PT2478100E - Método de geração de mosaicos de genes - Google Patents

Description

Descrição Método de geração de mosaicos de genes A invenção relaciona-se com métodos para geração de mosaicos de genes por recombinação homóloga in vivo.

Antecedentes da invenção

Um dos objectivos primários do desenho de proteínas é gerar proteínas com propriedades novas ou melhoradas. A habilidade de conferir uma actividade desejada numa proteína ou enzima tem uma aplicação prática considerável na indústria farmacêutica e química.

Evolução do direccionamento de proteína tem emergido como uma plataforma tecnológica poderosa na engenharia de proteína, nas quais bibliotecas de variantes são pesquisadas experimentalmente para clones processarem as proteínas desejadas. 0 direccionamento de proteínas aproveita o poder da selecção natural para desenvolver proteínas ou ácidos nucleicos com propriedades desejadas não encontradas na natureza. Várias técnicas são usadas para gerar proteínas mutantes e variantes e seleccionar funções desejadas. Tecnologias de ADN recombinante têm permitido a transferência de genes estruturais individuais ou genes de caminho inteiro para um hospedeiro substituto para rápida propagação e/ou alto nível de produção de proteína. 1/111

Melhoramentos acumulados em actividade ou outras propriedades são normalmente obtidos através de iterações de mutação e blindagem. Aplicações de evolução direccionada são principalmente encontradas em laboratórios industriais e académicos para aumentar estabilidade de proteina e desencadear a actividade ou performance no geral de enzimas e organismos ou para alterar especificidade de substrato de enzima e desenhar novas actividades. A maioria dos projectos de evolução direccionada procuram evoluir propriedades que são uteis para humanos num contexto (biocatálise) agricola, médico ou industrial. A evolução de todos os caminhos metabólicos é um conceito particularmente atractivo uma vez que a maioria dos compostos naturais e novos são produzidos por caminhos em vez de enzimas individuais. Engenharia de caminhos metabólicos usualmente requer a manipulação coordenada de todas as enzimas no caminho. A evolução de novos caminhos metabólicos e desencadeamento do bio processamento usualmente é levada a cabo por um processo de ciclos repetidos de recombinação e blindagem ou selecção para evoluir genes individuais, plasmideos inteiros, aglomerados de vários genes ou mesmo genomas inteiros.

Shao et al (Nucleic Acids Research 37(2):el6 Epub 2008 Dec 12) descreve a assemblagem de um ADN recombinante grande codificando um caminho bioquimico inteiro ou genoma num único passo através de recombinação homologa in vivo de duas regiões (de ancoragem) flanqueadoras nas extremidades 5' e 3' contendo sequências da extremidade 5' ou 3' do fragmento adjacente em Saccharomyces cerevidiae. 2/111

Elefanty et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. 95, 11897-11902 (1998) ) descreve experiencias de identificação de gene para gerar rato mutante, em gue o gene repórter lacZ foi batido no lócus SCL. Referência é feita à Figura 1 mostrando a estratégia de segmentação do gene SCL-lacZ aplicando duas seguências de ancoragem, por exemplo um em cada uma da extremidade 5' e 3' .

Evolução direccionada pode ser levada a cabo em células vivas, também chamada evolução in vivo, ou pode não envolver células (evolução in vitro). Evolução in vivo tem a vantagem de seleccionar as propriedades em ambiente celular, que é útil quando a proteína evoluída ou ácido nucleico são para ser usados em organismos vivos. Recombinação homóloga in vivo em levedura tem sido amplamente usada para clonagem de genes, construção plasmídea e criação de bibliotecas.

Diversidade de biblioteca é obtida através de mutagénese e recombinação. Embaralhamento de ADN permite a recombinação directa de mutações benéficas de múltiplos genes. Em embaralhamento de ADN uma população de sequências de ADN são fragmentadas aleatoriamente e depois de novo assembladas em sequências de híbridas de comprimento total.

Para o propósito de recombinação homóloga naturalmente ocorrendo genes homólogos são usados como a fonte de diversidade inicial. Embaralhamento de genes únicos membros de biblioteca são tipicamente mais que 95% idênticos. A família embaralhamento, contudo, permite trocas de bloco de sequências que são tipicamente mais do que 60% idênticas. A 3/111 diversidade de sequência funcional vem de sequências parentais relacionadas que sobreviveram à selecção natural; assim, números muito maiores de mutações são tolerados numa sequência dada sem introduzir efeitos deletérios na estrutura ou função. A recombinação de fragmentos de ADN de diferente origem com até 30% de diversidade como descrito em WOl990007576A1. Genes hibridos são produzidos in vivo por recombinação intergenérica e/ou interespecifica em reparação de incompatibilidade de bactérias deficientes ou em bactérias das quais o sistema de reparação de incompatibilidade (MMR) é transitoriamente inactivo. Assim esses processos pelos quais ADN danificado é reparado, são evitados, o que pode ter um efeito inibitório na frequência de recombinação entre sequências divergentes por exemplo recombinação homologa.

Uma revisão de mecanismos básicos de MMR é fornecida por Kunz et al (Eli. Mol. Life. Sei. 66 (2009) 1012-1038).

Recombinação homóloga "tageted" é descrita em MMR plantas deficientes (WO2006/134496A2). "Targeting" para um lócus com sequências tendo até 10% de diferenças foi possível.

Recombinação homóloga em bactérias para a geração de bibliotecas polinucleotídicas é divulgada na WO03/095658A1. Uma biblioteca de expressão de polinucleotídeos foi gerada onde cada polinucleotídeo é integrado por recombinação homóloga no genoma de uma célula de bactéria hospedeira 4/111 competente, usando uma cassete de integração linear não replicante compreendendo o polinucleotideo e duas sequências homólogas flanqueadoras com uma região da célula de genoma hospedeira. A diversidade de bibliotecas pode ser desencadeada tirando vantagem da habilidade de células haplóides para eficientemente acasalarem e levar à formação de organismos diplóides. No seu ciclo de vida vegetativo células de S. cerevisiae têm um genoma haplóide, por exemplo todos os cromossomas estão presentes como uma única cópia. Sob certas condições as células haplóides podem acasalar. Desta forma uma célula diplóide é formada. Células diplóides podem formar células haplóides de novo, especialmente quando faltam alguns nutrientes. Elas entram depois num processo chamado meiose seguido de esporulação para formar esporos haplóides. Durante a meiose os diferentes cromossomas dois genomas parentais recombinam-se. Durante recombinação meiótica fragmentos de ADN são trocados resultando em material de ADN recombinado. A W02005/075654A1 divulga um sistema para gerar sequências de ADN recombinante em Saccharomyces cerevisiae, que é usado ciclo reprodutivo sexual de S. cerevisiae. Células diplóides heterozigotos crescem sob condições que induzem os processos de meiose e formação de esporos. Meiose é geralmente caracterizada por elevadas frequências de recombinação genética. Assim, os produtos de meiose, que são células haplóides ou esporos, podem conter sequências de ADN recombinantes devido a recombinação entre as duas sequências de ADN divergidas. Por um método iterativo a descendência haplóide recombinante é seleccionada e 5/111 acasalada uma com a outra, os diplóides resultantes são esporos de novo, os seus esporos descendentes são sujeitos a condições de selecção apropriadas para identificar novos eventos de recombinação. Este processo é descrito no tipo selvagem ou reparação de incompatibilidade de células deficientes S.cerevisiae. Assim os genes de interesse, cada um flanqueado por dois marcadores de selecção, são integrados num lócus idêntico em cada um dos dois cromossomas irmãos de reparação de incompatibilidade diplóide. Sequências de ADN são adicionadas à extremidade 5'ou 3'' no novo fragmento de ADN que são 100% idênticas às sequências de ADN flanqueadoras do lócus onde o ADN tem que ser integrado. Estas sequências alvo flanqueadoras têm cerca de 400-450 nucleotideos de comprimento. As células são forçadas a iniciar esporulação. Durante a esporulação o processo de recombinação tem lugar. Os esporos resultantes e sequências recombinantes podem ser diferenciados por selecção dos marcadores flanqueadores apropriados. A habilidade da levedura para eficientemente recombinar sequências homólogas de ADN pode ser explorada para aumentar a diversidade de biblioteca. Quando dois genes que partilham 89,9% de homologia foram mutados por PCR e transformados em levedura do tipo selvagem, uma biblioteca quimérica de 10e7 foi criada através de recombinação homóloga in vivo, mostrando vários pontos cruzados através dos dois genes (Swers et al Nucleic Acids Research 32 (3) e36 (2004)). O método de recombinação homóloga mitótica é descrito por Nicholson et al (Genetics 154: 133-146 (2000)). Efeitos de incompatibilidades definidas contidas em repetições 6/111 pequenas invertidas em taxas de recombinação no tipo selvagem ou MMR - tensões com defeito foram investigadas. É objecto da presente invenção fornecer um método melhorado de preparação e assemblagem de uma diversidade de mosaicos de genes, especialmente para recombinação de longos fragmentos de ADN. Como resultado será desejável fornecer bibliotecas respectivas de variantes para a selecção de recombinantes melhorados. 0 objecto é alcançado pela provisão das realizações da presente aplicação.

Sumário da invenção A presente invenção fornece um método novo para gerar mosaicos de genes por recombinação somática in vivo de sequências de ADN homólogas, compreendendo a) Num procedimento de um único passo (i) Transformar uma célula de ADN de reparação de deficiência com pelo menos um gene A tendo uma homologia de sequência de pelo menos 30% e menos do que 99.5% noutro gene a ser recombinado que é parte integrante do genoma da célula ou presente no quadro de uma construção genética empregando pelo menos um gene B a ser recombinado, 7/111 (ii) Recombinar os ditos genes, (iii) Gerar um mosaico de genes dos genes num sitio de integração de um genoma alvo

Onde o dito pelo menos um gene A tem uma única sequência flanqueadora alvo na extremidade de ancoragem 5' ou 3' à extremidade 5' ou 3' do dito sitio de integração, onde a única sequência flanqueadora alvo do gene A é ancorada à extremidade 5' do sitio de integração enquanto o gene B tem a única sequência flanqueadora alvo ancorada à extremidade 3',e b) Seleccionar clones compreendendo pelo menos um mosaico de gene intragênico.

Especificamente preferido é um método para gerar um mosaico de genes por recombinação somática in vivo, compreendendo a) um procedimento de passo único (i) Transformar a célula com pelo um gene A tendo uma homologia de sequência de menos que 99.5% num qene diferente B que é parte integrante do genoma da célula ou presente no quadro da construção genética ou cassete de expressão, (ii) Recombinar os ditos genes, (iii) Gerar um mosaico de genes A e B num sitio de integração de um genoma alvo, onde o dito pelo menos gene A é ligado a uma sequência alvo flanqueadora na extremidade 5' ou 3' da 8/111 construção genética ancorando na extremidade 5' ou 3' do dito sitio de integração e b) Seleccionar clones compreendendo o mosaico de genes. É especificamente preferido que marcador de selecção seja usado no mosaico de genes e os clones sejam seleccionados de acordo com a presença do marcador de selecção. Por exemplo, o mosaico de genes compreende um marcador de selecção, por exemplo onde o dito gene A é ligado a um marcador de selecção. Em alternativa, a selecção pode ser feita pela presença de qualquer produto resultante de recombinantes, por exemplo, através de determinação a levedura ou caracteristicas funcionais. Especificamente um ou mais diferentes marcadores de selecção podem ser usados para diferenciar o tipo de mosaicos de gene.

Especialmente o método de acordo com a presente invenção emprega o dito outro gene que é parte do genoma alvo, por exemplo o genoma da célula. Numa realização preferida o dito outro gene é o gene B sendo parte do genoma da célula.

De acordo com uma realização alternativa preferida, o dito outro gene é uma construção genética separada do genoma alvo, tal como um polinucleotídeo linear, e opcionalmente integrado no genoma alvo no decorrer da recombinação. 9/111

De acordo com uma realização específica da invenção a célula é co transformada com pelo menos um gene A e pelo menos um gene B, onde a dita sequencia flanqueadora única de gene A é ancorada à extremidade 5' do sitio de integração no dito genoma alvo, e onde o gene B é ligado a uma sequencia flanqueadora única ancorada à extremidade 3' do sitio de integração.

Especificamente a célula pode ser co transformada com pelo menos um gene A com marcador de selecção e pelo menos um gene B, onde a dita sequencia flanqueadora única alvo do gene A é ancorada à extremidade 5' de um sitio de integração no dito genoma alvo, e onde o gene B é ligado a um marcador de selecção diferente e uma sequencia flanqueadora única alvo ancorada à extremidade 3' do sítio de integração, e onde clones para os pelo menos dois marcadores de selecção são seleccionados.

Especificamente a célula pode ser co transformado com pelo menos duas diferentes variantes de gene A a ser recombinado, que são genes AI e A2, e opcionalmente com pelo menos duas variantes de gene B a ser recombinado, que são genes BI e B2.

De acordo com uma realização especifica, pelo menos um gene C adicional é co transformado, que tem uma sequência que híbrida com uma sequência de gene A e/ou dito outro gene, onde um ou mais genes assemblados têm um mosaico de gene intragênico. 10/111

Especificamente, pelo menos um gene adicional C é co transformado, que tem uma sequência que hibrida com uma sequência de gene A e/ou B, por exemplo gene A ou gene B de comprimento total ou sequência parcial de gene A e/ou B, para obter recombinação e assemblagem do dito gene C adicional para gene A e/ou B.

Especificamente, a sequência de hibridação do dito gene C tem uma homologia de sequência de menos de 99.5% em relação à dita sequência, e preferivelmente pelo menos 30% de homologia de sequência.

Especificamente mosaicos de genes tendo pelo menos uma troca de nucleotideo ou cruzamento são seleccionados, por exemplo mosaicos com cruzamentos intragenicos, tais como os que compreendem partes do fene A e partes de outro gene(s) combinados, o que é entendido como uma mistura de genes parciais para obter um mosaico de gene intragenico recombinado, tais como genes adequados para a expressão de produtos de uma forma diferente, por exemplo tendo propriedades melhoradas ou em rendimentos melhoradas. Tais mosaicos de genes intragenicos podem ser produzidos por recombinação e preferivelmente também montagem de uma serie de genes, onde um ou mais dos genes assemblados têm tais mosaicos de genes intragenicos.

De acordo com uma realização preferida, mosaicos de pelo menos três diferentes genes A e/ou B e/ou C podem ser obtidos. 11/111

De acordo com uma realização especifica, mosaicos de genes de uma sequência não codificada, um gene parcial ou genes de pelo menos 3 a 20.000 pares base são obtidos.

De acordo com uma realização preferida o dito gene A e/ou outro gene são sequências não codificadas ou codificação para um polipéptido ou parte de um polipéptido tendo uma actividade.

Preferivelmente, o dito gene A e/ou dito outro gene codifica um polipéptido ou parte de um polipéptido tendo uma actividade.

Especificamente, o método inventivo emprega genes A, B e/ou C que codificam parte de um polipéptido tendo uma actividade. De acordo, os genes, tais como genes A e (ou B e/ou C, preferivelmente todos eles não codificam individualmente um polipéptido biologicamente activo como tal, mas codificam apenas parte dele, e podem trazer uma actividade respectiva ou actividade modificada apenas após assemblagem de gene.

Usando o método da invenção, múltiplos genes codificando polipéptidos de um caminho bioquimico pode ser assemblado e recombinado.

Noutra realização especifica o método inventivo fornece para recombinação e eventual assemblagem de genes 12/111 resultando numa sequência não codificada, tal como um promotor, região não traduzida, sitio de ligação ribossomal, terminador, etc..

Qualquer célula recombinante hospedeira competente eucariótica ou procariótica pode ser usada para gerar um mosaico de genes por recombinação somática in vivo de acordo com a presente invenção. De acordo com a invenção, a célula é uma célula de reparação de deficiência de ADN, por exemplo um ácido nucleico reparador de deficiência de célula com ADN de reparação de deficiência, ou uma célula MME deficiente.

Especificamente, a célula é uma célula eucariótica, preferivelmente uma célula de fungo, mamífero ou planta ou célula procariótica.

Preferivelmente a célula é uma célula de Aspergillus sp ou uma célula de fungo, preferivelmente, pode ser selecionada do grupo constituído por genera Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Hansenula, Schizosaccaromyces, Yarrowia, Pichia e Aspergillus.

Preferencialmente, procarióticos, tais como tensões de levedura haploide são empregues.

Em alternativa, procarióticos, tais como E.coli, Cabillus, Streptomyces, ou células de mamíferos, preferencialmente pelo menos 10 bp, mais 13/111 preferencialmente pelo menos 20 bp, 50 bp, 100 bp até 5000 bp de comprimento. Especialmente a sequência alvo flanqueadora é ligada ao dito gene ou é integral, da parte terminal do dito gene. É preferido que a dita sequência alvo flanqueadora tenha homologia no intervalo de 30% a 99.5%, preferivelmente menos que 95%, menos que 90%, menos que 80%, hibridizando com a sequência de ancoragem do dito sitio de integração.

Quando pelo menos duas sequências alvo flanqueadoras ancoradas ao sitio de integração alvo do genoma são usadas de acordo com a invenção, é preferido que elas não recombinem uma com a outra, preferivelmente elas partilham menos que 30% de homologia.

Marcadores de seleção uteis para o método inventivo podem ser selecionados do grupo constituido por qualquer um dos marcadores nutricionais auxotróficos, antibióticos, marcadores de resistência, marcadores fluorescentes, marcadores knock-in, marcadores do dominio activador/ligação e marcadores dominantes recessivos e marcadores colorimétricos. Marcadores preferidos podem ser temporariamente inativos ou funcionalmente knocked out, e podem ser reestabelecidos para voltar a ganhar a sua propriedade de marcação. Marcadores preferidos adicionais são genes rastreáveis, onde o marcador é uma função do gene A de sequência e/ou outros gene(s), tal como um gene B, sem sequências separadas com uma função de marcador, tal que a expressão do mosaico de genes possa ser diretamente determinada através de deteção do próprio mosaico. Neste caso o mosaico de genes é diretamente rastreável. 14/111

De acordo com uma realização específica, ditos genes são compreendidos num polinucleótido linear, um vector ou um cromossa de levedura artificial. Especialmente, o gene A e/ou outros genes a serem recombinados estão na forma de po1inucleótidos, preferivelmente de 30 0 a 2 0 0 0 0 bp . Especialmente não existe necessidade de construir ou empregar plasmídeos ou mega plasmídeos. 0(s) gene(s) podem assim ser usados, por exemplo, sem carregador.

Os genes usados para recombinação e integração podem também ser compreendidos em qualquer construção genética, por exemplo, serem usados como vetor para carregar o(s) dito(s) gene(s). Ditos genes podem assim ser compreendidos numa construção genética, por exemplo um polinucleótido linear, um plasmídeo ou cromossoma, incluindo cromossomas artificiais. O método de acordo com a invenção especificamente fornece para a seleção de pelo menos um clone tendo um mosaico de gene intragénico. Especialmente, pelo menos um clone tendo uma assemblagem de gene e pelo menos um mosaico de gene intragénico é selecionado.

Usando o método de acordo com a invenção mosaicos de gene intragénico de pelo menos 3, preferivelmente 9, até 20000 pares base podem ser obtidos, como também mosaicos de gene, por exemplo, compreendendo pelo menos um mosaico intragénico, preferivelmente com pelo menos 3 eventos cruzados, preferivelmente pelo menos 4, 5 ou 10 eventos cruzados por 700 pares base, mais preferivelmente por 600 bp, por 500 bp ou mesmo menos. 15/111

Tipicamente um alto grau de eventos cruzados fornece uma maior diversidade de genes recombinantes, que podem ser usados para produzir uma biblioteca para selecção adequada de membros de biblioteca. 0 grau de mosaicos ou eventos cruzados pode ser percebido como um parâmetro de qualidade de tal biblioteca.

Os genes que são modificados de acordo com o método da invenção podem ser quaisquer genes uteis para propósitos científicos ou industriais. Estes genes podem ser por exemplo sequências não codificadas, por exemplo as que podem ser usadas para sistemas de expressão recombinante, ou variantes de polipéptidos, no total ou em parte, incluindo essas sequências parciais, que não codificam um polipéptido com actividade biológica, tais polipéptidos são especialmente seleccionados do grupo constituído de enzimas, anticorpos ou partes destes, citocinas, antígenos vacinais, factores de crescimento ou péptidos. Se os genes forem modificados, codificando uma sequência não codificada ou uma sequência de aminoácido como parte de um polipéptido tendo uma actividade biológica, também chamados "genes parciais", pode ser preferido que uma assemblagem de tais genes parciais tenha características funcionais, por exemplo, genes parciais diferentes, num tamanho entre 3bp a 20000 bp, especialmente pelo menos 100 bp, preferivelmente de 300 bp a 20000 bp, especialmente até 10000 bp, sejam recombinados, o número de genes diferentes é de pelo menos 2, mais especialmente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou pelo menos 10 para produzir uma sequência de gene recombinada que não é codificada ou codifica um polipéptido recombinante, por exemplo tendo uma actividade biológica, que é vantajosamente modulada, por 16/111 exemplo tendo uma actividade biológica aumentada. 0 termo "actividade biológica" como usado neste contexto especialmente refere-se a uma actividade enzimática, tal como uma actividade que converte um substrato particular num produto particular.

Genes preferidos diversificados de acordo com a invenção são codificação para polipéptidos de muti cadeia.

De acordo com uma realização particular da invenção é fornecido um método de exibição celular de variantes de gene, compreendendo criar uma variedade de mosaicos de gene em células usando o método de acordo com a invenção, e exibindo dita variedade na superfície das ditas células para obter uma biblioteca de mosaicos. A biblioteca obtida por tal exibição preferida especialmente compreende uma alta percentagem de moisaicos de gene com um quadro funcional de leitura aberta (ORF), preferencialmente 80%.

Uma biblioteca de acordo com a invenção especialmente pode ser em qualquer forma adequada, especialmente uma biblioteca biológica compreendendo uma variedade de organismos contendo os variantes de gene. A biblioteca biológica de acordo com a invenção pode ser contida e/ou especificamente expressa por uma população de organismos para criar um reportório de organismos, onde organismos individuais incluem pelo menos um membro de biblioteca. 17/111

De acordo com um aspecto específico da invenção é adicionalmente fornecido um organismo que compreende uma variante de gene da tal biblioteca, por exemplo um organismo seleccionado de um reportório de organismos. 0 organismo como fornecido de acordo com a invenção pode ser usado para expressar um produto de expressão de gene num sistema de expressão adequado, por exemplo como uma produção de célula hospedeira.

Figuras

Figura 1: Recombinação não meiótica in vivo

Os genes homólogos A e B (homologia de menos de 99.5%) foram recombinados. Uma vez que as sequências de marcador e as sequências flanqueadores alvo não são homólogas, recombinação/assemblagem apenas ocorre entre os genes A e B. Como consequência o mosaico de ADN/hibrido contendo gene recombinado A e B, dois marcadores e ambas sequências flanqueadoras alvo. O mosaico de gene é integrado no lócus alvo num cromossoma alvo. Clones que integraram a construção inteira cresceram numa média apropriada que é selectiva para os dois marcadores. T 5' e T 3' correspondem à sequências alvo (homologia de menos de 99.5%) no genoma de levedura (ca. 400 bp) endereçando a integração homóloga no sitio de cromossoma. Ml e M2 são marcadores flanqueadores para a dupla selecção. Gene A e gene B são versões homólogas 18/111 relacionadas com um dado grau de homologia (menos que 99.5%). Sequências sobrepostas correspondem aos ORF inteiros de ambos os genes. Após assemblagem por recombinação homóloga num transformante MMR de levedura deficiente, a dupla selecção permite o isolamento de recombinantes.

Figura 2: Recombinação e assemblagem de ADN por recombinação homóloga

Esta figura mostra uma apresentação esquemática de uma realização especifica, onde a célula é co transformada com pelo menos dois genes, aqui fragmentos de ADN A e B, que têm homologia de menos de 99.5% na sua fracção sobreposta de 8 0 bp. Cada fragmento de ADN foi flanqueado por um marcador de selecção. O fragmento A contem uma sequência flanqueadora alvo que corresponde à extremidade 5' do sitio correto de integração no cromossoma e uma região de hibridização que se sobrepões com o fragmento B, o fragmento B contem a sequência flanqueadora alvo que corresponde à 3' do sitio de integração e uma região de hibridização que se sobrepões com o fragmento A. Célula de levedura deficientes incompatíveis foram transformadas com os fragmentos resultantes. Os transformantes resultantes foram banhados num meio, que é selectivo para ambos marcadores. Clones que podem ser seleccionados para ambos os marcadores foram isolados, e a integridade do aglomerado assemblado/integrado, como também a reconstituição ORF de genes A e B foi verificada por 19/111 analise molecular de ADN genómico dos recombinantes seleccionados. T 5' e T 3' correspondem às sequências alvo (homologia de menos que 99.5%) no genoma de levedura (ca. 400 bp) endereçando a integração homóloga no sítio de cromossoma. Ml e M2 são marcadores flanqueadores para a dupla selecção. Fragmentos de ADN A e B podem ambos ser assemblados num gene, que pode ser rastreável tal como GFP, ou pode3 representar dois genes que são assemblados por este método. Sequências sobrepostas de todos os genes têm homologia de menos de 99.5% (120 bp) , permitindo a reconstituição dos ORF após assemblagem por recombinação homóloga. Selecção dupla permite o isolamento do recombinante e serve como verificação primária da assemblagem.

Figura 3: Recombinação e assemblagem de genes A, B e C

Esta figura mostra a co transformação de um gene adicional C que tem uma sequência hibridizando com uma sequência flanqueadora de genes A e/ou B para obter assemblagem do dito gene C para genes A e B. T 5' e T 3' correspondem a sequências alvo (homologia de menos de 99.5%) no genoma de levedura (ca. 400 bp) endereçando a integração homóloga no sítio de cromossoma. Ml e M2 são os marcadores flanqueadores para a dupla selecção. Gene A, gene b e gene C são versões homólogas relacionadas com um grau dado de homologia 20/111 (menos de 99.5%). Sequências sobrepostas correspondem à parte 5' e à parte 3' dos genes. 0 fene B liga-se com os fragmentos flanqueadores e o novo ORF ABS é reconstituído por similaridade de sequência. Após assemblagem por recombinação homóloga num transformante MMR de levedura deficiente, a dupla selecção permite isolamento dos recombinantes.

Figura 4: Recombinação de substratos Oxa

Os quatro genes codificam variantes da enzima β lactamase. Eles são versões relacionadas com um diferente grau de homologia ao nível do ADN (de 95% a 49%). 0 painel superior mostra o recozimento esquemático dos genes ORF, com um dendrograma gerado após o alinhamento. Os tamanhos dos genes são aproximadamente 800 bp. ATG e TAA significam códons de início e fim. A tabela de fundo mostra a percentagem de similaridade entre os quatro genes ao nível do ADN.

Figura 5: Sequências de mosaicos de gene e proteína OXA11/OXA 7 (SEQ ID Nos 1-14)

Sequências de nucleótidos de origem OXA7 estão a BOLD e sublinhados, sequências de nucleótidos mutantes estão a BOLD e itálico.

Clones foram isolados por dupla selecção de ADN e usadas para amplificação e sequenciamento. Apenas sequências 21/111 claramente legíveis de fios Standard foram usadas. Cromatogramas resultantes foram alinhados com programa do tipo Clustal.

Figura 6: Seguências de mosaicos de gene e proteína 0XA11/0XA5 (SEQ ID Nos 15-38)

Sequências de nucleótidos de origem 0XA5 estão a BOLD e sublinhados, sequências de nucleótidos mutantes estão a BOLD e itálico.

Clones foram isolados por dupla selecção de ADN e usadas para amplificação e sequenciamento. Apenas sequências claramente legíveis de fios Standard foram usadas. Cromatogramas resultantes foram alinhados com programa do tipo Clustal.

Figura 7: Sequências de genes parentais 0XA11, OXA7 e 0XA5 (SEQ ID Nos 39-41)

Figura 8: Sequências de clones compreendendo mosaicos de genes complexos, correspondendo a assemblagem homóloga OXA11/OXA5/OXA7

Sequências de clones e resultados de recozimento de proteína respectivo: figura 8a) OUL3-05-II (SEQ ID Nos 42 e 43), figura 8b) OUL3-05-III (SEQ ID Nos 44 e 45), Figura 8c) OUL3-05-IV (SEQ ID Nos 46 e 47), Figura 8d) OUL3-05-IX (SEQ ID Nos 48 e 49) e Figura 8e) OUL3-05-X (SEQ ID Nos 50 e 51) de OXA11/OXA5/OXA7. 22/111

Sequências de nucleótido de OXA 5 estão a BOLD e as correspondentes para OXA 7 estão sublinhadas. Sequências que não estão a BOLD nem sublinhadas correspondem a OXA 11. genes ADH1 de Kluyveromyces cerevisiae e sequências

Figura 9: Sequências de lactis, Saccharomyces recombinantes.

Sequências de nucleótido de origem Kluyveromyces lactis estão sublinhadas.

Figura 9a): (SEQ ID Nos 52) ADH Kluyvermyces, Figura 9b) (SEQ ID Nos 53), Figura 9c) (SEQ ID Nos 54)clone A02, Figura 9d): (SEQ ID Nos 55) A03, Figura 9e): (SEQ ID Nos 56) A05, Figura 9f): (SEQ ID Nos 57) A06, Figura 9g): (SEQ ID Nos 58) AIO, Figura 9h): (SEQ ID Nos 59) All.

Descrição detalhada da invenção

Assim a presente invenção relaciona-se com um novo método altamente eficiente para recombinação homóloga in vivo de sequências de ADN homólogas, por exemplo, similares, mas não sequências idênticas. Daqui para a frente o termo recombinação homóloga, por vezes chamado homeóloga quando sequências hemeólogas são recombinadas, refere-se à recombinação de sequências tendo uma certa homologia, que podem ou não ser idênticas. Ao contrario 23/111 da abordagem normal de clonagem que depende de sitio especifico de digestão e ligação, recombinação homóloga alinha seguências complementares e permite a troca entre fragmentos. Mosaicos de gene recombinantes, também chamados genes híbridos, são gerados na célula através de hibridização de sequências tendo bases incompatíveis. Por tal método inventivo de mutagénese é possível criar facilmente uma diversidade para selecções adequadas e redesenhar os polipéptidos de interesse de uma forma eficiente em termos de tempo.

Especialmente a invenção permite que a primeira vez que recombinação e formação de mosaico, diversificação e assemblagem de genes diversos num único passo de procedimento, empregando o sistema funcional de recombinação in vivo. 0 termo "procedimento de único passo" significa que vários passos de processo de engenharia de recombinantes, como transformação de células com um gene, a recombinação de genes, geração de mosaico de gene e integração de um gene no genoma alvo, são tecnicamente levados a cabo num passo de método. Assim não há necessidade de recombinação in vitro de carregadores de ADN antes da recombinação in vivo, ou quaisquer ciclos de repetição de passos de processo, incluindo aqueles que empregam meiose.

Vantajosamente, o uso de células de levedura meióticas pode ser evitado. 24/111 0 procedimento de passo único de acordo com a invenção pode ainda incluir a expressão de tais recombinantes de engenharia por um hospedeiro ao mesmo tempo. Assim nenhuma manipulação adicional é necessária para obter o produto de expressão. 0 termo "mosaico de gene" de acordo com a invenção significa a combinação de pelo menos dois genes diferentes com pelo menos um evento cruzado. Especificamente tal cruzamento fornece combinação ou mistura de seguências de ADN. Um mosaico de gene pode ser criado mistura intragénica de genes, um mosaico intagénico de gene, e/ou assemblagem, opcionalmente assemblagem de genes com ambos, cruzamento intragénicos e intergénicos ou mosaicos de gene. 0 termo "cruzado" refere-se à recombinação entre genes num sitio onde dois fios de ADN podem trocar informação genética, por exemplo, pelo menos um nucleótido. 0 processo de cruzamento leva à descendência de mosaico de genes tendo diferentes combinações de genes ou sequências originadas dos genes parentais.

Em alternativa outos mecanismos de reparação podem ser fornecidos, que não são baseados em cruzamento, por exemplo, reparação de excisão de nucleótido ou mecanismos de união de extremidade não homóloga compreendendo o reconhecimento de nucleótidos incorrectos, excisão e/ou substituição após junção de fios. 25/111 0 termo "sequência flanqueadora alvo" refere-se a regiões de uma sequencia de nucleótido que são complementares ao alvo de interesse, tais como sitio de integração do genoma alvo, incluindo o sitio dos genes A e/ou outros genes a serem recombinados, polinucleótidos lineares, plasmideos YAC lineares ou circulares e do tipo. Devido a um grau especifico de complementação ou homologia, a sequência flanqueadora alvo pode hibridizar com e integrar gene(s) no sitio de integração alvo. 0 termo "genoma" de uma célula refere-se à totalidade de informação hereditária de um organismo, representada por genes e sequências não codificadas de ADN, elementos genéticos cromossómicos e não cromossómicos tais como, polinucleótidos lineares, por exemplo incluindo o gene A e/ou outros genes a serem recombinados, vírus, carregadores e vectores auto replicantes, plasmideos, e elementos transponíveis, incluindo cromossomas artificiais e do tipo. Cromossomas artificiais são moléculas de ADN lineares ou circulares que contem todas as sequências necessárias para manutenção estável após introdução numa célula, onde se comportam de igual forma a cromossomas naturais e assim são considerados como parte do genoma. 0 termo "homologia" indica que duas ou mais sequências de nucleótido têm (para um certo grau, até 100%) os mesmos ou pares base conservados numa posição correspondente. Uma sequência homóloga, também chamada sequência complementária ou correspondente, como usado de acordo com a invenção preferivelmente hibridiza com a sequência contraparte homóloga, por exemplo tem pelo 26/111 menos 30% de identidade de sequência, mas menos de 99.5% de identidade de sequência, possivelmente menos de 90%, menos que 85% ou menos que 80%, com uma sequência respectiva complementar, em relação a uma sequência nativa de comprimento total de ADN ou um segmento de sequência de ADN como discutido aqui. Preferivelmente uma sequência homóloga terá pelo menos 30% de identidade de sequência de nucleótido, preferivelmente pelo menos cerca de 40% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 50% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 60% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 70% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 80% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 90% de identidade, mais preferivelmente pelo menos cerca de 95% de identidade. Intervalos preferidos com limites superiores e inferiores como citado em cima estão n intervalo de 30% e 99.5% de correspondência de identidade de sequência. Como aqui usado, o grau de identidade refere-se sempre também às sequências complementares. "Percentagem (%) de identidade" com respeito à sequência de nucleótido de um gene é definida como a percentagem de nucleótidos numa sequência de ADN candidata que é idêntica com os nucleótidos na sequência de ADN, após alinhamento da sequência e introdução de espaços, se necessário, para alcançar máxima percentagem de identidade de sequência, e não considerando quaisquer substituições conservativas como parte da identidade de sequência. O alinhamento para propósitos de determinação da percentagem de identidade da sequência de nucleótido pode ser alcançado de várias formas que são conhecidas 27/111 para um perito na arte, por exemplo, usando software de computador disponível publicamente. Os peritos na arte podem determinar parâmetros apropriados para medir alinhamento, incluindo quaisquer alqoritmos necessários para alcançar alinhamento máximo ao longo do comprimento total das sequências sendo comparadas. 0 termo "ancoragem" significa ligação de um gene ou mosaico de gene a uma sequência de integração através de um segmento chamado "sequência de ancoragem" com homologia parcial ou total da sequência, para permitir a integração de tal gene ou mosaico de gene no sítio de integração de um genoma. Especialmente a sequência de ancoragem pode ser uma região flanqueadora homóloga ou parcialmente homóloga a um sítio de integração de uma sequência genómica. A sequência de ancoragem preferida tem preferivelmente pelo menos 70% de homologia de sequência para um sitio de integração alvo, mais preferivelmente pelo menos 80%, 90%, 95% até 99.5% ou correspondência total com a secção de hibridização do genoma. O sítio de integração pode adequadamente ser um lócus definido no genoma hospedeiro, onde uma alta frequência de eventos de recombinação ocorre. Um lócus preferido é, por exemplo, o lócus BUD31-HCM1 no cromossoma III de S. cerevisiae. Em geral qualquer local adicional em cromossomas de levedura que mostre recombinação em altas frequências mas não mudança de viabilidade celular são preferidos. 28/111 refere-se 0 termo "expressão" ou "sistema de expressão" a moléculas de ácidos nucleicos contendo uma sequência codificada desejada e sequências de controlo em ligação operável, tal que os hospedeiros transformados ou transfectados com estas sequências sejam capazes de produzir as proteínas codificadas. De forma a efectuar transformação, o sistema de expressão pode ser incluindo num vector, contudo, o ADN relevante podem depois também ser integrado no cromossoma hospedeiro. 0 termo "gene" deve também incluir fragmentos de ADN de um gene, em particular os que são genes parciais. Um fragmento pode também conter grelhas de leitura abertas, repetições do mesmo ORF ou ORF diferente. O termo deve especialmente incluir sequências de nucleótido, que não são codificadas, por exemplo sequências não transcritas ou não traduzidas, ou polipéptidos codificados, num todo ou em parte-0 termo "gene A" como usado de acordo com a invenção deve significar qualquer sequência de nucleótido de uma sequência não codificada ou uma sequência codificando um polipéptido ou polipéptidos de interesse. O gene A é caracterizado por estar presente no quadro de uma construção genética, tal como uma cassete de expressão, um polinucleótido linear, um plasmídeo ou um vector, que preferencialmente incorpora pelo menos um marcador de sequência e tem uma única sequência flanqueadora alvo, na extremidade 5' e extremidade 3' do gene A ou da construção genética. No método de acordo com a invenção o gene A é tipicamente o primeiro gene numa série de genes a serem recombinados para formação do mosaico de 29/111 gene. 0 gene A é homólogo a outro gene a ser recombinado, que é eventualmente uma variante do gene A, ou qualquer um dos genes B, C, D, E, F, G, H, etc., como ocaso. Assim apenas uma sequência flanqueadora alvo por gene A é tipicamente fornecida para o propósito de máxima fidelidade. Variantes do gene A são chamadas gene Al, A2, A3, etc., que têm homologia de sequência até uma certa extensão, e opciona 1mente caracteristicas funcionais similares. 0 termo "pelo menos um gene A" deve significar pelo menos um gene A e opcionalmente variantes do gene A. (...) continuação no ficheiro original - estado revisto. 30/111

Lista de sequências 31/111 <110> Eviagenics <120> Method for generating gene hybrids <130> EvOOIP <160> 59 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 801 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> gene hybrid OXA11/OXA7 <400> 1 32/111 atgaaaacat ttgccgcata tgtaattatc gcgtgtcttt cgagtacggc attagcfcagt 60 tcaatfcacag aaaatacgtt ttggaacaaa gagttctefcg ccgaagccgt caatggtgrfct 120 ttcgtgcttt gtaaaagtag cagtaaatcc tgcgcfcacca ataacttagc tcgtgcatca 180 aaggaatatc ttccageate aacatttaag atccceaacg caattatcgg octagaaact 240 ggtgtcataa agaatgagca tcagattttc aaatgggacg gaaaaccaag agccatgaaa 300 caatgggaaa gagacttgag cttaagaggg gcaatacaag tttcagcggt tcccgtattt 360 caacaaateg ceagagaagt tggegaagta agaatgcaga aatatcttaa aaaattttca 420 tatggtaacc agaatatcag tggcggcatt gacaaattct ggttggaggg tcagcttaga 480 atttccgcag ttaatcaagt ggagtttcta gagtctctat ttttaaataa attgtcagca 540 tcaaaagaaa atcagctaat agtaaaagag getttggtaa cggaggetge gcctgaatat 600 ettgtgcatt caaaaactgg tttttetggt gtgggaaotg agtcaaatco tggtgtcgca 660 tggtgggttg gttgggttga gaagggagca gaggtttact ttttcgcatt taacatggat 720 atagaçaacg aaaataagtfc gccgctaaga aaatccattc ccaccaaaat catggcaagt 780 gagggcatca ttggtggcta a 801 <210>2 <211>266

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<210> 41 <211=· 804 <212> ONA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 41 86/111 atgaaaacca tagccgcata cttagttact tcctgttttt eaagcaccgc gctctcaaag 60 tctatttctg aaaatttggt gtggaataaa gaattttcta gtgaatccgt acatggcgtt 120 tttgtacttt gtaaaagtag tageaattcc tgtactacaa ataatgcggc acgtgcatct 180 acagcctsta ttccagcatc aacattcaaa attcctaatg ctctaatagg tcttgaaacc 240 ggcgccataa aagatgaacg gcagattttc aaatgggacg gcaagcccag agccatgaaa 300 caatgggaaa aagacttaag gctaaggggc gctatacagg tttctgcggt tceggtattt 360 caacaaattg ccagagaagt tggcgaaatg agaatgcaaa gatatcttaa cctgttttca 420 tacggtaacg ccaatatagg gggaggcatt gacaaattct ggctagaggg tcagcttaga 480 atcccagcat tcaatcaaga taaatcttta gagtcgctct tcctgaataa tttgccagca 540 tcaaaagcaa atcaactaat agtaaaagag gcaatagtta cagaagctac gccagaatat 600 attgttcatt caaaaactgg gtattccggt gttggcacag aatcaagtcc tggtgtcgct 660 tggtgggttg gttgggtagg gaaaggagct gaggtttact tttttgcatt taacatggac 720 atagacaatg agaataaatt gccgtcaaga aaatccattt caacgaaaat catggcaagt 780 gaaggcatca tcattggtgg ctaa 804 <210> 42 <211 >827 <212> DMA <213> Artificial Sequence <220> <223> OUL3-05-II <400> 42 atgaaaacat ttgccgcata tgtaattatc gcgtgtcttt cgagtacggc attagctggt 60 tcaatfcaeag aaaatacgtc ttggaacaaa gagttctetg ccgaagccgt caatggtgtc 120 ttcgtgcttt gtaaaagtag cagtaaatcc tgcgctacca atgacttagc tcgtgcatca 180 aaggaatatc ttccagcatc aacattcaaa attcctaatg ctctaatagg tcttgaaacc 240 ggcgccataa aagatgaacg gcaggtttte aaatgggacg gcaagcceag agccatgaag 300 87/111 castgggaaa aagacttaaa gctaagggge gctatacagg tttctgetgt tccggtatfct 360 caacaaattg ccagagaagt tggcgaaata agaatgcaaa aataccfctaa catgttttca 420 tacggcaacg ccaafcatagg gggaggcatt gacaaattct ggctagaagg tcagcfctaga 430 atctcagcat tcaatcaagt taaattttta gagtcgctct acctgaataa tttgccagca 540 tcaaaagcaa accaactaat agtaaaagag gcaatagtta cagaagcaac tccagaatat 600 atagttcatt caaaaactgg gtattceggt gttggcacag aatcaagtcc tggtgtcgct 660 tggtgggttg gttgggtaga gaaaggaact gaggtttact tttttgcttt taacatggac 720 atagacaatg agagtaaatt gccgtcaaga aaatccatto ccaccaaaat catggcaagt 780 gagggcatca fctgçfcggeta agotgtgaag atcccagcaa aggctta 827 <210> 43 <211 >266 <212> PRT <213> Artificia! <220> <223> OUL3-G5-IÍ <400> 43 88/111

Met Lys Thr Phe Ala Ala Tyr Vai Ile Ile Ala Cys Leu Ser Ser Thr 15 10 15

Ala Leu Ala Gly Ser Ile Thr Glu Asn Thr Ser Trp Asn Lys Glu Phe 20 25 30

Ser Ala Glu Ala Vai Asn Gly Vai Phe Vai Leu Cys Lys Ser Ser Ser 35 40 45

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Gin Vai Ser Ala Vai Pro Vai Phe Gin Gin Ile Ala Arg Glu Vai Gly 115 120 125

Glu Ile Arg Met Gin Lys Tyr Leu Asn Leu Phe Ser Tyr Gly Asn Ala 130 135 140 89/111

Asn Ile Gly Gly Gly Ile Asp Lys Phe Trp Leu Glu Gly Qln Leu Arg 14S 150 155 160

Ile Ser Ala Phe Asn Gin Vai Lys Phe Leu Glu Ser Leu Tyr Leu Asn 165 170 175

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Vai Thr Glu Ala Thr pro Glu Tyr Ile Vai His Ser Lys Thr Gly Tyr 195 200 205

Ser Gly Vai Gly Thr Glu Ser Ser Pro Gly Vai Ala Trp Trp Vai Gly 210 215 220

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Ile Asp Asn Glu Ser Lys Leu Pro Ser Arg Lys Ser Ile Pro Thr Lys 245 250 255

Ile Met Ala Ser Glu Gly Ile Ile Gly Gly 260 265 <210> 44 <211?· 801 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> OUL3-05-IIÍ <400> 44 90/111 atgaaaacat fctgeégçràfca tttagttctc gcgtgtefctt cgagtacggc attagctggt '^Cáaíitacag: aaaafcacgtc ttggaacaaa gagttctctg ecgaagccgt caatggtgtc tfccgiggtefcÊ:' gtaaaagtag cagtaaatcc tgcgctacca atgacttage tcgtgcatca aaggaatatc fctç.cagcafca aacatfctaag atccecaacg caattatcgg tctagaaact ggtgtcataa agaatgagca tcaggtttte aaatgggacg gaaagecaag agceatgaag caatgggaaa gagacttgac ctta&gaggg gcaatacaag tfctcagatgt tcecgtattt caacaaatcg gcagagaagt fcggcgsaata agaatgcaga aatatettaa aaaatfctfcca taiggtaacc agaatatcag tggtggaatt gacaaattct ggctagaagg tíagcttaga atctcagaa” tcáatcaagt taaattttta gagtcgctct acctgaafcaa tttgccagca tcaaaagaaa atcagctaat agtaaaagag gcttfcggtaa cggaggctge gcctgaatat cttgtgcstfe caaaaactgg fcttttctggt gtgggaactg agtcaaatcc fcggtgtcçca tggtgggttg gttgggttga gaagggagca çaggtttact ttttcgcatt taacatggat atagacaacg aaaataagtt gccgctaaga aaatccattc ccaccaaaat catggcaagt gagggcatca ttggtggcta a <210-- 4ô <2Í1»266

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Met Lys Thr Phe Ala Ala Tyr Leu Vai Leu Ala Cys Leu Ser Ser Thr 1 5 10 15 Ala Leu Ala Gly Ser Ile Thr Glu Asn Thr Ser Trp Asn Lys Glu Phe 20 25 30 Ser Ala Glu Ala Vai Asn Gly Vai Phe Vai Leu Cys Lys Ser Ser Ser 35 40 45 Lys Ser Cys Ala Thr Asn Asp Leu Ala Arg Ala Ser Lys Glu Tyr Leu 50 55 60 Pro Ala Ser Thr Phe Lys Ile Pro Asn Ala Ile Ile Gly Leu Glu Thr 65 70 75 80 Gly Vai Ile Lys Asn Glu His Gin Vai Phe Lys Trp Asp Gly Lys Pro 85 90 95 Arg Ala Met Lys Gin Trp Glu Arg Asp Leu Thr Leu Arg Gly Ala Ile 100 105 110 Gin Vai Ser Ala Vai Pro Vai Phe Gin Gin Ile Ala Arg Glu Val Gly 115 120 125 Glu Ile Arg Met Gin Lys Tyr Leu Lys Lys Phe Ser Tyr Gly Asn Gin 130 135 140 Asn Ile Ser Gly Gly Ile Asp Lys Phe Trp Leu Glu Gly Gin Leu Arg 145 150 155 160 Ile Ser Ala Phe Asn Gin Vai Lys Phe Leu Glu Ser Leu Tyr Leu Asn 165 170 175 Asn Leu Pro Ala Ser Lys Glu Asn Gin Leu Ile Val Lys Glu Ala Leu 180 185 190 Vai Thr Glu Ala Ala Pro Glu Tyr Leu Val His Ser Lys Thr Gly Phe 195 200 205 92/111

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<210> 47 <211 >266 <212> PRT <213> Artificiai Sequence <220» 93/111 <223> OUL3..05..1V <400> 47 94/111

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Ala Leu Ala Ser Ser lie thr Glu Aan Thr Ser Trp Asn Lys Glu Phe 20 25 30

Ser Ala Glu Ala Vai Asn Gly Vai Phe Vai Leu Cys Lys Ser Ser Ser 35 40 45

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<210 49 <211 >266 <212» PRT <210 ArtífieialSégugnce <220» <223» Qtíl3-00-IX: 4400 40 gtfefcfctefeafcg caagcaccgc gctcfccagag gaattiçcta gtgaatccgt acatggcgtt tgtacfcacaa ataatgcgçc acgrtgeatet attcctaatg ctctaatagg tcttgaaaec aaatgggaçg gaaagecaag agccafcgaag gctatacagg tttctgctgt tcçggtafctt sgaatgeaaa aataccttaa ectgttttca gacaaattct ggctagaagg tcagettaga gagtcgctct acctgaataa attgtcagca gcaatagtta cagaagcaac tccagaatat gttggcaeag aatcaagtca tggtgtcgct gaggtttact tttttgcfctt taacatggac a&atccattc ccaccaaaat catggcaagt 60 120 ISO 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 801 96/111

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<2f0> 51 <211> 266 <212> PRT <213> Artificia! Sequertce <220> <223> OUL3-05-X <400> 51 99/111

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REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo Titular tem como único objetivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração se tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e a EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.

Documentos de Pedidos de Patente citadas na descrição

WO 1990007576 AI WO 20066134496 A2 WO 03095658 AI WO 2005075654 AI US 5912119 A

Literatura que não é patente citada na descrição SHAO et al. Nucleic Acids Research, 12 December 2008, vol. 37 (2), el6 ELEFANTY et al. Proc. NAtl. Acad. Sei., 1998, vol. 95, 11897-11902 KUNZ et al. Cell. Mol. Life Sei. 2009, vol. 66, 1021-1038 110/111 SWERS et al. Nucleic Acids Research, 2004, vol. 32 (3), e36 NICHOLSON et al. Genetics, 2000, vol. 154, 133-146 MANIATIS; FRITSCH; SAMBROOK. Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 1982 GIETZ, R.D.; R.A. WOODS TRANSFORMATION OF YEAST BY THE Liac/SS CARRIER DNA/PEG METHOD. Methods in Enzymology, 2002, vol. 350, 87-96

Isis and Herculase PCR based on Cha and Thily protocol; Specificity, Efficiency and fidelity of PCR. PCR primer: A Laboratory Manual, 1995, 37 GIETZ, R.D.; R.A. WOODS Transformation of Yeast by the Liac/SS Carrier DNA/PEG Method. Methods in Enzymology, 2002, vol. 350, 87-96 111/111

Claims (14)

1. Reivindicações 1. Um método para gerar um mosaico de gene por recombinação somática de seguências de ADN homólogas, compreendendo a) Num procedimento de um único passo (i) Transformar uma célula de ADN de reparação de deficiência com pelo menos um gene A tendo uma homologia de seguência de pelo menos 30% e menos do que 99.5% noutro gene a ser recombinado que é parte integrante do genoma da célula ou presente no quadro de uma construção genética empregando pelo menos um gene B a ser recombinado, (ii) Recombinar os ditos genes, (iii) Gerar um mosaico de genes dos genes num sitio de integração de um genoma alvo Onde o dito pelo menos um gene A tem uma única sequência flanqueadora alvo na extremidade de ancoragem 5' ou 3' à extremidade 5' ou 3' do dito sitio de integração, onde a única sequência flanqueadora alvo do gene A é ancorada à extremidade 5' do sitio de integração enquanto o gene B tem a única sequência flanqueadora alvo ancorada à extremidade 3',e b) Seleccionar clones compreendendo pelo menos um mosaico de gene intragênico. 1/4
2. 2. Um método de acordo com a reivindicação 1 onde um marcador de seleção é usado no mosaico de gene e os clones são selecionados de acordo com a presença do marcador de seleção.
3. 3. Um método de acordo com a reivindicação 1 ou 2 onde mosaicos de gene de uma sequência não codificada, um gene parcial ou genes de pelo menos 3 a 20000 pares base são obtidos.
4. 4. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3 onde a célula é co transformada com pelo menos dois variantes diferentes de gene A a ser recombinado, esses genes são genes AI e A2, e opcionalmente com pelo menos dois variantes de gene B a ser recombinado, que são genes BI e B2.
5. 5. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 onde pelo menos um gene C adicional é co transformado, que tem uma sequência hibridizando com a sequência de gene A e/ou dita outra sequência de gene para obter assemblagem do dito gene adicional C para gene A e/ou dito outro gene, onde um ou mais genes assemblados têm um mosaico de gene intragénico.
6. 6. Um método de acordo com as reivindicações de 1 a 5 onde o dito gene A e/ou dito outro gene são sequências não codificadas ou codificadas para um polipéptido ou parte de um polipéptido tendo uma atividade. 2/4
7. 7. Um método de acordo com a reivindicação 5 ou 6 onde múltiplos genes codificando polipéptidos de um caminho bioquímico são recombinados e assemblados.
8. 8. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7 onde a célula é uma célula com knock-out de um gene de reparação de ADN ou célula de reparação de incompatibilidade deficiente.
9. 9. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8 onde a célula é uma célula eucariótica, preferencialmente uma célula de fungo, de mamífero ou planta, ou célula procariótica.
10. 10. Um método de acordo com a reivindicação 9 onde a célula é uma célula de fungo preferencialmente selecionado do grupo constituído por Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Hansenula, Schizosaccaromyces, Yarrowia, Pichia e Aspergillus.
11. 11. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, onde um marcador de seleção é usado, e é selecionado do grupo constituído de marcadores nutricionais auxotróficos, marcadores de resistência de antibióticos, marcadores fluorescentes, marcadores knock-in, marcadores do domínio ativador/ligante e marcadores dominantes recessivos e marcadores clorométricos. 3/4
12. 12. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 onde os ditos genes são compreendidos num polinucleotideo linear, num vetor ou cromossoma de levedura artificial.
13. 13. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12 onde os ditos genes são polinucleotideos lineares, preferencialmente de 300 a 20000 bp.
14. 14. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13 onde os genes são sequências não codificadas ou variantes de codificação de polipéptido seleccionado de um grupo constituido de enzimas, anticorpos ou partes destes, citocinas, factores de crescimento, antigenos vacinais e péptidos. Lisboa, 13 de Fevereiro de 2014 4/4 Resumo A invenção relaciona-se com um método para gerar um mosaico de gene por recombinação somática in vivo, compreendendo e) num procedimento com um único passo (vii) transformar uma célula com pelo menos um gene A tendo uma homologia de sequência de menos de 99.5% em outro gene a ser recombinado que é parte integral do genoma da célula ou presente no quadro de uma construção genética, (viii) recombinar disto genes, (iX) gerar uma mosaico de gene dos genes num sitio de integração do genoma alvo, onde o dito pelo menos um gene A tem uma única sequência flanqueadora alvo na extremidade 5' ou 3' ancorando à extremidade 5' ou 3' do dito sitio de integração, e f) selecionar clones compreendendo o mosaico de genes, como também um método para produzir uma diversidade de moisaicos de gene e assemblagem de gene. 1/1