CN102016022A - 通过4轮连续pcr或阻断pcr或其全基因合成的方法进行的含有基因特异的条形码的粟酒裂殖酵母杂合缺失突变体的全基因组构建 - Google Patents

通过4轮连续pcr或阻断pcr或其全基因合成的方法进行的含有基因特异的条形码的粟酒裂殖酵母杂合缺失突变体的全基因组构建 Download PDF

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Abstract

提供用于制备基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母的方法，包括用缺失盒转化粟酒裂殖酵母，该缺失盒由4轮连续PCR、阻断PCR或全基因合成构建，含有同源重组位点。还提供了由该方法制备的基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母突变体，和基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母突变体文库。此外，该文库在构建用于筛选药物作用方式的方法和试剂盒中有用。

Description

通过4轮连续PCR或阻断PCR或其全基因合成的方法进行的含有基因特异的条形码的粟酒裂殖酵母杂合缺失突变体的全基因组构建
技术领域
本发明涉及系统地制备基因靶向的杂合缺失突变粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)菌株的方法。更具体地，本发明涉及通过用缺失盒(deletion cassette)转化粟酒裂殖酵母制备基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母的方法，该缺失盒由4轮连续PCR、阻断PCR或全基因合成构建，含有同源重组位点。同时，本发明涉及由该方法制备的基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母突变体，和基因靶向的杂合缺失粟酒裂殖酵母突变体的文库。此外，本发明与用于在文库中筛选药物作用方式的方法和试剂盒有关。
背景技术
在2006年，据报道全世界的药物市场价值为6430亿美元，韩国药物产品占该总额中的11,4728亿韩元份额。全球药物市场预期在2007年增加到7350～7450亿美元。据报道将新药带进市场需要1～6亿美元的平均成本，10至15年的开发期。尽管这样巨大的时间和金钱的花费，但是据报道新药开发的成功率低，为万分之一。因此，新药的成功开发必须应该从许多可能的作用方式中定义高度假定的在疾病的发生和治疗中起关键作用的“药物的作用方式”；这通常是通过从复杂的实验数据中提取生物相关性的智能生物信息学工具完成的。由此，系统地筛选直接涉及许多疾病的特异作用方式非常重要。
就这一点而论，筛选技术在鉴别药物发挥其治疗作用的靶标中是有用的，因此非常有助于减少药物开发需要的时限。同时，筛选技术允许与药物的副作用相关的作用方式的鉴别。因此，急需筛选药物作用方式的新颖的方法。
粟酒裂殖酵母是本发明的优选实施方式中有用的裂殖酵母，它与芽殖酵母——酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)在进化上不具有高度相关性，尽管它们都属于子囊菌粟酒裂殖酵母(ascomycetes S.pombe)(Wood V.et al.，Nature.45：871-880，2002)，在酿酒酵母以后被标记为第六模式真核生物，其基因组已被完全测序(Goffeau A.et al.，Science，274：546-567，1996)。根据分析，在迄今其基因组已被测定的真核细胞中，粟酒裂殖酵母具有有效的基因组结构，该结构具有最低的基因功能重复。还据报道粟酒裂殖酵母含有4,824个蛋白编码基因，这是已被鉴定的真核生物的最小数目，但是约43％的基因含有内含子。同时，发现粟酒裂殖酵母具有对包括细胞周期控制、蛋白水解、蛋白磷酸化和RNA剪接需要的那些细胞构造在内的真核细胞构造重要的高度保守基因。此外，粟酒裂殖酵母的基因的31％被鉴定为与酿酒酵母的基因不同，而与人类同源。因此，粟酒裂殖酵母和酿酒酵母之间的遗传功能的比较正显现为研究人类基因功能的有效方法学。
术语“基因打靶(基因寻靶)”如本文所用以在药物作用方式的筛选中转化酵母菌株，意欲指使用同源重组来改变内源基因——诸如通过破坏基因(敲除)或通过导入基因——的遗传技术。已使牵涉特异疾病的基因从其中去除或导入其中的转基因小鼠具有其观察到的病理学，因此允许在功能上鉴别敲除基因。
由于1989年转基因小鼠的产生，基因打靶已产生了巨大的技术进步。例如，靶基因能在特定的发育阶段被导入或导入到已经长大的成体。同时，可能设计在发育过程中的特定时间表达的突变基因。Martin J.Evans、Oliver Smithies和Mario R.Capecchi因他们在基因打靶方面的工作而被宣布成为2007年生理学和医学诺贝尔奖获得者。
PCR(聚合酶链反应)是用于复制和扩增DNA的分子生物学技术(美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159；欧洲专利号0200362、0201184和0229701；Methods in Enzymology，Volume 155，1987，pp.335-350，Murakawa et al.，DNA 7；287-295(1988))。这个技术典型地由30至40个变性、退火和延伸的循环组成，并允许感兴趣的基因区段选择性地扩增，甚至从DNA库中的痕量扩增。现在，已发展了基本PCR技术的变化，包括多重PCR、巢式PCR、定量PCR、实时PCR、逆转录(RT-PCR)、递降PCR等。
实时PCR是建立的用于DNA定量的工具，因为荧光探针与引物一起使用，基于PCR产物扩增期间按比例产生的荧光信号的检测，它测量每轮PCR扩增之后DNA产物的积累。实时PCR能快速并方便地获得PCR结果，因为它不需要电泳测定。同时，实时PCR具有污染风险低的优势。由于这些理由，实时PCR作为典型PCR的替代享有广泛的使用。
转化是缘于外源DNA的摄取、基因组整合和表达的细胞遗传变化。实际上，用选择性标记来标记外源DNA以容易地选择外源DNA已被成功导入的细胞。选择性标记的典型例子包括氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因和卡那霉素抗性基因。转化之后，在相关抗生素存在下的培养允许成功转化的细菌的选择。在本发明中，通过将抗生素抗性基因导入到相应的同源重组位点的转化来敲除裂殖酵母中的特定基因。
基因合成是公知技术，自从20世纪90年代早期基于PCR的寡聚体连接的发展后，已发表了约200篇关于基因合成的文章(Edge et al.，Nature.292：756-62、Roufflardet al.，NAR.32：176-80、Smith et al.，NAR.10：4467-82、Dillon et al.，Biotechniques.9：298-300、Ciccarelli et al.，Nucleic Acid Research.21：6007-13、Prodromou et al.，ProteinEngineering.5：827-29、Stemmer et al.，Gene.164：49-53、Lin et al.，Gene.288：85-94、Venter et al.，Proceedings National Academy of Science.100：15440-45)。原则上，将20bp至60bp长的寡核苷酸退火并相互连接以产生双链DNA片段，该片段然后被用作通过PCR的期望DNA扩增的模板。可以通过基因合成获得的DNA片段通常小于1,000bp。对于较长的基因，通过PCR连接获得的小于1000bp的DNA片段。在2003年，Craig Venter博士以这样的方式成功地建立
Figure BPA00001248841500031
噬菌体(phiX174噬菌体)全部的5,386-bp基因组。
关于药物作用方式的筛选，最广泛使用的是体外的方法。例如，将细胞蛋白的混合物通过具有药物附着的树脂的亲和柱，纯化因此结合到药物上的蛋白并用MALDI-TOF分析(Schreiber et al.，Bioorg.Med.Chem.6：1127-1152)。可选的是将人类蛋白质噬菌体文库通过含有药物附着的树脂的亲和柱，在该文库中人类蛋白质表达在膜上，接下来选择和分析结合到药物的噬菌体以推论药物的靶蛋白(Sche et al.，Chem.Biol.6：707-716)。
最近，已经对与上面的两种方法完全不同的体内筛选方法进行了尝试(Lutn et alCell.116：121-37)。尽管与筛选人类蛋白的体外方法相比，这种方法因为筛选酵母蛋白是不利的，但是它具有快速(100个药物/周)、方便和高成功率的优点。在2004年，Merck的Shoemaker和Lum博士的研究小组筛选了针对80个预先存在药物的作用方式，成功率从25％增加到70％。被称作药物诱导的单倍性不足的筛选策略是基于降低药物靶标的基因剂量增加对药物的敏感性的事实。在大多数情况下，一个等位基因足以允许细胞正常地工作，但是当正常的表型需要两个等位基因的蛋白产物时，50％的基因功能的重建导致异常的表型，这被称作单倍性不足。据报道，芽殖酵母的180个基因，相当于约6,000个基因的3％，牵涉单倍性不足，因此与野生型相比，突变体甚至在充足的营养培养基中生长差(Deutschbauer et al.，Genetics.169：1915-25)。这种单倍性不足是在杂合突变体酵母菌株中筛选药物作用方式的基础。例如，假定药物‘a’靶向蛋白‘A’，IC50剂量的药物‘a’的治疗导致在基因靶向的杂合菌株中蛋白‘A’的100％抑制(击倒)，IC50是抑制蛋白‘A’一半的浓度。相应地，药物治疗的菌株以比未治疗的菌株低的速度生长。根据本发明，提供在单倍性不足的基础上筛选药物作用方式的方法。
构建基因靶向菌株的成功依赖菌株的性质，因为它由同源重组效率决定，一个菌株与另一个菌株的同源重组效率不同。然而，在相同的菌株中同源重组效率与基因组同源位点的长度成比例。因此，对应于基因组同源位点的较长DNA片段允许基因靶向的菌株以更有效的速度构建。被概述在下面表1中的试验已在芽殖酵母上进行，但是在裂殖酵母上没有这样高成功率的先例(Palaniyandi et al.，Nud Acid Res.3：2799-2800；Michael et al.，Gene.158：113-17；Kaur et al，Nud Add Res.25：1080-81)。
表1
Figure BPA00001248841500041
典型地，基因特异连接体介导的PCR方法已被用于加长在基因靶向的裂殖酵母菌株构建中使用的同源重组位点。使用这种方法，Giaever等构建了约6000个芽殖酵母总基因组的缺失盒，这样酵母DNA序列的两个40-60bp同源区位于每个盒两侧(Giaever et al.，Nature Genetics 14：450-56；Wach et al.，Yeast 10：1793-1808)。在芽殖酵母的情况下，每个盒两个末端的45～60bp基因组同源区保证了在突变体菌株全基因组构建中高达81％的成功率(表1)。然而，在裂殖酵母中，甚至当将同源长度延长到40bp时，成功率最多增加到1～3％。裂殖酵母这样低的成功率表明，由于裂殖酵母的同源重组率低于芽殖酵母的同源重组率，菌株制备是非常困难的。在对该背景的充分考虑中，本发明提供通过同源重组高效构建裂殖酵母突变体的方法。
发明内容
技术问题
据报道，从裂殖酵母构建基因靶向的突变体比从芽殖酵母构建基因靶向的突变体在技术上更难(Decottignies et al.，Genome Research.13：399-406)。在本发明中，通过使一对20mer的基因特异的条形码位于选择性标记基因两侧，和将一对长度为250～350bp的同源重组区分配到各自的条形码侧面来构建缺失盒，并将缺失盒转化进裂殖酵母中以制备裂殖酵母的基因靶向的杂合缺失突变体。基于杂合缺失突变体文库，基因芯片允许药物作用方式的高通量筛选。
技术方案
因此本发明的一个目的是提供使用基因打靶缺失盒制备基因靶向的粟酒裂殖酵母杂合缺失突变体菌株的方法，该基因打靶缺失盒包括选择性标记基因、用于微点阵的基于条形码的序列和同源重组区。
本发明的另一个目的是提供使用该方法制备的基因靶向的粟酒裂殖酵母杂合缺失突变体菌株。
本发明的另一个目的是提供使用该方法制备的基因靶向的粟酒裂殖酵母杂合缺失突变体菌株的文库。
本发明的另一个目的是提供在基因靶向的粟酒裂殖酵母杂合缺失突变体菌株文库的基础上筛选药物作用方式的方法。
本发明的另一个目的是提供用于筛选新颖药物的试剂盒，包括基因靶向的粟酒裂殖酵母杂合缺失突变体菌株的文库。
有益的效果
本发明人在世界上首次建立了制备基因靶向的粟酒裂殖酵母杂合缺失突变体的系统。同时，本发明将构建裂殖酵母菌株的成功率增加到95％～99％，这与芽殖酵母的成功率相似，而通常认为裂殖酵母的成功率低于芽殖酵母的成功率。在酿酒酵母的大约6,000个基因中，在构建芽殖酵母的杂合缺失突变体中只成功使用了5,700个基因(95％)(参考网址http://www-sequence.stanford.edu/group/yeast_deletion_project/not_made.html中公开的“Saccharomyces Genome Deletion Project”)。
在本发明中，成功构建了4,945个基因靶向的粟酒裂殖酵母杂合缺失突变体，它们对应于2007年6月20日从Well come Trust Sanger Institute的公共裂殖酵母数据库(http://www.genedb.org/genedb/pombe/index.jsp)获得的大约5,000个基因的99％(估计为4,989～5,014个基因)。
从构建中排除的55个基因对应于全部基因的1％，由18个wtf基因、11个Tf2基因和26个不确定的基因组成，理论上它们在构建基因靶向的缺失突变体中不可能使用。根据本发明制备的杂合突变体菌株文库还能被用于在基因水平筛选药物作用方式的系统，因此有效地开发新颖的药物。
附图简述
图1是显示用于基因打靶的典型缺失盒结构的示意图，
图2显示用于缺失盒的Kanr条形码模块的构建过程，
图3显示通过四轮连续PCR构建缺失盒的过程，
图4显示通过阻断PCR构建缺失盒的过程，
图5显示通过基因合成构建缺失盒的过程，
图6显示通过菌落PCR对期望的突变体菌株的鉴别，
图7至55显示基因特异条形码的碱基序列，该序列将被插入到缺失盒用于基因靶向的突变体菌株的构建，
图56在图解显示在单倍性不足的基础上使用基因芯片(GeneChip)筛选药物作用方式的过程，
图57是通过基因芯片的使用制备用于筛选药物作用方式的基因靶向突变体文库的过程，
图58显示来自Affymetrix的定做的基因芯片，
图59显示基因芯片上用于药物作用方式筛选的抗真菌剂特比萘芬的IC50的测量，和
图60显示板上基于基因芯片的特比萘芬作用方式的再证实。
最佳实施方式
在本发明中，利用4轮连续PCR、阻断PCR或基因合成来扩增缺失盒模块，然后用其构建转化的基因靶向的突变体。进而，该突变体被用于构建DNA文库，利用该文库的优点来寻找药物作用方式。
在本发明的一个实施方式中，提供使用缺失盒构建基因靶向的裂殖酵母杂合缺失突变体的方法，该缺失盒包括(a)选择性标记，(2)用于微点阵的、分别位于选择性标记基因两侧的一对基因特异的条形码碱基序列，和(3)一对至少150bp同源重组区，其分别分配到在选择性标记基因的上游和下游位置的条形码碱基序列的侧面。在下面将给予每个组分详细的描述。
选择性标记
将选择性标记用来区分成功转化的酵母和未成功转化的酵母。本发明中有用的选择性标记的例子包括营养缺陷型标记、新霉素抗性(neoR)、卡那霉素抗性(kanR)、潮霉素抗性(hyg)、组氨醇脱氢酶(hisD)、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、四环素(tetR)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)、ura3、ble和sacB，优选来自卡那霉素抗性基因的kanMX。通过同源重组可将包括选择性标记的缺失盒整合进基因组。
需要特异的氨基酸或核酸用于存活的营养缺陷型标记，诸如ura4、leu1、his3，目前用于裂殖酵母中靶向的基因整合和断裂。然而，具有一个或多个营养缺陷型突变的菌株对这样的标记的使用是必要的。同时，由于DNA的导入，基因转变可发生在营养缺陷型中。此外，营养缺陷型突变本身、与其他的突变一起可导致难以猜测的表型，诸如胞体敏感性(somosensitivity)、氮饥饿调节的细胞分化、孢子形成、假菌丝等。此外，许多营养缺陷型突变可使酵母在典型培养基中生长困难。
为了克服营养缺陷型标记的这些局限性，Philippsen组研发了KanMX模块作为显性药物抗性标记。该标记被用于酿酒酵母的缺失项目。对遗传霉素
Figure BPA00001248841500061
(G418)有抵抗力，kanMX模块被设计以用作选择性标记。相比营养缺陷型标记，甚至当使用PCR-DNA片段时，G418标记具有产生高比率缺失的优点。现在，已研发了另外的显性药物抗性标记，包括对潮霉素B、诺尔丝菌素和双丙氨磷(bialaphos)/膦丝菌素有抵抗力的那些药物抗性标记。
在本发明的优选实施方式中使用的是选择标记KanMX4，它的长度是810bp，含有来自大肠杆菌的Kan转座子Tn903 ORF。具有氨基糖苷磷酸转移酶活性，KanMX4被报道抑制卡那霉素或其衍生物G418(Lang-Hinrichs et al.，Current Genetics.18：511-6、Oka et al.，J.MoI.Biol.147：217-26)。该kanMX模块，显性药物抗性标记之一，含有已知的大肠杆菌转座子Tn903的kanr开放阅读框(ORF)，该转座子被融合到丝状真菌棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)的TEF基因的转录和翻译控制序列。该杂合模块允许抗遗传霉素(G418)的转化体的有效选择。
如果PCR产物被使用，或者如果标记具有与靶区低的序列同源性，整合到靶区的高错误率可通常发生。相比之下，即使PCR-DNA片段被使用，用作杂合选择性标记的KanMX模块(G418标记)由于其显性抗性而保证缺失的高比率。
用于微点阵的条形码序列
为了有效地测量(6,000)基因靶向的裂殖酵母突变体文库的生长速度，实用的和系统的策略对通过基因芯片技术的生长测量是必需的。在这一点上，将用于微点阵的条形码序列导入到缺失盒中(图3)。将从6,000个菌株中分离的染色体库用作条形码区PCR扩增的模板，接下来是基因芯片上的分析，这些条形码序列以这样的方式使检测生长被药物抑制的菌株变得容易。必须给每个菌株特异地指定条形码序列，这样需要比菌株的基因组1DNA的群大两倍或三倍的群(每一个被指定在基因组DNA的上游和下游，至少两个条形码序列位于一个基因组DNA两侧)。只要满足这个条件，对条形码序列的长度没有限制。
在本发明的优选实施方式中，两个拷贝的20mer基因特异的条形码位于缺失盒的KanMX4的两侧。因为四个碱基G、A、T和C被用在条形码序列中，20mer条形码理论上可能的数目是420。本发明中使用的条形码序列是图7至55中显示的那些序列。
同源重组区
构建基因靶向的菌株的成功依赖菌株的性质，因为它由同源重组效率决定，一个菌株与另一个菌株的同源重组效率不同。然而，在相同的菌株中同源重组效率与基因组同源区域的长度是高度成比例的(Michael et al.，Gene.158：113-17；Palaniyandi et al.，Nucl Acid Res.3：2799-2800)。因此，为了有效地构建基因靶向的菌株，对应于基因组同源区的DNA片段必须将其长度优化。
根据本发明的一个实施方式，该同源重组区的长度是150bp或更长，并位于缺失盒中的每个5′和3′侧。优选地，同源重组区的长度范围是150bp至450bp。本发明更优选的实施方式提供缺失盒，其中长度为150bp至450bp的同源重组区位于每个5′和3′侧。
表2
Figure BPA00001248841500071
Figure BPA00001248841500081
用于基因打靶的缺失盒的构建
本发明的缺失盒以用转化进酵母中的缺失盒的标记基因替换靶基因这样的方式在将约～5000个酵母基因作为目标中起重要作用。作为基因靶向的杂合裂殖酵母突变体构建的先决条件，缺失盒优选地具有这样的基因结构，其中基因特异的条形码位于选择性标记基因两侧，该条形码反过来被分别插入到合适长度的染色体同源重组区(图1)。
在本发明的优选实施方式中，将KanMX4模块设计为在裂殖酵母中表达Tn903的卡那霉素抗性基因，该模块具有这样的结构，其中棉阿舒囊霉的381bp TEF启动子序列在抗性基因前，刚好在其起始密码子ATG前，抗性基因后面跟着棉阿舒囊霉的242bp TEF终止子，刚好在其终止密码子之后。当使用时，芽殖酵母(酿酒酵母)的启动子或终止子或裂殖酵母本身还充当附加的染色体同源区，导致假同源重组。因为这个原因，缺失盒中使用的启动子优选来自异源酵母。因此构建的KanMX4模块变成1,433bp长。通过转化将缺失盒导入到裂殖酵母中之后，标记基因经历与染色体靶基因的同源重组，以便将标记基因插入到染色体中，同时将靶基因删除。
在本发明的一个实施例中，在存在一对70bp长的5′和3′条形码引物时进行初次PCR，每个引物含有20bp条形码，卡那霉素抗性基因(KanR)用作模板以提供KanR条形码模块(图2)，该模块反过来被用作利用一对60～80bp引物的二次PCR的模板，每个引物由40～60bp染色体同源的重组序列和20bp长的KanR条形码模块的5′或3′终止区组成，以产生作为本发明组分有用的缺失盒。
用于缺失盒构建的四轮连续PCR、阻断PCR和基因合成
根据本发明，通过(1)四轮连续PCR；(2)阻断PCR；或(3)基因合成完成用于基因打靶的缺失盒构建，优选如下。
(1)如本文所用，术语“四轮连续PCR”意指连续进行四次的PCR。用一对约70bp长的5′和3′条形码引物进行初次PCR以提供条形码模块，该模块反过来被用作三次连续PCR的模板，一对50-mer引物用于前两次PCR，一对40-mer引物用于最后一次PCR，以产生基因特异的条形码和80bp长的基因同源重组区。
(2)如本文所用，术语“阻断PCR”意指用用于在染色体上同源重组的5′和3′DNA片段进行的阻断PCR，在具有产生的Kanr条形码模块的混合物中，通过PCR使这些DNA片段分别产生为350～500bp的长度，以提供缺失盒。
(3)术语“基因合成”与PCR完全不同，它享有下面的优点：第一，基因合成方法能通过一轮磷酸化和连接以及两轮PCR进行，而四轮PCR是由四轮PCR和四轮纯化完成的。由于它的简单，基因合成以90％或更高的成功率获得了杂合缺失突变体的全基因组构建，而阻断PCR获得80％的成功率(表2)；第二，基因合成能在96孔板上连续进行，因此提高可工作性。例如，一个熟练的工作者通过常规PCR一周能构建十个菌株。相比之下，基因合成能使工作者一周构建100个或更多个菌株，增加效率至少10倍。最后，只需要两轮PCR，而常规PCR连续进行四次PCR，这使点突变的可能性减少两倍或更多倍。例如，从根据该方法构建的每组突变体随机地选择20个菌株，使其进行PCR用于扩增大约2.1-kb的靶基因，接下来DNA测序发现0.2个碱基/1kb的比率的突变，该比率比常规PCR中的0.5个碱基/1kb的比率低两倍或更多倍。
图1是图解由根据本发明的基因合成构建的缺失盒的基因图谱。方法(1)和方法(2)的共同之处在于在PCR的基础上构建缺失盒，但是方法(3)是不同的，在于缺失盒的构建是基于合成寡核苷酸的连接，而不是基于PCR。特别地，方法(3)允许约200个杂合基因靶向的突变体的成功构建，常规PCR方法难以制备这些突变体，显示来自裂殖酵母的全部4,988个基因的高达97％的成功率。
根据本发明的一个方面，本发明提供体内药物作用方式的高通量筛选系统，其中用如上面描述构建的缺失盒制备裂殖酵母的杂合缺失突变体的文库，并且将该文库应用于定制的基因芯片。在本发明的优选实施例中，通过抗真菌剂特比萘芬的使用显示系统的性能。
杂合裂殖酵母
八孢裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)和粟酒裂殖酵母都属于裂殖酵母组。任何裂殖酵母都可用于本发明。用缺失盒转化的突变体菌株是杂合缺失突变体，其中通过同源重组将缺失盒的基因特异序列与裂殖酵母的染色体靶基因交换以从裂殖酵母的染色体中删除靶基因。
在优选的实施方式中，裂殖酵母可以是粟酒裂殖酵母，但不限于此。本发明的优选实施方式中有用的裂殖酵母——粟酒裂殖酵母是首先从非洲粟酒中分离出来的，并被广泛用作用于细胞和分子研究的模式真核生物以及用于食品诸如啤酒、面包等的生产。粟酒裂殖酵母在研究通过均等分裂增殖的细胞的细胞周期中特别有用。内含子分布在43％的粟酒裂殖酵母基因中，显示较高的真核生物的特征。发现裂殖酵母有具有约5,000个ORF(开放阅读框)的紧密基因组结构，此外，它被用作适于基因分析的材料。此外，人们认识到粟酒裂殖酵母对生命科学，特别是涉及新药研发的应用做出广泛的贡献。
根据本发明的另外的方面，本发明涉及基因靶向的裂殖酵母杂合缺失突变体，该突变体是用基因靶向的缺失盒制备的，该缺失盒包括选择性标记、用于微点阵分析的条形码基因序列和同源重组区。
根据本发明的另外的方面，本发明涉及由本发明的方法制备的基因靶向的杂合裂殖酵母突变体文库。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及用于筛选药物作用方式的方法，该方法如下进行：以化学方法处理杂合裂殖酵母突变体文库、培养以化学方法处理的文库、从培养物中分离全部基因组DNA并将分离的基因组DNA应用于微点阵基因芯片或应用于实时PCR。
提供了作为鉴别药物作用方式的工具的杂合裂殖酵母突变体文库。鉴别“药物的作用方式”对预存药物药用有效性的改进和没有副作用或几乎没有副作用的新药的开发是必要的。根据本发明的筛选药物作用方式的方法包括如下步骤：
1)用化学药品处理杂合裂殖酵母突变体文库；
2)培养化学药品处理的、杂合裂殖酵母突变体文库；
3)从培养的文库中分离基因组DNA；和
4)利用施加到微点阵基因芯片上的分离的基因组DNA，测量和分析突变体的生长速度，以检测被相对地抑制生长的菌株。
只要抑制突变体的生长，任何化学药品都可用于本发明。在本发明的优选实施例中，靶向基因ergl的抗真菌剂特比萘芬被用于检测是否药物作用方式的筛选系统良好地工作。
只要是本领域已知的，任何技术都可用于从裂殖酵母中分离基因组DNA。在本发明的优选实施例中，利用真菌的/细菌的DNA试剂盒(Zymo Research，catalog#D6005)来获得基因组DNA。
如本文所用，术语“基因芯片(gene chip)”或“基因芯片(GeneChip)”指分析遗传信息表达的工具，它典型地由在约1cm2的固相支持体上排列的数百至数万DNA寡核苷酸的一系列细微点组成。将已知的、特异的遗传信息的DNA寡核苷酸排列在芯片的表面上，并用作探针以在高严紧性的条件下杂交靶标。通常通过荧光团标记的靶标的基于荧光的检测来检测和定量探针-靶标杂交以测定靶标中核酸序列的相对丰度。这些基因芯片不但对基因研究有用，而且还能快速检测基因相关的疾病。此外，这些新的分析系统在例如选择或设计最佳定制药物中具有广谱应用。
只要识别被插入到缺失盒的基因特异的条形码序列，任何基因芯片都可用于本发明。本发明的一个优选实施方式利用具有插入其中的20-mer条形码的缺失盒和来自Affymetrix的具有序号KRIBBSP1-a520429的定制的基因芯片来检测条形码。
在本发明的可选实施方式中，用内螯合染料或荧光团标记的探针进行实时PCR，而不是基因芯片，以筛选药物作用方式。下面将给出利用探针的检测的详细描述。
已开发了TaqMan探针和循环探针用作实时PCR中的荧光探针。前者是利用TaqDNA聚合酶的5′→3′外切核酸酶活性用来测量样品中靶序列量的技术，而循环探针技术是利用由RNA和DNA组成的嵌合探针与RNase H结合的方法。在该方法中，用荧光物质标记探针的一端，用猝灭剂标记探针的另一端，猝灭剂猝灭由荧光物质发出的荧光。当这个探针与扩增产物的互补序列形成杂化物时，RNase H特异地切割这个探针的RNA区域，导致强的荧光发射。下面将给出用于筛选药物作用方式的TaqMan探针技术的详细描述。
在本发明的优选的实施方式中，除了共同引物外，用Taqman探针进行实时PCR。TaqmanTM探针是在5′端用报道荧光团标记、在3′端用猝灭剂标记的寡核苷酸。PCR期间，在退火步骤，探针在正向引物和反向引物之间与PCR产物的内部区域特异地退火，荧光被猝灭剂猝灭。聚合酶然后实施引物的延伸并复制TaqManTM探针结合的模板，聚合酶的5′外切核酸酶活性切割探针，从猝灭剂的紧密附近释放报道分子。所以，报道染料的荧光强度增加并能被检测到以测定靶基因的表达。在本发明中，可将TaqmanTM探针构建为具有条形码序列作为寡核苷酸序列。在这种情况下，具有每个TaqmanTM探针的实时PCR产生关于相应条形码实时表达的定量的数据，在此基础上，显著增加的或降低的区域能被视为药物作用方式。
根据本发明的另一个方面，本发明涉及新颖的药物筛选试剂盒，包括杂合裂殖酵母突变体文库。
将本发明的药物筛选试剂盒用在筛选药物作用方式的方法中。更具体地，通过1)在含有各自的药物候选物的培养基中培养筛选试剂盒的杂合裂殖酵母突变体文库和2)比较地分析裂殖酵母突变体的生长以检测生长抑制的裂殖酵母突变体，筛选试剂盒被用于筛选新颖的药物以及药物作用方式。
发明的实施方式
可通过下面的实施例获得对本发明更好的理解，这些实施例被提出以举例说明本发明但不被解释为限制本发明。
实施例1：通过四轮连续PCR或阻断PCR的缺失盒的构建
能以两种不同的PCR技术构建缺失盒：四轮连续PCR和阻断PCR。这两个基于PCR的方法在预先制备Kanr条形码模块中是共同的。KanMX4的碱基序列在本领域是熟知的，不具体描述。用一对70-mer 5′和3′条形码引物进行初次PCR，每个引物含有基因特异的条形码，KanMX4充当模板以制备Kanr条形码模块(图2)。在用溴化乙锭(EtBR)染色的琼脂糖凝胶上电泳之后，通过在UV灯下切除从凝胶中提取因此制备的Kanr条形码模块。
用于构建缺失盒的四轮连续PCR与用于构建基因靶向的芽殖酵母或裂殖酵母突变体的常规PCR相似，但是其不同在于将80bp同源重组区加到缺失盒的任何一端(Giaever et al.，Nature Genetics 14：450-56)。Giaever博士等通过在Kanr条形码模块充当模板的一个PCR中提供45bp重组区而在靶向芽殖酵母全部6000个基因的90％或更多基因中获得成功。然而，对于裂殖酵母，45bp重组区太短了，不能有效地在基因组上诱导同源重组。因此，将用于基因靶向的裂殖酵母突变体构建的方法进行改造，这样连续进行三次PCR，一对50-mer引物用于前两轮PCR，一对40-mer引物用于最后一轮PCR，以产生80bp同源重组区和基因特异的条形码(图3)。
这个四轮连续PCR只成功地应用于裂殖酵母的全部4,988个基因的四分之一，在突变体菌株构建中具有50％或更高成功率，但是对于剩余的四分之三基因则失败了。因此，使用阻断PCR延伸同源重组区(图4)。在阻断PCR中，用于染色体同源重组的5′和3′DNA片段每个长350～500bp，通过PCR分别合成，然后和纯化的Kanr条形码模块一起进行阻断PCR以制备缺失盒，其中5′和3′350-500bp DNA片段分别融合到Kanr条形码模块的5′和3′端。所以，缺失盒中的染色体同源重组区从四轮连续PCR的80bp被延伸到350～500bp，从而将缺失突变体的构建效率从50％显著地增加90％。
实施例2.通过基因合成的缺失盒的构建
甚至上面描述的PCR技术未能制备基因靶向的突变体多达全部基因的4％。原因是因为基因的启动子和终止子中腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的高含量不允许常规PCR的引物位点。考虑到这个问题，利用基因合成方法。本发明是第一个在构建缺失盒和制备缺失裂殖酵母突变体中使用基因合成的。
将缺失盒设计成由三个片段组成：1)带有5′常见连接体序列(common likersequence)的5′染色体同源区和5′条形码，2)卡那霉素抗性基因(Kan1)，和3)3′条形码和带有3′常见连接体序列的3′染色体同源区。为了将这三个片段连接成一行，将重叠连接寡核苷酸序列排列在片段之间以相互连接(图5)。将250bp的长度作为染色体同源区的长度，这是决定突变体构建效率的最重要因素。5′染色体同源区与自起始密码子ATG向着启动子方向延伸250bp的染色体核苷酸序列相同，同时3′染色体同源区与自终止密码子TGA、TAG或TAA向着多聚-A方向延伸250bp的染色体核苷酸序列相同。
5′和3′染色体同源区，每个长250bp，在基因之间是不同的，省略了它们的核苷酸序列的描述，因为本领域的任何一个技术人员都能推断它们。
将被相互连接的片段中的连接寡核苷酸序列设计成互相重叠，片段之间没有缺口，以便只通过重叠寡核苷酸序列获得双链缺失盒DNA片段，虽然片段之间具有切口。在Santa Lucia计算结果的基础上，将所有寡核苷酸序列设计成具有60±3℃的Tm值(Santa Lucia PNAS.95：1460-5)。将两个相对短的、12～16bp长的寡核苷酸序列分别排列在缺失盒的相反末端区域，产生平端。然后，连接酶的处理封闭该切口以产生完整的缺失盒DNA模板。
实施例3：缺失盒的转化和基因靶向突变体的鉴别
使用醋酸锂方法，将通过实施例1和2制备的缺失盒转化进二倍体裂殖酵母SP286菌株(ade6-M210/ade6-M216、ura4-D18/ura4-D18、leu1-32/leu1-32)(Moreno et al.，Methods Enzymol.194：795-823)。将转化的菌株铺在YES琼脂板上，在30℃培养3～4天以形成菌落。进行菌落PCR以检查是否期望的基因被靶向。从琼脂板上生长的菌落边缘挑取少量的细胞，并将其悬浮在去离子水中。将一部分悬液用一对引物进行PCR。如图6所示，利用用于插入到染色体中的缺失盒5′侧的一对CP5和CPN1或CPN10，和利用用于缺失盒3′侧的一对CP3和CPC1或CPC3，进行菌落PCR。CP5和CP3分别位于相应染色体同源区上游和下游100～200bp处。CPN1和CPC1位于KanMX4基因内，分别距其5′和3′端200bp，而CPN10和CPC3也位于KanMX4基因内，分别距其5′和3′端300bp。相应地，如此获得的菌落PCR产物具有300～400bp的长度加上染色体同源区的长度，即80～450bp，总计全长500～1,000bp。对于菌落PCR的反应条件，可参考韩国专利号10-0475645。
没有详细描述CP5和CP3的碱基序列——根据基因它们是不同的，因为它们对本领域的技术人员来说是明显的。在下面的表3中给出了CPN1、CPN10、CPC1和CPC3的碱基序列和它们的序列识别号。
表3
Figure BPA00001248841500131
实施例4：基因特异的条形码碱基序列的测定和其PCR扩增
为了使用微点阵基因芯片系统地鉴别菌株，必须需要基因特异的条形码，这将在下面的实施例5中描述。在这一点上，将两个基因特异的条形码，每个20bp，分别给予缺失盒的5′和3′侧(图1)。根据Sanger研究所的基因数据库，4,988个基因出现在裂殖酵母中。由此，如图7至55所示，将全部的9,976个条形码分配给4,988个基因，每个基因两个。条形码以这样的方式命名，延伸UP或DN跟在相应基因的系统名称后。例如，对基因SPAC1002.09c特异的条形码，对于5′向上标签(上游标签，up-tag)命名为SPAC1002.09c_UP，鉴定为SEQ ID NO.18，对于3′向下标签(下游标签down-tag)命名为SPAC1002.09c_DN，鉴定为SEQ ID NO.19(图7)。条形码因此是不存在于裂殖酵母染色体上的人工DNA序列，并根据计算机算法被设计为具有60±1℃的Tm值。
实施例5：使用基因靶向的二倍体裂殖酵母突变体文库进行的药物作用方式的筛 选
根据本发明，将基于单倍性不足的在芽殖酵母中筛选药物作用方式的Giaever方法的修改应用于裂殖酵母(图56)(Giaever et al.，Nature Genetics 14：450-56、Pierce etal.，Nature Protocols 11：2958-2974、Pierce et al.，Nat Methods.：601-3)。
利用基因芯片的药物作用方式的分析包括下面七个步骤：1)菌株文库的集中，2)冷冻菌株库的活化、化学处理和取样，3)染色体DNA的分离和条形码标签的PCR扩增，4)来自Afifymetrix的基因芯片的定货，5)杂交，6)染色、漂洗和比色法，和7)结果分析。
1)菌株文库的集中
以图57图解的方式制备突变体被均等混合的库。因为不容易同时处理4,884个基因靶向的杂合突变体文库，所以将它们分成96个突变体的单位包装。详细地，将96个突变体在含有浓度为200mg/ml的G418的YES琼脂板上30℃培养3天，接下来在96孔板上30℃温育3天。将在51块板上培养的菌株刮出，悬浮在5.5ml各自的2×YES肉汤中。加入甘油至30％的浓度之后，将51个培养物以1ml的体积等分，-80℃储存。将低温存储中的所有的51个1ml等分试样集中在一起以提供突变体文库，然后将该文库以1ml的体积等分，-80℃储存。使用总数为5×107的细胞，以便将至少10,000个细胞分配到每一轮筛选药物作用方式的一个突变体菌株。
2)冷冻菌株库的活化、化学处理和取样
化学处理之前，活化储存在-80℃的菌株库。解冻之后，将菌株库的等分试样首先以O.D600＝0.2接种到YES肉汤中，并在25℃生长到0.D600＝2.0。将这些活化的菌株稀释到0.D60O＝0.2的密度，并用化学药品在合适的浓度处理，接下来在总共20～30个传代培养物中每三个传代培养物从中取样一次(裂殖酵母的一个传代培养典型地需要4小时)。由于当菌株没有营养物的影响下必须以恒定的速度生长时，容易测定化学药品对细胞生长的抑制活性，所以将取样的菌株在含有化学药品的新鲜肉汤中再次以0.D60O＝0.2的密度稀释。将取自无化学药品的肉汤中的样品用作对照。将样品离心以产生细胞沉淀，然后将该沉淀储存于-80℃。同时分离所有样品的基因组DNA并进行基因芯片分析。
为了确定用于处理的化学药品的浓度，首先测量50％抑制浓度(IC50)。野生型SP286菌株在YES肉汤中生长到0.D600＝0.2，用5至10倍系列稀释的化学药品接种至O.D600＝0.1，接下来30℃温育24小时。在化学药品的每个浓度，测量培养物的最终O.D600值，然后将该值对Log[化学药品浓度]作图。在这些图的基础上，使用Prism软件(version 3.0，GraphPad Software Inc.，San Diego，CA)自动计算出IC50值。科学经验使在适当的IC50值周围确定化学药品的浓度成为可能。
3)染色体DNA的分离和条形码标签的PCR扩增
使用真菌/细菌DNA试剂盒(Zymo Research，目录#D6005)，从200mg的细胞样品中分离2～4μg基因组DNA。20～50倍稀释的分离基因组DNA与200倍稀释的Pico Green染料(Pico
Figure BPA00001248841500151
dsDNA检测试剂盒)(Invitrogen Inc.目录#P 11495)以1∶1的体积比混合，接下来用NanoDrop(ND-1000，NanoDrop Inc.)定量。每个样品的200ng用于标记PCR。
为了作为探针在基因芯片中使用，只有存在于分离的基因组DNA中的条形码通过使用生物素标记引物的PCR被扩增。为了这个目的，首先，测定用于20-bp条形码扩增的共同引物的碱基序列。设计不与裂殖酵母基因组形成非特异结合的共同引物很重要。下面的表4给出了通过算法和系列实验确定的碱基序列。将在条形码PCR扩增中的用作标记的生物素偶联到指向卡那霉素抗性基因的引物的5′端。5′和3′条形码的PCR产物的长度是70bp和73bp。下面的表5中概述了用于PCR扩增的溶液和条件。PCR完成之后，通过在3％琼脂糖凝胶中对5μl PCR反应进行电泳分析PCR产物的长度和量，并将PCR产物储存在4℃冰箱中直到杂交。每次杂交使用约30μlPCR产物。
表4
Figure BPA00001248841500152
表5
Figure BPA00001248841500153
4)来自Afifymetrix的基因芯片的定货
使用来自Afifymetrix的具有系列号KRH3BSP1-a520429的定制基因芯片来识别特异地插入到突变体菌株中的20bp条形码(图58)。在这个具有0.8×0.8cm大小的DNA芯片上安置100,000个探针，每个探针具有11×11μm的特征。探针由1)三份(总共60,000)与5′和3′条形码(每个10,000)完全匹配(PM)和错配(由于分配到条形码中间位点的错配碱基)；2)10,000个对照探针，用于最小化非特异的杂交引起的假阳性信号；3)20,000个条形码备用探针；和4)对指明制造者Affymetrix和寡核苷酸文本和区室化必要的10,000个基本结构探针组成。
5)杂交
来自Affymetrix的基因芯片与3)中通过PCR获得的探针之间的杂交是如下进行的。如表6所示，首先，将除了生物素标记的条形码探针外还包括生物素标记的文本寡核苷酸混合物和阻断寡核苷酸混合物的杂交溶液在1.5ml管中混合。生物素标记的文本寡核苷酸混合物在基因芯片上分析时给光学识别系统一个标准。由8个寡核苷酸组成的阻断寡核苷酸混合物用于阻断条形码内的共同引物和引物与条形码之间的缺口以只暴露单链中20bp条形码，由此允许正义单链与基因芯片的反义探针寡核苷酸杂交。8个寡核苷酸的每一个被用作300pM贮存液。在阻断寡核苷酸混合物中，5U-Block、K5U-Block、5U-Block(rev comp)和K5U-Block(rev comp)每个以37.5pmole/μl的浓度存在，而3U-Block、K3U-Block、3U-Block(rev comp)和K3U-Block(revcomp)每个以12.5pmole/μl的浓度存在。在98℃煮沸5min之后，杂交溶液即刻在冰水中退火以暴露单链中20bp正义条形码序列。将140μl杂交溶液注入用140μl杂交缓冲液预处理5min的基因芯片，接下来在42℃杂交16小时。
表6
Figure BPA00001248841500162
Figure BPA00001248841500171
6)染色和漂洗和比色法
杂交完成之后，使用流控技术站(Afrymetrix)将基因芯片用藻红蛋白结合的链霉抗生物素蛋白染色。链霉抗生物素蛋白坚固地结合到生物素上以产生荧光，提供与基因芯片上的探针杂交的生物素标记条形码的定量。
根据制造者推荐的程序使用流控技术站，使用染色溶液(600μl：20×SSPE 180.57μl+50×Denhart′s溶液11.94μl+10％Tween20 0.597μl+藻红蛋白结合的链霉抗生物素蛋白1.019μl+去离子水405.874μl)和漂洗溶液(漂洗A：1升中20×SSPE 300ml、10％Tween 1ml、蒸馏水699ml；漂洗B：1升中20×SSPE 150ml、10％Tween 1ml、蒸馏水849ml)。此后，用扫描仪3000 G7(Affymetrix)扫描基因芯片以检测荧光。
表7
  条件   轮号   注释
  漂洗A1回收混合物   0
  漂洗A1温度(℃)25
  漂洗A1循环的数目2
  每个漂洗A1循环的混合物  4
  漂洗B回收混合物  0
  漂洗B温度(℃)  42
  漂洗B循环的数目  6
  每个漂洗B循环的混合物  4
  染色温度(℃)  25
  第一次染色时间(秒)  0   (虚设步骤)
  漂洗A2回收混合物  0   (虚设步骤)
  漂洗A2温度(℃)25
  漂洗A2循环的数目1
  每个漂洗A2循环的混合物  2
  第二次染色时间(秒)  600
  第三次染色时间(秒)  0   (虚设步骤)
  漂洗A3回收混合物  0   (虚设步骤)
  漂洗A3温度(℃)25
  漂洗A3循环的数目  6
  每个漂洗A3循环的混合物  4
  保温温度(℃)  25
7)结果分析
PCR扩增的基因特异正义条形码和安置在基因芯片上的反义寡核苷酸探针之间的结合能通过检测的荧光强度进行定量。将测量的荧光值储存在具有扩展名cel的文件中。强的荧光强度表示具有相应基因的细胞正占主导优势地生长。另一方面，弱的荧光强度表示细胞生长的抑制。基于ANOVA/ANCOVA模型，分析来自基因芯片的荧光数据，以获得生长被抑制的杂合基因靶向突变体。
根据ANCOVA模型，药物诱导的细胞生长抑制被表示为减少的传代数，根据下面的公式能获得减少的传代数。
单位时间里(12小时)药物引起的减少的传代数＝单位时间里(12小时)药物处理时改变的传代数-单位时间里(12小时)缺少药物时改变的传代数
根据下面的公式计算传代数：
传代数＝Log2(基因X在预设时间的荧光强度)-Log2(基因X在先前时间的荧光强度)
实施例6：使用基因芯片进行的特比萘芬作用方式的筛选和验证
为了用基因芯片筛选特比萘芬的作用方式，首先，用在上面提到的方法中获得的IC50测量结果确定药物的处理浓度。在这一点上，通过用特比萘芬以0.1nM、1nM、5nM、10nM、50nM、100nM、500nM和1μM的剂量处理细胞获得药物诱导的对细胞生长的抑制的相对速度。用Prism软件的分析确定IC50＝40nM(图11)。
如表8所示，用40nM特比萘芬处理菌株库之后，每三代(大约12小时)取样，直到30～35代，对13个对照和12个药物处理的样品进行基因芯片分析。
表8
Figure BPA00001248841500201
将通过ANCOVA分析排在前10(或前20)的基因候选物——根据用特比萘芬处理之后随着时间推移的细胞生长所定义——概述在下面的表9中。被称作特比萘芬作用方式的erg1基因编码鲨烯单加氧酶，该酶在膜组分麦角固醇的生物合成中起重要作用。用传统芽殖酵母进行的特比萘芬作用方式的筛选也导致erg1基因的第一排列。这种符合证明了，利用根据本发明的基因靶向的裂殖酵母突变体文库的筛选药物作用方式的系统正确地工作。
由于用基因芯片检测的药物作用方式可能包括产生实验误差的假阳性信号和假芯片分析，所以所有的前10个药物作用方式，除了非特异的核糖体相关基因，都再次在含有特比萘芬的YES琼脂板上培养。如图60所示，erg1和pmm1基因获得了与芯片中相同的结果，而smb1基因与芯片结果不同。因此，证实了红框内的erg1和pmm1基因为特比萘芬的靶标。
合在一起，实施例中获得的数据显示本发明在准确寻找新颖的药物作用方式以及已知的靶蛋白中非常有用。
表9
Figure BPA00001248841500202
Figure BPA00001248841500211
[产业适用性]
如迄今所描述的，本发明提供在其两端具有两个20mer基因特异条形码和两个250～350bp同源区的缺失盒，该缺失盒在构建基因靶向的酵母突变体中非常有用。杂合基因靶向酵母突变体文库能用于在基因组水平系统地筛选药物作用方式，因此提供新药的有效研发。
尽管为了示例的目的，本发明的优选实施方式已被公开，但是本领域的技术人员将理解，各种修改、添加和替换是可能的，不背离如所附权利要求所公开的本发明的范围和精神。

Claims (14)

1.构建基因靶向的杂合裂殖酵母突变体的方法，包括将用于基因打靶的缺失盒导入到裂殖酵母菌株中，所述缺失盒包括选择性标记基因；用于微点阵的、分别定位于所述选择性标记基因两侧的一对基因特异的条形码碱基序列；和被分别分配到定位在所述选择性标记基因的上游和下游的所述条形码碱基序列侧面的一对同源重组区，其中每个同源重组区的长度大于150bp。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述每个同源重组区的长度范围是150bp至450bp。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述每个同源重组区的长度范围是250bp至450bp。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述缺失盒是通过四轮连续PCR、阻断PCR或基因合成构建的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述每个条形码碱基序列的长度范围是20至30bp。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述条形码碱基序列选自图7至55显示的碱基序列，所述条形码碱基序列中的两个被分别分配在所述选择性标记基因的上游和下游。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择性标记基因是卡那霉素抗性基因。
8.被缺失盒转化的、基因靶向的杂合裂殖酵母菌株，所述缺失盒包括选择性标记基因；用于微点阵的、分别定位于所述选择性标记基因两侧的一对基因特异的条形码碱基序列；和被分配到各自的条形码碱基序列侧面的一对同源重组区，所述条形码碱基序列选自图7至55显示的碱基序列，其中两个被分别分配在所述选择性标记基因的上游和下游。
9.根据权利要求8所述的基因靶向的杂合裂殖酵母菌株，其中所述选择性标记基因是卡那霉素抗性基因。
10.将缺失盒导入到裂殖酵母每个基因的基因靶向的杂合裂殖酵母突变体文库，其中所述缺失盒包括选择性标记基因和分别定位于裂殖酵母每个基因的所述选择性标记基因两侧的一对基因特异的条形码碱基序列，所述基因特异的条形码碱基序列选自图7至55显示的碱基序列。
11.根据权利要求10所述的基因靶向的杂合裂殖酵母突变体文库，其中所述选择性标记基因是卡那霉素抗性基因。
12.筛选药物作用方式的方法，包括：
1)用化学药品处理权利要求10或11所述的基因靶向的杂合裂殖酵母突变体文库；
2)培养所述化学处理的裂殖酵母突变体文库；
3)从所述培养的文库中分离基因组DNA；和
4)利用施加到微点阵基因芯片上的所述分离的基因组DNA测量和分析所述突变体的生长速度，以检测相对生长被抑制的菌株。
13.筛选药物作用方式的方法，包括：
1)用化学药品处理权利要求10或11所述的基因靶向的杂合裂殖酵母突变体文库；
2)培养所述化学处理的裂殖酵母突变体文库；
3)从所述培养的文库中分离基因组DNA；和
4)利用所述分离的基因组DNA通过定量实时PCR测量和分析所述突变体的生长速度，以检测相对生长被抑制的菌株。
14.用于药物作用方式的筛选试剂盒，包括权利要求10所述的基因靶向的杂合裂殖酵母突变体文库。
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