JP2013524785A - 遺伝子モザイクの発生方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、ｅ）単工程法において、（ｖｉｉ）細胞ゲノムの不可欠部分であり、又は遺伝子構造の骨組において存在する、組換えられるべき他の遺伝子に対して９９．５％未満の配列相同性を有する少なくとも１つの遺伝子Ａで細胞を形質転換すること、（ｖｉｉｉ）前記遺伝子を組換えること、（ｉｘ）標的ゲノムの組込み部位で遺伝子の遺伝子モザイクを製造すること（その際少なくとも１つの遺伝子Ａは、該組込み部位の５’又は３’末端に繋がっている５’末端又は３’末端で単一のフランキング標的配列を有する）、ｆ）遺伝子モザイクを含むクローンを選択することを含む、体性ｉｎ ｖｉｖｏ組換えによって遺伝子モザイクを生じるための方法、及び遺伝子モザイク及び遺伝子アセンブリの多様性を製造する方法に関する。

Description

本発明は、相同なｉｎ ｖｉｖｏ組換えによる遺伝子モザイクの発現方法に関する。

背景技術
タンパク質設計の一次目標の１つは、新たな又は改良された特性を有するタンパク質を生じることである。タンパク質又は酵素に対する所望の活性を付与する能力は、化学及び医薬産業における相当な実質的な適用を有する。定方向タンパク質進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）は、タンパク質工学における有力な技術台として明らかになっており、変異体のライブラリは、所望の特性を加工するクローンのために実験的に調査される。

定方向タンパク質進化は、自然に見出されない所望の特徴を有するタンパク質又は核酸を進化するための自然選択の能力を利用する。種々の技術は、タンパク質突然変異体及び変異体を生じるため、及び所望の機能を選択するために使用される。組換えＤＮＡ技術は、ための単構造遺伝子、又は急速な増殖及び／又は高レベルなタンパク質生成に適した代理宿主に対する全体経路の遺伝子の輸送を可能にさせる。活性又は他の特性における累積した改良は、通常、突然変異体の反復及びスクリーニングを介して得られる。直接進化の適用は、主に、大学及び産業の研究所において、タンパク質の安定性を改良し、かつ酵素及び生物の活性又は全体の性能を高めること、又は酵素基質特異性を変質させ、かつ新たな活性を設計することを見出せる。ほとんどの直接進化計画は、農業、医薬又は産業背景（生体触媒作用）において人間に有用である特性を進化することを要求する。

全体の代謝経路の進化は、特に魅力的な概念である。それというのも、ほとんどの天然及び新規化合物が、単一酵素によってではなく経路によって製造されるからである。代謝経路設計は、通常、経路における全ての酵素の協調操作を要求する。新たな代謝経路の進化及び応用生物学的方法の進化は、通常、個々の遺伝子、全体のプラスミド、多重遺伝子クラスター又はさらに全体のゲノムを進化するための組換えの不活性サイクル、及びスクリーニング又は選択の方法によって実施される。

Ｓｈａｏ ｅｔ ａｌ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３７（２）：ｅ１６ Ｅｐｕｂ ２００８ Ｄｅｃ １２）は、サッカロミケス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）における調節フラグメントの５’又は３’末端の配列を含む５’及び３’末端での２つのフランキング（係留）領域のｉｎ ｖｉｖｏでの相同な組換えによる単工程での全体の生化学経路又はゲノムをエンコードする、多量の組換えＤＮＡのアセンブリを記載している。

Ｅｌｅｆａｎｔｙ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９５， １ １８９７−１ １９０２（１９９８）は、突然変異マウスを生じる遺伝子ターゲティング実験を記載しており、その際ｌａｃＺ受容体遺伝子は、ＳＣＬ遺伝子座にノッキングされる。２つの係留配列、すなわちそれぞれの５’及び３’末端での１つを使用するＳＣＬ−ｌａｃＺ遺伝子ターゲティング戦略を示す図１を参照できる。

直接進化は、生きている細胞中で実施することができ、ｉｎ ｖｉｖｏ進化とも言われ、又は全ての細胞を含まなくてよい（ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化）。Ｉｎ ｖｉｖｏ進化は、進化したタンパク質又は核酸が生きた生体に使用されるべきである場合に有用である、細胞環境における特徴のための選択の利点を有する。酵母におけるｉｎ ｖｉｖｏでの相同な組換えは、遺伝子クローニング、プラスミドアセンブリ及びライブラリ作成のために広く使用されている。

ライブラリ多様性は、突然変異誘発又は組換えによって得られる。ＤＮＡシャッフリングは、同義遺伝子から有益な突然変異体の直接組換えを可能にする。ＤＮＡシャッフリングにおいて、ＤＮＡシャッフリングにおいて配列の集団は、無作為に断片化され、そして完全な長さのハイブリッド配列に再構築される。

相同な組換えの目的のために、自然に生じる相同遺伝子は、開始多様性の源として使用される。単一遺伝子シャッフリングライブラリ要素は、典型的に９５％より多い同一性である。ファミリー−シャッフリングは、しかしながら、典型的に６０％同一である配列のブロック変換を可能にする。機能配列の多様性は、自然選択を生き残った関連する親配列から生じ、従って、はるかに多数の突然変異体は、構造又は機能に対して有害性の降下を導入することなく与えられた配列において許容される。

３０％までの多様性を有する種々の起源のＤＮＡ断片の組換えは、ＷＯ １９９０００７５７６Ａ１において記載されている。ハイブリッド遺伝子は、ミスマッチ修復欠損細菌において、又はミスマッチ修復（ＭＭＲ）システムが一時的に不活性化されている細菌において、属間及び／又は種間組換えによってｉｎ ｖｉｖｏで製造される。それによって、発散配列間の組換え頻度、すなわち相同な組換えに対する阻害効果を有する、損傷したＤＮＡが修復されることによってそれらの方法は、妨げられる。

ＭＭＲの基本機構の調査は、Ｋｕｎｚ ｅｔ ａｌ（Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ６６ （２００９） １０２１ −１０３８）によって提供される。

標的とされる相同組換えは、ＭＭＲ欠損プラントにおいて記載されている（ＷＯ２００６／１３４４９６Ａ２）。１０％までの差異を有する配列を有する遺伝子座を標的とすることが可能であった。

ポリヌクレオチドライブラリの発生のための細菌中への相同な組換えは、ＷＯ０３／０９５６５８Ａ１において開示されている。ポリヌクレオチドの発現ライブラリを生じ、その際それぞれのポリヌクレオチドは、宿主細胞ゲノムの領域で相同なポリヌクレオチド及び２つのフランキング配列を含む複製していない直鎖の組込みカセットを使用して、完全な細菌宿主細胞のゲノム中に相同な組換えによって組込まれる。

ライブラリの多様性は、複相生物の形成を導く効率的に交配する単相細胞の能力の利点をとることによって高められる。その植物的生活サイクルにおいて、Ｓ．セレビジエ細胞は、単相ゲノムを有し、すなわち、全ての染色体は、単一の複製として存在する。ある条件下で、単相細胞は交配することができる。この方法によって複相細胞が形成される。複相細胞は、特に一定の養分が欠失した場合に、再度、複相細胞から形成することができる。そして、それらは、減数分裂と言われる過程、続く胞子形成を受け、４つの単相胞子を形成する。減数分裂中に、２つの親ゲノムの異なる染色体が組合わされる。減数分裂性組換え中に、ＤＮＡ断片は、組換えられたＤＮＡ材料をもたらすように変換される。

ＷＯ２００５／０７５６５４Ａ１は、Ｓ．セレビジエの有性生殖サイクルに基づいて、サッカロミケス・セレビジエにおける組換えＤＮＡ配列を生じるためのシステムを開示している。ヘテロ接合複相細胞は、減数分裂及び胞子形成の過程を誘発する条件下で成長される。減数分裂は、一般に、遺伝子組換えの高められた頻度によって特徴付けられる。従って、単数細胞又は胞子である減数分裂の生成物は、２つの分岐したＤＮＡ配列管の組換えによって、組換えＤＮＡ配列を含むことができる。不活性方法によって、組換え複相子孫が選択され、かつ互いに交配され、得られた複相は、再度胞子形成され、かつそれらの子孫胞子は、新たな組換え事象を識別するための適切な選択条件を受ける。この方法は、野生型又はミスマッチ修復欠損のＳ．セレビジエ細胞において記載されている。従って、それぞれ２つの選択マーカーによって隣接させた、対象の遺伝子は、それぞれのミスマッチ修復欠損の複相株の２つの姉妹染色体の同一の遺伝子座中に組込まれる。ＤＮＡ配列は、遺伝子座のフランキングＤＮＡ配列に対して１００％同一である新たなＤＮＡ断片の５’又は３’末端に追加される。これらのフランキング標的配列は、約４００〜４５０ヌクレオチドの長さである。そして、その細胞は、胞子形成を開始させる。得られた胞子及び組換え配列は、適切なフランキングマーカーのための選択によって区別される。

効率のよい組換え相同ＤＮＡ配列に対する酵母の能力は、ライブラリの多様性を増加することを開発させることもできる。８９．８％の相同性を共有する２つの遺伝子が、ＰＣＲによって突然変異され、かつ野生型の酵母中に形質転換される場合に、２つの遺伝子全体に渡っていくつかの交叉点を示す、１０ｅ７のキメラライブラリは、ｉｎ ｖｉｖｏでの相同組換えを介して作製された（Ｓｗｅｒｓ ｅｔ ａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２（３） ｅ３６ （２００４））。

有糸分裂相同組換えの方法は、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５４： １３３−１４６ （２０００））によって記載されている。野生型又はＭＭＲ欠損株における組換えに対して短い逆転繰り返し率において含まれる定義されたミスマッチの効果が調査された。

本発明の目的は、特に、長いＤＮＡ断片を組換えるために、遺伝子モザイクの多様性を製造する及びアセンブリする改良された方法を提供することである。結果として、改良された組換えの選択のための変異体のそれぞれのライブラリを提供するために望ましい。

前記目的は、本発明の実施態様の規定によって達せられる。

発明の要約
本発明は、
ａ）単工程法において、
（ｉ）細胞ゲノムの不可欠部分であり、又は遺伝子構造の骨組において存在する、組換えられるべき他の遺伝子に対して９９．５％未満の配列相同性を有する少なくとも１つの遺伝子Ａで細胞を形質転換すること、
（ｉｉ）前記遺伝子を組換えること、
（ｉｉｉ）標的ゲノムの組込み部位で遺伝子の遺伝子モザイクを製造すること（その際前記少なくとも１つの遺伝子Ａは、該組込み部位の５’又は３’末端に繋がっている５’末端又は３’末端で単一のフランキング標的配列を有する）
ｂ）遺伝子モザイクを含むクローンを選択すること
を含む、体性ｉｎ ｖｉｖｏ組換えによって遺伝子モザイクを生じるための新規方法を提供する。

特に、本発明は、
ａ）単工程法において、
（ｉ）細胞ゲノムの不可欠部分であり、又は遺伝子構造の骨組において存在し、又は発現カセットである、異なる遺伝子Ｂに対して９９．５％未満の配列相同性を有する少なくとも１つの遺伝子Ａで細胞を形質転換すること、
（ｉｉ）前記遺伝子を組換えること、
（ｉｉｉ）標的ゲノムの組込み部位で遺伝子Ａ及びＢの遺伝子モザイクを製造すること（その際前記少なくとも１つの遺伝子Ａは、該組込み部位の５’又は３’末端に繋がっている遺伝子構造の５’末端又は３’末端で単一のフランキング標的配列に連結される）
ｂ）遺伝子モザイクを含むクローンを選択すること
を含む、体性ｉｎ ｖｉｖｏ組換えによって遺伝子モザイクを生じるための方法に関する。

選択マーカーが遺伝子モザイクにおいて使用され、かつクローンが選択マーカーの存在に従って選択されることが特に好ましい。例えば、遺伝子モザイクは、例えば前記遺伝子Ａが選択マーカーに連結される場合に、選択マーカーを含む。代わりに、選択は、例えば収率又は機能特性を決定することによって、組換えの結果のあらゆる生成物の存在によって製造されてもよい。特に、１つ以上の異なる選択マーカーは、遺伝子モザイクのタイプを区別するために使用されてよい。

特に、本発明による方法は、標的ゲノム、例えば細胞のゲノムの一部である前記の他の遺伝子を使用する。好ましい一実施態様において、前記他の遺伝子は、細胞のゲノムの一部である遺伝子Ｂである。

代わりの好ましい一実施態様に従って、前記他の遺伝子は、標的ゲノムから分かれた遺伝子構造、例えば直鎖のポリヌクレオチドであり、及び場合により、組換えの過程において標的ゲノム中に組込まれる。

本発明の特定の一実施態様に従って、前記細胞は、少なくとも１つの遺伝子Ａ及び少なくとも１つの遺伝子Ｂで同時形質転換され、その際遺伝子Ａの単一のフランキング標的配列は、前記標的ゲノム上で組込み部位の５’末端に繋がっており、かつ遺伝子Ｂは、組込み部位の３’末端に繋げる単一のフランキング標的配列に連結される。

特に、細胞は、選択マーカーを有する少なくとも１つの遺伝子Ａ及び少なくとも１つの遺伝子Ｂで同時形質転換されることができ、その際遺伝子Ａの単一のフランキング標的配列は、前記標的ゲノム上の組込み部位の５’末端に繋がっており、かつ遺伝子Ｂは、組込み部位の３’末端に繋げる単一のフランキング標的配列に連結され、かつ少なくとも２つの選択マーカーのためのクローンが選択される。

特に、細胞は、少なくとも２つの異なる遺伝子Ａ１及びＡ２で、及び場合により少なくとも２つの異なる遺伝子Ｂ１及びＢ２で同時形質転換されてよい。

特定の一実施態様に従って、遺伝子Ａ及び前記他の遺伝子Ｃのアセンブリを得るための他の遺伝子の配列で、遺伝子Ａ及び／又は他の遺伝子にハイブリダイゼーションする配列を有する、少なくとも１つの他の遺伝子Ｃが同時形質転換される。

特に、遺伝子Ａ及び／又はＢに対して遺伝子Ｃの組換え及びアセンブリを得るために、遺伝子Ａ及び／又はＢ、例えば完全な長さの遺伝子ＡもしくはＢの配列、又は遺伝子Ａ及び／又はＢの部分的な配列でハイブリダイゼーションする配列を有する、少なくとも１つの他の遺伝子Ｃは、同時形質転換される。

特に、前記遺伝子Ｃのハイブリダイズ配列は、該配列に対して９９．５％未満の配列相同性、有利には少なくとも３０％の配列相同性を有する。

例えば改良された特徴を有し又は改良された収率で、組換えられた遺伝子内遺伝子モザイクを得るための部分的な遺伝子の混合物、例えば異なる方法で生成物の発現に適した遺伝子として理解される、少なくともヌクレオチド変換又は遺伝子内での交叉を有する特定の遺伝子モザイク、すなわち遺伝子内交叉を有するモザイク、例えば遺伝子Ａの部分及び組合された他の遺伝子の部分を含むものが選択される。かかる遺伝子内遺伝子モザイクは、遺伝子の系列の組換えによって及び有利にはアセンブリによっても製造されることができ、その際１つ以上のアセンブリされた遺伝子は、かかる遺伝子内遺伝子モザイクを有する。

好ましい一実施態様に従って、少なくとも３つの異なる遺伝子Ａ及び／又はＢ及び／又はＣのモザイクを得ることができる。

有利には、前記遺伝子Ａ及び／又は前記他の遺伝子は、活性を有するポリペプチド又はポリペプチドの部分のためのコード化である。

特に、本発明の方法は、活性を有するポリペプチドの部分のためのコード化である、遺伝子Ａ、Ｂ及び／又はＣを使用する。従って、遺伝子、例えば遺伝子Ａ及び／又はＢ及び／又はＣ、有利にはそれらの全ては、個々に、それ自体生物学的に活性のあるポリペプチドをコードしないが、しかしその一部のみをコードしてよく、かつ遺伝子アセンブリに対してのみ、それぞれ活性又は改質された活性について有してよい。

本発明の方法を使用して、生化学的経路のポリペプチドに関してコードする同義遺伝子は、アセンブリされ、かつ組換えられてよい。

他の特定の一実施態様において、本発明の方法は、コードしていない配列、例えばプロモータ、翻訳されていない領域、リボソーム結合部位、ターミネータ等において得られる遺伝子の組換え及び偶発のアセンブリを提供する。

あらゆる組換えコンピテント真核又は原核宿主細胞は、本発明による体性ｉｎ ｖｉｖｏ組換えによって遺伝子モザイクを生じるために使用されうる。本発明の好ましい一実施態様に従って、前記細胞は、修復欠損細胞、例えば核酸修復欠損細胞、例えばＤＮＡ修復欠損、又はＭＭＲ欠損細胞である。

特に、前記細胞は、真核細胞、有利には真菌、哺乳動物もしくは植物細胞、又は原核細胞である。

有利には、前記細胞は、アスペルギルス種又は真菌細胞であり、有利には、一般のサッカロミセス、カンジダ、クリベロミセス、ハンゼヌラ、シゾサッカロミセス、ヤロウイア、ピチア及びアスペルギルスからなる群から選択されてよい。

有利には、単相株、例えば単相酵母株が使用される。

代わりに、真核細胞、例えば大腸菌、バチルス、ストレプトミセス、又は哺乳動物細胞、例えばＨｅＬａ細胞もしくはＪｕｒｋａｔ細胞、又は植物細胞、例えばアラビドプシスが、使用されてよい。

特定の一実施態様に従って、フランキング標的配列は、少なくとも５ｂｐ、有利には１０ｂｐ、より有利には少なくとも２０ｂｐ、５０ｂｐ、１００ｂｐ、１００ｂｐ、５０００ｂｐまでの長さである。特に、フランキング標的配列は、前記遺伝子に連結され、又は必須の、該遺伝子の末端部位である。該フランキング標的配列は、前記組込み部位のアンカリング配列でハイブリダイズして、３０％〜９９．５％、有利には９５％未満、９０％未満、８０％未満の範囲で相同性を有することが好ましい。

ゲノムの標的組込み部位に繋がっている少なくとも２つの異なるフランキング標的配列が本発明に従って使用される場合に、それらは互いと組換えせず、有利には、それらは３０％未満の相同性を共有する。

本発明の方法に有用な選択マーカーは、あらゆる公知の栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、ノックインマーカー、活性剤／結合ドメインマーカー及び優性劣性マーカー及び比色マーカーからなる群から選択されうる。好ましいマーカーは、時間的に不活性化され、又は機能的にノックアウトされてよく、かつそのマーキング特性を回復するために再建されてよい。さらに好ましいマーカーは、追跡可能な遺伝子であり、その際該マーカーは、マーカー機能を有する分離配列を有さない、遺伝子配列Ａ及び／又は他の遺伝子、例えば遺伝子Ｂの機能であり、その結果、遺伝子モザイクの発現は、モザイク自体の欠損によって直接決定されることができる。この場合において、遺伝子モザイクは、直接追跡可能である。

特定の一実施態様に従って、前記遺伝子は、直鎖ポリヌクレオチド、ベクター又は酵母人工染色体中に含まれる。特に、組換えられるべき遺伝子Ａ及び／又は他の遺伝子は、有利には３００〜２００００ｂｐの直鎖ポリヌクレオチドの形である。特に、これらは、プラスミド又はメガプラスミドをアセンブリし、又は使用するために必要ではない。遺伝子を、従って、それ自体、すなわちキャリヤーなしに使用することができる。

組換え及び組込みのために使用される遺伝子は、例えば該遺伝子を運搬するためのベクターとして使用されるべき、あらゆる遺伝子アセンブリにおいて含まれてもよい。該遺伝子は、従って、遺伝子アセンブリ、例えば直鎖ポリヌクレオチド、ベクター又は酵母人工染色体中に含まれる。これらは、有利には、直鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、ＰＣＲ構築物、人工染色体、例えば酵母人工染色体、ウィルス性ベクター又は転移因子を含む。

本発明の特定の一実施態様に従って、標的ゲノムの組込み部位は、例えば、人工染色体を含む、直鎖ポリヌクレオチド、プラスミド又染色体内の遺伝子上に置かれる。

本発明による方法は、特に、遺伝子内遺伝子モザイクを有する少なくとも１つのクローンの選択のために提供する。特に、遺伝子アセンブリを有する少なくとも１つのクローン及び少なくとも１つの組換え遺伝子モザイクが選択される。

本発明による方法を使用して、少なくとも３塩基対、有利には少なくとも９塩基対の、２００００塩基対までの遺伝子モザイクが得られ、並びに、例えば有利には、７００塩基対ごと、より有利には６００塩基対ごと、５００塩基対又はさらに少ない塩基対ごとに、少なくとも３つのクロスオーバー、有利には少なくとも４、５又は１０のクロスオーバーを有する、少なくとも１つの遺伝子内モザイクを含む遺伝子モザイクが得られる。典型的に、クロスオーバーの高い程度は、適したライブラリ要素を選択するためのライブラリを製造するために使用されてよい、組換え遺伝子の大きい多様性に関して提供する。モザイク又はクロスオーバーの程度は、かかるライブラリの品質のパラメータとして理解されうる。

本発明の方法によって改質される遺伝子は、化学的又は産業目的のために有用なあらゆる遺伝子であってよい。これらの遺伝子は、例えば、組換え発現システムのために使用されてよい例えばコード化されていない配列、又は生物学的活性を有するポリペプチドをエンコードしてない、全体で又は部分的に、それらの部分的はない列を含むポリペプチドの変異体であってよく、ポリペプチドは、特に、酵素、抗体又はそれらの一部、サイトカイン、ワクチン抗原、成長因子又はペプチドからなる群から選択される。生物活性を有するポリペプチドの一部として非コード配列又はアミノ酸配列をエンコードする遺伝子、いわゆる"部分遺伝子"が改質される場合、かかる部分遺伝子のアセンブリが、機能的特徴を有し、例えば生物活性を有するポリペプチドをエンコードすることが好ましくてよい。有利には、３ｂｐ〜２００００ｂｐ、特に少なくとも１００ｂｐ、有利には３００ｂｐ〜２００００ｂｐ、特に１００００ｂｐまでのサイズ範囲で、多数の異なる遺伝子、例えば異なる部分遺伝子は組換えられ、その際異なる遺伝子の数は、少なくとも２、より特に少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は少なくとも１９であり、例えば有利には調整される、生物活性を有する、例えば増大させた生物活性を有する、非コード又はエンコード化組換えペプチドである組換えられた遺伝子配列を製造する。この点に関して使用される"生物活性"と言う用語は、酵素活性、例えば特定の基材が特定の生成物に変換する活性をいう。本発明によって多様化されるような好ましい遺伝子は、多重鎖ポリペプチドに関してコードする。

本発明の特定の一実施態様によって、これらは、本発明の方法を使用して細胞における遺伝子モザイクの多様性を製造すること、及びモザイクのライブラリを得るために該細胞の表面上に多様性を提示することを含む、遺伝子変異体の細胞提示の方法を提供する。

かかる好ましい提示において得られるライブラリは、特に、あらゆる適した形、特に、遺伝子変異体を含む種々の生物を含む生物学的ライブラリであってよい。本発明による生物学的ライブラリは、生物のレパートリーを作るために生物の個体群を含み、及び／又はそれらによって特に表現され、その際個々の生物は、少なくとも１つのライブラリ数を含む。

本発明の特定の側面に従って、それらは、さらに、かかるライブラリからの遺伝子変異体を含む生物、例えば生物のレパートリーから選択される生物を提供する。本発明によって提供される生物は、例えば生成宿主細胞のような、適した発現システムにおける遺伝子発現生成物を表すために使用されてよい。

非減数分裂ｉｎ ｖｉｖｏ組換えを示す図。 相同組換えによるＤＮＡの組換え及びアセンブリを示す図。 遺伝子Ａ、Ｂ及びＣの再組換え及びアセンブリを示す図。 オキサ組換え基材を示す図。 遺伝子及びタンパク質モザイクＯＸＡ１１／ＯＸＡ７（配列番号１〜１４）の配列を示す図。 遺伝子及びタンパク質ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５（配列番号１５〜３８）の配列を示す図。 親遺伝子ＯＸＡ１１、ＯＸＡ７及びＯＸＡ５（配列番号３９〜４１）の配列を示す図。 ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７の相同アセンブリに対応する、複雑なモザイク遺伝子を含むクローンの配列を示す図。 クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）及び組換え体配列のＡＤＨ１遺伝子の配列を示す図。

図１：非減数分裂ｉｎ ｖｉｖｏ組換え
相同遺伝子Ａ及びＢ（９９．５％未満の相同性）を組換えた。マーカー配列及びフランキング標的配列が相同でないために、組換え／アセンブリは、遺伝子Ａ及びＢ間でのみ生じた。結果として、ハイブリッド／モザイク遺伝子は、組換えられた遺伝子Ａ及びＢ、２つのマーカー及び双方のフランキング標的配列を含んだ。遺伝子モザイクは、標的染色体上で標的遺伝子座中に組込まれる。全体の構成を組込ませたクローンは、双方のマーカーに関する選択性である適した媒体上で成長した。

Ｔ５’及びＴ３’は、染色体部位状に相同組込みを処理する酵母ゲノム（約４００ｂｐ）上での標的配列（９９．５％未満の相同性）に対応する。Ｍ１及びＭ２は、二重選択のためのフランキングマーカーである。遺伝子Ａ及び遺伝子Ｂは、与えられた程度の相同性（９９．５％未満）を有する相同バージョンに関連する。オーバーラップ配列は、双方の遺伝子の全体のＰＲＦに対応する。ＭＭＲ欠損酵母形質転換体における相同組換えによるアセンブリ後に、二重選択は、組換えの分離を許可する。

図２：相同組換えによるＤＮＡの組換え及びアセンブリ
この図は、特定の一実施態様の図説を示し、その際細胞は、少なくとも２つの遺伝子と同時形質転換され、ここでＤＮＡ断片Ａ及びＢは、それらの８０ｂｐのオーバーラップ断片に対して少なくとも９９．５％未満の相同性を有する。それぞれのＤＮＡ断片は、１つの選択マーカーによってフランクされる。

断片Ａは、染色体上の５’末端の正確な組込み部位に対応するフランキング標的配列、及び断片Ｂとオーバーラップするハイブリダイズ領域を含み、断片Ｂは、３’組込み部位に対応するフランキング標的配列及び断片Ａとオーバーラップするハイブリダイズ領域を含んだ。ミスマッチ欠損酵母細胞は、得られた断片で形質転換された。双方のマーカーに関して選択性がある得られた形質転換体を培地上に置く。双方のマーカーに関して選択されてよいクローンを単離し、アセンブリされた／組込まれたクラスター、並びに遺伝子Ａ及びＢのＯＲＦの再構築を、選択された組換え体のゲノムＤＮＡの分子解析によって確認した。

Ｔ５’及びＴ３’は、染色体部位状に相同組込みを処理する酵母ゲノム（約４００ｂｐ）上での標的配列（９９．５％未満の相同性）に対応する。Ｍ１及びＭ２は、二重選択のためのフランキングマーカーである。ＤＮＡ断片Ａ及びＢは、追跡可能であってよい１つの遺伝子、例えばＧＦＰにアセンブリされてよく、又はこの方法によってアセンブリされる２つの遺伝子を示してよい。全ての遺伝子のオーバーラップ配列は、相同組換えによるアセンブリ後にＯＲＦの再構築を可能にする、９９．５％未満の相同性（１２０ｂｐ）を有する。二重選択は、組換え体の単離を可能にし、かつアセンブリの一次検証として提供する。

図３：遺伝子Ａ、Ｂ及びＣの再組換え及びアセンブリ
この図は、さらに遺伝子Ｃの同時形質転換を示し、遺伝子Ｃは、遺伝子Ａ及び／又はＢのフランキング配列とハイブリダイズする配列を有し、遺伝子Ｃのアセンブリを遺伝子Ａ及びＢに対して得る。

Ｔ５’及びＴ３’は、染色体部位状に相同組込みを処理する酵母ゲノム（約４００ｂｐ）上での標的配列（９９．５％未満の相同性）に対応する。Ｍ１及びＭ２は、二重選択のためのフランキングマーカーである。遺伝子Ａ、遺伝子Ｂ及び遺伝子Ｃは、与えられた程度の相同性（９９．５％未満）を有する相同バージョンに関連する。オーバーラップ配列は、双方の遺伝子の全体のＰＲＦに対応する。ＭＭＲ欠損酵母形質転換体における相同組換えによるアセンブリ後に、二重選択は、組換えの分離を許可する。

図４：オキサ組換え基材
４つの遺伝子は、β−ラクタマーゼ酵素の変異体をエンコードする。それらは、ＤＮＡレベルでの相同性の異なる程度（９５％〜４９％）を有する関連する変異体である。上部のパネルは、アライメント後に生じた樹状図で、遺伝子のＰＲＦの図式的なアニーリングを示す。遺伝子サイズは、約８００ｂｐである。ＡＴＧ及びＴＡＡは、開始コドン及び終止コドンを意味する。下部の表は、ＤＮＡレベルでの４つの遺伝子間の配列類似性のパーセンテージを示す。

図５：遺伝子及びタンパク質モザイクＯＸＡ１１／ＯＸＡ７（配列番号１〜１４）の配列
ＯＸＡ７起源のヌクレオチド配列は、太字及び下線であり、突然変異ヌクレオチド配列は、太字でイタリック文字である。

クローンは、二重選択によって単離され、かつＤＮＡは、増幅及びシーケンス処理のために使用した。双方のストランドの明らかに読みやすい配列のみを使用した。得られたクロマトグラムは、Ｃｌｕｓｔａｌのようなプログラムで配置させた。

図６：遺伝子及びタンパク質ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５（配列番号１５〜３８）の配列
ＯＸＡ５起源のヌクレオチド配列は、太字及び下線であり、突然変異ヌクレオチド配列は、太字でイタリック文字である。

クローンは、二重選択によって単離され、かつＤＮＡは、増幅及びシーケンス処理のために使用した。双方のストランドの明らかに読みやすい配列のみを使用した。得られたクロマトグラムは、Ｃｌｕｓｔａｌのようなプログラムで配置させた。

図７：親遺伝子ＯＸＡ１１、ＯＸＡ７及びＯＸＡ５（配列番号３９〜４１）の配列

図８：ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７の相同アセンブリに対応する、複雑なモザイク遺伝子を含むクローンの配列
配列をクローンし、そしてそれぞれのタンパク質アニーリングを得る：図８ａ）ＯＵＬ３−０５−ＩＩ（配列番号４２及び４３）、図８ｂ）ＯＵＬ３−０５−ＩＩＩ（配列番号４４及び４５）、図８ｃ）ＯＵＬ３−０５−ＩＶ（配列番号４６及び４７）、図８ｄ）ＯＵＬ３−０５−ＩＸ（配列番号４８及び４９）、並びに図８ｅ）ＯＵＬ３−０５−Ｘ（配列番号５０及び５１）（それぞれＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７）。

ＯＸＡ５のヌクレオチド配列は太字であり、かつＯＸＡ７に対応するものは下線である。太字でなく、下線を引いていない配列はＯＸＡ１１に対応する。

図９：クルイベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、サッカロミセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）及び組換え体配列のＡＤＨ１遺伝子の配列
クルイベロミセス・ラクチスのヌクレオチド配列は下線である。

図９ａ）：（配列番号５２）ＡＤＨ クルイベロミセス、図９ｂ）：（配列番号５３）サッカロミセス、図９ｃ）：（配列番号５４）クローンＡ０２、図９ｄ）：（配列番号５５）Ａ０３、図９ｅ）：（配列番号５６）Ａ０５、図９ｆ）：（配列番号５７）Ａ０６、図９ｇ）：（配列番号５８）Ａ１０、図９ｈ）：（配列番号５９）Ａ１１。

発明の詳細な説明
従って、本発明は、相同ＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｖｏ組換えのための新規でより高い効率の、すなわち同様に、しかし同一でない方法に関する。以下で、相同組換えの用語は、時に相同配列が組換えられる場合に相同組換えと言われ、同一であってよく、又は同一であってはいけない、一定の相同性を有する配列の組換えを言う。部位特異性消化及び結紮に関する従来のクローニング方法と異なり、相同組換えは、相補的配列を配置し、かつ断片間の変換を可能にする。ハイブリッド遺伝子とも言われる組換えモザイク遺伝子は、ミスマッチ塩基を有する配列のハイブリダイゼーションを介して細胞で生じる。本発明の突然変異誘発方法によって、適した選択のための多様性を容易に製造すること、及び時間効率方法でのインタレストのポリペプチドの再設計することが可能である。

特に、本発明は、まず、ｉｎ ｖｉｖｏ組換えの機能的システムを使用することによって、効率的な組換え及びモザイク形成、単工程法での多様遺伝子の多様化及びアセンブリを可能にする。

"単工程法"と言う用語は、組換え体を製造するいくつかの工程、例えば細胞の遺伝子での形質転換、遺伝子の組換え、モザイク遺伝子の発現、及び遺伝子の標的ゲノム中への組込みを、１つの方法工程で技術的に実施することを意味する。従って、それらは、ｉｎ ｖｉｖｏ組換え前にＤＮＡキャリヤーのｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えの必要がなく、又は減数分裂を衣装するものを含む加工工程のあらゆる繰り返しサイクルが必要でない。有利には、減数分裂酵母細胞の使用を避けることができる。

本発明による単工程方法は、さらに、同時に宿主によるかかる設計された組換え体の発現を含んでよい。それによって、さらに、操作は、発現生成物を得るために必要ではない。

本発明による"遺伝子モザイク"の用語は、少なくとも１つのクロスオーバー事象を有する少なくとも２つの異なる遺伝子の組合せを意味する。特に、かかるクロスオーバーは、ＤＮＡ配列の組合せ又は混合を提供する。遺伝子モザイクは、遺伝子の遺伝子内混合、遺伝子内遺伝子モザイク、及び／又は遺伝子アセンブリ、場合により遺伝子の双方でのアセンブリ、遺伝子内及び遺伝子内クロスオーバー又は遺伝子モザイクによって製造されてよい。

"クロスオーバー"という用語は、２つのＤＮＡストランドが遺伝子情報を変換することができる部位での遺伝子、すなわち少なくとも１つのヌクレオチド間の組換えを言う。クロスオーバー法は、親細胞から生じる遺伝子又は配列の異なる組合せを有するモザイク遺伝子の子孫を導く。

代わりに、他の修復機構、例えばヌクレオチド切除修復又は不正確なヌクレオチドの認識を含む非相同性末端結合機構、ストランドの連接後の切除及び／又は置き換えは、クロスオーバーに基づかずに提供されてよい。

"フランキング標的配列"の用語は、ヌクレオチド配列の領域が、組換えされるべき遺伝子Ａ及び／又は他の遺伝子の部位を含むインタレストの標的、例えばゲノム標的統合部位、直鎖ポリヌクレオチド、直鎖又は環状プラスミドＹＡＣ’ｓ等に対して相補的であるものを言う。相補性又は相同性の特定の程度によって、フランキング標的配列は、標的組込み部位とハイブリダイズしてよく、かつ標的組込み部位中に遺伝子を組込んでよい。

"ゲノム"という用語は、ＤＮＡの遺伝子及び非コード配列、例えば組換えられるべき遺伝子Ａ及び／又は他の遺伝子を含む染色体又は非染色体遺伝子要素、例えば直鎖ポリヌクレオチド、ウィルス、自己複製キャリヤー及びベクター、プラスミド、並びに人工染色体を含む転位性要素等によって示される、全体の生物の遺伝的な情報を言う。人工染色体は、細胞中での導入に対して安定した維持のために必要である全ての配列を含む直鎖又は環状ＤＮＡ分子であり、その際それらは、天然の染色体と同様の挙動であり、従ってゲノムの一部と考えられる。

"相同性"と言う用語は、２つ以上のヌクレオチド配列が、対応する位置で同様又は保存された塩基対を（一定の程度まで、１００％まで）有することを示す。本発明によって使用されるような配列に対応する、又は適合する相同配列（相補的ともいう）は、有利には、相同の対応物の配列でハイブリダイズし、例えば、完全な長さの天然のＤＮＡ配列又はここで開示されているＤＮＡ配列のセグメントに関して、それぞれ相補的配列で、少なくとも３０％の配列同一性、しかし９９．５％未満の配列同一性、可能であれば９５％未満、９０％未満、８５％未満、又は８０％未満を有する。有利には、相同配列は、少なくとも約３０％のヌクレオチド配列同一性、有利には少なくとも約４０％の同一性、より有利には少なくとも約５０％の同一性、より有利には少なくとも約６０％の同一性、より有利には少なくとも約７０％の同一性、より有利には少なくとも約８０％の同一性、より有利には少なくとも約９０％の同一性、より有利には少なくとも約９５％の同一性を有する。挙げられた上限及び下限での好ましい範囲は、配列同一性に対応して、３０％及び９９．５％の範囲内である。ここで使用されているように、同一性の程度は、常に、相補的な配列自体を言う。

遺伝子のヌクレオチド配列に関する"同一性の割合（％）"は、必要であれば最大の割合の配列同一性を得るために配列をアニーリングし、ギャップを導入した後に、ＤＮＡ配列におけるヌクレオチドと同一性し、かつ配列同一性の一部としてあらゆる保存的置き換えを考慮しない、候補ＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの割合として定義される。ヌクレオチド配列の同一性の割合を定義する目的のためのアライメントは、当業者の範囲内である種々の方法で、例えば公然に入手できるコンピュータソフトウェアを使用して達せられる。当業者は、比較される配列の完全な長さにわたって最大のアライメントを達成するために要求されるあらゆるアルゴリズムを含む、アライメントを測定するための適したパラメータを決定することができる。

"繋がること"と言う用語は、遺伝子又は遺伝子モザイクのゲノムの組込み部位への組込みを可能にするために、部分的又は完全な配列相同性を有する"アンカリング配列"と言われるセグメントを介した組込み配列への遺伝子又は遺伝子モザイクの結合を意味する。特に、アンカリング配列は、ゲノム配列の組込み部位に対するフランキング標的領域相同性又は部分的相同性であってよい。好ましいアンカリング配列は、有利には、ゲノムのハイブリダイズする部位で、標的組込み部位に対して少なくとも約７０％の配列相同性、より有利には少なくとも８０％、９０％、９５％、９９．５％まで、又は完全な同一性を有する。

組込み部位は、適宜、宿主ゲノム上の定義された遺伝子座であってよく、その際組換えの高い頻度が生じる。好ましい遺伝子剤は、例えば、Ｓ．セレビジエの染色体ＩＩＩ上のＢＵＤ３１−ＨＣＭ１遺伝子座である。一般に、高い頻度で組換えを示すが細胞生存力の変化がない酵母染色体上のあらゆる他の遺伝子座が好ましい。

"発現"又は"発現システム"又は"発現カセット"の用語は、所望のコード配列及び操作可能な連鎖における制御配列を含む核酸分子を言い、これらの配列で形質転換又は形質移入した宿主は、エンコードしたタンパク質を製造することができる。形質転換の効率化のために、発現システム、ベクター上で含まれてよく、しかしながら関連するＤＮＡは、宿主染色体中に組込まれることができてよい。

"遺伝子"と言う用語は、遺伝子のＤＮＡ断片、特に部分的遺伝子であるものも含む。断片は、いくつかの開いた読み枠、同様のＯＲＦ又は異なるＯＲＦの繰り返しも含むことができる。前記用語は、特に、非コードであるヌクレオチド配列、例えば全体又は部分的に、転写されていない又は翻訳されていない配列、またはエンコードポリペプチドを含む。

本発明によって使用される"遺伝子Ａ"と言う用語は、非コード配列又はポリペプチド又はインタレストのポリペプチドのあらゆるヌクレオチド配列を意味する。遺伝子Ａは、有利には少なくともマーカー配列を組入れ、かつ遺伝子Ａもしくは遺伝子構成の５’末端又は３’末端で単独のフランキング標的配列を有する、遺伝子構成のフレームワーク、例えば発現カセット、直鎖ポリヌクレオチド、プラスミド又はベクターにおいて存在することによって特徴づけられる。本発明に従った方法において、遺伝子Ａは、典型的に、遺伝子モザイク形成のために組換えられるべき遺伝子の系列における最初の遺伝子である。遺伝子Ａは、最終的に、状況次第で、遺伝子Ａの変異体、又は遺伝子Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ等のあらゆる変異体である、組換えられるべき他の遺伝子に対して相同である。従って、遺伝子Ａごとに１つのフランキング標的配列のみが、典型的に、最大の忠実性の目的のために提供される。遺伝子Ａの変異体は、ある範囲までの配列相同性を有し、かつ場合により同様の機能特性を有する、遺伝子Ａ１、Ａ２、Ａ３等と言われる。"少なくとも１つの遺伝子Ａ"という用語は、少なくとも１つの遺伝子Ａ及び場合により遺伝子Ａの変異体を意味する。

本発明によって使用される"遺伝子Ｂ"は、最終的に、状況次第で、遺伝子Ａの変異体、又は遺伝子Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ等のあらゆる変異体である、組換えられるべき他の遺伝子を有する遺伝子モザイク形成のために選択される、非コード配列又はポリペプチド又はインタレストのポリペプチドのあらゆるヌクレオチド配列を意味する。遺伝子Ｂは、遺伝子Ａ又は組換えられるべき他の遺伝子を有するモザイク形成を可能にするためのある範囲で、遺伝子Ａ又は他の遺伝子に相同である。本発明による方法において、遺伝子Ｂは、典型的に、遺伝子モザイク形成のために組換えられるべき遺伝子の系列における最終遺伝子である。遺伝子Ｂは、細胞ゲノムの組込み部分であってよく、又は遺伝子の反対側の末端で意味する遺伝子Ａのフランキング標的配列の対応物として、有利には少なくともマーカー配列を組入れ、かつ遺伝子Ｂもしくは遺伝子構成の５’末端又は３’末端で単独のフランキング標的配列を有する、遺伝子構成のフレームワーク、例えば発現カセット、直鎖ポリヌクレオチド、プラスミド又はベクターにおいて存在してよい。従って、遺伝子Ｂごとに１つのフランキング標的配列のみが、典型的に、最大の忠実性の目的のために提供される。遺伝子Ｂは遺伝子Ａの変異体であってよい。遺伝子Ｂの変異体は、ある範囲までの配列相同性を有し、かつ場合により同様の機能特性を有する、遺伝子Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３等と言われる。"少なくとも１つの遺伝子Ｂ"という用語は、少なくとも１つの遺伝子Ｂ及び場合により遺伝子Ｂの変異体を意味する。

本発明によって使用される"遺伝子Ｃ"と言う用語は、非コード配列又はインタレストのポリペプチドをエンコードする配列のあらゆるヌクレオチド配列を意味する。遺伝子Ａは、場合によりマーカー配列を組込む遺伝子構成のフレームワーク、例えば発現カセット、直鎖ポリヌクレオチド、プラスミド又はベクターにおいて存在することによって特徴づけられ、かつさらに、状況次第で、遺伝子Ａ及び／又はＢ、遺伝子Ｃ又は最終的に遺伝子Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ等のあらゆる変異体の配列に相同性であるヌクレオチド配列のセグメントによって特徴づけられる。遺伝子Ｃは、有利には、遺伝子Ｃの５’末端又は３’末端で単独のフランキング標的配列、または双方の末端でフランキング標的配列を有する。それによって、遺伝子Ｃは、遺伝子Ａ及び／又は他の遺伝子で部分的に又は完全にハイブリダイズして、遺伝子を組換え、連結及びアセンブリしてよい。本発明に従った方法において、遺伝子Ｃは、典型的に、遺伝子モザイク形成のために組換えられるべき遺伝子の系列における遺伝子Ａに続く第二の遺伝子である。遺伝子Ｃの変異体は、ある範囲までの配列相同性を有し、かつ場合により同様の機能特性を有する、遺伝子Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３等と言われる。

さらなる遺伝子Ｄは、さらに、そのヌクレオチド配列、又は状況次第でそれぞれ組換え及び連結を提供するために、遺伝子Ｃの配列、遺伝子Ｄの変異体、又は最終的に遺伝子Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ等に相同性である、そのヌクレオチド配列のセグメントのハイブリダイゼーションを介して組換え又はアセンブリされてよい。遺伝子Ｄは、有利には、遺伝子Ｄの５’末端又は３’末端で単独のフランキング標的配列、または双方の末端でフランキング標的配列を有する。本発明に従った方法において、遺伝子Ｄは、典型的に、遺伝子モザイク形成のために組換えられるべき遺伝子の系列における遺伝子Ｃに続く次の遺伝子である。遺伝子Ｄの変異体は、ある範囲までの配列相同性を有し、かつ場合により同様の機能特性を有する、遺伝子Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３等と言われる。

さらなる遺伝子Ｅは、さらに、状況次第でそれぞれ組換え及び連結を提供するために、遺伝子Ｄの配列、遺伝子Ｅの変異体、又は最終的に遺伝子Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ等に相同性である、そのヌクレオチド配列のセグメントを介して組換え及びアセンブリされてよい。遺伝子Ｅは、有利には、遺伝子Ｅの５’末端又は３’末端で単独のフランキング標的配列、または双方の末端でフランキング標的配列を有する。本発明に従った方法において、遺伝子Ｅは、典型的に、遺伝子モザイク形成のために組換えられるべき遺伝子の系列における遺伝子Ｄに続く次の遺伝子である。遺伝子Ｅの変異体は、ある範囲までの配列相同性を有し、かつ場合により同様の機能特性を有する、遺伝子Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３等と言われる。

さらにある遺伝子Ｆ、Ｇ、Ｈ等は、適宜に使用されてよい。さらにある遺伝子の系列は、アルファベットの文字の数によって制限されるべきではないと解する。インタレストの遺伝子の最終鎖は、遺伝子Ａ及びＢへの連結を介して得られて、ゲノムの組込み部位での遺伝子アセンブリを得る。そのようにアセンブリされたインタレストの遺伝子は、それぞれ、対応するインタレストのポリペプチド及び代謝物の発言を支持するために実施可能に連結されてよい。アセンブリの特定の方法は、実質的なサイズの所望されるＤＮＡ分子を得るために、多数のＤＮＡ断片でさえアセンブリする、ｉｎ ｖｉｖｏ組換えによるカセットの組合せを使用する。オーバーラップ配列を示すカセットは、全体の所望される配列に及ぶために適宜設計される。一実施態様において、好ましいオーバーラップは、少なくとも約５ｂｐ、有利には少なくとも約１０ｂｐである。他の実施態様において、オーバーラップは、少なくとも１５ｂｐ、有利には少なくとも２０ｂｐで、１０００ｂｐまでである。

好ましい一実施態様において、いくつかのカセットは、識別を可能にするマーカー配列を含むために設計される。典型的に、マーカー配列は、トランスポゾン挿入を許容する部位に配置され、最終の所望の核酸配列に対して最少の生物学的効果がある。

特定の一実施態様において、宿主細胞は、該遺伝子又は断片の混合物での同時形質転換、及び組換えられた又はアセンブリされた配列を移動する宿主を培養することによって、オーバーラップ配列、例えば少なくとも２、有利には少なくとも３、４、５、６、７、８、９、より有利には少なくとも１０の遺伝子又は宿主細胞における核酸断片を有する、核酸の多数の遺伝子又はＤＮＡ断片を組換え又はアセンブリ可能である。

遺伝子全体又は部分的に、本発明に従って使用されるべき遺伝子又はＤＮＡ断片は、二本鎖又は一本鎖であってよい。二本鎖核酸配列は、一般に３００〜２００００塩基対であり、かつ一本鎖断片は、一般に短く、かつ４０〜１００００ヌクレオチドの範囲であってよい。例えば、２Ｍｂから５００Ｍｂまでのアセンブリは、酵母によってアセンブリされる。

多数の生物からのゲノム配列は、公然に入手でき、かつ本発明に従った方法で使用されてよい。これらのゲノム配列は、有利には、宿主細胞又は異なる種の異なる下部から得られる情報を含み、特定の多様性を有する相同配列を提供する。

組換えのための基材として使用される最初の遺伝子は、通常、遺伝子の変異体形を含むポリヌクレオチドの収集である。変異体形は、基材間の相同組換えを可能にするのに互いに十分な、実質的な配列同一性を示す。ポリヌクレオチド間の多様性は、例えば誤りがちなＰＣＲ又は誤りがちな再帰的配列組換えを誘発させる自然、例えば対立遺伝子又は種変異体、又はｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えの結果であってよい。多様性は、代わりのコドン使用で天然タンパク質をエンコードする遺伝子の再合成からももたらされる。これらは、組換えが、出発材料であるより多様な生成物を製造することができる基材間の少なくとも十分な多様性であってよい。多様性の程度は、組換えられる基材の長さ、含まれるべき機能変化の範囲に依存する。位置の６９％までの多様性が典型的である。

本発明の方法によって、遺伝子Ａ、Ｂ、Ｃ及びさらなる遺伝子は、完全な長さの遺伝子を含む、ハイブリダイゼーションのために設計された特定のセグメントで、少なくとも３０％の相同性を分ける。好ましい相同性の割合は、少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９９．５％未満までである。

単純に、アセンブリすること、例えば遺伝子変異体を有する遺伝子を繋ぎ合せる及び場合により混合すること、大きい遺伝子、例えば個々の代謝経路の一部を多様化すること、又はこの方法に従った代謝経路の多重性をアセンブリすることが、所望されてもよい。自然に存在しない代謝経路は、この方法で構成されうる。従って、下流酵素を欠く異なる生物によって製造される所望の基材上で作用する１つの生物に存在する酵素は、組換えられた酵素を得るために、遺伝子又は部分的遺伝子のアセンブリを構成する力によって同様の生物においてエンコードされうる。多数の酵素は、従って、複雑な代謝経路を構成するために含まれうる。これは、ポリペプチド又は部分的ポリペプチドのクラスターが経路内で生化学機能に従って配置される場合に有利である。インタレストの例示的遺伝子経路は、産業関心の第二の代謝物の合成のための酵素、例えばフラボノール、マクロライド、ポリケチド等をエンコードする。

さらに、組合せのライブラリは、断片を混合することによって製造されることができ、その際１つ以上の断片は、同様のハイブリダイズする配列と供給されるが、しかし酵素又は他のタンパク質をエンコードする異なる介在性配列と供給される。

遺伝的経路は、組合せライブラリにおけるそれぞれの数が遺伝子変異体の異なる組合せを有するような組合せの様式で構成されうる。例えば、変異体の組合せライブラリは、個々のＤＮＡ要素から構成されることができ、その際種々の断片は、組換え及びアセンブリされ、かつ種々の断片それぞれは、いくつかの変異体を有する。代謝経路の組換え及びアセンブリは、成功したエンジニアリングを証明するために、マーカー配列の存在を必要としなくて良い。所望される方法での代謝物の発現は、すでに、実施例のために示されている。代謝経路の成功した組換え及びアセンブリは、例えば、細胞培養培地における第二の代謝物の検出によって測定されてよい。

原核及び真核宿主細胞は、最近宿主細胞、例えば大腸菌又はバチルス種、酵母宿主細胞、例えばＳ．セレビジエ、昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Spodooptera frugiperda）又はヒト宿主細胞、例えばＨｅＬａ及びＪｕｒｋａｔを含む、開示された方法での使用のために双方熟慮される。

好ましい宿主細胞は、単相細胞、例えばカンジダ種、ピチカ種及びサッカロミセス種である。

本発明の方法は、生殖周期又は減数分裂組換えを使用しない。ＤＮＡ断片は、単相細胞中に形質転換されることができる。形質転換体は、選択プレート上で直ちにストリークされてよい。組換え体は、ＰＣＲ又は他の手法、例えばギャップ修復によって単離される。

本発明の方法は、あらゆる野生型、又は核酸修復における欠損、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ修復を有するものを含む修復欠損の原核又は真核細胞で行うことができる。野生型細胞において、相同組換えのために可能な適した組込み部位が選択される。野生型細胞において実施されるような本発明による方法は、有利には、少なくとも８０％、有利には少なくとも９０％の配列同一性を有する遺伝子、例えば遺伝子ＡおよびＢの組換えを提供する。しかしながら損傷した及びミスマッチのＤＮＡは、通常、修復され、かつ組換えは阻害され、驚くべきことに、組込み部位での相同組換えが、かかる野生型細胞において可能であるように代わる。

ミスマッチ修復（ＭＭＲ）システムの突然変異又は組換えは、細胞における組換えの頻度を高める。代わりに、他の修復欠損システムを使用してよく、組換えを高めることができる完全な又は一時的なＤＮＡ修復遺伝子ｒａｄ１、ｒｅｃＱのノックアウトである。

ＤＮＡ修復欠損細胞は、有利には、本発明による方法で使用される。一例として、ミスマッチ修復は、完全又は一時的にノックアウトされることができ、又は条件付きであってよく、又は細胞培養培地に特定の基材の添加によって誘発され、その際細胞は、標的とされた組換えが実施される間、又はその後に、培養される。特に、細胞のＭＭＲ欠損性は、ミスマッチ修復、ＵＶ光での処理、化学物質、例えば２−アミノプリンでの処理、ミスマッチ修復において含まれる遺伝子の、例えば一時的な不活性化及び活性化が可能である調節プロモータによる誘発性の発現又は抑制において含まれる遺伝子の突然変異を含む、ミスマッチ修復を一過性又は持続的に損なうあらゆる方法によって達せられる。

細菌性のミスマッチ修復システムは、広範囲に研究されている。他のシステム、例えば酵母において、いくつかの遺伝子は識別され、その生成物は、細菌性ミスマッチ修復タンパク質、例えばＭｕｔＳタンパク質、すなわちＭｓｈ１、Ｍｓｈ２ｐ、Ｍｓｈ３ｐ、Ｍｓｈ４、Ｍｓｈ５、Ｍｓｈ６ｐ、及びＭｕｔＬタンパク質の類似体、すなわちＭｌｈｌｐ、Ｍｌｈ２ｐ、Ｍｌｈ３ｐ、及びＳ．セレビジエにおけるＰｍｓ１と相同性を分け合う。

好ましいミスマッチ修復欠損細胞の例は、特定の酵母細胞、例えば不完全な又は（一時的に）不活性化されたＭＳＨ２を有するＳ．セレビジエ株、例えば設計されたＷ３０３、ＢＹ、ＳＫ１株、例えばＭＸＹ４７（破壊させたＭＳＨ２を有するＷ３０３）株である。

ＭＭＲのさらに好ましいシステムは、よく知られている細菌の株、例えばＵＳ５９１２１１９において記載されているもの、例えばミスマッチの認識において部分的にとられる酵素的なＭｕｔＨＬＳミスマッチ修復システムのための欠損性のある株、例えばＭｕｔＳ及びＭｕｔＬのための欠損性があるｍｕｔＳ又はｍｕｔＬタイプの選択である。好ましい株は、例えばＦ^-ｍｕｔＬ又は組換え大腸菌Ｈｆｒ／Ｓ．チフィリウムＦ^-ｍｕｔＬの株である。

さらに、他の真核ミスマッチ対欠損細胞、例えばＨｅＬａ及びＪｕｒｋａｔ細胞は、有利には本発明に従って使用される。

本発明に従った方法は、成功した組換え生成物の選択を促進するマーカーを主に使用する。ツール、例えば分子マーカー又はＤＮＡフィンガープリンティングの使用は、インタレストの遺伝子をマッピングできる。これは、細胞の大きいレパートリーのスクリーニングを可能にし、インタレストの特性を有する細胞の選択を与える。スクリーニングは、ある遺伝子の存在又は不在に基づく。

本発明に従って使用される"選択マーカー"の用語は、成功した組込みに対するマーカーを提供するタンパク質をエンコードする又は非コードのＤＮＡ配列を言う。特に、タンパク質をエンコードするマーカー配列は、栄養性マーカー、顔料マーカー、抗生物質耐性マーカー、抗生物質感受性マーカー、蛍光マーカー、ノックインマーカー、活性剤／結合ドメインマーカー及び優性劣性マーカー、比色マーカー、並びに２つ以上のサブユニットが同様の細胞中で発現される場合にのみ機能する酵素の異なるサブユニットをエンコードする配列の群から選択される。その用語は、分離マーカー配列を使用する必要なしに、遺伝子モザイクの直接決定のために提供する組換えられるべき追跡可能な遺伝子も言う。

"栄養性マーカー"は、細胞の栄養要求性を補うことができる遺伝子生成物をエンコードし、かつ従ってその栄養要求性細胞に対して原栄養性を提供するマーカー配列である。本発明に従って、"栄養要求性"は、細胞が、栄養要求性細胞自体によって製造されることができない必須の栄養を含む培地中で成長させることを意味する。栄養マーカー遺伝子の遺伝子生成物は、栄養要求性細胞において欠損したこの必須の栄養の合成を促進する。栄養マーカー遺伝子の成功した発現によって、この必須の栄養を、細胞が成長する培養培地に添加する必要がない。

好ましいマーカー配列は、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＣＡＮ１、ＣＹＨ２、ＴＲＰ１、ＡＤＥ１及びＭＥＴ５である。

"顔料マーカー"に関してコードする遺伝子は、発現に対して細胞を染色することができる顔料の合成において含まれる遺伝子生成物をエンコードする。それらによって、顔料マーカーの成功した発現の細胞の急速な表現型の検出を提供させる。

"抗生物質耐性マーカー"は、抗生物質の存在で、該生成物を発現しない細胞が成長できない濃度で成長するための細胞を可能にする遺伝子生成物をエンコードする遺伝子である。

"抗生物質感受性マーカー"は、遺伝子生成物が、抗生物質の不在で該マーカーを発現する細胞の成長を阻害するマーカー遺伝子である。

"ノックイン"マーカーは、ノックアウト細胞への連結を欠損し、従って成功した組換え及び操作に対して成長するための細胞を生じることを示すヌクレオチド配列と理解される。ノックアウト細胞は、一般的に設計された細胞であり、１つ以上の遺伝子が、標的とされる突然変異を介して遮断されている。かかる欠損遺伝子は、ノックインマーカーとして適宜使用されてよい。

"蛍光マーカー"は、それぞれの蛍光シグナルを放出することによって検出可能である蛍光体をエンコードするヌクレオチド配列を意味する。細胞は、種々の蛍光ラベルに基づいてフローサイトメトリーのよく知られた技術によって容易に仕分けられてよい。

多様化又は組換えのために使用される遺伝子は、成功した組換えのための十分な配列の長さを有する、非コードの配列又はポリペプチドをエンコードする配列、又はそれらの配列又は一部又は断片をエンコードするタンパク質であってよい。より詳述すれば、該遺伝子は、最小で３ｂｐの長さ、有利には少なくとも１００ｂｐ、より好ましくは少なくとも３００ｂｐを有する。

本発明に従って得られる好ましい遺伝子モザイクは、少なくとも３塩基対、有利には２００００塩基対までであり、好ましい範囲は、３００〜１００００ｂｐであり、少なくとも５００ｂｐ又は少なくとも１０００ｂｐの大きいＤＮＡ配列が特に好ましい。

単一のヌクレオチド、又は少なくとも１つ、有利には少なくとも２、３、４、５、１０、２０の、大きいヌクレオチド配列までのセグメントを含む、７００塩基対毎に少なくとも３つのクロスオーバーが特に好ましく、有利には７００塩基対毎に少なくとも４つのクロスオーバー、より好ましくは７００塩基対毎又は５００塩基対毎に少なくとも５、６又は７のクロスオーバーである。

本発明の方法に従って、少量だけでなくさらに多数の組換えも、１つの単一の組換えられた遺伝子において得られる。これは、減数分裂のｉｎ ｖｉｖｏ組換えについて特定の利点である。

組換えモザイク現象の複雑なパターンは、１つの単一分子の範囲内で異なる長さの多数の組換えられた配列ブロックを伸ばす、本発明の方法によって得られる。モザイク現象及びポイント状変換は、タンパク質レベルで必然的に保存的ではない。むしろ、種々の極性を有する新たなアミノ酸を組換え後に生じることができ、この方法によって得られた組換えタンパク質にタイする新規の潜在性及び酵素のタンパク質特性を得る。

有利には、遺伝子は、治療又は産業適用の酵素又はタンパク質をエンコードするそれらの配列又は一部又は断片をタンパク質でエンコードする。次に、"ポリペプチド"の用語は、少なくとも２個のアミノ酸、有利には少なくとも３つのポリペプチド又はタンパク質を有するインタレストのペプチドを含む。インタレストのポリペプチドは、有利には、酵素に限定されずに、イムノグロブリンスーパーファミリー、例えば抗体及び抗体ドメイン又は断片、サイトカイン、ワクチン抗原、成長因子及びペプチドの種類を選択する。

酵素触媒は、それらの高い選択性のために、多くの産業プロセスにおいて適宜使用される。本発明による多様化のために使用される好ましい酵素は、タンパク質分解酵素、例えばサブチリシン；セルロース分解酵素、例えばパルプ及び製紙産業において使用される細胞壁を緩める酵素、エンドグルカナーゼ、アミロスクラーゼ、アルドラーゼ、糖キナーゼ、セルロース、アミラーゼ、キシラナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、及びベータ−グルコシダーゼ、ラッカーゼ；細かい化学物質、農業化学物質及び医薬品の合成において使用されるリパーゼ；例えば生物燃料の製造のためのエステラーゼを含む。酵素改良の好ましい例は、改良された熱安定性を有するアルコールデヒドロゲナーゼの製造である。

複雑な構造及び折り畳みを有する多重鎖ポリペプチドをエンコードする遺伝子でさえ、組換え及びアセンブリされる。好ましい例は、イムノグロブリンスーパーファミリー、細胞表面の抗原受容体、共受容体及び免疫システムの共刺激分子を含む、イムノグロブリンドメイン又は溝として公知のドメインを有するイムノグロブリンで構造特性を分け合うそれらのイムノグロブリン及びポリペプチド、リンパ球にタイして抗原提示で含まれる分子、細胞付着分子、あるサイトカイン受容体及び細胞内筋タンパク質の群である。有利には、抗体又は抗原断片、例えばＦａｂ、Ｆｖ又はｓｃＦｖは、組換え及びアセンブリされる。

代わりに、モザイク遺伝子は、非タンパク質エンコード配列、例えばタンパク質をエンコードする配列の発現の調整で含まれる配列、さらに短い及び長い非コードＲＮＡとして調整配列であってもよい。これらは、プロモータ配列、イントロン配列、ポリアデニル化シグナルのためにコードする配列であってよい。

本発明の好ましい一実施態様において、モザイク遺伝子のアセンブリ、宿主ゲノムでのその組換え、及びさらにインタレストの組換えポリペプチド又は該宿主細胞の代謝物質を製造するためのモザイク遺伝子の発現は、単工程方法で実施される。

本発明に従って、これらは、当業者の範囲内の通常の分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技術を使用してよい。かかる技術は、文献で完全に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ、"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）を参照。

ｉｎ ｖｉｖｏ組換えのために、ゲノム又は他の遺伝子で組換えられるべき遺伝子は、標準の形質移入技術を使用して宿主を形質移入するために使用される。適した一実施態様において、複製の起源を提供するＤＮＡは、構成において含まれる。複製の起源は、当業者によって適宜選択されてよい。遺伝子の性質に依存して、複製の補助起源は、配列が、複製自体の起源として操作可能である遺伝子又はゲノムで既に存在する場合に要求されなくてよい。

合成核酸配列又はカセット及びサブセットは、直鎖ポリヌクレオチド、プラスミド、目がプラスミド、合成もしくは人工染色体、例えば植物、細菌、動物又は酵母の人工染色体の形で製造されてよい。

細胞は、ＤＮＡが細胞の内側で導入される場合に、外因性又は非相同のＤＮＡによって形質転換されてよい。形質転換ＤＮＡは、組込まれてよく、又は組込まれてはいけない。すなわち、細胞のゲノム中に共有結合で結合される。原核生物、酵母及び動物細胞において、例えば形質転換ＤＮＡは、エピソームの要素、例えばプラスミド状で維持されてよい。真核細胞に関して、適宜形質転換される細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体中に組込まれるようになるものであり、染色体の複製を介して娘細胞によって引き継がれる。この安定性は、細胞系列又は形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団から構成されるクローンを確立するために、真核細胞の性能によって証明される。

多様性遺伝子基材は、プラスミド中に組込まれてよい。プラスミドは、通常、標準のクローニングベクター、例えば細菌多コピー型プラスミドである。基材は、同様又は異なるプラスミド中に組込まれてよい。通常、選択可能なマーカーの種々のタイプを有するプラスミドの少なくとも２つの異なるタイプが、少なくとも２つのタイプのベクターを含む細胞に関する選択を可能にするために使用される。

多様性遺伝子基材を含むプラスミドは、あらゆる方法（例えば科学的形質転換、自然の反応能、エレクトロポレーション、遺伝子銃、ファージ又はウィルス性システム中へのパッキング）によって細胞中に最初に導入される。通常、プラスミドは、飽和濃度で又は飽和濃度近くで存在し、同様の細胞を入れる１つより多くのプラスミドの確率を増加する。種々の基材を含むプラスミドは、同時に又は複数回で形質移入されてよい。例えば、後者の方法で、細胞は、プラスミドの最初のアリコート、選択され成長させた形質移入体で形質移入され、そしてプラスミドの第二のアリコートで感染させる。好ましいプラスミドは、例えばｐＵＣ及びｐＢｌｕｓｃｒｉｂｅ誘導体、例えばｐＭＸＹ９、ｐＭＸＹ１２及びｐＭＩＸ−ＬＡＭ、又はＹＡＣ誘導体、例えばＹＣｐ５０である。

発生の割合は、全ての遺伝子基材を組換えに関連させること増加させることができる。それは、形質移入した細胞をエレクトロポレーションすることによって達せられる。エレクトロポレーションの条件は、外因性ＤＮＡを細胞中に導入するために通常使用される条件と同様である。進化の割合は、プラスミド又は染色体の変換を誘発する細胞を融合することによっても増加させることができる。融合は、化学剤、例えばＰＥＧ、又はウィルス性タンパク質、例えばインフルエンザウィルス赤血球凝集素、ＨＳＶ−１ ｇＢ及びｇＤによって誘発されうる。発生の割合は、突然変異誘発遺伝子宿主細胞（例えば、細菌におけるＭｕｔ Ｌ、Ｓ、Ｄ、Ｔ、Ｈ、酵母における類似の突然変異体、及び毛細血管拡張性運動失調のヒトの細胞系列）の使用によって増加されてもよい。

組換え遺伝子を有する細胞は、所望の機能のためのスクリーニング及び選択を受ける。例えば、含まれる基材が薬剤耐性遺伝子を含む場合に、薬剤耐性に関して選択する。

典型的に、組換えの本発明の方法において、所望される表現型を獲得させる組換えの最終生成物は、位置の０．１％〜５０％で出発基剤と異なり、かつ自然に獲得する突然変異の割合の過剰（例えば少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍又は１００００倍）での程度の割合で含まれる。最終の遺伝子モザイク生成物は、製造目的のための混ぜられたＤＮＡの使用率のためにより所望される他の宿主細胞に形質移入されてよい。

本発明の好ましい方法において、宿主細胞は、よく知られた細胞表樹システムを使用して細胞表面上で遺伝子モザイクを提示することである。ハイブリダイゼーションを介した多様化によって、かかる変異体のライブラリを製造するために適宜示されてよい遺伝子変異体のレパートリーが製造されうる。

適した提示方法は、酵母提示及び細菌細胞提示を含む。特に好ましいライブラリは、タンパク質工学及びライブラリスクリーニングにおける多くの適用で使用される酵母の表面提示ライブラリである。かかるライブラリは、野生型ポリペプチドのモノに関連する高められた表現型の特性を有するポリペプチド変異体の適した選択を提供する。有利には、細胞を基礎とする選択方法は、例えば、表面固定化リガンドに対して使用される。通常使用される選択技術は、野生型ポリペプチドの特性を有するかかるライブラリから得られる突然変異ポリペプチドの特性を分析及び比較することを含む。改良された所望の特性は、受容体に結合可能である、リガンドポリペプチドの結合特性の特異性又はアフィニティの変化を含む。ポリペプチドアフィニティ成熟は、本発明の特に好ましい一実施態様である。変異体のさらに所望される特性は、インタレストのポリペプチドの安定性、例えば熱安定性、ｐＨ安定性、プロテアーゼ安定性、溶解性、収率又は分泌のレベルをいう。

本発明に従った方法によって得られるライブラリは、機能的ＯＲＦにおいて発現されてよい。機能的モザイク遺伝子の潜在先導候補の高い割合を含む。好ましいライブラリは、機能的ＯＲＦ内で含まれる遺伝子モザイクの少なくとも８０％、有利には少なくとも８５％、少なくとも９０％、さらに少なくとも９５％を有する。本発明に従って提供されるライブラリは、特に、さらに、成功したハイブリダイゼーションの高い割合を示すマーカー配列の存在によって特徴付けられる。本発明に従って、前記方法によって製造された組換えライブラリにおける変異対数又はライブラリ数を増加する少数だけでなくさらに多くの数のモザイクパッチが得られる。

通常、本発明に従ったライブラリは、遺伝モザイクの変異体の少なくとも１０個、有利には少なくとも１００個、より好ましくは少なくとも１０００個、より好ましくは少なくとも１０⁴個、より好ましくは少なくとも１０⁵個、より好ましくは少なくとも１０⁶個、より好ましくは少なくとも１０⁷個、より好ましくは少なくとも１０⁸個、より好ましくは少なくとも１０⁹個、より好ましくは少なくとも１０¹⁰個、より好ましくは少なくとも１０¹¹個、１０¹²個までを含み、さらに高い数が可能である。本発明による方法は、遺伝子モザイクの機能的変異体を発現する独立クローンの少なくとも１０²個を含むライブラリを提供することができる。本発明に従って、例えば成熟したアフィニティである、予め選択された独立クローンのプールも提供し、プールは、有利には少なくとも１０、より有利には少なくとも１００、より有利には少なくとも１０００、より有利には少なくとも１００００、さらに１０００００より多くの独立クローンを含む。予め選択されたプールを含むそれらのライブラリは、本発明に従った高いアフィニティ変異体を選択するための好ましい源である。

本発明に従って使用されたライブラリは、有利には、ライブラリ数の少なくとも１０²個、より好ましくは少なくとも１０³個、より好ましくは少なくとも１０⁴個、より好ましくは少なくとも１０⁵個、より好ましくは少なくとも１０⁶個、より好ましくは少なくとも１０⁷個、より好ましくは少なくとも１０⁸個、より好ましくは少なくとも１０⁹個、より好ましくは少なくとも１０¹⁰個、より好ましくは少なくとも１０¹¹個、１０¹²個までを含み、有利には対応するインタレストのポリペプチドに対して新しい特性を構成するための親遺伝子とは異なる。

有利には、ライブラリは酵母ライブラリであり、かつ酵母宿主細胞は、有利には、生物学的活性を有するインタレストのポリペプチドを細胞の表面で呈する。代わりに、生成物は、細胞内で留まるか、又は細胞の外へ分泌される。酵母宿主細胞は、有利には、サッカロミセス、ピチア、ハンゼヌラ、シゾサッカロミセス、クリベロミセス、ヤロウイア及びカンジダの属から選択される。最も好ましくは、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビジエである。

本記載内容に記載された例は、本発明の詳細であり、かつそれらに制限されるべきでないことを意図する。本発明の種々の実施態様は、本発明に従って記載されている。多くの改質及び改変は、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく、本記載内容に記載及び説明された技術であってよい。従って、実施例は、詳細のみであり、本発明の範囲を制限しないことを理解すべきである。

実施例
実施例１
説明
実験設定において、組換えられるべき基材としてＯＸＡ分類のベータラクタマーゼ遺伝子を使用する。ＯＸＡ遺伝子の利点は、入手できる種々の多様性（５〜５０％）の相同遺伝子がある事実に基づく。それらの遺伝子は、従って、ｉｎ ｖｉｖｏ組換えの多様性の制限を試験するための良好な候補である。遺伝子は、扱いが容易でもある（約８００ｂｐの長さ）。

図４は、ＯＸＡ組換え基材：遺伝子及び相同性を示す。

表１：Ｏｘａ遺伝子の配列同一性

最初の実験において、Ｏｘａ１１を、それぞれＯｘａ７（９５％同一性）、Ｏｘａ５（７７％同一性）及びＯｘａ１（４９％同一性）で組換えた。

栄養要求性（−ｕｒａ３、−Ｉｅｕ２）マーカー遺伝子及びｍｓｈ２のノックアウトを含む株収集物（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ）由来の酵母株ＢＹ４７を使用した。ウラシル及びロイシンの生合成経路での遺伝子欠損は、栄養要求性をもたらし、すなわちウラシル及びロイシンが、成長培地に添加される。

第一工程において、それぞれマーカーＬＥＵ２を有する、一方でマーカーＵＲＡ３及びＯＸＡ１１又は他方でＯＸＡ５／７／１を含む遺伝子断片を設計した。ＵＲＡ−ＯＸＡ１１断片の５’末端の近くで、酵母染色体のＢＵＤ３１領域における５’挿入部位に対応する、約４００ｂｐのＤＮＡ断片（５’フランキング標的配列）を、挿入した。ＯＸＡ５／７／１の３’末端で、染色体上の隣接する３’部位に対応する約４００ｂｐのＤＮＡ断片（３’フランキング標的配列）（図３参照）。全ての断片を、Ｇｅｎｅａｒｔ（Ｇｅｒｍａｎｙ）の標準プロトコルに従って合成した。

合成した断片を、ＰＣＲで増幅し、そして形質転換のために使用した。

ＵＲＡ３−ＯＸＡ１１断片及び他のＯＸＡ−ＬＥＵ２断片の１つを、野生型（複相体ＢＹ２６２４０、Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）及びミスマッチ欠損株（単相体ａ−マターＢＹ０６２４０、ｍｓｈ２−、Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ）中に形質転換した。形質転換プロトコルは、Ｇｉｅｔｚ ［Ｇｉｅｔｚ， Ｒ．Ｄ． ａｎｄ Ｒ．Ａ． Ｗｏｏｄｓ． （２００２） ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＯＦ ＹＥＡＳＴ ＢＹ ＴＨＥ Ｌｉａｃ／ＳＳ ＣＡＲＲＩＥＲ ＤＮＡ／ＰＥＧ ＭＥＴＨＯＤ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３５０：８７−９６］に従った。形質転換体を、適したマーカー（ウラシル、ロイシンではない）に対して選択のための選択性培地を含むプレート上に置いた。７２時間後に、コロニーを観察できた。

表２：形質転換／選択後に得られたクローンの数

ＢＹ０６２４０形質転換から生じた合計４８コロニーを単離し、そしてコロニーＰＣＲを形質転換した（Ｃｈａ及びＴｈｉｌｌｙプロトコルに基づく溶解及びＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＰＣＲ：特に、ＰＣＲプライマーにおけるＰＣＲの効率及び忠実度：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ ｅｄｓ． １９９５， ｐｐ ３７）。異なるＰＣＲ反応物を、断片の標的領域への正確な挿入を検査するために実施する。４８個のうち３７個のクローンは、正確な挿入プロフィールを示した。これらの３７個から、３１個が、シーケンスのためのクリアな利用できる増幅生成物を得た。Ｏｘａ ＯＲＦをフランキングする２つの特定プライマーを使用する反応は、ＯＸＡ配列が実際にアセンブリされる場合に、実際の組換えの増幅のみを許容する。さらに、得られた生成物は、直接シーケンスのための正確な基材である。そして、正の増幅生成物をシーケンスした（ＧＡＴＣ）。

シーケンスの結果
３１個のうち２４個のクローン（明らかに陽の増幅シグナルを有するもの）をシーケンスした。それらは、以下に対応する：
相同対照Ｏｘａ１１／Ｏｘａ１１（配列番号３９）、相同対照Ｏｘａ０７／Ｏｘａ０７（配列番号４０）、相同対照Ｏｘａ０５／Ｏｘａ０５（配列番号４１）
ｆｅ０２〜ｆｅ０６、ｆｅ０９及びｆｅ１１：Ｏｘａ１１／Ｏｘａ０７（配列番号１〜配列番号１４）
ｆｅ０９及びｆｅ１３、ｆｅ１４、ｆｅ１６〜ｆｅ２４：Ｏｘａ１１／Ｏｘａ５（配列番号１５〜配列番号〜３８）。

全てのクローンのシーケンス結果に関しては、図５及び６、並びに配列番号１〜３８を参照する。

Ｏｘａ１１／Ｏｘａ０７クローンのＤＮＡアニーリングに関しては、図５、配列番号１、３、５、７、９、１１及び１３を参照する。

Ｏｘａ１１／Ｏｘａ０５クローンのＤＮＡアニーリングに関しては、図６、配列番号１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５及び３７を参照する。

ＯＸＡ１１／Ｏｘａ０７のタンパク質アニーリングに関しては、図５及び配列番号２、４、６、８、１０、１２及び１４を参照する。

Ｏｘａ１１／Ｏｘａ０５のタンパク質アニーリングに関しては、図６及び配列番号１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６及び３８を参照する。

実施例２
説明
複雑なモザイク遺伝子のライブラリを製造するための第二の変法として、３つの異なる、しかし関連する遺伝子配列を、アセンブリしそして組換えた。実施例１におけるように、ＯＸＡ遺伝子配列を、ＭＭＲ欠失酵母におけるそれらのアセンブリのために使用した（ＯＸＡ遺伝子同一性に関して図４を参照）。図３において示されているように、モザイク発生の原理は、ＯＸＡ５（遺伝子Ｃ）の全体のＯＲＦでハイブリダイズしたＯＸＡ１１（遺伝子Ａ）及びＯＸＡ７（遺伝子Ｂ）のそれぞれの短縮された配列の使用量に基づく。従って、栄養要求性マーカーを分けるアセンブリされた及び組立てられたカセットＡ−Ｂ−Ｃのみが、形質転換後に選択される。

実施例１におけるように、栄養要求性（−ｕｒａ３、−Ｉｅｕ２）マーカー遺伝子及びｍｓｈ２の欠損のノックアウトを含む株収集物（ＥＵＲＯＳＣＡＲＦ）由来の酵母株ＢＹ４７を使用した。ウラシル及びロイシンの生合成経路での遺伝子欠損は、栄養要求性をもたらし、すなわちウラシル及びロイシンが、成長培地に添加される。

短縮された遺伝子Ａ及びＢを含む新たな遺伝子断片を、実施例１において既に記載された断片から特定のＰＣＲによって得た：ＵＲＡ−Ｏｘａ１１（ＯＸＡ１１ ＯＲＦのヌクレオチド３８６〜４０６上での逆一次アニーリング）及びＯＸＡ７−Ｌｅｕ（ＯＸＡ７ ＯＲＦのヌクレオチド４２１〜４４１上での前方一次アニーリング）。全体のＯＸＡ５のＯＲＦを、断片ＯＸＡ５−ＬｅｕからＰＣＲによって得た。断片ＥＮＤ−Ｌｅｕを実施例１におけるように使用した。生成したＰＣＲ断片を、形質転換のために使用した。

形質転換プロトコルは、Ｇｉｅｔｚ ［Ｇｉｅｔｚ， Ｒ．Ｄ． ａｎｄ Ｒ．Ａ． Ｗｏｏｄｓ． （２００２） ＴＲＡＮＳＦＯＲＭＡＴＩＯＮ ＯＦ ＹＥＡＳＴ ＢＹ ＴＨＥ Ｌｉａｃ／ＳＳ ＣＡＲＲＩＥＲ ＤＮＡ／ＰＥＧ ＭＥＴＨＯＤ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ３５０：８７−９６］に従った。形質転換体を、適したマーカー（ウラシル、ロイシンではない）に対して選択のための選択性培地を含むプレート上に置いた。７２時間後に、コロニーを観察できた。

表３：形質転換／選択後に得られたクローンの数

ＢＹ０６２４０形質転換から生じた合計８コロニーをランダムに単離し、そしてコロニーＰＣＲを形質転換した（Ｃｈａ及びＴｈｉｌｌｙプロトコルに基づく溶解及びＨｅｒｃｕｌａｓｅ ＰＣＲ：特に、ＰＣＲプライマーにおけるＰＣＲの効率及び忠実度：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ ａｎｄ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ ｅｄｓ． １９９５， ｐｐ ３７）。異なるＰＣＲ反応物を、断片の標的領域への正確な挿入を検証するために実施する。８個のうち７個のクローンは、正確な挿入プロフィールを示した。これらの７個からは、シーケンスのためのクリアな利用できる増幅生成物を得た。Ｏｘａ ＯＲＦをフランキングする２つの特定プライマーを使用する反応は、ＯＸＡ配列が実際にアセンブリされる場合に、実際の組換えの増幅のみを許容する。さらに、得られた生成物は、直接シーケンスのための正確な基材である。そして、正の増幅生成物をシーケンスした（ＧＡＴＣ）。

シーケンスの結果
８個のうち７個のクローン（明らかに陽の増幅シグナルを有するもの）をシーケンスし、使用できる配列を得た。それらは、全て相同性のアセンブリのクローンＯＵＬ３−０５−ＩＩ、ＯＵＬ３−０５−ＩＩＩ、ＯＵＬ３−０５−ＩＶ、ＯＵＬ３−０５−ＩＸ及びＯＵＬ３−０５−ＸからのＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７に対応する。

全てのクローン及びタンパク質アニーリングのシーケンス結果に関しては、図８：ＯＸＡ１１／ＯＸＡ５／ＯＸＡ７のＯＵＬ３−０５−ＩＩ（配列番号４２及び４３）、ＯＵＬ３−０５−ＩＩＩ（配列番号４４及び４５）、ＯＵＬ３−０５−ＩＶ（配列番号４６及び４７）、ＯＵＬ３−０５−ＩＸ（配列番号４８及び４９）、及びＯＵＬ３−０５−Ｘ（配列番号５０及び５１）を参照する。

考察
細胞によるアセンブリ及びｉｎ ｖｉｖｏ組換えによる多様性の発生のための鋳型として多様性配列を有する有糸分裂ＭＭＲ欠損細胞のこの単純な形質転換方法は、証明されている（図５、６及び８）。

組換えモザイクの複雑なパターンは、実施例１において期さされた方法によって得られ、８００ｂｐの１つの単一分子、すなわちｆｅ１９（配列番号２７）及びｆｅ２０（配列番号２８）のクローン中に異なる長さの少なくとも１７パッチを伸ばした。組換えは、配列の全ての長さを実施したように見える。

さらに、ストランド鋳型の１つに対応するヌクレオチドの点状置き換えを、ＯＲＦ、すなわちｆｅ１９（配列番号２７）及びｆｅ２０（配列番号２９）のクローンの枠に関する多様性の重要源として観察した。これは、いくつかの遺伝子からインタレストの領域を再結合するためのより高い効率的な方法でアリ、かつｉｎ ｖｉｖｏのモザイク遺伝子ライブラリの発生に基づく相違の新たな源を示す。

組換えクローンは、翻訳されたＤＮＡのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ分析によって検証される短縮されたタンパク質生成物を得なかった（図５、６及び８）。

２１個のうち１個のクローン（ｆｅ１５）のみが、親のプロフィールを示した（データなし）。

モザイクの及び点状変換は、タンパク質レベルで必然的に保存的でない。代わりに、異なる極性を有する新たなアミノ酸が、組換え後に生じ、組換え変異体、すなわちｆｅ１９（配列番号２７）及びｆｅ２０（配列番号２９）のクローンに対する新たな潜在及び酵素のタンパク質特性を得た。

組換えライブラリを豊富に製造するこのアプローチによって組換え世代の非常に誘引性の特性は、減数分裂組換えアプローチと比較して、少数のみをライブラリ中に示すことができることによって、少数だけでなくより多くの組換えが得られる事実である（すなわちｆｅ０６（配列番号７）、ｆｅ１１（配列番号１３）、ｆｅ１３（配列番号１７）、ｆｅ１９（配列番号２７）。

親の鋳型に関連しないいくつかの点の突然変異は、少数の配列、すなわちｆｅ１６（配列番号２１）及びｆｅ１７（配列番号２３）において観察された。全ての場合において、突然変異は、得られたＯＲＦの読み枠を変更しなかった。

実施例３：
第二の実施例において、組換えの標的として内因性ＤＮＡを選択した。アルコールデヒドロゲナーゼ１（ＡＤＨ１）は、酵母のサッカロミセス・セレビジエにおいてエタノールの製造のためのキー酵素である。改良されたＡｄｈ１変異体を生じることが産業上の関心である。

Ｅｕｒｏｓｃａｒｆ製のＥｕｒｏｓｃａｒｆ及びＷ３０３からの株ＢＹ０６２４６を、この実施例のために使用した。

サッカロミセス・セレビジエＡＤＨ１遺伝子を、染色体ＸＶ上に置く。従って、１つの相同遺伝子のみの導入が、組換えのために十分である。組換えた組換え体がさらに突然変異しない保証のために、ミスマッチ修復の野生型も再構築する。従って、さらに、そのプロモータ及びターミネータ領域で機能ＭＳＨ２遺伝子を含む断片を追加する。

身体の遺伝子組換えのためのパートナーとして、サッカロミセス・セレビジエ遺伝子と８２％の相同性を有するクルイベロミセス・サーモトレランス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｔｈｅｒｍｏｔｈｏｌｅｒａｎｓ）／ラチャンシア・サーモトレランス（Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）ＡＤＨ１遺伝子を選択した。２つの断片を設計する。１つの断片は、Ｋ．サーモトレランスＡＤＨ１オープン読み枠を含む。その３’末端で、プロモータの２８３ｂｐを含むＴＲＰ１遺伝子カセットからのターミネータ領域の２９６ｂｐ、及びクルイベロミセス・ラクチスからのＵＲＡ３ ＯＲＦの第一の７４３ｂｐを含む断片を設計する。Ｋ．ラクチスのＵＲＡ３遺伝子生成物は、サッカロミセス・セレビジエにおけるｕｒａ３欠損を補うことができる。第二の断片は、ＵＲＡ３の最後の１６０ｂｐ及びＵＲＡ３のターミネータ領域の２２３ｂｐを含む。この配列は、内因性ＭＳＨ２プロモータの４６９ｂｐ及びＭＳＨ２ ＯＲＦ（２８９４ｂｐ）及びＴＥＦ１ターミネータ領域の２４２ｂｐに続く。断片は、Ｃｈｒ．Ｘｖ．上の挿入部位に同一である４０３ｂｐ配列によって３’側でフランクする。全ての断片を、Ｇｅｎｅａｒｔで合成する。

ＡＤＨ−１−ＵＲＡ３断片の３’末端、及びＵＲＡ−３−ＭＳＨ２断片の５’末端は、相同であり、２つの断片はアセンブリできる。サッカロミセス・セレビジエＡＤＨ１遺伝子での組換えをアセンブリする及び組込み工程の後に実行する。

形質転換後に、いくつかのクローンをランダムに単離し、そしてＤＮＡを製造する。ＡＤＨ組換体のＤＮＡをシーケンスした。下線を引いた配列は、ＡＤＨサッカロミセス・セレビジエではなく、ＡＤＨクルイベロミセス・ラクチス由来である（図９を参照）。

Claims (24)

1. 以下、
   ｃ）単工程法において、
   （ｉｖ）細胞ゲノムの不可欠部分であり、又は遺伝子構造の骨組において存在する、組換えられるべき他の遺伝子に対して９９．５％未満の配列相同性を有する少なくとも１つの遺伝子Ａで細胞を形質転換すること、
   （ｖ）前記遺伝子を組換えること、
   （ｖｉ）標的ゲノムの組込み部位で遺伝子の遺伝子モザイクを製造すること（その際少なくとも１つの遺伝子Ａは、該組込み部位の５’又は３’末端に繋ぐ５’末端又は３’末端で単一のフランキング標的配列を有する）
   ｄ）遺伝子モザイクを含むクローンを選択すること
   を含む、体性ｉｎ ｖｉｖｏ組換えによって遺伝子モザイクを生じるための方法。
2. 選択マーカーを遺伝子モザイクにおいて使用し、かつクローンを、選択マーカーの存在によって選択する、請求項１に記載の方法。
3. 前記他の遺伝子が、細胞のゲノムの一部である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記細胞を少なくとも１つの遺伝子Ａ及び少なくとも１つの遺伝子Ｂと同時形質転換し、その際、遺伝子Ａの単一のフランキング標的配列が、標的ゲノム上の組込み部位の５’末端に繋がっており、かつ遺伝子Ｂが、組込み部位の３’末端に繋ぐ単一のフランキング標的配列に連結される、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
5. 前記細胞を、少なくとも２つの異なる遺伝子Ａ１及びＡ２で、及び場合により少なくとも２つの異なる遺伝子Ｂ１及びＢ２で同時形質転換する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
6. 遺伝子Ａ及び／又は他の遺伝子の配列とハイブリダイズして、さらなる遺伝子Ｃの遺伝子Ａ及び／又は他の遺伝子へのアセンブリを得る配列を有する、少なくとも１つのさらなる遺伝子Ｃを、同時形質転換する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
7. 前記遺伝子Ａ及び／又は他の遺伝子が、活性を有するポリペプチド又はポリペプチドの一部をコードする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
8. 生化学経路のポリペプチドをコードする多重遺伝子を組換える及びアセンブリする、請求項６又は７に記載の方法。
9. 前記細胞が、修復欠損細胞である、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
10. 前記細胞が、真核細胞、有利には菌類、哺乳動物もしくは植物細胞、又は原核細胞である、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
11. 前記細胞が、菌類細胞であり、有利には、サッカロミセス、カンジダ、クリベロミセス、ハンゼヌラ、シゾサッカロミセス、ヤロウイア、ピチア及びアスペルギルスからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記フランキング標的配列が少なくとも５ｂｐである、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
13. フランキング標的配列が、前記組込み部位のアンカリング配列と３０％〜９９．５％の範囲で相同性を有する、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
14. 栄養要求性マーカー、抗生物質耐性マーカー、蛍光マーカー、ノックインマーカー、活性剤／結合ドメインマーカー及び優性劣性マーカー及び比色マーカーからなる群から選択される、選択マーカーを使用する、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
15. 前記遺伝子を、直鎖ポリヌクレオチド、ベクター、又は酵母人工染色体中で含む、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
16. 前記遺伝子が、有利には３００〜２００００ｂｐの直鎖ポリヌクレオチドである、請求項１から１５までのいずれか１項に記載の方法。
17. 遺伝子内遺伝子モザイクを有する少なくとも１つのクローンを選択する、請求項１から１６までのいずれか１項に記載の方法。
18. 遺伝子アセンブリ及び少なくとも１つの遺伝子内遺伝子モザイクを有する少なくとも１つのクローンを選択する、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の方法。
19. 少なくとも３〜２００００塩基対までの、有利には７００ｂｐごとに少なくとも３つのクロスオーバーを有する遺伝子モザイクを得る、請求項１から１８までのいずれか１項に記載の方法。
20. 前記遺伝子は、非コード配列であり、かつ酵素、抗体又はそれらの一部、サイトカイン、成長因子、ワクチン抗原及びペプチドからなる群から選択されるポリペプチドの変異体をエンコードする、請求項１から１９までのいずれか１項に記載の方法。
21. 請求項１から２０までのいずれか１項に記載の方法を使用して細胞中で種々の遺伝子モザイクを製造し、該細胞の表面上でその種々の遺伝子モザイクを提示してモザイクのライブラリを得ることを含む、遺伝子変異体の細胞提示の方法。
22. 遺伝子モザイクの少なくとも８０％が、機能的ＯＲＦ内で含まれる、請求項１から２０までのいずれか１項に記載の方法によって得られる遺伝子モザイクのライブラリ。
23. 遺伝子変異体を含む種々の生物を含む、請求項２２に記載のライブラリ。
24. 請求項２２又は２３に記載のライブラリからの遺伝子変異体を含む生物。

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