしながら、ＭＳＨ２のみの不活性化は、より異種性の度合いが高い組換え基質間の組換えの阻害を完全に補うことはできない。例えば、７８％の相同性を共有するＯｘａ挿入断片を有するｍｓｈ２菌株（ＭＸＹ１０２）についての組換え頻度は、１００％の相同性のＯｘａ挿入断片を有する野生型菌株（ＭＸＹ６０）について観察されたより、少なくとも１０倍（Ｕｒａ＋ＣａｎＲ）および２５倍（Ｔｒｐ＋ＣｙｈＲ）低い。このことは、ＭＳＨ２依存性ミスマッチ修復以外の要因が、より相違する配列間の交叉組換えを妨げることを示唆する。７８％の相違レベルでｍｓｈ２組換え体の出現が、おおよそ２×１０^−４の頻度であったことは注目すべきであり、より相違が多い基質間でも組換えが達成されたことを示す。

２．４ ｍｓｈ２過組換え効果
相同的組換えおよび相同的組換え（ｈｏｍｅｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）におけるｍｓｈ２の効果は、まず、各実験の特定の選択の特定の相同性割合について野生型組換え体に対するｍｓｈ２組換え体の比率を計算し、そしてその後、このように決定された比率全体の平均および標準偏差を計算して定量化した。データを図４に示す。ｍｓｈ２変異の存在は、相同性９５％および７８％の相同的組換えの頻度を増加させ、あまり有利な判断は下せないが、依然として１００％同一の配列間の組換えの定量可能な増加がある。さらに、相同的組換えのｍｓｈ２増加の程度は２つの選択物において異なっている：配列が少し異なる相同配列のＯｘａ挿入断片を有する菌株に関しては、ＭＳＨ２の不活性化は、Ｔｒｐ＋ＣｙｈＲ組換え体の発生頻度を、Ｕｒａ＋ＣａｎＲ組換え体の発生頻度を増加させるより大いに増加させる。原則として、両方の組換え体の型（Ｕｒａ＋ＣａｎＲおよびＴｒｐ＋ＣｙｈＲ）の発生頻度は等しいはずであるが、これらの数は、配列の相違の程度における差異と関連して、ｍｓｈ変異によって誘発されるまたは高められるシステムに偏りがあることを示唆している。得られた組換え体の型における、挿入断片およびフランキングマーカー配列の相対的な影響を調べるための実験は、この偏りはフランキングマーカーの特性であることを示すが、減数分裂の組換え現象の結果に作用する組換え基質の影響は、まだ説明できない（データは示さず）。

２．５ 選択された組換え体のＰＣＲ分析
２２％相違のＯｘａ遺伝子を含む野生型およびｍｓｈ２二倍体（それぞれＭＸＹ９９およびＭＸＹ１０２）から生じたＵｒａ＋ＣａｎＲおよびＴｒｐ＋ＣｙｈＲ胞子コロニーに適用された、ＰＣＲ分析の例を図５に示した。各菌株について、各組換え体の表現型を発現した１０のコロニーを分析した。
各コロニーからの抽出物が、親分子を特異的に増幅させるプライマー対および組換え分子を特異的に増幅させるプライマー対を用いる増幅のためのテンプレートとして用いられた。

全ての場合において、予測された組換え挿入断片のみが増幅し、このことは、選択された胞子コロニーが、親のＯｘａ組換え基質間での組換えにより生成した配列を含むことを示唆している。これらの結果はまた、遺伝子選択工程を行わなくても組換え分子が胞子の培地から直接回収できることを証明する。ここで、ＵＰＡ３、ＣＡＮ１、ＴＲＰ１およびＣＹＨ２遺伝子中に位置するプライマー認識部位は、各組換え基質に隣接する分子マーカー配列に相当する。

２．６ 第一ラウンドの減数分裂における相同的組換えの配列分析：５％および２２％の相違
野生型およびｍｓｈ２二倍体（それぞれＭＸＹ６４およびＭＸＹ６６）から生じたＯｘａ７−０ｘａ１減数分裂の組換え体、これらは９５％の相同性を共有する組換え基質を含むが、これらの組換え体のうち表現型および分子（ＰＣＲ）試験を満たすものが配列分析にかけられた。

組換え断片は、フランキングマーカーに特異的なプライマーを用いて増幅され、翻訳開始および終結部位にごく近いプライマーを用いて配列決定された。全部で、Ｏｘａ７−Ｏｘａ１１二倍体の一倍体の子孫から生じた５５の組換え体の配列が分析された：ＭＸＹ６４からの１４のＵｒａ＋ＣａｎＲおよび１３のＴｒｐ＋ＣｙｈＲ組換え体、ＭＸＹ６６からの１４のＵｒａ＋ＣａｎＲおよび１４のＴｒｐ＋ＣｙｈＲ組換え体。配列決定されたサンプルの型について、いくつかの観察がなされた。１）野生型およびｍｓｈ２組換え体両方について、交叉が起こった位置はコード領域の全体におよび、特定の区間に対する明白な優先はなかった。５´領域で起こった交叉は、３´領域と同じぐらい起こりそうであった。また特定の菌株について、−Ｕｒａ＋Ｃａｎによるまたは−Ｔｒｐ＋Ｃｙｈによる選択で得られた胞子コロニーについて、交叉部位の分布における明白な差異はなかった。２）交叉区間における中断されていない相同性の長さもまた、重要でない：交叉は、２つの最も広く間隔をあけて位置している多形（ポジション１６３−２６５、例えばＭＸＹ６６ Ｔｒｐ＋ＣｙｈＲ ＃１５）の間だけでなく、２つのごく近い間隔に位置している多形（ＭＸＹ６６ Ｔｒｐ＋ＣｙｈＲ ＃７、＃８および＃１３に関してポジション５４３−５５２、ここで、ポジション１は、ＡＴＧ翻訳開始部位のアデノシン残基を表す。）の間でも検出された。３）野生型およびｍｓｈ２出の両方から単離された組換え体Ｏｘａ挿入断片は、新しい機能性Ｏｘａタンパク質をコードする潜在的能力を有する完全長の組換え配列を含んでいた。つまり、全ての交叉は、無傷のＯＲＦを保つような態様で、交叉区間においてまたはその他の区間において、ヌクレオチドの正味の挿入または欠失なしに起こった。４）ほとんどの組換え配列の構造は、相同性の局部領域における２つのＯｘａ配列間の単純な交叉と一致しているが、ｍｓｈ２の出のものにおいて単離されたいくつかの組換え体は非常な複雑性を示した。４つの組換え体（ＭＸＹ６６ Ｕｒａ＋ＣａｎＲ ＃１６および＃３１、および、ＭＸＹ６６ Ｔｒｐ＋ＣｙｈＲ ＃５および＃９）から生じた配列は、それらが１つ以上の交叉現象により生成したかのように、高度のモザイク性を示した。事実、これらの組換え体のうちの２つの分析は困難であった。なぜなら電気泳動図を調べると、配列決定した領域内の複数の部位で２つの重なり合うピークが存在することが明らかになったからであり、その各部位は、Ｏｘａ７−Ｏｘａ１１遺伝子多形に対応した。この観察結果は、配列決定された分子の集団が不均一（異種性）であることを示唆しており、それに対する最も適当な説明は、ｍｓｈ２組変え体胞子中に存在する、修復されないまたは部分的に修復されたヘテロ二重鎖の存在である。この解釈は、ｍｓｈ２変異によって引き起こされる減数分裂後の分離（ｐｏｓｔ−ｍｅｉｏｔｉｃ ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）（ＰＭＳ）の、周知の頻度の増加と一致している。これらの２つのケース、ＭＸＹ６６ Ｕｒａ＋ＣａｎＲ ＃１６および＃３１では、１または２以上の修復部位が修復されていないヘテロ二重鎖の範囲に隣接し、Ｃｒｉｃ、ＧｌｕｃｋおよびＦａｂｒｅ（ＥＭＢＯ Ｊ． １９：３４０８）により示唆されるように、ｍｓｈ２の出のものにおけるショートパッチ（ｓｈｏｒｔ−ｐａｔｃｈ）ミスマッチ修復活性のアンマスキングと一致する。ショートパッチミスマッチ修復に関係ないＰＭＳのいくつかの他の例も、ｍｓｈ２組換え配列について観察されており、この別のミスマッチ修復システムは、ヘテロ二重鎖ＤＮＡにおけるミスマッチの修正に高度に効率がよいのではないらしいことが示唆される。配列の電気泳動図から判断すると、正されなかったヘテロ二重鎖の範囲は、約５０ｎｔの短い領域から全ＯＲＦをほとんどカバーする領域まで変動する。ＰＭＳまたはショートパッチミスマッチ修復が野生型組換え体配列で見つかった証拠はない。概して、これらの発見は、ｍｓｈ２減数分裂において作られた多様性の程度は、野生型減数分裂におけるものより大きいことを示唆している。

減数分裂の組換え体はまた、７８％の相同性を共有する組換え基質を含む野生型およびｍｓｈ２二倍体（それぞれＭＸＹ９９およびＭＸＹ１０２）から生じた。Ｏｘａ５−Ｏｘａ１１二倍体の組換え体子孫由来の全部で２４の組換え配列が分析された：ＭＸＹ９９から、５つのＵｒａ＋ＣａｎＲおよび３つのＴｒｐ＋ＣｙｈＲ組換え体、および、ＭＸＹ１０２から９つのＵｒａ＋ＣａｎＲおよび７つのＴｒｐ＋ＣｙｈＲ組換え体。これらの配列を調べると、いくつかの傾向が示唆された。１）−Ｔｒｐ＋ＣｙｈＲ上での選択により野生型およびｍｓｈ２菌株両方において得られた組換えＯｘａ配列は、ＯＲＦのすみずみにわたる異なる位置での交叉を示し、共有される相同の全領域の中央の２５０ｂｐ領域（ｎｔ３３３−ｎｔ５７３）に向かう傾向がわずかにあるようであった。対照的に、−Ｕｒａ＋ＣａｎＲ上での選択により野生型およびｍｓｈ２菌株両方において得られた組換え体は、交叉ポジションにおいて明確な偏りを示した：５の野生型のうちの３において、および９のｍｓｈ２配列のうちの８において、交叉は、共有される相同性領域の最後の８０ｎｔの範囲、すなわちＯＲＦの最後の１０％において起こった。２）交叉が同定された完全に相同な区間は、−Ｔｒｐ＋Ｃｙｈ選択については１１から２０ｎｔに渡っており、このことは、これらの比較的広い配列同一の範囲に対して優先的であることを示している。対照的に−Ｕｒａ＋Ｃａｎ選択については交叉区間は短く、３から１７ｎｔ（これらの１３／１４は１３ｎｔかより短い区間を含む）にわたる。３）９５％相同性を共有する配列を含む組換え体に関しては、得られる新規な配列も無傷の（完全な）ＯＲＦから構成され、そして潜在的に新規なＯｘａタンパク質をコードしている。４）電気泳動図の観察から判断されるように、ＰＭＳが野生型組換え体について観察された例はないが、修復されていないヘテロ二重鎖の非常に短い断片が、７のＴｒｐ＋ＣｙｈＲ組換え体のうちの３を含む数個のｍｓｈ２組換え体について発見された。これらの領域は高々６７ｎｔであり、Ｏｘａ７−Ｏｘａ１１組換え体に関して観察されたいくつかの広がりよりも短い。要約すると、これらの観察は、組換え配列が少なくとも２２％異なる投入組換え基質から選択されうること、およびこれらの配列は新規なタンパク質をコードしていることを示唆している。

２．７ Ｏｘａ７−Ｏｘａ１１第二ラウンド組換え体の配列分析
配列の多様性を増やす反復方式の酵母のシステムの能力を、減数分裂の第一ラウンドで生成したＯｘａ７−Ｏｘａ１１組換え一倍体から二倍体を作製することによってテストし、そしてこれらの新たな二倍体を減数分裂の第二ラウンドにかけた。

配列の相同性の全体的なレベルが再び９５％である新しい二倍体の作製のために、ＭＸＹ６４およびＭＸＹ６６の配列決定されたＵｒａ＋ＣａｎＲおよびＴｒｐ＋ＣｙｈＲ子孫の中で、同じ区間に交叉を有する適当な組換え体の対が選択された。３つの野生型（ＭＸＹ８１、ＭＸＹ８２およびＭＸＹ８３）および３つのｍｓｈ２（ＭＸＹ８６、ＭＸＹ８７およびＭＸＹ８８）二倍体が作製された。Ｏｘａ１１配列挿入断片のみを有するコントロールの野生型およびｍｓｈ２二倍体もＭＸＹ６０およびＭＸＹ６２の適当な組換え体子孫から作製し、ＭＸＹ９０およびＭＸＹ９２が生成した。これらの二倍体は胞子を形成し、第二ラウンドの組換え体の選択のため、胞子をウラシル欠乏シクロヘキサミド含有（−Ｕｒａ＋Ｃｙｈ）培地上およびトリプトファン欠乏カナバニン含有（−Ｔｒｐ＋Ｃａｎ）倍地上に植えた。図６に示すように、これらのすべての菌株について観察された−Ｕｒａ＋ＣｙｈＲおよびＴｒｐ＋ＣａｎＲ胞子コロニーの発生頻度は、ＭＳＨ２遺伝子の抗組換え効果と一致していた。野生型ホモ接合型ＭＸＹ９０の子孫の中に、１０^−３の生存頻度で両方の型のコロニーが見つかったが、この生存頻度は、異種のＯｘａ挿入断片を有する野生型二倍体（ＭＸＹ８１、ＭＸＹ８２およびＭＸＹ８３）の子孫では５から１０倍少なかった。異なるＯｘａ挿入断片を有する二倍体（ＭＸＹ８６、ＭＸＹ８７およびＭＸＹ８８）におけるＭＳＨ２遺伝子の不活性化は、Ｕｒａ＋ＣｙｈＲおよびＴｒｐ＋ＣａｎＲ胞子コロニーの発生頻度を２から６倍増加させ、同一のＯｘａ挿入断片を有するｍｓｈ２二倍体（ＭＸＹ９２）について見られたのと同様のレベルであった。用いられた培地は、第一ラウンドの組換えに用いられたものと異なるが、野生型およびｍｓｈ２の第二ラウンドの組換え体が選択された生存頻度は、第一ラウンドの組換え体のそれと同等であった。

野生型（ＭＸＹ８１およびＭＸＹ８３）およびｍｓｈ２（ＭＸＹ８６）の出の両方におけるＵｒａ＋ＣｙｈＲおよびＴｒｐ＋ＣａｎＲ胞子コロニーが、配列決定のために選択された。全部で１４の野生型および７のｍｓｈ２Ｏｘａ挿入断片の配列が決定された。ほとんどの場合、第二ラウンドの組換えの間、交叉は新規な区間において起こり、再び、位置または区間サイズに関して明確な偏りはなかった：異なる区間を含む交叉が、Ｏｘａ ＯＲＦのいたるところに見られ、それらは１０１ｎｔ程大きい区間、そして５ｎｔ程小さい区間に起こった。ある場合（ＭＸＹ８３ Ｔｒｐ＋ＣｙｈＲ一倍体）、第二ラウンドの交叉が第一ラウンドの交叉区間において起こり、したがって全Ｏｘａ１１配列が回復した。ｍｓｈ２二倍体から作られた組換え体は、野生型菌株から作られたものより多様であった。ｍｓｈ２二倍体ＭＸＹ８６に関して、広範囲にわたるＰＭＳを示すいくつかの胞子コロニーと、配列のモザイク現象が観察され、組換え中間体におけるヘテロ二重鎖の長断片の形成と一致した。さらに、ミスマッチの中にはヘテロ二重鎖域において修復されるものがあり、再びショートパッチミスマッチ修復活性と一致した。要約すると、ｍｓｈ２の出のものにおける第二ラウンドの組換えは、生成する配列の多様性に関して（例えば、交叉区間の分布およびＰＭＳの影響）定性的に、および、配列が少し異なる相同配列どうしの（５％相違）組換えの全体的な頻度の増加に関して定量的に、両方において第一ラウンドの組換えと同じくらい効率的であった。

所定の培地上の組換え体を選択するための選択システムの模式図ある。 上図はプラスミドｐＭＸＹ９およびｐＭＸＹ１２を示す。下図は組換えカセットのＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座への組み込みを示す。 Ｏｘａ遺伝子間の組換え頻度を野生型とｍｓｈ２菌株における配列の同一性の関数として示す。 ｍｓｈ２の過度の組換え効果を示す。 ７８％相同性を共有するＯｘａ配列間の組換えのＰＣＲ分析を示す。 第二ラウンドの組換えに関する組換え頻度を示す。

Claims (44)

1. サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）における組換えＤＮＡ配列の産生および検出方法であって、
   ａ）ゲノムの定められた遺伝子座に、第一のおよび第二のマーカー配列の間に位置する組換えられるべき第一のＤＮＡ配列を含む第一の組換えカセットを有し、かつ、該ゲノムの定められた遺伝子座の対立遺伝子座に、第三のおよび第四のマーカー配列の間に位置する組換えられるべき第二のＤＮＡ配列を含む第二の組換えカセットを有している第一の二倍体エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞を産生する工程、
   ｂ）ａ）で得られた第一の二倍体細胞の胞子形成を誘導する工程、および、
   ｃ）該組換えられるべき第一のＤＮＡ配列と該組換えられるべき第二のＤＮＡ配列との間の交叉によって形成される第一の組換えＤＮＡ配列が第一のおよび第四のマーカー配列の間に位置する組換えカセットを含む一倍体細胞、および、該組換えられるべき第一のＤＮＡ配列と該組換えられるべき第二のＤＮＡ配列の間の交叉によって形成される第二の組換えＤＮＡ配列が第二のおよび第三のマーカー配列の間に位置する組換えカセットを含む一倍体細胞を単離する工程：
   を含む、方法。
2. さらに、
   ａ）請求項１のｃ）で得られた第一の組換えＤＮＡ配列を含む一倍体細胞と請求項１のｃ）で得られた第二の組換えＤＮＡ配列を含む一倍体細胞とを交配することにより第二の二倍体細胞を産生する工程、
   ｂ）ａ）で得られた第二の二倍体細胞の胞子形成を誘導する工程、および、
   ｃ）請求項１のｃ）で得られた第一の組換えＤＮＡ配列と請求項１のｃ）で得られた第二の組換えＤＮＡ配列との間の交叉によって形成される第三の組換えＤＮＡ配列が第一のおよび第二のマーカー配列の間に位置する組換えカセットを含む一倍体細胞、および、請求項１のｃ）で得られた第一の組換えＤＮＡ配列と請求項１のｃ）で得られた第二の組換えＤＮＡ配列との間の交叉によって形成される第四の組換えＤＮＡ配列が第三のおよび第四のマーカー配列の間に位置する第四の組換えカセットを含む一倍体細胞を単離する工程：
   を含む請求項１に記載の方法。
3. 請求項２のｃ）で得られた一倍体細胞を、少なくとも一度他の一倍体細胞と共に別の交配サイクルを行い、得られた二倍体細胞の胞子形成を誘導し、組換えＤＮＡ配列を有する一倍体細胞を、２つのマーカー配列間の分子連鎖に基づき単離することにより、さらに組換えＤＮＡ配列を産生する請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記第一の二倍体細胞が同時にまたは経時に第一の組換えカセットを含むＤＮＡ分子および第二の組換えカセットを含むＤＮＡ分子を用いて二倍体エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞を形質転換することにより産生されたものであり、この２つの組換えカセットがエス・セレビジエ（S. cerevisiae）ゲノムの対立遺伝子座に組み込まれてもよい、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第一のまたは第二の組換えカセットを含むＤＮＡ分子が酵母人工染色体（ＹＡＣ）である請求項４に記載の方法。
6. 第一のまたは第二の組換えカセットを含むＤＮＡ分子がクローニング媒体であり、そこで２つのマーカー配列それぞれが、組換えられるべき第一のまたは第二のＤＮＡ配列に隣接する側とは反対側において、エス・セレビジエ（S. cerevisiae）ゲノムの定められた遺伝子座と相同の標的配列に隣接する請求項４に記載の方法。
7. 前記第一の二倍体細胞がゲノムの定められた遺伝子座に第一の組換えカセットを有している一倍体エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞と、該ゲノムの定められた遺伝子座の対立遺伝子座に第二の組換えカセットを有している一倍体エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞とを融合することにより産生されたものである請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第一の二倍体細胞がゲノムの定められた遺伝子座に第一の組換えカセットを有している一倍体エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞と、該ゲノムの定められた遺伝子座の対立遺伝子座に第二の組換えカセットを有している一倍体エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞とを交配することにより産生されたものである請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
9. 第一のまたは第二の組換えカセットを有している一倍体細胞が：
   ａ）組換えられるべき第一のＤＮＡ配列を、第一のクローニング媒体上において隣接して位置する第一と第二のマーカー配列の間に挿入し、組換えられるべき第二のＤＮＡ配列を第二のクローニング媒体上において隣接して位置する第三と第四のマーカー配列の間に挿入し、それにより２つのマーカー配列それぞれが、組換えられるべき第一のまたは第二のＤＮＡ配列に隣接する側とは反対側において、エス・セレビジエ（S. cerevisiae）ゲノムの定められた遺伝子座と相同の標的配列に隣接し、
   ｂ）ａ）で得られたクローニング媒体から第一の組換えカセットおよび第二の組換えカセットそれぞれを有している断片を切り出し、それにより各カセットがそれぞれの２つのマーカー配列の間に位置する組換えられるべきＤＮＡ配列を含み、そして各カセットが標的配列に隣接し、
   ｃ）第一のカセットまたは第二のカセットに対してヘテロ接合性の二倍体細胞を得るために、ｂ）で得られた組換えカセットとフランキング標的配列とを有している断片を別々にエス・セレビジエ（S. cerevisiae）二倍体細胞に形質転換し、それにより該標的配列がカセットのその配列が相同である遺伝子座への組み込みに作用し、
   ｄ）ｃ）で得られたヘテロ接合性の二倍体細胞の胞子形成を別々に誘導し、および、
   ｅ）第一のカセットを含み、第一のおよび第二のマーカー配列を発現する一倍体細胞、および、第二のカセットを含み、第三のおよび第四のマーカー配列を発現する一倍体細胞を別々に単離する
   ことにより産生されるものである請求項７または８に記載の方法。
10. 前記第一のクローニング媒体がプラスミドｐＭＸＹ９（ＤＳＭ １７０１０）であり、第二のクローニング媒体がプラスミドｐＭＸＹ１２（ＤＳＭ １７０１１）である請求項９に記載の方法。
11. 形質転換に用いられる前記二倍体エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞が少なくとも二つの栄養因子に対して栄養要求性である請求項４から６、９または１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記二倍体細胞がｕｒａ３−１対立遺伝子およびｔｒｐ１−１対立遺伝子に対してホモ接合性であり、該遺伝子が該細胞をウラシルおよびトリプトファンそれぞれに対して栄養要求性にする請求項１１に記載の方法。
13. 形質転換に用いられる前記二倍体細胞が少なくとも２つの抗生物質に対して耐性である請求項４から６または９から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記二倍体細胞がｃａｎ１−１００対立遺伝子およびｃｙｈ２Ｒ対立遺伝子に対してホモ接合性であり、該遺伝子が該細胞をカナバニンおよびシクロヘキサミドそれぞれに対して耐性にする請求項１３に記載の方法。
15. 対立遺伝子ｕｒａ３−１、ｔｒｐ１−１、ｃａｎ１−１００およびｃｙｈ２Ｒに対してホモ接合性であり、ｍｓｈ２：：ＫａｎＭＸ変異に対してヘテロ接合性であるエス・セレビジエ（S. cerevisiae）菌株ＭＸＹ４７（ＤＳＭ １７０２６）の二倍体細胞が形質転換に用いられる請求項４から６または９から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞が機能的ミスマッチ修復システムを有するものである請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞が一過的にまたは持続的にミスマッチ修復システムを欠損しているものである請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記一過的または持続的なミスマッチシステムの欠損が、ミスマッチ修復システムに関わる１または２以上の遺伝子の変異および／または誘導的な発現または抑圧、ミスマッチ修復システムを飽和させる薬剤を用いた処理および／または包括的にミスマッチ修復を損なわせる薬剤を用いた処理によるものである請求項１７に記載の方法。
19. 前記第一のおよび第二の組換えカセットがエス・セレビジエ（S. cerevisiae）ゲノムの染色体ＩＩＩ上のＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座に組み込まれている請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記組換えられるべき第一のおよび第二のＤＮＡ配列が少なくとも１個のヌクレオチドで異なるものである請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記組換えられるべき第一のおよび第二のＤＮＡ配列が、エス・セレビジエ（S. cerevisiae）以外の生物体およびエス・セレビジエ（S. cerevisiae）を含む生物体由来のものである請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記組換えられるべき第一のおよび第二のＤＮＡ配列が、１または２以上の非翻訳配列および／または１または２以上のタンパク質をコードしている配列を含む請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記マーカー配列が、栄養マーカー、色素マーカー、抗生物質耐性マーカー、抗生物質感受性マーカー、プライマー認識部位、イントロン／エクソン境界、酵素の特定のサブユニットをコードしている配列、プロモーター配列、下流調節遺伝子配列および制限酵素部位からなる群より選択されるものである請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記第一のおよび第三のマーカー配列が栄養マーカーであり、その遺伝子産物がエス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞の栄養要求性を補うことができる請求項２３に記載の方法。
25. 前記第一のマーカー配列がＵＲＡ３であり、その遺伝子産物がウラシル栄養要求性エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞にウラシル原栄養性を付与することができる請求項２４に記載の方法。
26. 前記第三のマーカー配列がＴＲＰ１であり、その遺伝子産物がトリプトファン栄養要求性エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞にトリプトファン原栄養性を付与することができる請求項２４に記載の方法。
27. 前記第二のおよび第四のマーカー配列が抗生物質感受性マーカーであり、その遺伝子産物がその抗生物質に耐性のエス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞に抗生物質への感受性を付与することができる請求項２３に記載の方法。
28. 前記第二のマーカー配列がＣＡＮ１であり、その遺伝子産物がカナバニン耐性エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞にカナバニン感受性を付与することができる請求項２７に記載の方法。
29. 前記第四のマーカー配列がＣＹＨ２であり、その遺伝子産物がシクロヘキサミド耐性エス・セレビジエ（S. cerevisiae）細胞にシクロヘキサミド感受性を付与することができる請求項２７に記載の方法。
30. 第一の、第二の、第三のまたは第四の組換えＤＮＡ配列のいずれかを有する組換えカセットを含む一倍体細胞が、各マーカーの組合せの存在を検出するためにＰＣＲ法により確認される請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 第一の、第二の、第三のまたは第四の組換えＤＮＡ配列のいずれかを有する組換えカセットを含む一倍体細胞が、それぞれのマーカー配列の組合せと同じＤＮＡ分子上の分子連鎖を選択する培地上に植えられることにより確認される請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
32. 第一の組換えＤＮＡ配列を含む一倍体細胞が、第一のおよび第四のマーカー配列と同じＤＮＡ分子上の分子連鎖を選択する培地上に植えられる請求項３１に記載の方法。
33. 第二の組換えＤＮＡ配列を含む一倍体細胞が、第二のおよび第三のマーカー配列と同じＤＮＡ分子上の分子連鎖を選択する培地上に植えられる請求項３１に記載の方法。
34. 第三の組換えＤＮＡ配列を含む一倍体細胞が、第一のおよび第二のマーカー配列と同じＤＮＡ分子上の分子連鎖を選択する培地上に植えられる請求項３１に記載の方法。
35. 第四の組換えＤＮＡ配列を含む一倍体細胞が、第三のおよび第四のマーカー配列と同じＤＮＡ分子上の分子連鎖を選択する培地上に植えられる請求項３１に記載の方法。
36. 隣接するＵＲＡ３マーカー遺伝子およびＣＡＮ１マーカー遺伝子を含み、組換えられるべきＤＮＡ配列を挿入するためのポリリンカー配列が該２つのマーカー遺伝子配列の間に位置し、該２つのマーカー遺伝子配列が、該ポリリンカー配列に隣接する側とは反対側において、エス・セレビジエ（S. cerevisiae）ゲノムの染色体ＩＩＩ上のＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座と相同の標的配列に隣接するプラスミドｐＭＸＹ９（ＤＳＭ １７０１０）。
37. 前記ポリリンカー配列が制限酵素ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＰａｃＩおよびＢｇｌＩＩの制限部位を含む請求項３６に記載のプラスミドｐＭＸＹ９（ＤＳＭ １７０１０）。
38. 隣接するＴＲＰ１マーカー遺伝子およびＣＹＨ２マーカー遺伝子を含み、組換えられるべきＤＮＡ配列を挿入するためのポリリンカー配列が該２つのマーカー遺伝子配列の間に位置し、該２つのマーカー遺伝子配列が、該ポリリンカー配列に隣接する側とは反対側において、エス・セレビジエ（S. cerevisiae）ゲノムの染色体ＩＩＩ上のＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座と相同の標的配列に隣接するプラスミドｐＭＸＹ１２（ＤＳＭ １７０１１）。
39. 前記ポリリンカー配列が制限酵素ＳｍａＩ、ＳｐｅＩおよびＰａｃＩの制限部位を含む請求項３８に記載のプラスミドｐＭＸＹ１２（ＤＳＭ １７０１１）。
40. エス・セレビジエ（S. cerevisiae）菌株ＭＸＹ４７（ＤＳＭ １７０２６）であって、その二倍体細胞が対立遺伝子ｕｒａ３−１、ｔｒｐ１−１、ｃａｎ１−１００およびｃｙｈ２Ｒに対してホモ接合性であり、ｍｓｈ２：：ＫａｎＭＸ変異に対してヘテロ接合性であることを特徴とするエス・セレビジエ（S. cerevisiae）菌株ＭＸＹ４７（ＤＳＭ １７０２６）。
41. プラスミドｐＭＸＹ９（ＤＳＭ １７０１０）を含むイー・コリ（E.coli）菌株ＪＭ１０１。
42. プラスミドｐＭＸＹ１２（ＤＳＭ １７０１１）を含むイー・コリ（E.coli）菌株ＤＨ５α。
43. 少なくとも、エス・セレビジエ（S. cerevisiae）菌株ＭＸＹ４７（ＤＳＭ １７０２６）の細胞を含む第一のコンテナ、プラスミドｐＭＸＹ９（ＤＳＭ １７０１０）を含むイー・コリ（E.coli）菌株ＪＭ１０１の細胞を含む第二のコンテナおよびプラスミドｐＭＸＹ１２（ＤＳＭ １７０１１）を含むイー・コリ（E.coli）菌株ＤＨ５αを含む第三のコンテナを含むキット。
44. 少なくとも、エス・セレビジエ（S. cerevisiae）菌株ＭＸＹ４７（ＤＳＭ １７０２６）の細胞を含む第一のコンテナ、プラスミドｐＭＸＹ９（ＤＳＭ １７０１０）のＤＮＡを含む第二のコンテナおよびプラスミドｐＭＸＹ１２（ＤＳＭ １７０１１）のＤＮＡを含む第三のコンテナを含むキット。

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