KR20070004652A - 사카로마이세스 세레비시애에서 재조합 유전자의 생성 - Google Patents

사카로마이세스 세레비시애에서 재조합 유전자의 생성 Download PDF

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믹시스 프랑스 에스. 에이.
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Abstract

본 발명은 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서 재조합 DNA 서열, 및 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용된 플라스미드 및 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포를 생성하고 검출하는 방법에 관한 것이다.
사카로마이세스 세레비시애, 재조합 서열, 플라스미드, 생성 방법, 검출 방법

Description

사카로마이세스 세레비시애에서 재조합 유전자의 생성{GENERATION OF RECOMBINANT GENES IN SACCHAROMYCES CEREVISIAE}
본 발명은 일반적으로 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisia e)에서 재조합 DNA 서열을 생성하고 검출하는 방법, 및 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용된 플라스미드 및 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에 관한 것이다.
상기 방법이 관련되는 DNA 서열은 단백질-코딩 및 비코딩 서열을 포함하고; 생합성 경로에 속할 수 있는 것과 같은 개재하는 비코딩 서열과 함께 하나 초과의 단일 코딩 서열을 함유하는 보다 큰 연속적 스트레치로 이루어질 수 있다.
효소 및 다른 단백질과 같은 물질의 미생물 및 효소에 의한 생산은 중요한 경제적 주제이다. 효소는 천연 화합물 및 유기체의 대사에서 기능을 할 뿐만 아니라 천연 및 비천연 화합물의 산업적 생산에 이용되는 생물학적으로 활성 단백질이다. 효소 또는 효소의 도움으로 생산된 화합물은 약물, 화장품, 식품 등의 제조에 이용될 수 있다. 그러나, 효소의 산업적인 용도는 그들의 표적 특이성 및 이들이 기능할 수 있는 특이적인 조건에 의해 크게 저해된다. 다른 단백질은 인간 및 동물 건강 분야에서 치료 용도를 갖는다. 중요한 종류의 의학적으로 중요한 단백질 은 시토킨 및 성장인자를 포함한다.
신규하거나 개선된 기능 및 특성을 갖는 단백질, 효소 및 경로는 주로 미지의 천연 물질종 사이에서 탐색함으로써 또는 현재 공지된 천연 단백질 또는 효소를 개선함으로써 얻을 수 있다. 후자의 방법이 자연 진화 과정이 선택할 것 같지 않은 특성을 생성시키기 위해 더 적합할 수 있다.
그러한 신규한 바람직한 특성을 생성시키고 효소, 다른 단백질, 비코딩 서열 또는 경로를 재설계하기 위한 하나의 유망한 방법은 통제된 (directed) 분자 진화에 의한 것이다. 종래에, DNA 서열의 통제된 진화는 부위 지정 돌연변이, 다중 부위 또는 카세트 돌연변이, 랜덤 돌연변이 및 오류 유발 PCR과 같은 기술을 사용하여 달성된다. 최근에, 효소 또는 단백질의 특성을 최적화하거나 미세조정하기 위해 유전자 셔플링 방법이 많은 주목을 받고 있다. 상기 통제된 진화 기술은 기존 기술을 개선시키고, 신규한 생성물을 생산하며 합성 화학의 능력을 확장할 수 있는 효소를 생산할 수 있다.
많은 상이한 돌연변이 방법, 예를 들어 랜덤 돌연변이, 부위 지정 돌연변이, 올리고뉴클레오티드 카세트 돌연변이, 또는 오류 유발 PCR에 의한 점 돌연변이가 존재한다. 예를 들어 랜덤 돌연변이는 아질산, 히드라진 등과 같은 화학물질로 처리하여 클로닝된 DNA 단편 내에 많은 수의 랜덤하게 분포된 뉴클레오티드 치환 돌연변이의 생성을 수반한다. 오류 유발 PCR은 랜덤 점 돌연변이를 클로닝된 유전자에 도입하기 위해 개발되었다. PCR 반응의 충실도를 감소시키는 변형은 MgCl2의 농 도 증가, MnCl2의 첨가, 또는 4개의 dNTP의 상대적 농도 변경을 포함한다.
이들 전통적인 돌연변이 방법은 분리된 선택가능 표현형을 갖는 개별 유전자의 최적화에 촛점을 맞춘다. 일반적인 방법은 유전자를 클로닝하고, 유전자에 대한 분리된 기능을 확인하고, 모니터링될 수 있는 분석을 확립하고, 유전자에서 선택된 위치를 돌연변이시키고, 유전자의 공지 기능의 개선을 위한 유전자의 변이체를 선택하는 것이다. 이어서 개선된 기능을 갖는 변이체는 목적하는 세포 종류에서 발현될 수 있다. 바람직한 효소 특성을 얻기 위해 돌연변이 방법의 반복 사이클을 수행할 수 있다.
이들 종래의 방법은 각각 내재적인 서열 탐색 방법을 갖는다. 상기 서열 탐색 기술에 사용되는 방법들은 매우 상이하다. 포화 부위 지정 돌연변이 탐색을 수행하는 것은 관심있는 부위에서 모든 가능한 치환을 확립하는 과정을 포함한다. 단백질에 대해, 상기 과정은 관심있는 부위에서 아미노산을 19개의 모든 다른 아미노산으로 교체하고 생성된 라이브러리를 개선된 돌연변이체에 대해 탐색하는 것으로 이루어진다. 서열 공간 측면에서, 매우 작은 영역이 완전히 탐색되는 것을 의미한다. 이와 달리, 카세트 돌연변이는 랜덤 펩티드 서열을 단백질의 특정한 구역에 삽입하여, 서열 공간의 보다 큰 규정된 영역의 보다 덜 완전한 샘플링을 제공한다. 오류 유발 PCR은 적지만 유의한 수의 오류를 도입하면서, 서열의 반복된 복제를 포함한다. 이 경우에, 서열 공간의 덜 규정된 영역의 산재 샘플링이 달성된다. 이들 각각의 방법에서, 각각의 선택 라운드에서 얻어진 최선의 돌연변이체를 사용 하여 다음 라운드를 개시시킨다.
그러나, 효소에서 신규한 특성을 발생시키기 위한 전통적인 돌연변이 방법은 많은 한계가 있다. 먼저, 이들은 클로닝되고 기능적으로 특성화된 유전자 또는 서열에만 적용가능하다. 두번재로, 이들 방법은 보통 분리된 기능을 갖는 유전자에만 적용가능하다. 따라서, 협동하여 단일 표현형을 부여하는 다수 유전자는 보통 상기 방식으로 최적화될 수 없다. 마지막으로, 이들 방법은 단일 유전자에 대해서조차 단지 매우 제한된 수의 총 치환수만을 연구할 수 있다. 이들 한계의 면에서, 종래의 돌연변이 방법은 많은 유용한 특성에 관하여 세포성 게놈을 개선하기에 부적절하다. 예를 들어, 단백질을 발현하는 세포의 능력 개선은 전사 효율, 번역 및 번역후 변형, 유전자 생성물의 분비 또는 단백질 분해 효소에 의한 분해 변경을 필요로 할 수 있다. 따라서 새로운 특성을 갖는 단백질을 발현하기 위해 하나 이상의 이들 세포성 메카니즘에서 역할을 하는 부가적인 유전자를 변형시키는 것이 필요할 수 있다. 그러한 기능을 갖는 모든 유전자를 개별적으로 최적화하려는 시도는 실질적으로 불가능한 일일 것이다.
종래의 돌연변이 방법과 관련된 대부분의 문제는 유전자 셔플링 방법에 의해 극복될 수 있다. 유전자 셔플링은 기능적 유전자의 상이한 서열을 랜덤하게 재조합하는 것을 수반하여, 자연적으로 유사하거나 랜덤하게 돌연변이된 유전자의 분자 혼합을 가능하게 한다. DNA 또는 유전자 셔플링, 또는 이들 기술의 변형은 효소의 활성, 안정성, 폴딩 (folding), 및 기질 인식 특성을 개선하기 위해 사용되었다. 종래의 돌연변이 방법을 유전자 셔플링과 비교하면, 개선된 표현형을 갖는 돌연변 이체를 수득할 가능성이 유의하게 더 높다. 유전자 셔플링은 유리한 돌연변이를 조합 방식으로 재조합한다는 점에서 근본적으로 종래의 방법과 상이하다. 따라서 이는 서열 공간의 훨씬 더 큰 구역을 보다 더 산재적으로 기능적 서열 생산 측면을 우선적으로 탐색할 것이다. 이는 또한 서열 정보가 하나 이상의 기원으로부터 제공될 수 있도록 하기 때문에 각각의 선택 라운드로부터 보다 유익한 돌연변이가 다음 라운드에서 보유되도록 허용한다. 종래의 방법은 또한 네가티브 (negative) 돌연변이의 고정을 허용하는 반면, 유전자 셔플링 방법에서는 그렇지 않다. 따라서, 유전자 셔플링 방법이 훨씬 더 극적인 결과를 얻는 것은 놀랍지 않다.
DNA 또는 유전자 셔플링 방법은 특정 상동성을 갖는 영역들 사이 또는 동일성의 스트레치들 사이의 재조합 사건을 기초로 한다. 진핵생물에서 유전적 재조합을 검사하는 실험에 사용된 핵심 유기체는 출아 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)이다. 단순한 단세포 유기체에서 이들 과정의 연구는 DNA 서열의 조작의 용이성의 명백한 잇점과 대부분의 세포에서 동시에 유도된 특이적 재조합 사건을 연구하는 가능성을 갖는다. 또한, 이 유기체의 발효 기술 및 기본 유전학 모두에서 지난 수십년에 걸쳐 풍부한 전문기술이 축적되었고, 현재 분자 수준에서 연구되는 최상의 진핵생물이다. 그의 비병원성, 그의 분비 능률 및 그의 글리코실화 가능성 때문에, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)는 유전자 클로닝 및 유전자 발현을 위한 바람직한 숙주 유기체이다. 따라서, 본 발명의 기초가 되는 기술적인 문제는 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서 재조합 모자이크(mosaic) 유전자의 생산을 위한 방법 및 수단을 제공하는 것이다.
본 발명은
a) 게놈의 규정된 로커스(locus)에 적어도 제1 및 제2 마커 서열에 인접하는 재조합시킬 제1 DNA 서열을 포함하는 제1 재조합 카세트, 및 대립유전자 위치(allelic position)에 적어도 제3 및 제4 마커 서열에 인접하는 재조합시킬 제2 DNA 서열을 포함하는 제2 재조합 카세트를 갖는 제1 배수체(diploid) 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포를 생성하고,
b) 단계 a)에서 수득한 제1 배수체 세포의 포자형성 (sporulation)을 유도하고,
c) 제1 재조합된 DNA 서열이 제1 및 제4 마커 서열에 인접하는 재조합 카세트를 함유하는 반수체(haploid) 세포, 및 제2 재조합된 DNA 서열이 제2 및 제3 마커 서열에 인접하는 재조합 카세트를 함유하는 반수체 세포를 단리하는 단계를 포함하는, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서 재조합 DNA 서열을 생성하고 검출하는 방법을 제공함으로써 상기 기술적인 문제를 해결한다.
본 발명은 적어도 2개의 분기된 DNA (diverging DNA) 서열 사이의 재조합 사건을 스크리닝하기 위해 효모계 시스템을 제공한다. 상기 시스템은 반수체상과 배수체상 사이에 교대하는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)의 유성 생식 주기에 기초한다. 본 발명의 방법의 제1 단계에서, 이들 재조합 기질에 이형접합성 (heterozygous)인 배수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포가 생성된다. 재조합시킬 DNA 서열은 대립유전자 위치에서 배수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포의 게놈 내에 통합된다.
재조합시킬 각각의 DNA 서열은 상기 DNA 서열 외에 DNA 서열에 인접하는 적어도 2개의 마커 서열을 포함하여, 2개의 재조합 카세트가 적어도 4개의 상이한 마커 서열을 포함하는 재조합 카세트의 형태로 통합된다.
이어서 이렇게 수득한 이형접합성 배수체 세포를 감수분열 및 포자 형성 과정을 유도하는 조건 하에 성장시킨다. 감수분열은 일반적으로 감수분열 I 전기에 초기에 유도된 이중가닥 절단 (DSB)의 형성 및 후속적인 복구에 의해 개시되는 유전자 재조합의 빈도 상승을 특징으로 한다. 따라서 효모 감수분열 세포는 DSB의 게놈 전체의 유도의 결과로서 높은 수준의 재조합을 경험하기 때문에 특히 흥미롭다. 따라서 모체 배수체 세포에 의해 생산된 4개의 각각의 감수분열 사건에 대한 반수체 세포 또는 포자인 제1 라운드의 감수분열 생성물은 2개의 분기된 (diverged) DNA 서열 사이의 재조합 때문에 재조합된 DNA 서열을 함유할 수 있다.
감수분열 동안 2개의 분기된 (diverging) DNA 서열 사이의 재조합은 또한 인접 마커 서열의 교환을 일으킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 재조합 기질에 인접하는 마커 서열의 교환이 발생하는 개별 세포 또는 분자의 선택에 의해 재조합된 DNA 서열의 신속하고 간단한 확인이 가능하다. 제1 라운드의 감수분열 후에 얻은 재조합체는 따라서 제1 재조합 카세트의 적어도 하나의 마커 서열 및 제2 재조합 카세트의 적어도 하나의 마커 서열을 포함 및(또는) 발현하는 특징을 갖는다. 특히, 재조합 포자는 제1 재조합 카세트의 제1 마커 서열 및 제2 재조합 카세트의 제4 마커 서열 또는 제1 재조합 카세트의 제2 마커 서열 및 제2 재조합 카세트의 제3 마커 서열을 포함할 수 있고, 이에 의해 2가지 종류의 재조합 포자는 모두 상기 상이한 마커 조합물 외에 상이한 재조합 DNA 서열을 또한 함유한다. 재조합 서열을 함유하는 2가지 종류의 포자는 모두 감수분열 동안 재조합에 의해 생산된 재조합 마커 구성체에 대한 선택을 허용하는 조건 하에 쉽게 선택되고 구분될 수 있다.
본 발명의 방법은 야생형 또는 미스매치 복구-결함 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에서 수행할 수 있다. 손상된 DNA가 복구되는 과정과 유전자 재조합의 메카니즘이 긴밀하게 관련되고, 미스매치 복구 기구가 분기된 (diverging) 서열 사이의 재조합 빈도, 즉, 부분상동성 (homeologous) 재조합에 대한 억제 효과를 갖는다고 알려져 있다. 미스매치 복구 시스템의 돌연변이는 따라서 효모에서 재조합 사건의 총 빈도를 크게 증가시킨다. 다른 한편으로, 야생형 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포는 두 재조합 기질에서 멀리 떨어진 미스매치를 기초로 하는 미스매치 복구-의존성 재조합 메카니즘을 갖는다고, 알려져 있다. 재조합시킬 DNA 서열에 따라, 야생형 또는 미스매치 복구-결함 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포를 사용하여 재조합된 서열을 얻을 수 있다.
본 발명의 방법은 반복될 수 있다는 잇점을 갖는다. 즉 본 발명의 방법은 추가 라운드의 재조합이 가능하다. 제1 라운드의 감수분열 생성물, 즉 상이한 재조합된 DNA 서열을 포함하는 반대 교배형의 반수체 세포를 다시 교배하여 재조합된 DNA 서열에 이형접합성인 배수체 세포를 얻는다. 이와 같이 얻은 배수체 세포에서, 감수분열이 다시 유도되어 재조합된 DNA 서열이 다시 재조합되고, 이에 의해 각각의 재조합 기질에 인접하는 2개의 마커의 교환이 발생한다. 제2 감수분열 후에 얻은 새로운 반수체 재조합체는 이제 본래의 제1 재조합 카세트의 제1 DNA 서열에 인접한 마커 유전자 또는 본래의 제2 재조합 카세트의 제2 DNA 서열에 인접한 마커 유전자의 공동 발현에 의해 쉽게 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 제1 라운드의 본 발명의 방법에서 얻은 제1 재조합된 DNA 서열을 갖는 재조합 카세트를 함유하는 반수체 세포는 제1 라운드의 본 발명의 방법에서 얻은 제2 재조합된 DNA 서열을 갖는 재조합 카세트를 함유하는 반수체 세포와 교배되어 제2 배수체 세포를 생성시킨다. 이와 같이 얻은 제2 배수체에서, 세포 포자형성이 유도되어 반수체 세포를 생성시킨다. 다음 단계에서, 제3 재조합된 DNA 서열이 적어도 제1 및 제2 마커 서열에 의해 인접되는 재조합 카세트를 함유하는 반수체 세포 및 제4 재조합된 DNA 서열이 적어도 제3 및 제4 마커 서열에 의해 인접되는 재조합 카세트를 함유하는 반수체 세포가 단리된다.
제3 및 제4 재조합된 DNA 서열을 포함하는 반수체 세포를 교배 및 감수분열/포자형성의 1회 이상의 추가의 사이클에 적용하여, 추가의 재조합된 DNA 서열이 생성될 수 있다. 각각의 라운드의 재조합 후에, 재조합체는 제1 재조합 기질에 인접한 적어도 하나의 마커 서열 및 제2 재조합 기질에 인접한 적어도 하나의 마커 서열의 동시 존재에 의해 또는 출발 재조합 기질의 제1 또는 제2 DNA 서열에 인접한 2개의 마커의 동시 존재에 의해 확인된다.
따라서, 본 발명의 방법의 유리한 특징은 반복된다는 것이다. 재조합 반수체 자손체는 개별적으로 또는 한꺼번에 선택되어 서로 교배되고, 생성되는 배수체는 새로이 포자를 형성하고, 이들의 자손체 포자는 새로운 재조합 사건을 확인하기 위해 적절한 선택 조건에 적용된다. 본 발명의 방법에서, 재조합된, 돌연변이된 서열의 큰 라이브러리를 쉽게 생성시킬 수 있고, 이어서 요구되는 기능을 갖는 변이체를 적절한 선택 또는 스크리닝을 사용하여 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 제1 배수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포는 배수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포를 제1 재조합 카세트를 포함하는 DNA 분자 및 제2 재조합 카세트를 포함하는 DNA 분자로 동시에 또는 순차적으로 형질전환시키고, 임의로 2개의 재조합 카세트를 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 천연 염색체 상의 대립유전자 위치 내로 통합시킴으로써 생성된다. 사용된 DNA 분자는 또한 예를 들어 효모 인공 염색체 (YAC)일 수 있다. YAC는 효모 세포 내에 안정한 유지를 위해 필요한 모든 서열, 예를 들어 센트로미어 (centromere), DNA 복제 기원 및 텔로미어 (telomere)와 효모 선택가능 마커를 함유하는 선형 DNA 분자임을 특징으로 한다. 효모 세포 내로 도입시, YAC는 천연 염색체와 유사하게 거동하고, 따라서 효모 게놈의 일부로서 간주될 수 있다. 본 발명의 측면에서, 용어 "게놈"은 안정하게 유지되고 유전되는, 세포 내에 존재하는 모든 유전적 성분 전체를 포함한다. YAC가 제1 및 제2 재조합 카세트를 배수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포 내로 도입하기 위한 DNA 분자로 사용되는 경우, 2개의 재조합 카세트를 천연 염색체 내의 대립유전자 위치에 통합하는 것은 필요하지 않다. 재조합 카세트가 천연 염색체 내로 도입되는 경우에, 그로부터 재조합 카세트를 갖는 단편이 유리될 수 있는 클로닝 비히클, 예를 들어 플라스미드를 사용하는 것이 가능하다. 바람직하게는, 2개의 재조합 카세트의 2개의 각각의 마커 서열은 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 규정된 로커스에 상동성인 표적화 서열에 인접한다. 별법으로, 복제 기원을 함유하지 않는 DNA 분자가 사용될 수 있다. 이 경우에, DNA 분자는 게놈의 성분 내로 통합될 수 있어야 하고, 따라서 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 규정된 로커스에 상동성인 표적화 서열을 함유한다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서, 제1 배수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포는 그들의 게놈의 로커스에 제1 재조합 카세트를 갖는 반수체 세포를 그들의 게놈의 대립유전자 위치에 제2 재조합 카세트를 갖는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 반수체 세포와 융합시킴으로써 제조된다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서, 제1 배수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포는 그들의 게놈의 로커스에 제1 재조합 카세트를 갖는 반수체 세포를 그들의 게놈의 대립유전자 위치에 제2 재조합 카세트를 갖는 반대 교배형의 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 반수체 세포와 교배함으로써 생성된다.
본 발명의 측면에서, 용어 "교배" 및 "융합"은 상이한 재조합 카세트를 함유하는 2개의 반수체 세포의 의도적 또는 랜덤 조합을 나타낸다. 2개의 반수체 세포의 의도적 교배 또는 융합은 목적하는 특성을 갖는 반대 교배형의 2개의 선택된 및(또는) 단리된 반수체 세포를 각각 교배 및 융합을 자극하는 조건 하에 접촉시킬 때 일어난다. 2개의 반수체 세포는 예를 들어 재조합시킬 DNA 서열 또는 이미 재조합된 DNA 서열을 함유하는 세포의 동일한 라이브러리, 또는 예를 들어 재조합시킬 DNA 서열 또는 이미 재조합된 DNA 서열을 함유하는 세포의 상이한 라이브러리로부터 유래할 수 있다.
2개의 반수체 세포의 랜덤 교배 또는 융합은 복수의 상이한 반수체 세포를 각각 교배 및 융합을 자극하는 조건 하에 접촉시킬 때 일어난다. 복수의 반수체 세포는 예를 들어 재조합시킬 DNA 서열 또는 이미 재조합된 DNA 서열을 함유하는 세포의 동일한 라이브러리, 또는 예를 들어 재조합시킬 DNA 서열 또는 이미 재조합된 DNA 서열을 함유하는 세포의 상이한 라이브러리로부터 유래할 수 있다.
재조합된 DNA 서열을 생성하고 검출하는 본 발명의 방법은 3개 이상의 분기된 (diverging) 서열이 재조합될 수 있는 잇점이 있다. 예를 들어, 4개의 상이한 DNA 서열이 재조합되어야 하면, 본 발명의 방법의 제1 단계에서 2개의 상이한 세트의 배수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포가 생성될 수 있다. 예를 들어, 제1 세트의 배수체 세포는 재조합시킬 제1 및 제2 DNA 서열을 포함하는 반수체 세포를 교배 또는 융합함으로써 생성될 수 있고, 제2 세트의 배수체 세포는 재조합시킬 제3 및 제4 DNA 서열을 포함하는 반수체 세포를 교배 또는 융합함으로써 생성될 수 있다. 2 세트의 배수체 세포의 포자형성 후, 제1 및 제2 DNA 서열 사이의 재조합으로 인해 재조합된 DNA 서열을 함유하는 제1 배수체 세포 세트로부터 수득한 반수체 세포는, 제3 및 제4 DNA 서열 사이의 재조합으로 인해 재조합된 DNA 서열을 함유하는 제2 배수체 세포 세트로부터 수득한 적절한 반수체 세포와 교배된다. 상기 교배 산물은 포자형성 후에 제1 DNA 서열, 제2 DNA 서열, 제3 DNA 서열 및 제4 DNA 서열의 영역을 포함하는 재조합된 DNA 서열을 함유하는 반수체 세포를 생성시키는 배수체 세포이다. 예를 들어, 3개의 상이한 DNA 서열이 재조합될 경우, 본 발명의 방법의 제1 단계에서 배수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포는 예를 들어 재조합시킬 제1 및 제2 DNA 서열을 포함하는 반수체 세포의 교배 또는 융합에 의해 생성된다. 상기 배수체 세포의 포자형성 후에, 제1 및 제2 DNA 서열 사이의 재조합에 의해 재조합된 DNA 서열을 포함하는 이와 같이 수득한 반수체 세포는 제3의 재조합시킬 DNA 서열을 포함하는 반수체 세포와 융합되거나 교배될 수 있다. 상기 교배 산물은 포자형성 후에 제1 DNA 서열, 제2 DNA 서열 및 제3 DNA 서열의 영역을 포함하는 재조합된 DNA 서열을 함유하는 반수체 세포를 생성시키는 배수체 세포이다. 이러한 방식으로, 5, 6 또는 그 보다 많은 분기된 (diverging) DNA 서열도 재조합될 수 있다.
바람직한 실시태양에서, 제1 또는 제2 재조합 카세트를 함유하는 반수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포는
a) 제1 클로닝 비히클 상에 인접하여 위치하는 제1 및 제2 마커 서열 사이에 재조합시킬 제1 DNA 서열을 삽입하고, 제2 클로닝 비히클 상에 인접하여 위치하는 제3 및 제4 마커 서열 사이에 재조합시킬 제2 DNA 서열을 삽입함으로써 각각의 2개의 마커 서열이 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 규정된 로커스에 상동성인 표적화 서열에 의해 인접되도록 하고,
b) 단계 a)에서 얻은 클로닝 비히클로부터 각각 인접 표적화 서열을 갖는 제1 재조합 카세트 및 제2 재조합 카세트를 절제함으로써 각각의 절제된 단편이 각각의 2개의 마커 서열 및 표적화 서열에 의해 인접되는 재조합시킬 DNA 서열을 포함하도록 하고,
c) 단계 b)에서 얻은 절제된 단편을 별개로 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 배수체 세포에 형질전환시킴으로써 표적화 서열이 그에 상동성인 로커스 내로 카세트가 통합되도록 하여, 제1 카세트 또는 제2 카세트에 이형접합성인 배수체 세포를 얻고,
d) 단계 c)에서 얻은 이형접합성 배수체 세포의 포자형성을 별개로 유도하고,
e) 제1 및 제2 마커 서열에 의해 인접되는 제1 카세트를 함유하는 반수체 세포, 및 제3 및 제4 마커 서열에 의해 인접되는 제2 카세트를 함유하는 반수체 세포를 단리함으로써 생성된다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 제1 또는 제2 클로닝 비히클 내의 각각의 2개의 마커 서열은, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 염색체 III 상의 BUD31-HCM1 로커스에 상동성이면서 절제된 카세트의 로커스 내로의 통합을 지시하는 표적화 서열에 의해 인접된다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 재조합 카세트의 클로닝에 사용되는 클로닝 비히클은 플라스미드이다. "플라스미드"는 자발적으로 복제할 수 있는 염색체외 성분이다. 플라스미드는 플라스미드가 함유되는 세포의 게놈에 물리적으로 연결되지 않는다. 대부분의 플라스미드는 이중가닥의 원형 DNA 분자이다. 다른실시태양에서, 클로닝 비히클은 YAC이다.
특히, 제1 재조합 카세트가 클로닝되는 제1 클로닝 비히클로서 플라스미드 pMXY9를 사용하는 것이 바람직하다. 플라스미드 pMXY9는 URA3 마커 유전자 및 CAN1 마커 유전자를 포함한다. 이 플라스미드에서, 2개의 마커 유전자는 인접하여 위치한다. 두개의 마커 유전자 사이에 재조합시킬 DNA 서열을 삽입하기 위해 복수개의 제한 부위, 특히 제한효소 SmaI, XbaI, BglII 및 PacI의 인식 부위가 존재한다. 2개의 마커 서열은 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 염색체 III 상의 BUD31-HCM1 로커스에 상동성인 표적화 서열에 의해 인접된다.
또한, 제2 재조합 카세트가 클로닝되는 제2 클로닝 비히클로서 플라스미드 pMXY12를 사용하는 것이 바람직하다. 플라스미드 pMXY12는 TRP1 마커 유전자 및 CYH2 마커 유전자를 포함한다. 상기 플라스미드에서, 2개의 마커 유전자는 인접하게 위치한다. 2개의 유전자 사이에 재조합시킬 DNA 서열을 삽입하기 위한 몇몇 제한 부위, 특히 제한효소 SpeI, SmaI 및 PacI에 대한 인식 부위가 배열된다. 2개의 마커 서열은 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 염색체 III 상의 BUD31-HCM1 로커스에 상동성인 표적화 서열에 인접한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 절제된 재조합 카세트의 형질전환을 위해 사용된 배수체 세포는 적어도 2개의 영양 인자에 대해 영양요구성이고 적어도 2가지 항생제에 내성이다. 바람직하게는, 배수체 세포는 세포를 각각 우라실 및 트립토판에 대해 영양요구성으로 만드는 ura3-1 대립유전자 및 trp1-1 대립유전자에 대해 동형접합성 (homozygous)이다. 또한, 형질전환을 위해 사용된 배수체 세포는 이들을 각각 카나바닌 및 시클로헥시미드에 내성으로 만드는 can1-100 대립유전자 및 cyh2R 대립유전자에 대해 동형접합성인 것이 바람직하다.
특히, 대립유전자 ura3-1, trp1-1, can1-100 및 cyh2R에 대해 동형접합성이고 msh2::KanMX 돌연변이에 대해 이형접합성인 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 균주 MXY47의 배수체 세포가 형질전환을 위해 사용되는 것이 바람직하다. 균주 MXY47의 배수체 세포가 재조합 카세트 및 그들의 인접하는 표적화 서열을 갖는 절제된 제1 또는 제2 단편을 사용하는 형질전환을 위해 사용되면, 수득된 형질전환체는 포자형성되어, 각각의 재조합 카세트를 포함하는 반수체 야생형 또는 msh2 분리개체 (segregant)를 생성시킬 수 있다.
본 발명에 따라, 본 발명의 방법을 위해 기능적 미스매치 복구 시스템을 갖는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 미스매치 복구 시스템은 복제시 DNA 폴리머라제 오류에 의한 돌연변이를 방지하는데 최대로 기여한다. 또한, 미스매치 복구는 유전자 재조합의 충실도를 변경시켜 유전자 안정성을 촉진시킨다. 따라서, 미스매치 복구 기구가 분기된 (diverged) 서열 사이의 재조합에 대한 다소의 억제 효과를 갖는다는 사실이 잘 알려져 있다. 그러나, 정상 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 배수체에서 미스매치 복구-의존성 재조합으로 불리는 미스매치 복구의 다른 특징이 보고되었다 (Borts and Haber, Science, 237 (1987), 1459-1465). 분기된 (diverged) 서열에서와 같이 멀리 이격된 미스매치의 미스매치 복구는 제2 라운드의 (미스매치 복구-의존) 재조합을 자극할 수 있는 새로운 이중가닥 절단을 야기하는 것으로 생각된다. 따라서 특정 환경에서, 특히, 사용된 2개의 재조합 기질이 멀리 이격된 염기 차이를 갖는 것으로 알려질 때, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 기능적 미스매치 복구 시스템을 갖는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포를 사용하는 것이 유용하다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서, 미스매치 복구 시스템이 결핍된 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포가 사용된다. 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)에서, 그의 산물이 MutS 단백질, 즉 Msh1, Msh2p, Msh3p, Msh4, Msh5 및 Msh6p의 6개의 상동체, 및 MutL 단백질, 즉 Mlh1p, Plh2p, Mlh3p 및 Pms1의 4개의 상동체를 포함하여 세균 미스매치 복구 단백질과 상동성을 공유하는 복수개의 유전자가 확인되었다. 특히 PMS1 및 MSH2 유전자가 분기된 (diverged) 서열의 재조합에 대한 장벽을 확립한다고 알려져 있다. 따라서, msh2 및 pms1 돌연변이체에서, 분기된 (diverged) 서열 사이의 감수분열 재조합이 야생형 세포에서의 재조합 빈도에 비해 증가한다.
본 발명의 측면에서, 용어 "미스매치 복구 시스템이 결핍된"은 세포의 미스매치 복구 시스템 (MMR)이 일시적으로 또는 영구적으로 손상됨을 의미한다. 세포 또는 유기체의 MMR 결핍은 미스매치 복구에 관련된 하나 이상의 유전자의 돌연변이, MMR의 전반적인 손상을 일으키는 UV광과 같은 물질을 사용하는 처리, MMR 시스템을 일시적으로 포화시키고 불활성화시키도록 2-아미노푸린과 같은 물질 또는 과량의 미스매치를 함유하는 이종이중체 (heteroduplex)를 사용하는 처리, 및 감수분열 동안 일시적 불활성화를 허용하지만, 증식적 성장 동안에는 허용하지 않는, 예를 들어 조절가능 프로모터를 통한 미스매치 복구에 관련된 하나 이상의 유전자의 유도가능 발현 또는 억제를 포함하지만 이로 제한되지 않는, 미스매치 복구를 일시적으로 또는 영구적으로 손상시키는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포의 미스매치 복구 결핍은 MMR에 관여된 적어도 하나의 유전자의 돌연변이 때문이다. 바람직한 실시태양에서, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에는 MSH2 유전자가 결핍된다. 바람직하게는, 배수체 세포는 msh2 대립유전자에 동형접합성이고, 여기서 MSH2 코딩 서열은 KanMX 구성물로 교체된다.
본 발명의 측면에서, 용어 "재조합 카세트"는 적어도 2개의 상이한 마커 서열에 인접하는, 적어도 하나의 재조합 기질 또는 재조합시킬 하나의 DNA 서열을 포함하는 DNA 서열을 나타낸다. 제1 및 제2 재조합 카세트는 재조합시킬 DNA 서열 및 인접 마커 서열에서 상이하여, 임의의 재조합 카세트쌍은 2개의 상이한 재조합시킬 DNA 서열 및 적어도 4개의 상이한 인접 마커 서열을 포함하게 된다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 제1 및 제2 재조합 카세트는 모두 재조합시킬 각각의 DNA 서열을, 클로닝 비히클 상에 가까이 위치하고 다시 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 규정된 로커스에 상동성인 표적화 서열로 둘러싸인 2개의 마커 서열 사이에 삽입함으로써 생성된다. 따라서, 표적화 서열은 재조합 카세트를 함유하는 절제된 단편의 상기 규정된 로커스 내로의 통합을 지시할 수 있다. 재조합시킬 DNA를 2개의 마커 서열 사이에 삽입하는 것은 바람직하게는 유전공학적 방법에 의해 수행된다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 클로닝 비히클 내의 2개의 마커 서열은 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 염색체 III 상의 BUD31-HGM1 로커스에 상동성인 표적화 서열에 인접한다. 따라서, 표적화 서열은 재조합 카세트를 함유하는 절제된 단편의 상기 로커스 내로의 통합을 지시한다.
본 발명의 측면에서, 용어 "재조합시킬 DNA 서열" 및 "재조합 기질"은 감수분열 재조합 방법의 결과로서 재조합될 수 있는 임의의 2개의 DNA 서열을 의미하고, 그에 의해 이들 서열 사이의 재조합은 상동성 또는 비상동성 재조합으로 인한 것일 수 있다.
몇몇 종류의 상동성 재조합 사건은 손상된 DNA 스트랜드와 상동성 파트너 사이의 염기 페어링 (pairing)을 특징으로 하고, 여기서 상호작용 정도는 수백개의 거의 완벽하게 매칭된 염기쌍을 포함할 수 있다. 용어 "상동성"은 2개의 핵산 분자의 서열 사이에 존재하는 동일성의 정도를 나타낸다. 이와 대조적으로, 변칙 (illegitimate) 또는 비상동성 재조합은 상보성 염기쌍을 공유하지 않거나 약간만 공유하는 DNA의 말단 연결을 특징으로 한다. 효모에서, 비상동성 복구 및 재조합 사건은 상동성 재조합 사건보다 유의하게 더 낮은 빈도로 일어난다.
제1 및 제2 재조합시킬 DNA 서열은 분기된 (diverging) 서열, 즉 동일하지 않지만 일정 정도의 상동성을 보이는 서열이다. 이는 재조합시킬 DNA 서열이 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 분기하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 재조합시킬 DNA 서열은 매우 짧을 수 있는, 적어도 하나 이상의 상동성 영역을 공유하는 서열이다. 상동성 영역은 적어도 5-10 뉴클레오티드, 바람직하게는 20-30 초과의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 30-40 초과의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 50 초과의 뉴클레오티드를 포함해야 한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 재조합시킬 제1 및 제2 DNA 서열은 적어도 하나의 뉴클레오티드에 의해 특히 0.1% 초과, 바람직하게는 5% 초과 내지 50% 초과로 분기한다. 이는 제1 및 제2 재조합시킬 DNA 서열이 또한 55%, 60%, 65% 또는 그 이상 분기할 수 있음을 의미한다.
재조합 기질 또는 재조합시킬 DNA 서열은 천연 또는 합성 기원에서 유래할 수 있다. 따라서, 재조합시킬 DNA 서열은 바이러스, 세균, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)를 포함한 진균, 동물, 식물 및 인간을 포함하는 임의의 천연 출처로부터 유래할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 재조합시킬 제1 및 제2 DNA 서열은 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 이외의 유기체로부터 유래한다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 재조합시킬 DNA 서열은 단백질-코딩 서열, 예를 들어 천연 및 비천연 화합물의 공업적 생산에 사용될 수 있는 효소를 코딩하는 서열이다. 효소 또는 효소에 의해 생산된 화합물은 약품, 화장품, 식품 등의 제조에 사용될 수 있다. 단백질-코딩 서열은 또한 인간 및 동물 건강 분야에서 치료 용도를 갖는 단백질을 코딩하는 서열일 수 있다. 의학적으로 중요한 단백질의 중요한 종류는 시토킨 및 성장인자를 포함한다. 단백질 코딩 서열의 재조합은 변경된, 바람직하게는 개선된 기능 및(또는) 새로 획득한 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 새로운 돌연변이된 서열을 생성시킨다. 이러한 방식으로, 예를 들어, 단백질의 열안정성의 개선의 달성 및(또는) 단백질의 기질 특이성의 변화 및(또는) 그의 활성의 개선 및(또는) 새로운 효소 부위의 발생 및(또는) 2개의 상이한 효소로부터 도메인의 융합이 가능하다. 재조합시킬 단백질 코딩 DNA 서열은 자연 환경에서 유사하거나 동일한 기능을 갖는 동일하거나 유사한 단백질을 코딩하는 상이한 종으로부터의 서열을 포함할 수 있다. 재조합시킬 단백질 코딩 DNA 서열은 동일한 단백질 또는 효소 패밀리로부터의 서열을 포함할 수 있다. 재조합시킬 단백질 코딩 서열은 또한 상이한 기능을 갖는 단백질을 코딩하는 서열, 예를 들어 주어진 대사 경로의 상이한 단계를 촉매하는 효소를 코딩하는 서열일 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 재조합시킬 제1 및 제2 DNA 서열은 B-락타마제의 Oxa 수퍼패밀리의 유전자 서열의 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서, 재조합시킬 DNA 서열은 비코딩 서열, 예를 들어 그의 자연 세포 환경 내에서 단백질-코딩 서열의 발현의 조절에 관여하는 서열이다. 비코딩 서열의 예는 프로모터 서열, 리보좀 결합 부위를 함유하는 서열, 인트론 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 상기 비코딩 서열을 재조합함으로써, 세포 환경에서 세포 과정의 변경된 조절 - 예를 들어, 유전자의 변경된 발현을 일으키는 돌연변이된 서열을 발생시킬 수 있다.
본 발명에 따라, 재조합 기질 또는 재조합시킬 DNA 서열은 물론 하나 이상의 단백질 코딩 서열 및(또는) 하나 이상의 비코딩 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 기질은 하나의 단백질 코딩 서열 + 하나의 비코딩 서열 또는 상이한 단백질 코딩 서열 및 상이한 비코딩 서열의 조합을 포함할 수 있다. 따라서 본 발명의 다른 실시태양에서, 재조합시킬 DNA 서열은 개재하고(하거나) 인접하는 비코딩 서열과 코딩 서열의 하나 이상의 스트레치로 이루어질 수 있다. 이는 재조합시킬 DNA 서열이 예를 들어, 그의 5'-말단 및(또는) 비번역 3'-영역에서 조절 서열을 갖는 유전자 서열, 또는 엑손/인트론 구조를 갖는 포유동물 유전자 서열일 수 있음을 의미한다. 본 발명의 또다른 실시태양에서, 재조합시킬 DNA 서열은 생합성 경로 또는 오페론 (operon)에 속할 수 있는 것과 같은, 개재하는 비코딩 서열을 갖는 단일 코딩 서열보다 더 많은 서열을 함유하는 보다 큰 연속 스트레치로 이루어질 수 있다. 재조합시킬 DNA 서열은 이미 하나 이상의 재조합 사건, 예를 들어 상동성 및(또는) 비상동성 재조합 사건을 겪은 서열일 수 있다.
재조합 기질은 돌연변이되지 않은 야생형 DNA 서열 및(또는) 돌연변이된 DNA 서열을 포함할 수 있다. 따라서 바람직한 실시태양에서, 새로운 돌연변이된 서열을 발생시키도록 야생형 서열을 이미 존재하는 돌연변이된 서열과 재조합시킬 수 있다.
본 발명의 측면에서, 용어 "마커 서열"은 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae) 세포에서 재조합 기질 또는 이미 재조합된 DNA 서열의 상류 또는 하류에 위치하는 독특한 DNA 서열을 나타낸다. 재조합 기질 또는 이미 재조합된 DNA 서열로서 DNA의 동일한 분자 상에 마커 서열의 존재는 바람직하게는 재조합 기질의 다른 면 상에 위치하는 다른 마커 서열과 조합하여, 재조합 기질 또는 이미 재조합된 DNA 서열이 분자적 또는 유전적 방법에 의해 인식되고 선택될 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명의 한 바람직한 실시태양에서, 각각의 재조합 기질의 상류에 하나 이상의 마커 서열 및 각각의 재조합 기질의 하류에 하나 이상의 마커 서열이 존재하여, 2개의 상이한 재조합 기질에 이형접합성인 세포에서, 적어도 4개의 상이한 마커 서열이 함께 존재하도록 해야 한다. 상기 배열은 재조합 기질을 포함한 크로스오버 (crossover)의 선택을 허용한다. 이는 또한 추가 라운드의 재조합이 반복 방식으로 수행될 수 있도록 한다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서, 2 이상의 마커는 재조합 기질의 임의의 면 상에 놓일 수 있다. 예를 들어, 부가적인 마커가 선택의 엄격함을 증가시키기 위해 도입될 수 있다.
마커 서열은 단백질-코딩 또는 비코딩 DNA 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 단백질 코딩 마커 서열은 영양 마커, 안료 마커, 항생제 내성 마커, 항생제 감수성 마커, 및 둘 이상의 서브유닛이 동일한 세포에서 발현되는 경우에만 기능하는 효소의 상이한 서브유닛을 코딩하는 서열로 이루어진 군 중에서 선택된다. 본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서, 분자 비코딩 마커 서열은 프라이머 인식 부위, 즉 PCR 프라이머가 그에 대해 어닐링하고 재조합체의 증폭을 허용하는 서열, 인트론/엑손 경계, 프로모터 서열, 하류 조절된 유전자 서열 또는 제한효소 부위를 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
"영양 마커"는 유기체 또는 세포의 영양요구성을 보충(compensation)할 수 있어서 그 영양요구성 유기체 또는 세포에 독립영양성 (prototrophy)을 부여할 수 있는 유전자 생성물을 코딩하는 마커 서열이다. 본 발명의 측면에서, 용어 "영양요구성"은 유기체 또는 세포를 영양요구성 유기체 자체에 의해 합성될 수 없는 필수 영양소를 함유하는 배지에서 성장시켜야 한다는 것을 의미한다. 영양 마커 유전자의 유전자 생성물은 영양요구성 세포에 없는 상기 필수 영양소의 합성을 촉진한다. 따라서, 영양 마커 유전자의 발현시, 유기체 또는 세포가 획득된 독립영양성을 가지므로 상기 필수 영양소를 유기체 또는 세포가 성장하는 배지에 첨가할 필요가 없다.
"안료 마커"는 유전자 생성물이 그 발현시에 안료 마커가 발현되는 세포를 염색시킬 안료의 합성에 관여하는 마커 유전자이다. 안료 마커를 갖지 않는 세포는 안료를 합성하지 않고 따라서 염색되지 않는다. 따라서, 안료 마커는 안료 마커를 함유하는 세포의 신속한 표현형 검출을 허용한다.
"항생제 내성 마커"는 유전자 생성물이 그 발현시에 항생제 마커 유전자의 발현이 일어나는 세포에 주어진 농도의 주어진 항생제의 존재 하에 성장하는 능력을 제공하는 마커 유전자인 반면, 항생제 내성 마커가 없는 세포는 성장할 수 없다.
"항생제 감수성 마커"는 유전자 생성물이 그 발현시에 주어진 농도에서 주어진 항생제의 존재 하에 성장하는 세포의 능력을 파괴하는 마커 유전자이다.
본 발명의 바람직한 실시태양에서, 제1 및 제3 마커 서열의 각각의 유전자 생성물은 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포의 영양요구성을 보충할 수 있다. 바람직하게는,제1 마커 서열은 URA3이고, 그의 유전자 생성물은 우라실 영양요구성 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에 우라실 독립영양성을 부여할 수 있다. 바람직하게는, 제3 마커 서열은 TRP1이고, 그의 유전자 생성물은 트립토판 영양요구성 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에 트립토판 독립영양성을 부여할 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서, 제2 및 제4 마커 서열의 유전자 생성물은 항생제에 내성인 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에 항생제에 대한 감수성을 부여한다. 바람직하게는, 제2 마커 서열 CAN1이고, 그의 유전자 생성물은 카나바닌 내성 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에 카나바닌에 대한 감수성을 부여할 수 있다. 바람직하게는, 제4 마커 서열은 CYH2이고, 그의 유전자 생성물은 시클로헥시미드 내성 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에 시클로헥시미드에 대한 감수성을 부여할 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시태양에서, 마커 서열은 PCR 프라이머에 대한 어닐링 부위를 포함한다. 바람직하게는, 제1, 제2, 제3 및 제4 마커 서열은 프라이머 KNS11, KNS28, KNS16 및 KNS29에 의해 인식된다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시태양에서, 제1, 제2, 제3 또는 제4 재조합된 DNA 서열을 갖는 재조합 카세트를 함유하는 반수체 세포는 각각의 마커 조합의 존재를 검출하기 위해 PCR 공정에 의해 확인할 수 있다.
본 발명의 방법의 다른 바람직한 실시태양에서, 제1, 제2, 제3 또는 제4 재조합된 DNA 서열을 갖는 재조합 카세트를 함유하는 반수체 세포는 동일한 DNA 분자 상에 각각의 마커 조합의 존재에 대해 선택하는 배지 상에 반수체 세포를 플레이팅함으로써 확인한다. 이는 제1 재조합된 DNA 서열을 함유하는 반수체 세포를 제1 및 제4 마커 서열의 존재에 대해 선택하는 배지 상에 플레이팅하는 것을 의미한다. 제2 재조합된 DNA 서열을 함유하는 반수체 세포는 제2 및 제3 마커 서열의 존재에 대해 선택하는 배지 상에 플레이팅한다. 제3 재조합된 DNA 서열을 함유하는 반수체 세포는 제1 및 제2 마커 서열의 존재에 대해 선택하는 배지 상에 플레이팅한다. 제4 재조합된 DNA 서열을 함유하는 반수체 세포는 제3 및 제4 마커 서열의 존재에 대해 선택하는 배지 상에 플레이팅한다.
본 발명의 다른 측면은 신규하거나 개선된 기능 및 특성을 갖는 신규한 단백질, 효소, 경로 및 비코딩 서열을 생성시키는 방법에 관한 것이고, 그에 의해 공지의 단백질-코딩 서열 또는 공지의 비코딩 서열이 에스. 세레비시애(S. cerevisiae)에서 재조합 DNA 서열을 생성하고 검출하는 본 발명의 방법을 사용함으로써 하나 이상의 재조합 라운드로 처리된다.
본 발명의 다른 측면은 플라스미드 pMXY9에 관한 것이다. 플라스미드 pMXY9는 인접하게 위치하는 URA3 마커 유전자 및 CAN1 마커 유전자를 포함한다. 2개의 마커 유전자 사이에, 재조합시킬 DNA 서열을 삽입하기 위한 몇몇 제한 부위를 포함하는 폴리링커 (polylinker) 서열이 배열된다. 2개의 마커는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 염색체 III 상의 BUD31-HCM1 로커스에 상동성인 표적화 서열에 인접한다. 2개의 마커 유전자 사이의 폴리링커 서열은 제한효소 SmaI, XbaI, BglII 및 PacI에 대한 제한 부위를 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 플라스미드 pMXY12에 관한 것이다. 플라스미드 pMXY12는 인접하게 위치하는 TRP1 마커 유전자 및 CYH2 마커 유전자를 포함한다. 2개의 마커 유전자 사이에, 재조합시킬 DNA 서열을 삽입하기 위한 몇몇 제한 부위를 포함하는 폴리링커 서열이 배열된다. 2개의 마커는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 염색체 III 상의 BUD31-HCM1 로커스에 상동성인 표적화 서열에 인접한다. 폴리링커 서열은 제한효소 SpeI, SmaI 및 PacI에 대한 제한 부위를 포함한다.
본 발명은 또한 그의 배수체 세포가 대립유전자 ura3-1, trp1-1, can1-100 및 cyh2R에 대해 동형접합성이고 msh2::KanMX 돌연변이에 대해 이형접합성인 것을 특징으로 하는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 균주 MXY47에 관한 것이다.
본 발명은 또한 플라스미드 pMXY9를 함유하는 이. 콜라이 (E. coli) 균주 JM101, 및 플라스미드 pMXY12를 함유하는 이. 콜라이 균주 DH5α에 관한 것이다.
플라스미드 pMXY9 및 pMXY12 및 사카로마이세스 세레비시애 균주 MXY47은 2005년 1월 3일에 DSMZ (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, 독일 브라운슈바이크 마스케로더베크 1베)에 각각 기탁 번호 DSM 17010, DSM 17011 및 DSM17026으로 기탁하였다.
본 발명의 다른 측면은 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서 재조합된 DNA 서열을 생성하고 검출하는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 사용할 수 있는 키트에 관한 것이다. 제1 실시태양에서, 키트는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 균주 MXY47의 세포를 함유하는 제1 용기, 플라스미드 pMXY9를 갖는 이. 콜라이 균주 JM101의 세포를 함유하는 제2 용기, 플라스미드 pMXY12를 갖는 이. 콜라이 균주 DH5α의 세포를 함유하는 제3 용기를 적어도 포함한다.
제2 실시태양에서, 키트는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 균주 MXY47의 세포를 함유하는 제1 용기, 플라스미드 pMXY9의 DNA를 함유하는 제2 용기, 및 플라스미드 pMXY12의 DNA를 함유하는 제3 용기를 적어도 포함한다.
본 발명은 아래 서열 목록, 도면 및 실시예로 설명한다.
도 1은 규정된 배지 상에서 재조합체의 선택을 위한 선택 시스템의 개략도를 도시한다. 재조합 카세트에 대해 이형접합성인 배수체 모체 세포 - 여기서, URA3 및 CAN1 유전자에 인접하는 재조합 기질 A, 및 TRP1 및 CYH2 유전자에 인접하는 재조합 기질 B -를 감수분열하도록 유도한다. 포자는 재조합 세포 3 및 4에 대해 선택하기 위해 우라실이 결핍되고 카나바닌을 함유하는 배지 (-Ura+Can), 및 트립토판이 결핍되고 시클로헥시미드를 함유하는 배지 (-Trp+Cyh) 상에 플레이팅하고, 여기서 (+)로 표시된 바와 같이 재조합 기질 A 및 B를 포함하는 크로스오버가 일어난다. 모체 배수체 및 비-재조합 반수체 1 및 2는 (-)로 표시된 바와 같이 이들 배지 상에서 성장할 수 없다. 후속 감수분열 라운드에서는 포자형성될 때, 세포 1 및 2에 나타낸 바와 동일한 인접 마커 구성체를 갖는 새로운 재조합 세포를 생성하는 새로운 배수체를 구성하기 위해 재조합체 3 및 4를 사용할 수 있다. 이들 구성체를 갖는 재조합 포자 콜로니는 각각 우라실이 결핍되고 시클로헥시미드를 함유하는 배지 (-Ura+Cyh), 및 트립토판이 결핍되고 카나바닌을 함유하는 배지 (-Trp+Can) 상에서 선택될 수 있다.
도 2는 재조합 카세트를 효모 게놈의 염색체 III 상의 BUD31-HCM1 로커스에 표적화하기 위해 사용된 벡터인 플라스미드 pMXY9 및 pMXY12 (상기)를 도시한다. 두 플라스미드는 상기 로커스에 상동성인 서열을 갖고 (5' 및 3'으로 표시된), 이들은 URA3 및 CAN1 마커 (pMXY9) 또는 TRP1 및 CYH2 (pMXY12) 마커에 인접한다. 재조합 기질을 클로닝하는 것을 허용하는 제한 부위를 갖는 짧은 서열이 각 마커 서열쌍 사이에 위치한다. 아래는 재조합 카세트의 BUD31-HCM1 로커스 내로의 통합이다. 재조합 기질 A를 갖는 pMXY9 유도체를 NotI로 소화시켜 5' 및 3' 표적화 서 열에 인접하는 재조합 카세트를 유리시키고, 소화 생성물을 MXY47 세포 내로 형질전환시킨다. 정확하게 표적화된 삽입체를 갖는 Ura+ 유도체는 재조합 카세트에 이형접합성인 균주를 제작하는데 후속적으로 사용하기 위해 확인한다. TRP1 및 CYH2 마커를 갖는 재조합 카세트는 pMXY12에서 유사하게 제작되고 MXY47 내로 형질전환된 후, 트립토판 독립영양성에 대해 선택한다.
도 3은 Oxa 유전자 사이의 재조합의 빈도를 야생형 및 msh2 균주에서 서열 동일성의 함수로서 도시한다. 위는 (n) 독립 실험의 평균±표준 편차를 제공한다. 아래는 이들 데이타의 그래프이다. 다음 균주를 사용하였다: MXY60, MXY62, MXY64, MXY66, MXY99 및 MXY102.
도 4는 msh2 하이퍼(hyper)-재조합 효과를 도시한다. msh2/wt 비율은 공유된 Oxa 상동성의 주어진 백분율을 갖는 균주쌍에 대해 및 각각의 선택 조건에 대해 각각의 독립 실험 (총수 = n)에 대해 계산하고, 이들 합한 값의 평균±표준 편차를 나타낸다. 아래에 데이타를 그래프로 나타낸다. 다음 균주쌍을 사용하였다: MXY60과 MXY62, MXY64와 MXY66, MXY99와 MXY102.
도 5는 78% 상동성을 공유하는 Oxa 서열 사이의 재조합의 PCR 분석을 도시한다. 포자 콜로니는 야생형 (MXY99) 및 msh2 (MXY102) 배수체로부터 우라실이 결핍되고 카나바닌을 함유하는 배지 상에서 또는 트립토판이 결핍되고 시클로헥시미드를 함유하는 배지 상에서 선택에 의해 유도되었다. 크로스오버 재조합체에 대해 예상되는 것과 일치하는 표현형을 나타낸 선택된 포자 콜로니에서 콜로니 PCR을 수행하였다. 위에서, 각각의 야생형 및 msh2 Ura+CanR 후보물에 대해 2개의 반응을 수행하였고, 하나는 모체-특이적 프라이머쌍 (KNS16+ KNS28, 각 후보물에 대한 제1의 각각의 레인쌍에 나타낸 생성물)을 갖고, 다른 하나는 재조합체-특이적 프라이머쌍 (KNS16 + KNS29, 제2 레인)을 갖는다. 아래에서, 각각의 야생형 및 msh2 Trp+CyhR 후보물에 대해 유사한 반응을 수행하였고, 하나는 모체-특이적 프라이머쌍 (KNS11 + KNS29, 제1 레인)을 갖고, 다른 하나는 재조합체-특이적 프라이머쌍 (KNS11 + KNS28, 제2 레인)을 갖는다. 모체 (P) 또는 재조합 (R)의 인접 마커 서열의 공지의 구성체를 함유하는 적절한 게놈 DNA 템플레이트에서 비교 반응을 수행하였다. (-)는 DNA 대조군이 없다.
도 6은 제2-라운드 재조합에 대한 재조합의 빈도를 도시한다. MXY64 및 MXY66을 사용하는 제1 라운드의 재조합 후 수득한 야생형 및 msh2 반수체를 교배시켜, 모자이크 Oxa7-Oxa11 재조합 카세트를 갖는 야생형 (MXY81, MXY82 및 MXY83) 및 msh2 (MXY86, MXY87 및 MXY88) 배수체를 생산하였다. Oxa11 재조합 기질에 대해 동형접합성인 야생형 (MXY90) 및 msh2 (MXY92) 배수체를 또한 MXY60 및 MXY62의 재조합 자손체로부터 제작하였다. 모든 배수체를 포자형성시키고, 포자를 Ura+CanR 및 Trp+CyhR 재조합체에 대해 선택하기 위해 배지 상에 플레이팅하였다.
서열 목록은 하기 서열들을 포함한다:
서열 1 및 2는 MSH2의 증폭을 위한 프라이머 MSH2UP 및 MSH2DN의 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열 3 내지 서열 6은 MSH2-특이적 분석 프라이머인, 프라이머 MSH2A1, MSH2A2, MSH2A3 및 MSH2A4의 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열 7 및 서열 8은 KanMX-특이적 분석 프라이머인, 프라이머 K2KANMX 및 K3KANMX의 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열 9 및 서열 10은 LEU2의 증폭을 위해 사용되는, 프라이머 LEU2UP 및 LEU2DN의 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열 11 및 서열 12는 HIS3의 증폭을 위해 사용되는, 프라이머 HIS3UP 및 HIS3DN의 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열 13 및 서열 14는 3' 표적화 서열의 증폭을 위해 사용되는, 프라이머 KNS1 및 KNS2의 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열 15 내지 서열 17은 5' 표적화 서열의 증폭을 위해 사용되는, 프라이머 KNS3, KNS4 및 KNS6의 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열 18 및 서열 19는 Oxa7의 증폭을 위해 사용되는, 프라이머 KNS7 및 KNS8의 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열 20 및 서열 21은 Oxa11의 증폭을 위해 사용되는, 프라이머 KNS9 및 KNS10의 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열 22는 BUD31 하류 분석 프라이머인, 프라이머 KNS12의 서열을 나타낸 것이다.
서열 23은 BUD31 상류 분석 프라이머인, 프라이머 KNS13의 서열을 나타낸 것이다.
서열 24는 TRP1-특이적 분석 프라이머인, 프라이머 KNS14의 서열을 나타낸 것이다.
서열 25는 URA3-특이적 분석 프라이머인, 프라이머 KNS15의 서열을 나타낸 것이다.
서열 26 및 서열 27은 CYH2의 증폭을 위해 사용되는, 프라이머 KNS17 및 KNS18의 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열 28은 서열결정 프라이머로서 사용되는 TRP1-특이적 전방향 프라이머인, 프라이머 KNS30의 서열을 나타낸 것이다.
서열 29는 서열결정 프라이머로서 사용되는 CAN1-특이적 역방향 프라이머인, 프라이머 KNS31의 서열을 나타낸 것이다.
서열 30은 서열결정 프라이머로서 사용되는 CYH2-특이적 역방향 프라이머인, 프라이머 KNS33의 서열을 나타낸 것이다.
서열 31 및 서열 32는 Oxa5의 증폭을 위해 사용되는, 프라이머 KNS36 및 KNS37의 서열을 각각 나타낸 것이다.
서열 33은 서열결정 프라이머로서 사용되는 URA3-특이적 전방향 프라이머인, 프라이머 KNS38의 서열을 나타낸 것이다.
사카로마이세스 세레비시애( Saccharomyces cerevisiae ) 미스매치 복구 돌연변이체에서 모자이크 유전자의 생성
1. 재료 및 방법
1.1 배지
표준 풍부 배지 YPD (바이오101 (Bio101))를 일상적인 성장을 위해 사용하 고, 합성 부족 (dropout) 배지 (바이오101)를 유전 마커를 모니터하고 재조합체의 선택을 위해 사용하였다. 포자형성을 위해, 세포를 SPS (50 mM 칼륨 프탈레이트, pH 5.0, 0.5% 효모 추출물 (딥코 (Difco)), 1% 박토펩톤 (Bactopeptone) (딥코), 0.17% 효모 질소 베이스, 1% 아세트산칼륨, 0.5% 황산암모늄) + 요구되는 영양 보충물에서 밤새 예비배양하고, 세척하고, 1% 아세트산칼륨 + 보충물에 재현탁하고 2일 동안 진탕하면서 인큐베이팅하였다. 모든 조작은 30℃에서 수행하였다. 테트라드 (tetrad) 분석을 위해, 자낭 (asci)을 헬릭스 포마티아 (Helix pomatia) B-글루쿠로니다제 (시그마 (Sigma))로 소화시키고 TDM400 미세조작기 (마이크로 비데오 인스트루먼츠, 인크. (Micro Video Instruments, Inc.))가 장치된 니콘 이클립스 (Nikon Eclipse) E400 현미경을 사용하여 절개하였다. 다른 유전적 방법은 문헌 [Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (1998), John Wiley and Sons, Inc., New York]에 기재된 바와 같이 수행하였다. 모든 효모 형질전환은 문헌 [Agatep et al., Technical Tips On-line (http://tto.trends.com)]에 따른 LiAc 방법을 사용하여 수행하였다.
1.2. 효모 균주
본 연구에서 사용되거나 생성된 모든 효모 균주를 표 1 및 표 2에 나열한다. 모든 효모 균주는 즉시 포자형성하는 W303 배경의 동질유전자 유도체이다. 재조합 카세트를 갖는 형질전환용 숙주로서 역할을 하는 배수체 MXY47은 다음과 같이 형질전환 및 유전적 교배에 의해 제작하였다. 반수체 D184-1B (에스. 갱로프 (S. Gangloff, CEA, 프랑스)의 기증물)를 LEU2 단편 (W303 균주 U474를 서열 목록에 나 열된 프라이머쌍 LEU2UP/LEU2DN을 사용하여 예비적 PCR시켜 얻음)로 형질전환시켜 Leu+ 반수체 MXY13을 생성하였다. 반수체 D184-1C (에스. 갱로프의 기증물)를 HIS3 단편 (ORD4369-25D를 프라이머쌍 HIS3UP/HIS3DN을 사용하여 예비적 PCR시켜 얻음)으로 형질전환시켜 His+ 반수체 MXY25를 생성하였다. 반수체 MXY18 및 MXY22는 각각 10 ㎍/ml 시클로헥시미드 상에서 선택된 D184-1B 및 D184-1C의 열성 시클로헥시미드-내성 (cyh2R) 유도체이고; 시클로헥시미드 내성을 부여하는, CYH2 로커스에 맵핑(mapping)되는 돌연변이의 존재는 서열분석 (글루타민 38을 라이신으로 변화시키는 2개의 상이한 뉴클레오티드 변경) 및 분리 분석에 의해 확인하였다. MXY18 및 MXY25를 교배하여 배수체 MXY29를 얻고; MXY13 및 MXY22를 교배하여 배수체 MXY33을 얻었다. 반수체 분리개체 MXY29-6D 및 MXY33-8C을 교배하여, leu2-3, 112 및 his3-11,15 마커에 대해 이형접합성이고 cyh2R 돌연변이에 대해 동형접합성인 MXY38을 얻었다. MXY38을 프라이머 MSH2UP 및 MSH2DN을 사용하여 RBT348 (알. 보어츠 (R. Borts, 레스터 대학교)의 기증물)로부터 PCR에 의해 증폭된 msh2::KanMX 카세트로 형질전환시켜 MXY47을 얻었다. 형질전환체를 200 ㎍/ml G418 (인비트로겐 (Invitrogen)) 상에서 선택하고, 프라이머 MSH2A1, MSH2A2, MSH2A3 및 MSH2A4를 사용하는 콜로니 PCR (하기 참조)에 의해 및 마커 분리를 확인하기 위해 테트라드 분석, 즉 4개의 포자의 분석에 의해 확인하였다.
Figure 112006062363235-PCT00001
Figure 112006062363235-PCT00002
Figure 112006062363235-PCT00003
Figure 112006062363235-PCT00004
Figure 112006062363235-PCT00005
1.3 플라스미드 제작
세균 균주 XL1-Blue MRF'(ΔmcrA)183(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F' proAB laclqZΔM15 Tn10 (Tetr)]) 및 JM110 (rpsL [Strr] thr leu thi-1 lacY galK galT ara tonA tsx dam dcm supE44 Δ[lac-proAB] [F' traD36 proAB laclqZΔM15])을 클로닝을 위한 숙주로서 사용하였다. 플라스미드 제작을 위해 표준 방법을 사용하였다 (Ausubel et al.). 본 연구에서 사용되거나 생성된 모든 플라스미드를 표 3에 나열한다. 제한효소, T4 DNA 리가제 및 클로닝에 사용된 다른 효소는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England BioLabs)로부터 구입하였다. DNA 단편 및 플라스미드는 퀴아겐 앤드 머셔리-나겔 (Qiagen and Macherey-Nagel)에서 공급된 키트를 사용하여 정제하였다.
BUD31 로커스에 대응하는 상류 ("5' 표적") 서열을 프라이머쌍 KNS3/KNS4를 사용하여 W303 게놈 DNA로부터 예비적 PCR에 의해 증폭하고, KpnI/XhoI 단편으로서 KpnI/XhoI-소화된 pKSII(+) (스트라타젠 (Stratagene)) 내로 클로닝하여 pMXY1을 생성시키고; 하류 ("3' 표적") 표적화 서열을 프라이머쌍 KNS1/KNS2를 사용하여 유사하게 증폭하고 XbaI/NotI 단편으로서 XbaI/NotI-소화된 pKSII(+) (스트라타젠) 내로 클로닝하여 pMXY2를 생성시켰다. TRP9 마커를 pJH53 (알. 보어츠의 기증물)으로부터 BglII/EcoRI 단편으로서 절제하고 BamHI/EcoRI-소화된 pMXY1에 라이게이션시켜 pMXY3을 생성시키고, URA3 마커를 XhoI/HinDIII-소화된 pRED316 (알. 보어츠의 기증물)로부터 절제하고 XhoI/HinDIII-소화된 pMXY1에 라이게이션시켜 pMXY4를 생성시켰다. CAN1 마커를 pRED316으로부터 SmaI 단편으로서 단리하고 HpaI-소화된 pMXY2에 라이게이션시켜 pMXY5를 생성시켰다. pMXY3 및 pMXY4 내의 5' 표적화 서열을 프라이머쌍 KNS4/KNS6을 사용하여 게놈 DNA로부터 재증폭된 서열로 교체하고, KpnI/XhoI 단편으로서 각각의 KpnI/XhoI-소화된 플라스미드 내에 라이게이션시켜 pMXY7 및 pMXY6을 생산하였다. 상기 단계는 클로닝의 후기에 요구되는 제한 부위의 프라이머 KNS3으로부터 부재를 교정하기 위해 취해졌다. 5' 표적 및 URA3 마커를 함유하는 pMXY6의 KpnI-SmaI 단편을 KpnI/SmaI-소화된 pMXY5에 라이게이션시켜 URA3-CAN1 재조합 카세트 벡터 pMXY9를 생산하였다. 5' 표적 및 TRP1 마커를 함유하는 pMXY7의 KpnI/SpeI 단편을 KpnI/SpeI-소화된 pMXY2에 라이게이션시켜 pMXY11을 생산하였다. 마지막으로, CYH2 마커를 프라이머쌍 KNS17/KNS18을 사용하여 W303 게놈 DNA로부터 예비적 PCR에 의해 증폭시키고, BamHI 및 PvuI로 소화시키고, BglII/PacI-소화된 pMXY11에 라이게이션시켜 TRP1-CYH2 재조합 카세트 벡터 pMXY12를 생성시켰다. 모든 플라스미드 구성물은 전기 천공에 의해 세균 숙주 내로 도입하고 제한 분석에 의해 검증하고, pMXY9 및 pMXY12는 모든 클로닝 연결부의 서열분석에 의해 추가로 검증하였다.
B-락타마제 재조합 기질을 Oxa5 (기탁번호 X58272)에 대해 프라이머쌍 KNS36/KNS37, Oxa7 (기탁번호 X75562)에 대해 KNS7/KNS8 및 Oxa11 (기탁번호 Z22590)에 대해 KNS9/KNS10을 사용하여 숙주 플라스미드 (더블유. 쇼엔펠드 (W. Schoenfeld)가 제공함)로부터 예비적 PCR에 의해 증폭하였다. Oxa7 및 Oxa11 PCT 생성물을 PacI로 소화시키고 SmaI/PacI-소화된 pMXY9에 라이게이션시켜 각각 pMXY13 및 pMXY14를 생성시키고, Oxa11 PCT 생성물을 또한 SpeI 및 PacI로 소화시키고 SpeI/PacI-소화된 pMXY12에 라이게이션시켜 pMXY22를 생성시켰다. Oxa5 PCR 생성물을 BamHI 및 PacI로 소화시키고 BglII/PacI-소화된 pMXY9에 라이게이션시켜 pMXY24를 생성시켰다. 모든 구성물은 제한 분석에 의해 검증하였다.
Figure 112006062363235-PCT00006
1.4 재조합체 선택 및 특성화
제1 라운드 재조합을 위해, 재조합 카세트를 갖는 플라스미드를 NotI로 소화시키고, 전체 소화 생성물을 사용하여 MXY47을 형질전환시켰다. 우라실 (pMXY9 유도체에 대해) 또는 트립토판 (pMXY12 유도체에 대해) 독립영양주를 선택하고, 도입된 구성물에 의한 BUD31-HCM1 로커스의 2개의 염색체 카피 중 하나의 표적화를 URA3-CAN1 유도체에 대해 프라이머 KNS12/KNS13/KNS15, 및 TRP1-CYH2 유도체에 대해 프라이머 KNS12/KNS13/KNS14를 사용하는 콜로니 PCR에 의해 확인하였고, 이는 무손상으로부터 및 파괴된 BUD31-HCM1 로커스로부터 단편이 증폭되도록 하였다. 형질전환된 이형접합체는 포자형성되고, 재조합 카세트를 갖는 야생형 또는 msh2 반수체를 확인하기 위해 테트라드 분석을 수행하였다. 반대 교배형의 적절한 반수체를 YPD 플레이트 상에 패치시키고, 밤새 성장시키고, 동일한 YPD 플레이트 상에서 함께 혼합하고, 밤새 교배시켰다. 교배 플레이트를 Ura-Trp 배지에 배양평판 복사배양하여 배수체에 대해 선택하고, 이를 다음날 벌크 (bulk)로 SPS + 보충물 내로 접촉하고 밤새 배양하였다. 예비배양물을 원심분리하고 세척하고, 세포를 1% K 아세테이트 + 보충물에 재현탁시키고 2일 동안 인큐베이팅하였다.
포자형성된 세포를 회수하고, 정량하고, 몇몇 경우 모든 마커의 적절한 분리를 확인하기 위해 절개하였다. 자낭을 자이몰리아제-20T (아이씨엔 바이오메디칼스 (ICN Biomedicals))로 소화시켜 포자를 유리시키고, 포자 현탁액을 초음파처리하고 (브랜슨 모델 (Branson Model) 250 Digital Sonifier), 적절한 희석액을 세포 생존력을 결정하기 위해 YPD 상에, Ura+CanR 재조합체를 선택하기 위해 60 ㎍/ml 카나바닌 (시그마)를 함유하는 우라실 부족 배지 상에, 및 Trp+CyhR 재조합체를 선택하기 위해 3 ㎍/ml 시클로헥시미드 (시그마)를 함유하는 트립토판 부족 배지 상에 플레이팅하였다. 각 배지 상에 나타난 포자 콜로니를 계수하고 표현형 및 분자 시험하여 진성 재조합체를 나타내는지 결정하였다. 표현형 분석을 위해, 대표적인 수의 후보 재조합체를 선택에 사용된 것과 동일한 배지에 재스트리킹한 후, -Ura, -Trp, 시클로헥시미드 (10 ㎍/ml), 카나바닌 (60 ㎍/ml) 및 교배형 시험기 플레이트에 배양평판 복사배양하였다.
포자를 또한 -Ura-Trp 배지 상에 플레이팅하여 각각의 포자 제제에 대한 배수체의 빈도를 결정하였고, 이는 모든 경우에 총 생존 세포의 4% 미만이었다. 분자 분석을 위해, 총 게놈 DNA를 모체 또는 재조합 단편을 특이적으로 증폭시키는 적절한 프라이머쌍을 사용하는 분석적 PCR (하기 참조)로 처리하였다. 주어진 선택에 대한 재조합의 빈도는 주어진 선택 배지 상에서 생존 세포의 빈도로서 표현하고, 이는 위양성 표현형을 나타내는 비-재조합체에 대해 교정하였다. 대부분의 경우, 상기 위양성은 분석적 PCR로 제안되는 바와 같이 CAN1 또는 CYH2 마커의 돌연변이성 불활성화에 의해 발생한다.
제2 라운드 재조합을 위해, 제1 라운드의 재조합으로부터 유래된 적절한 재조합체를 교배시키고, Ura+Trp+ 배수체를 선택하였다. 제1 라운드 재조합과 동일한 포자형성 과정을 따르되, 포자를 YPD 상에, Ura+CyhR 재조합체를 선택하기 위해 시클로헥시미드를 함유하는 우라실 부족 배지 상에, 및 Trp+CanR 재조합체를 선택하기 위해 카나바닌을 함유하는 트립토판 부족 배지 상에 플레이팅하였다. 후보 재조합체를 유사하게 표현형 및 분자 분석하였다.
1.5 분자적 방법
예비적 또는 분석적 PCR을 위한 템플레이트로서 사용된 게놈 DNA는 문헌 [Ausubel et al.]에 따른 표준 미니프렙 (miniprep) 과정에 의해 철야 YPD 배양물로부터 제조하였다. 클로닝에 또는 서열분석을 위해 사용된 단편의 예비적 PCR은 2.5 U 허큘라제 (Herculase) 중합효소(스트라타젠), 1x 허큘라제 반응 완충제, 0.2 mM의 각 dNTP 및 100 ng의 각 프라이머를 함유하는 50 ㎕ 반응물 중에서 템플레이트로서 Oxa 플라스미드 DNA (약 50 pg) 또는 효모 게놈 DNA (약 0.5 ㎍)를 사용하여 수행하였다. 증폭은 다음과 같이 수행하였다: 94℃ 2분; 30 사이클의 94℃ 10초, 55℃ 30초, 72℃ 30초; 68℃ 10분. BUD31 로커스에 재조합 카세트의 통합을 확인하기 위해 95℃ 5분; 35 사이클의 95℃ 1분, 55℃ 1분, 68℃ 1분; 72℃ 10분의 증폭 조건으로 변형 콜로니 PCR 과정을 사용하였다 (http://www.fhcrc.org/labs/hahn/methods/mol bio meth/pcr yeast colony.html). Oxa 삽입물을 특정화하기 위한 분석적 PCR은 약 0.5 ㎍ 게놈 DNA (후보 재조합체 및 대조 균주로부터 제조된), 1.5 U Taq 중합효소 (로슈 (Roche)), 1 x 반응 완충제, 0.2 mM의 각 dNTP 및 100 ng의 각 프라이머를 함유하는 100 ㎕ 반응 부피에서, 연장을 68℃에서 2분 동안 수행하는 것을 제외하고는 콜로니 PCR과 동일한 증폭 조건으로 수행하였다. 모든 증폭 반응은 Mastercycler gradient 5331 (에펜도르프 (Eppendorf))를 사용하여 수행하였다.
재조합 Oxa 삽입물의 서열 분석을 위해, 예비적 PCR을 프라이머쌍 KNS16/KNS29 (Ura+CanR 재조합체에 대해) 또는 KNS11/KNS28 (Trp+CyhR에 대해)을 사용하여 수행한 후, Qiaquick PCR 키트 (퀴아겐)으로 정제하였다. PCR 생성물을 적절하게 프라이머 KNS30, KNS31, KNS33 또는 KNS38을 사용하여 Genome Express (메일란 (Meylan, 프랑스))에 의해 서열분석하였다. 재조합 서열을 Clone Manager 소프트웨어 (사이 에드 센트럴 (Sci Ed Central))를 사용하여 정렬하고 분석하였다. PCR 및 서열분석에 사용된 올리고뉴클레오티드 (표 3)는 프로리고 프랑스 (Proligo France)로부터 구입하였다.
2. 결과
2.1 효모 감수분열 부분상동성 재조합계의 개발
본 발명에 이르러 분기된 DNA 서열 사이에서 생체내 재조합을 촉진하기 위해 효모 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 이용하는 방법을 개발하였다. 상기 방법의 중요한 특징은 높은 수준의 게놈 범위 재조합이 발생하는 감수분열 세포의 사용, 및 분기된 서열 사이의 재조합을 정상적으로 제한하는 미스매치 복구 (MMR) 시스템의 불활성화를 포함한다. 재조합시킬 서열, 즉 재조합 기질을 또한 인접 마커 서열을 갖는 2개의 벡터 중 하나에 도입하여 재조합 카세트를 형성한다. 재조합 카세트를 효모 게놈 내로, 감수분열에서 재조합적으로 활성인 것으로 공지된 영역 내에 있는 염색체 III 상의 로커스 (BUD31-HCM1 간격)에서 도입한다. 재조합 카세트에 대해 이형접합성인 배수체를 포자형성시키고, 인접 마커의 특이적 구성을 갖는 세포를 선택함으로서 재조합 기질을 포함하는 크로스오버가 발생하는 재조합체의 선택을 허용하는 배지 상에 포자를 플레이팅한다 (도 1).
2개의 일반적인 재조합 카세트 벡터, 즉, 재조합 기질의 도입을 위해 사용될 수 있는 제한 부위에 인접하는 URA3과 CAN1, 및 TRP1과 CYH2 마커를 각각 함유하는 pMXY9 및 pMXY12 (도 2)를 제작하였다. URA3 마커는 우라실 독립영양성을 부여하고, CAN1 마커는 카나바닌 감수성을 부여한다. 상기 마커의 부재 하에, 세포는 약물에 내성이다. TRP1 마커는 트립토판 독립영양성을 부여하고, CYH2 마커는 시클로헥시미드 감수성을 부여한다. 상기 마커의 부재 하에, 세포는 약물에 내성이다. 2개의 재조합 카세트는 각각 다시 전능성 세포의 형질전환에 의해 BUD31-HCM1 로커스에 대한 전체 삽입물의 표적화를 허용하는 서열에 인접한다 (도 2). 형질전환을 위한 1차 숙주로서 역할을 하는 균주 MXY47을 또한 제작하였다 (표 2). 상기 배수체는 msh2::KanMX 돌연변이에 대해 이형접합성이고, MMR에 관해 표현형으로는 야생형이다. 이는 또한 재조합 카세트 마커의 존재의 모니터를 허용하도록 ura3-1, trp1-1, can1-100 및 cyh2R 마커에 대해 동형접합성이고, his3-11,15 및 leu2-3,112 마커에 대해 이형접합성이다. MXY47은 재조합 카세트를 갖는 단편을 사용하여 형질전환되고, 1차 형질전환체는 Ura+ 또는 Trp+ 독립영양주 (각각 MXY9 및 MXY12 유도체에 대해)로서 선택되고, 표적화는 도입된 구성물 내부 또는 외부의 서열을 인식하는 프라이머를 사용하는 분석적 PCR에 의해 확인된다. 1차 형질전환체를 포자형성시키고, 테트라드를 절개하고 배양평판 복사배양하여 재조합 카세트를 갖는 야생형 또는 msh2 분리개체를 확인한다. 적합한 반수체를 서로 교배시켜 재조합 기질에 이형접합성인 MSH2/MSH2 (야생형) 및 msh2/msh2 배수체를 생성시킨다. 재조합체를 생성하기 위한 제1 라운드의 감수분열 재조합에서, 이들 배수체를 포자형성시키고, 자유 포자를 URA3-CYH2 구성의 인접 마커를 갖는 재조합체 (Ura+CanR 포자 콜로니)에 대해 선택하기 위해 우라실이 결핍되고 카나바닌을 함유하는 배지 상에, 또는 TRP1-CANI 구성 (Trp+CyhR 포자 콜로니)에 대해 선택하기 위해 트립토판이 결핍되고 시클로헥시미드를 함유하는 배지 상에 플레이팅한다. 모체 배수체 및 비-재조합 반수체 자손체는 상기 배지 상에서 성장할 수 없다. 선택 배지 상에 나타나는 포자 콜로니의 빈도를 측정하고, 후보 재조합 포자 콜로니를 시험 배지 상에 배양평판 복사배양하여 표현형에 대해, 및 적절한 프라이머쌍을 사용하는 PCR에 의해 분자적으로 특성화하고, 확인된 재조합체의 샘플을 서열분석을 위해 선택한다.
재조합 삽입물을 갖는 세포가 확인되고 다양성을 증가시키기 위해 추가 라운드의 감수분열 재조합될 수 있다는 점에서 방법은 반복적이다. 제2 라운드에서, Ura+CanR 및 Trp+CyhR 반수체를 교배하고, 포자형성 및 선택 과정을 반복하되, 새로운 재조합체를 URA3-GAN1 구성의 인접 마커를 갖는 재조합체 (Ura+CyhR 포자 콜로니)에 대해 선택하기 위해 우라실이 결핍되고 시클로헥시미드를 함유하는 배지 상에서, 또는 TRP1-CYH2 구성 (Trp+CanR 포자 콜로니)에 대해 선택하기 위해 트립토판이 결핍되고 카나바닌을 함유하는 배지 상에서 선택한다. 본원에 상세히 설명된 방법은 선택의 엄격성을 증가시키기 위해 추가의 마커를 포함하도록 또한 변형될 수 있다. 또한, 재조합체는 인접하는 서열에 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 직접 선택될 수 있다.
2.2 다양한 서열 분기의 Oxa 유전자쌍 사이의 재조합에 대한 표현형 선택
재조합체의 선택을 위한 시스템의 실행가능성을 시험하기 위해 기질로서 베타-락타마제의 Oxa 수퍼패밀리에 속하는 유전자를 선택하였다. 다음 Oxa쌍 사이의 재조합을 야생형 및 msh2 배경에서 평가하였다: Oxa11-Oxa11, 이는 800 bp ORF 전체에서 100% 상동성을 공유한다; Oxa7-Oxa11, 95%; Oxa5-0xa11, 78%. 적절한 반수체 사이의 교배에 의해 생성된 배수체를 감수분열하도록 유도하였다. 감수분열 배양물로부터 포자를 제조하고, 연속 희석물을 세포 생존력을 결정하기 위해 YPD 상에, 재조합체를 선택하기 위해 우라실이 결핍되고 카나바닌을 함유하는 배지 (-Ura+Can) 상에 및 트립토판이 결핍되고 시클로헥시미드를 함유하는 배지 (-Trp+Cyh) 상에 플레이팅하였다.
2.3 다양한 서열 상동성의 Oxa 유전자 사이의 재조합의 빈도
도 3에 나타낸 데이타는 야생형 배경에서, 서열 이종성의 증가는 크로스오버 재조합에 대해 강한 억제 효과를 갖고, 상기 효과는 msh2 돌연변이에 의해 경감되지만 파괴되지는 않음을 증명한다. 일반적으로, msh2 돌연변이는 시험된 2 수준의 분기에서 야생형 균주에 대해 관찰된 것보다 약 1차수의 규모로 재조합의 빈도를 증가시킨다. 그러나, MSH2 단독의 불활성화는 보다 높은 정도의 이종성을 갖는 재조합 기질들 사이의 재조합의 억제를 충분히 보상하지 않는다. 예를 들어, 78% 상동성을 공유하는 Oxa 삽입물을 갖는 msh2 균주 (MXY102)에 대한 재조합의 빈도는 100% 상동성의 Oxa 삽입물을 갖는 야생형 균주 (MXY60)에 대해 발견된 것보다 적어도 10배 (Ura+CanR) 및 25배 (Trp+CyhR) 더 낮고, 이는 MSH2-의존성 미스매치 복구 이외의 인자가 보다 분기된 서열 사이의 크로스오버 재조합을 방지함을 나타낸다. 78% 분기 수준에서 대략 2 x 10-4의 빈도에서 msh2 재조합체의 출현은 훨씬 더 분기하는 기질 사이에 재조합이 달성될 수 있음을 나타내는 것은 주목할 만하다.
2.4 msh2 하이퍼-재조합 효과
상동성 및 부분상동성 재조합에 대한 msh2의 효과는 먼저 각 실험에 대한 주어진 선택에 대한 상동성의 주어진 백분율에 대해 msh2 대 야생형 재조합체의 비율을 계산한 다음, 이렇게 결정된 비율 전체의 평균 및 표준 편차를 계산함으로써 정량하였다. 데이타를 도 4에 나타낸다. msh2 돌연변이의 존재는 95% 및 78% 상동성의 서열에 대한 부분상동성 재조합의 빈도를 증가시키고, 100% 동일한 서열 사이의 재조합은 덜 뚜렷하지만 여전히 정량가능하게 향상된다. 또한, 부분상동성 재조합의 msh2 향상 정도는 2가지 선택에 대해 상이하고: 부분상동성 Oxa 삽입물을 갖는 균주에 대해, MSH2의 불활성화는 Ura+CanR 재조합체의 빈도를 증가시키는 것보다 더 큰 정도로 Trp+CyhR 재조합체의 빈도를 증가시킨다. 원칙적으로, 두 종류의 재조합체 (Ura+CanR 및 Trp+CyhR)의 빈도는 동등해야 하지만, 이들 수치는 서열 분기 정도의 변동과 함께 msh2 돌연변이에 의해 유발되거나 향상되는 시스템에서 편향 (bias)이 존재함을 나타낸다. 수득한 재조합체의 종류에 대한 삽입물 및 인접 마커 서열의 상대적인 영향을 시험하기 위한 실험은 상기 편향이 인접 마커의 특성임을 나타내지만, 감수분열 재조합 사건의 결과를 지시하는데 있어서 재조합 기질의 영향은 아직 설명될 수 없다 (데이타를 나타내지 않는다).
2.5 선택된 재조합체의 PCR 분석
22% 분기의 Oxa 유전자를 함유하는 야생형 및 msh2 배수체로부터 유래된 Ura+CanR 및 Trp+CyhR 포자 콜로니 (각각 MXY99 및 MXY102)에 적용된 바와 같은 PCR 분석의 예를 도 5에 나타낸다. 각 균주에 대해, 각각의 재조합체 표현형을 나타낸 10개의 포자 콜로니를 분석하였다. 각 콜로니로부터의 추출물을 모체 분자를 특이적으로 증폭시키는 프라이머쌍 및 재조합 분자를 특이적으로 증폭시키는 프라이머쌍을 사용하는 증폭을 위한 템플레이트로서 사용하였다. 모든 경우(들)에서, 예측된 재조합 삽입물만 증폭되었고, 이는 선택된 포자 콜로니가 모체 Oxa 재조합 기질 사이의 재조합에 의해 생성된 서열을 함유하였음을 나타낸다. 이들 결과는 또한 심지어 유전적 선택 단계의 부가 없이도 재조합 분자가 포자형성된 배양물로부터 직접 회수될 수 있음을 증명한다. 여기서, URA3, CAN1, TRP1 및 CYH2 유전자에 위치하는 프라이머 인식 부위는 각각의 재조합 기질에 인접하는 분자 마커 서열을 나타낸다.
2.6 제1 라운드 감수분열 부분상동성 재조합체의 서열 분석: 5% 및 22% 분기
표현형 및 분자 (PCR) 시험을 만족시킨, 95% 상동성을 공유하는 재조합 기질을 함유하는, 야생형 및 msh2 배수체 (각각 MXY64 및 MXY66)로부터 유래된 Oxa7-0xa11 감수분열 재조합체를 서열 분석하였다. 재조합 단편을 인접 마커에 특이적인 프라이머를 사용하여 증폭시키고, 번역 개시 및 중지 부위에 가까운 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. Oxa7-Oxa 11 배수체의 반수체 자손체로부터 유래된 총 55개의 재조합 서열을 분석하였다: MXY64로부터 14개의 Ura+CanR 및 13개의 Trp+CyhR 재조합체, 및 MXY66으로부터 14개의 Ura+CanR 및 14개의 Trp+CyhR 재조합체. 서열분석된 샘플 크기에 의해 몇몇 관찰이 이루어진다. 1) 야생형 및 msh2 재조합체 모두에 대해, 크로스오버가 일어나는 위치는 전체 코딩 영역 범위였고, 특정한 간격에 대한 명백한 선호는 없었다. 5' 영역에서 발생한 크로스오버는 3' 영역에서 발생한 것과 같았다. 또한, 주어진 균주에 대해, -Ura+Can 또는 -Trp+Cyh 선택에 의해 수득된 포자 콜로니에 대한 크로스오버 부위의 분포에서 명백한 차이가 없었다. 2) 크로스오버 간격에서 중단되지 않은 상동성의 길이는 또한 중요하지 않았다: 크로스오버는 2개의 근접하게 이격된 다형성 (MXY66 Trp+CyhR #7, #8 및 #13에 대해 위치 543-552, 여기서 위치 1은 ATG 번역 개시 부위의 아데노신 잔기를 나타낸다) 사이 및 2개의 가장 멀리 이격된 다형성 (MXY66 Trp+CyhR #15에 대해 위치 163-265) 사이에 검출되었다. 3) 야생형 및 msh2 배경 모두에서 단리된 재조합 Oxa 삽입물은 잠재적으로 신규한 기능적 Oxa 단백질을 코딩할 수 있는 전체-길이 재조합 서열을 함유하였다. 즉, 모든 크로스오버는 크로스오버 간격 또는 임의의 다른 간격에서 뉴클레오티드의 순 삽입 또는 결손없이, 무손상 ORF를 보존하는 방식으로 발생하였다. 4) 대부분의 재조합 서열의 구조가 상동성의 국소 영역에서 2개의 Oxa 서열 사이의 단순한 크로스오버와 일치하지만, msh2 배경에서 단리된 몇몇 재조합체는 보다 큰 복잡성을 나타냈다. 4개의 재조합체 (MXY66 Ura+CanR #16 및 #31, 및 MXY66 Trp+CyhR #5 및 #9)로부터 유래된 서열은 그들이 2 이상의 크로스오버 사건에 의해 생산된 것처럼 보다 높은 정도의 모자이크 현상을 나타냈다. 실제로, 이들 2개의 재조합체의 분석은 복잡하였고, 이는 전기영동 검사가 서열분석된 영역 내의 다수 부위 (각 부위는 Oxa7-Oxa11 다형성에 대응한다)에서 2개의 겹치는 피크의 존재를 밝혔기 때문이다. 상기 관찰은 서열분석된 분자의 집단이 이종성임을 나타내고, 그에 대한 가장 가능한 설명은 msh2 재조합 포자 내에 존재하는 복구되지 않거나 부분적으로 복구된 이종이중체 DNA의 존재이다. 상기 해석은 msh2 돌연변이에 의해 유발된 감수분열후 분리 (PMS)의 공지된 빈도 증가와 일치한다. 이들 두 경우에, MXY66 Ura+CanR #16 및 #31에서, 하나 이상의 복구된 부위는 복구되지 않은 이종이중체의 스트레치에 인접하였고, 이는 문헌 [Cric, Gluck and Fabre (EMBO J. 19: 3408)]에서 제안된 바와 같이 msh2 배경에서 짧은 패치 미스매치 복구 활성의 비차폐(unmasking)와 일치한다. 짧은-패치 미스매치 복구와 연관되지 않은 몇몇 다른 경우의 PMS가 또한 msh2 재조합 서열에 대해서도 관찰되었고, 이는 상기 대안적인 미스매치 복구 시스템이 이종이중체 DNA에서 미스매치를 교정하는데 매우 효율적일 수 없음을 나타낸다. 서열 전기영동으로부터 판단하면, 비교정된 이종이중체의 정도는 약 50 nt의 짧은 영역에서부터 거의 전체 ORF에 이르는 영역까지 상이하였다. PMS 또는 짧은-패치 미스매치 복구에 대한 증거는 야생형 재조합 서열에 대해 발견되지 않았다. 종합하면, 이들 발견은 형성된 다양성의 정도가 야생형 감수분열에서보다 msh2 감수분열에서 더 큼을 제안한다.
감수분열 재조합체는 또한 78% 상동성을 공유하는 재조합 기질을 함유하는 야생형 및 msh2 배수체 (각각 MXY99 및 MXY102)로부터 유래되었다. Oxa5-Oxa 11 배수체의 재조합 자손체로부터 유래된 총 24개의 재조합 서열을 분석하였다: MXY99로부터 5개의 Ura+CanR 및 3개의 Trp+CyhR 재조합체, 및 MXY102로부터 9개의 Ura+CanR 및 7개의 Trp+CyhR 재조합체. 이들 서열을 조사하면 몇가지 경향을 제안한다. 1) -Trp+CyhR에 대한 선택에 의해 야생형 및 msh2 균주로부터 수득한 재조합 Oxa 서열은 ORF 전체에서 상이한 위치에서 크로스오버를 나타냈고, 아마도 전체 공유된 상동성의 중앙 250 bp 영역 (nt 333-nt 573)을 향한 약간의 경향을 갖는다. 대조적으로, -Ura+CanR에 대한 선택에 의해 야생형 및 msh2 균주에서 수득된 재조합체는 크로스오버의 위치에서 5개 야생형 중 3개 및 9개 msh2 서열 중 8개에서 뚜렷한 편향을 나타냈고, 크로스오버는 공유된 상동성의 영역의 마지막 80 nt, 즉, ORF의 마지막 10% 내에서 발생하였다. 2) 크로스오버가 확인된 절대적 상동성의 간격은 -Trp+Cyh 선택에 대해 11 내지 20 nt이었고, 이는 서열 동일성의 비교적 더 큰 상기 영역에 대한 선호를 나타낸다. 대조적으로, 크로스오버 간격은 -Ura+Can 선택에 대해 보다 짧으며, 3 내지 17 nt (이들 관련된 간격 13 nt 이하의 13/14)이었다. 3) 95% 상동성을 공유하는 서열을 포함하는 재조합에 대해, 수득된 새로운 서열은 또한 무손상 ORF로 이루어졌고 잠재적으로 신규한 Oxa 단백질을 코딩한다. 4) 전기영동 검사에 의해 판단할 때 야생형 재조합체에 대해 PMS의 경우는 발견되지 않았지만, 7개 Trp+CyhR 재조합체 중 3개를 포함하는 소수의 msh2 재조합체에 대해 복구되지 않은 이종이중체의 매우 짧은 패치가 발견되었다. 이들 영역은 Oxa7-Oxa11 재조합체에 대해 관찰된 트랙 (tract)의 일부보다 더 짧은 최대 67 nt를 포함하였다. 결국, 이들 관찰은 재조합 서열이 적어도 22%로 변하는 도입 재조합 기질로부터 선택될 수 있고, 이들 서열은 신규한 단백질을 코딩하는 것을 나타낸다.
2.7 Oxa7-Oxa11 제2-라운드 재조합체의 서열 분석
반복하는 방식으로 서열 다양성을 증가시키는 효모 시스템의 능력을 제1 라운드의 감수분열에서 생성된 Oxa7-Oxa11 재조합 반수체로부터 배수체를 제작하고 이들 새로운 배수체를 제2 라운드에서 감수분열시킴으로써 시험하였다. MXY64 및 MXY66의 서열분석된 Ura+CanR 및 Trp+CyhR 자손체 중에서, 동일한 간격에서 크로스오버를 갖는 적절한 재조합체의 쌍을, 전체 수준의 서열 상동성이 다시 95%인 새로운 배수체를 제작하기 위해 선택하였다. 3개의 야생형 (MXY81, MXY82 및 MXY83) 및 3개의 msh2 (MXY86, MXY87 및 MXY88) 배수체를 생성하였다. Oxa11 서열 삽입물만을 함유하는 대조 야생형 및 msh2 배수체를 또한 MXY60 및 MXY62의 적절한 재조합 자손체로부터 제작하여, MXY90 및 MXY92를 생성시켰다. 이들 배수체를 포자형성시키고, 포자를 제2-라운드 재조합체에 대해 선택하기 위해 우라실이 결핍되고 시클로헥시미드를 함유하는 배지 (-Ura+Cyh) 상에 및 트립토판이 결핍되고 카나바닌을 함유하는 배지 (-Trp+Can) 상에 플레이팅하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 이들 모든 균주에 대해 관찰된 -Ura+CyhR 및 Trp+CanR 포자 콜로니의 빈도는 MSH2 유전자의 항-재조합 효과와 일치한다. 두 종류의 콜로니가 야생형 동형접합체 MXY90의 자손체 사이에서 10-3을 초과하는 빈도로 발견된 반면, 이들 빈도는 Oxa 삽입물 이종성을 갖는 야생형 배수체 (MXY81, MXY82 및 MXY83)의 자손체 사이에서 5배 내지 10배 감소하였다. 분기된 Oxa 삽입물을 갖는 배수체 (MXY 86, MXY 87 및 MXY 88)에서 MSH2 유전자의 불활성화는 Ura+CyhR 및 Trp+CanR 포자 콜로니의 빈도를 2 내지 6배 증가시켰고, 이는 동일한 Oxa 삽입물을 갖는 msh2 배수체 (MXY92)에 대해 관찰된 수준과 유사하였다. 사용된 배지는 제1-라운드 재조합체의 선택을 위해 사용된 것과 상이하지만, 야생형 및 msh2 제2-라운드 재조합체가 선택된 빈도는 제1-라운드 재조합체에 대한 것에 동등하다.
야생형 (MXY81 및 MXY83) 및 msh2 (MXY86) 배경 모두에서 Ura+CyhR 및 Trp+CanR 포자 콜로니를 서열분석을 위해 선택하였다. 총 14개의 야생형 및 7개의 msh2 Oxa 삽입물을 서열분석하였다. 대부분의 경우, 크로스오버는 제2 라운드 재조합 동안 신규한 간격에서 발생하였고, 이는 다시 위치 또는 간격 크기에 관하여 명백한 편향이 없고: 상이한 간격을 수반하는 크로스오버가 Oxa ORF 전체에서 발견되었고, 이들은 101 nt만큼 크고 5 nt만큼 작은 간격에서 발생하였다. 한 경우 (MXY83 Trp+CyhR 반수체)에, 제2 라운드 크로스오버는 제1 라운드 크로스오버 간격에서 발생하여, 완전한 Oxa11 서열을 회복시켰다. msh2 배수체로부터 회수된 재조합체는 야생형 균주로부터 회수된 것보다 더 다양하였다. msh2 배수체 MXY86에 대해, 광범한 PMS 및 서열 모자이크 현상을 나타내는 몇몇 포자 콜로니가 관찰되었고, 이는 재조합적 중간물 (intermediate)에서 이종이중체의 긴 트랙의 형성과 일치한다. 또한, 일부 미스매치가 이종이중체 트랙에서 복구되었고, 이는 다시 짧은 패치 미스매치 복구 활성에 일치한다. 결국, msh2 배경에서 제2-라운드 재조합은 서열 다양성을 생성시키는 것에 관하여 (예를 들어, 크로스오버 간격 분포 및 PMS의 발생률) 정성적으로, 및 부분상동성 (5% 분기) 재조합의 총 빈도를 증가시키는 것에 관하여 정량적으로 제1-라운드 재조합만큼 효율적이다.
<110> Mixis France S.A. <120> Generation of recombinant genes in Saccharomyces cerevisiae <130> 18248 <140> <141> <160> 33 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 agaactccag cactccgtat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 gagacctatc gccatcttca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 tcggttctta ctgccaagtg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 4 gagtggcaag aacttgtagc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 5 catgacgatg aggacatcac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 cgttcggacc taacatctct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 atgcttgatg gtcggaagag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 8 tatgcctctt ccgaccatca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 9 aggtcgcctg acgcatatac 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 10 tgaagaggag gtcgactacg 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 11 ccacctagcg gatgactctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 12 cgcctcgttc agaatgacac 20 <210> 13 <211> 45 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 13 acctctagat cttaattaag ttaacttacg gtgccctttg atcct 45 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 14 caagcggccg cagcgcatgt gtccgatctt t 31 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 15 caaggtacca gcggccgctg tgctgtctgc gctgcattc 39 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 16 acactcgagg caccgtaagg gaggagaa 28 <210> 17 <211> 39 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 17 caaggtacca gcggccgctg tgctgtctgc gctgcattc 39 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 18 acctctagac tagtcgaccc aaggaggtgc catgaa 36 <210> 19 <211> 35 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 19 accttaatta agtcgacctg cagcgaattg ttagc 35 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 20 accactagtc gacaccaaga aggtgccatg a 31 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 21 accttaatta agtcgacggt cacgatgctg tactt 35 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 22 tcattgcctt ctccactctc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 23 caccagcgct ctagatacat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 24 ggaccagaac tacctgtgaa 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 25 gagtagcagc acgttcctta 20 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 26 ccaggatccc gggttaatta agttcccagg aaaccctttc g 41 <210> 27 <211> 28 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 27 caacgatcgg atctgccact ggtaactt 28 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 28 ttgtttgtgc acttgcctgc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 29 aaagccgtat gactcaccca 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 30 gaaagggttt cctgggaact 20 <210> 31 <211> 37 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 31 cgcggatcca ctagtcgacc caccaaggta ccatgaa 37 <210> 32 <211> 35 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 32 accttaatta agtcgaccga gccttgagcg ccttg 35 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 33 tgagaagatg cggccagcaa 20

Claims (44)

  1. a) 게놈의 규정된 로커스(locus)에 적어도 제1 및 제2 마커 서열에 인접하는 재조합시킬 제1 DNA 서열을 포함하는 제1 재조합 카세트, 및 대립유전자 위치(allelic position)에 적어도 제3 및 제4 마커 서열에 인접하는 재조합시킬 제2 DNA 서열을 포함하는 제2 재조합 카세트를 갖는 제1 배수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포를 생성하고,
    b) 단계 a)에서 얻은 제1 배수체(diploid) 세포의 포자형성(sporulation)을 유도하고,
    c) 제1 재조합된 DNA 서열이 제1 및 제4 마커 서열에 인접하는 재조합 카세트를 함유하는 반수체(haploid) 세포, 및 제2 재조합된 DNA 서열이 적어도 제2 및 제3 마커 서열에 인접하는 재조합 카세트를 함유하는 반수체 세포를 단리하는 단계
    를 포함하는, 사카로마이세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)에서 재조합 DNA 서열을 생성하고 검출하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    a) 제1항의 단계 c)에서 얻은 제1 재조합된 DNA 서열을 함유하는 반수체 세포를, 제1항의 단계 c)에서 얻은 제2 재조합된 DNA 서열을 함유하는 반수체 세포와 교배시켜 제2 배수체 세포를 생성하고,
    b) 단계 a)에서 얻은 제2 배수체 세포의 포자형성을 유도하고,
    c) 제3 재조합된 DNA 서열이 적어도 제1 및 제2 마커 서열에 인접하는 재조합 카세트를 함유하는 반수체 세포, 및 제4 재조합된 DNA 서열이 적어도 제3 및 제4 마커 서열에 인접하는 제4 재조합 카세트를 함유하는 반수체 세포를 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제2항의 단계 c)에서 얻은 반수체 세포를, 다른 반수체 세포와 교배하고 수득한 배수체 세포의 포자형성을 유도하여 2개의 마커 서열 사이의 분자 연결을 기초로 재조합된 DNA 서열을 갖는 반수체 세포를 단리하는 추가의 사이클에 1회 이상 적용함으로써, 추가의 재조합된 DNA 서열을 생성하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 배수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포를 제1 재조합 카세트를 함유하는 DNA 분자 및 제2 재조합 카세트를 함유하는 DNA 분자로 동시에 또는 순차적으로 형질전환시키고, 임의로 2개의 재조합 카세트를 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 대립유전자 위치 내로 통합시킴으로써, 제1 배수체 세포를 생성하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 제1 또는 제2 재조합 카세트를 포함하는 DNA 분자가 효모 인공 염색체 (YAC)인 방법.
  6. 제4항에 있어서, 제1 또는 제2 재조합 카세트를 포함하는 DNA 분자가 클로닝 비히클이고, 이에 의해 각각 2개의 마커 서열이 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 규정된 로커스에 상동성인 표적화 서열에 인접하는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈의 로커스에 제1 재조합 카세트를 갖는 반수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포를 대립유전자 위치에 제2 재조합 카세트를 갖는 반수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포와 융합시킴으로써, 제1 배수체 세포를 생성하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈의 로커스에 제1 재조합 카세트를 갖는 반수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포를 대립유전자 위치에 제2 재조합 카세트를 갖는 반수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포와 교배함으로써, 제1 배수체 세포를 생성하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 제1 또는 제2 재조합 카세트를 갖는 반수체 세포가
    a) 제1 클로닝 비히클 상에 인접하여 위치하는 제1 및 제2 마커 서열 사이에 재조합시킬 제1 DNA 서열을 삽입하고, 제2 클로닝 비히클 상에 인접하여 위치하는 제3 및 제4 마커 서열 사이에 재조합시킬 제2 DNA 서열을 삽입함으로써, 각각의 2개의 마커 서열이 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 규정된 로커스에 상동 성인 표적화 서열에 의해 인접되도록 하고,
    b) 단계 a)에서 얻은 클로닝 비히클로부터 각각 제1 재조합 카세트 및 제2 재조합 카세트를 갖는 단편을 절제함으로써, 각각의 카세트가 각각의 2개의 마커 서열에 의해 인접된 재조합시킬 DNA 서열을 포함하고, 각각의 카세트는 다시 표적화 서열에 의해 인접되도록 하고,
    c) 단계 b)에서 얻은 인접하는 표적화 서열을 갖는 재조합 카세트를 갖는 단편을 별개로 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 배수체 세포에 형질전환시킴으로써, 표적화 서열이 그에 상동성인 로커스 내로 카세트가 통합되도록 하여, 제1 카세트 또는 제2 카세트에 이형접합성인 배수체 세포를 얻고,
    d) 단계 c)에서 얻은 이형접합성 배수체 세포의 포자형성을 별개로 유도하고,
    e) 제1 카세트를 함유하고 제1 및 제2 마커 서열을 발현하는 반수체 세포, 및 제2 카세트를 함유하고 제3 및 제4 마커 서열을 발현하는 반수체 세포를 개별적으로 단리함으로써 생성되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 제1 클로닝 비히클이 플라스미드 pMXY9이고 제2 클로닝 비히클이 플라스미드 pMXY12인 방법.
  11. 제4항 내지 제6항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환을 위해 사용된 배수체 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포가 적어도 2개의 영양 인 자에 대해 영양요구성인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 배수체 세포가 각각 우라실 및 트립토판에 대해 영양요구성으로 만드는 ura3-1 대립유전자 및 trp1-1 대립유전자에 대해 동형접합성인 방법.
  13. 제4항 내지 제6항 및 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 형질전환을 위해 사용된 배수체 세포가 적어도 2개의 항생제에 내성인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 배수체 세포가 각각 카나바닌 및 시클로헥시미드에 대해 내성으로 만드는 can1-100 대립유전자 및 cyh2R 대립유전자에 대해 동형접합성인 방법.
  15. 제4항 내지 제6항 및 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 대립유전자 ura3-1, trp1-1, can1-100 및 cyh2R에 대해 동형접합성이고 msh2::KanMX 돌연변이에 대해 이형접합성인, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 균주 MXY47의 배수체 세포가 형질전환을 위해 사용되는 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포가 기능적 미스매치 복구 시스템을 갖는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포의 미스매치 복구 시스템이 일시적으로 또는 영구적으로 결핍된 방법.
  18. 제17항에 있어서, 미스매치 복구 시스템의 일시적 또는 영구적 결핍이 미스매치 복구 시스템에 관련된 하나 이상의 유전자의 돌연변이 및(또는) 유도가능 발현 또는 억제, 미스매치 복구 시스템을 포화시키는 물질의 처리 및(또는) 미스매치 복구를 전체적으로 손상시키는 물질의 처리에 의한 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 재조합 카세트가 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 염색체 III 상의 BUD31-HCM1 로커스에 통합된 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합시킬 제1 및 제2 DNA 서열이 적어도 1개의 뉴클레오티드로 분기된 (diverge) 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합시킬 제1 및 제2 DNA 서열이 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 이외의 다른 유기체로부터 유래된 것인 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합시킬 제1 및 제2 DNA 서열이 하나 이상의 비코딩 서열 및(또는) 하나 이상의 단백질-코딩 서열을 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 마커 서열이 영양 마커, 안료 마커, 항생제 내성 마커, 항생제 감수성 마커, 프라이머 인식 부위, 인트론/엑손 경계, 효소의 특정 서브유닛을 코딩하는 서열, 프로모터 서열, 하류 조절된 유전자 서열 및 제한효소 부위로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 제1 및 제3 마커 서열이 영양 마커이고, 그의 유전자 생성물이 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포의 영양요구성을 보충(compensation)할 수 있는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 제1 마커 서열이 URA3이고, 그의 유전자 생성물이 우라실 영양요구성 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에 우라실 독립영양성(prototrophy)을 부여할 수 있는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 제3 마커 서열이 TRP1이고, 그의 유전자 생성물이 트립토판 영양요구성 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에 트립토판 독립영양성을 부 여할 수 있는 것인 방법.
  27. 제23항에 있어서, 제2 및 제4 마커 서열이 항생제 감수성 마커이고, 그의 유전자 생성물이 항생제에 내성인 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에 항생제에 대한 감수성을 부여할 수 있는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 제2 마커 서열이 CAN1이고, 그의 유전자 생성물이 카나바닌-내성 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에 카나바닌에 대한 감수성을 부여할 수 있는 것인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 제4 마커 서열이 CYH2이고, 그의 유전자 생성물이 시클로헥시미드-내성 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 세포에 시클로헥시미드에 대한 감수성을 부여할 수 있는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2, 제3 또는 제4의 재조합된 DNA 서열을 갖는 재조합 카세트를 함유하는 반수체 세포가 각각의 마커 조합의 존재를 검출하기 위한 PCR 방법에 의해 확인되는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 제1, 제2, 제3 또는 제4의 재조합된 DNA 서열을 갖는 재조합 카세트를 함유하는 반수체 세포가 각각의 마커 조합 의 동일한 DNA 분자 상의 분자 연결을 선택하는 배지 상에 반수체 세포를 플레이팅함으로써 확인되는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 제1 및 제4 마커 서열의 동일한 DNA 분자 상의 분자 연결을 선택하는 배지 상에 제1 재조합된 DNA 서열을 함유하는 반수체 세포를 플레이팅하는 방법.
  33. 제31항에 있어서, 제2 및 제3 마커 서열의 동일한 DNA 분자 상의 분자 연결을 선택하는 배지 상에 제2 재조합된 DNA 서열을 함유하는 반수체 세포를 플레이팅하는 방법.
  34. 제31항에 있어서, 제1 및 제2 마커 서열의 동일한 DNA 분자 상의 분자 연결을 선택하는 배지 상에 제3 재조합된 DNA 서열을 함유하는 반수체 세포를 플레이팅하는 방법.
  35. 제31항에 있어서, 제3 및 제4 마커 서열의 동일한 DNA 분자 상의 분자 연결을 선택하는 배지 상에 제4 재조합된 DNA 서열을 함유하는 반수체 세포를 플레이팅하는 방법.
  36. URA3 마커 유전자 및 CAN1 마커 유전자를 인접하게 포함하며, 2개의 마커 서 열이 재조합시킬 DNA 서열을 삽입하기 위한 폴리링커 서열에 인접하고, 2개의 마커가 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 염색체 III 상의 BUD31-HCM1 로커스에 상동성인 표적화 서열에 인접된 플라스미드 pMXY9.
  37. 제36항에 있어서, 폴리링커 서열이 제한효소 SmaI, XbaI, PacI 및 BglII에 대한 제한 부위를 포함하는 것인 플라스미드 pMXY9.
  38. TRP1 마커 유전자 및 CYH2 마커 유전자를 인접하게 포함하며, 2개의 마커 서열이 재조합시킬 DNA 서열을 삽입하기 위한 폴리링커 서열에 인접하고, 2개의 마커가 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 게놈의 염색체 III 상의 BUD31-HCM1 로커스에 상동성인 표적화 서열에 인접된 플라스미드 pMXY12.
  39. 제38항에 있어서, 폴리링커 서열이 제한효소 SmaI, SpeI 및 PacI에 대한 제한 부위를 포함하는 것인 플라스미드 pMXY12.
  40. 배수체 세포가 대립유전자 ura3-1, trp1-1, can1-100 및 cyh2R에 대해 동형접합성이고 msh2::KanMX 돌연변이에 대해 이형접합성인 것을 특징으로 하는 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 균주 MXY47.
  41. 플라스미드 pMXY9를 함유하는 이. 콜라이 균주 JM101.
  42. 플라스미드 pMXY12를 함유하는 이. 콜라이 균주 DH5α.
  43. 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 균주 MXY47 세포를 포함하는 제1 용기, 플라스미드 pMXY9를 함유하는 이. 콜라이 균주 JM101 세포를 포함하는 제2 용기, 및 플라스미드 pMXY12를 함유하는 이. 콜라이 균주 DH5α 세포를 포함하는 제3 용기를 적어도 포함하는 키트.
  44. 에스. 세레비시애(S. cerevisiae) 균주 MXY47 세포를 포함하는 제1 용기, 플라스미드 pMXY9의 DNA를 포함하는 제2 용기, 및 플라스미드 pMXY12의 DNA를 포함하는 제3 용기를 적어도 포함하는 키트.
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100778219B1 (ko) 2006-08-28 2007-11-29 한국생명공학연구원 교배형 특이적 유전자에 의해 조절되는 반수체 제조용형질전환 효모 균주의 제조
PT2132318E (pt) * 2007-03-16 2012-11-28 Univ California Composições e métodos para a redução dos níveis de h2s em bebidas fermentadas
WO2010110464A1 (en) 2009-03-24 2010-09-30 Meito Sangyo Co., Ltd. Improved type milk-clotting protease derived from a microorganism
MX2011013700A (es) * 2009-07-03 2012-04-30 Dsm Ip Assets Bv Cepa talaromyces y composiciones de enzimas.
CN102933710A (zh) 2010-04-09 2013-02-13 艾威艾基克斯有限公司 产生基因嵌合体的方法
EP2677881B1 (en) 2011-02-24 2020-04-01 Erber Aktiengesellschaft Feed processing enzymes
JP2014519831A (ja) 2011-06-21 2014-08-21 エヴィアジェニクス ソシエテ・アノニム 代謝的進化の方法
CN104105793A (zh) 2011-10-12 2014-10-15 埃微杰尼克斯有限公司 在真核细胞中产生基因嵌合体的方法
EP3390640A4 (en) * 2015-12-17 2019-05-22 Evonik Degussa (China) Co., Ltd GENETIC CASSETTE FOR APPROVED RECOMBINATION INACTIVATION IN YELLOW CELLS
CN106801098B (zh) * 2017-02-20 2020-06-30 天津大学 一种定位引起酵母特殊生长表型的序列位置的方法
CN106755116B (zh) * 2017-02-23 2020-07-28 天津大学 一种修复酵母染色体结构异常的方法
CN108486158B (zh) * 2017-12-06 2020-11-17 上海泽因生物科技有限公司 基于酵母细胞的基因检测标准品的构建方法及其试剂盒
CN112410366B (zh) * 2020-12-10 2022-03-04 科稷达隆(北京)生物技术有限公司 向酿酒酵母中导入线性质粒的方法及制备的酵母菌

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU6487196A (en) * 1996-07-09 1998-02-02 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Transformation-associated recombination cloning
EP1333095B1 (en) * 2002-01-31 2006-03-08 Mixis France S.A. Process for the reversible functional inactivation of the mismatch repair system

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Publication number Publication date
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