JP2024509446A - 細胞におけるタンパク質コード変異体の発現の分析 - Google Patents
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Abstract
細胞におけるタンパク質コード変異体の発現の分析を本明細書で提供する。方法は、細胞におけるＤＮＡのタンパク質コード領域を、タンパク質コード領域の変異体及びその変異体を同定する第１のバーコードを含むドナーベクターで置換することを含むことができる。細胞は、変異体の発現及び第１のバーコードの発現を含むｍＲＮＡを生成し得る。細胞に対応する第２のバーコードは、ｍＲＮＡにカップリングされ得る。第２のバーコードがカップリングされたｍＲＮＡは、相補的ｃＤＮＡに逆転写され得る。ｃＤＮＡを配列決定することができる。アンプリコン配列決定を使用してドナーベクター又はｃＤＮＡを配列決定することができる。ドナーベクター配列とｃＤＮＡ配列とを相関させて、変異体及び細胞によるその変異体の発現を同定することができる。【選択図】図２
Description
（関連出願の相互参照）
本出願は、それらの各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれている、以下の出願の利益を主張する：
２０２１年３月９日に出願され、「Ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｓｓａｙｓ ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題された米国仮特許出願第６３／１５８，４９２号、
２０２１年３月１８日に出願され、「Ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｓｓａｙｓ ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題された米国仮特許出願第６３／１６２，７７５号、
２０２１年３月１９日に出願され、「Ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｓｓａｙｓ ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題された米国仮特許出願第６３／１６３，３８１号、及び
２０２１年７月２８日に出願され、「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｄｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｓ」と題された米国仮特許出願第６３／２２６，４２４号。
本出願は、それらの各々の全内容が参照により本明細書に組み込まれている、以下の出願の利益を主張する：
２０２１年３月９日に出願され、「Ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｓｓａｙｓ ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題された米国仮特許出願第６３／１５８，４９２号、
２０２１年３月１８日に出願され、「Ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｓｓａｙｓ ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題された米国仮特許出願第６３／１６２，７７５号、
２０２１年３月１９日に出願され、「Ｇｅｎｏｍｉｃ ｌｉｂｒａｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ａｓｓａｙｓ ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題された米国仮特許出願第６３／１６３，３８１号、及び
２０２１年７月２８日に出願され、「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ｃｏｄｉｎｇ Ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｓ」と題された米国仮特許出願第６３／２２６，４２４号。
（発明の分野）
本出願は、細胞におけるタンパク質コード変異体を分析するための組成物及び方法に関する。
本出願は、細胞におけるタンパク質コード変異体を分析するための組成物及び方法に関する。
（配列表に関する記述）
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、８５４９１０３７１６＿ＳＬ．ｔｘｔである。テキストファイルは、約５．７３ＫＢであり、２０２２年２月１８日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書に参照により組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、８５４９１０３７１６＿ＳＬ．ｔｘｔである。テキストファイルは、約５．７３ＫＢであり、２０２２年２月１８日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
変異体の機能又はゲノム編集の効果を決定しようと試みるために、特異的表現型アッセイが使用されてきたが、スループットは低い。例えば、そのようなアッセイは、ただ１つの変異体又は編集の機能に関する情報を提供する場合があり、他の変異体の機能に関する情報は提供しない場合がある。単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）が商業的に利用可能であり、細胞からトランスクリプトームを得て配列決定するために使用することができる。
細胞におけるタンパク質コード変異体の発現の分析を本明細書で提供する。
本明細書のいくつかの例は、細胞におけるＤＮＡのタンパク質コード領域の発現を分析する方法を提供する。方法は、細胞におけるＤＮＡのタンパク質コード領域を、タンパク質コード領域の変異体及びその変異体を同定する第１のバーコードを含むドナーベクターで置換することを含み得る。細胞は、変異体の発現及び第１のバーコードの発現を含むｍＲＮＡを生成し得る。方法は、細胞に対応する第２のバーコードをｍＲＮＡにカップリングすることを含み得る。方法は、第２のバーコードがカップリングされたｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することを含み得る。方法は、ｃＤＮＡを配列決定することを含み得る。方法は、アンプリコン配列決定を使用してドナーベクター又はｃＤＮＡを配列決定することを含み得る。方法は、ドナーベクター配列とｃＤＮＡ配列とを相関させて、変異体及び細胞による変異体の発現を同定することを含み得る。
いくつかの例では、ドナーベクターはプロモーター領域を含む。いくつかの例では、バーコードは、プロモーター領域と変異体との間に位置する。いくつかの例では、ドナーベクターは、右ホモロジーアーム及び左ホモロジーアームを含み、変異体及び第１のバーコードは、右ホモロジーアームと左ホモロジーアームとの間にある。いくつかの例では、プロモーター領域は、逆方向プロモーター領域を含む。いくつかの例では、逆方向プロモーター領域は、第１のバーコードと変異体との間に位置する。いくつかの例では、タンパク質コード領域の変異体の発現は順方向であり、第１のバーコードの発現は逆方向である。
加えて、又は代わりに、いくつかの例では、方法は、第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスを使用して、変異体、第１のバーコード、及び右ホモロジーアームを含み、左ホモロジーアームを実質的に除外する、ドナー配列の第１のアンプリコンを生成することを更に含む。方法は、第２のＰＣＲプロセスを使用して、変異体及び第１のバーコードを含み、右ホモロジーアーム及び左ホモロジーアームを実質的に除外する、第１のアンプリコンの第２のアンプリコンを生成することを含み得る。加えて、又は代わりに、いくつかの例では、ドナーベクターを配列決定することは、第２のアンプリコンを配列決定することを含む。加えて、又は代わりに、いくつかの例では、第２のアンプリコンは、約１０００塩基以下の長さを有する。
加えて、又は代わりに、いくつかの例では、ｍＲＮＡは、変異体の発現を含む第１のｍＲＮＡ分子と、第１のバーコードの発現を含む第２のｍＲＮＡ分子とを含む。いくつかの例では、第２のバーコードをｍＲＮＡにカップリングすることは、第２のバーコードの第１の分子を第１のｍＲＮＡ分子にカップリングすること及び、第２のバーコードの第２の分子を第２のｍＲＮＡ分子にカップリングすることを含む。加えて、又は代わりに、いくつかの例では、ｃＤＮＡは、変異体の逆転写及び第２のバーコードを含む第１のｃＤＮＡ分子と、タンパク質コード領域の逆転写及び第２のバーコードを含む第２のｃＤＮＡ分子とを含み、ｃＤＮＡを配列決定することは、第１及び第２のｃＤＮＡ分子を配列決定することを含む。
加えて、又は代わりに、いくつかの例では、初期タンパク質コード領域を置換することは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ガイドＲＮＡリボ核タンパク質（Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ＲＮＰ）を使用して細胞のＤＮＡを切断することと、ドナーベクターを使用してＤＮＡ中の切断を修復するために相同組換え修復（homology-directed repair、ＨＤＲ）を使用することと、を含む。いくつかの例では、方法は、第１及び第２のプラスミドを細胞に挿入することを更に含む。ドナーベクターは、第１のプラスミド上に位置し得る。細胞は、第２のプラスミドを使用してＣａｓ－ｇＲＮＡ ＲＮＰを発現してもよい。
加えて、又は代わりに、いくつかの例では、ドナーベクターはレンチウイルスベクターを含む。
加えて、又は代わりに、いくつかの例では、ドナーベクターはピューロマイシン耐性遺伝子を更に含み、方法は、細胞をピューロマイシンと接触させて細胞を濃縮することを更に含む。いくつかの例では、第１のバーコードはピューロマイシン耐性遺伝子のＵＴＲ末端に位置する。
加えて、又は代わりに、いくつかの例では、方法は、細胞における変異体から第１のバーコードを切断することを更に含む。
本明細書のいくつかの例は、細胞の集合体におけるＤＮＡのタンパク質コード領域の発現を分析する方法を提供する。方法は、細胞の各々におけるＤＮＡの初期タンパク質コード領域を、タンパク質コード領域の変異体及びその変異体を同定する第１のバーコードを含むドナーベクターで置換することを含み得る。細胞は、互いに異なる変異体を受け取ってもよい。方法は、細胞からｍＲＮＡを得ることを含み得る。各細胞からのｍＲＮＡは、その細胞におけるタンパク質コード領域の変異体の発現及び第１のバーコードの発現を含み得る。方法は、各細胞からのｍＲＮＡに、その細胞に対応する第２のバーコードをカップリングすることを含み得る。方法は、第２のバーコードがカップリングされたｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することを含み得る。方法は、ｃＤＮＡを配列決定することを含み得る。方法は、アンプリコン配列決定を使用してドナーベクター又はｃＤＮＡを配列決定することを含み得る。方法は、ドナーベクター配列とｃＤＮＡ配列とを相関させて、細胞の各々における変異体及びその細胞によるその変異体の発現を同定することを含み得る。
いくつかの例では、異なる変異体は飽和突然変異誘発されている。
本明細書のいくつかの例は、細胞の集合体を提供する。集合体中の各細胞のＤＮＡは、タンパク質コード領域の変異体及びその変異体を同定する第１のバーコードを含み得る。細胞は、互いに異なる変異体を有し得る。
いくつかの例では、異なる変異体は飽和突然変異誘発されている。
本明細書中のいくつかの例は、細胞の集合体からのポリヌクレオチドの集合体を提供する。ポリヌクレオチドは、細胞の各々からの第１及び第２のｍＲＮＡ分子を含み得る。各細胞について、第１のｍＲＮＡ分子は、その細胞に対応するバーコードの第１の分子及びその細胞における変異体の発現を含み、第２のｍＲＮＡ分子は、その細胞に対応するバーコード及びその変異体に対応する第１のバーコードの発現を含む。
いくつかの例では、異なる変異体は飽和突然変異誘発されている。
本明細書のいくつかの例は、方法を提供する。方法は、外来転写物の末端にセミランダムバーコードを含むバーコード化ホモロジードナーベクターを提供することを含み得る。ドナーベクターは、ホモロジーアーム及び突然変異を含み得る。方法は、バーコード化ホモロジードナーベクターを編集対象のエクソンの近傍にノックインして、エクソン上に変異体を作製することを含み得る。方法は、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ガイドＲＮＡリボ核タンパク質（Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ＲＮＰ）を使用して変異体を切断することを含み得る。
いくつかの例では、バーコードは、発現され、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑで検出可能であり得るように、ドナーベクターのＵＴＲ末端に配置される。
いくつかの例では、ドナーベクターはピューロマイシン耐性遺伝子を含む。
いくつかの例では、バーコード化ホモロジードナーベクターを提供することは、第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ゲノム編集された対立遺伝子を有するノックイン領域を特異的に増幅することと、第１のＰＣＲの生成物を鋳型として使用する第２のＰＣＲを使用して、バーコードをアンプリコン中の変異体に連結することと、第２のＰＣＲからの生成物を使用してアンプリコン配列決定を実施することと、を含んでもよい。
いくつかの例では、アンプリコン配列決定はバーコード及び変異体の両方をカバーする。
本明細書のいくつかの例は、方法を提供する。方法は、飽和突然変異誘発された変異体ライブラリーのＵＴＲ領域にセミランダム変異体バーコードを付加することを含み得る。方法は、細胞バーコードを変異体バーコードにカップリングすることを含み得る。方法は、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑで変異体バーコードを読み出すことを含み得る。方法は、別個の配列決定操作を使用して、変異体バーコードをライブラリーの変異体に連結することを含み得る。
いくつかの例では、セミランダム変異体バーコードは、変異体ライブラリーのプロモーターの下流又はターミネーターの上流に配置され得る。
いくつかの例では、変異体バーコードをライブラリーの変異体に連結することは、各アンプリコンが変異体のそれぞれのセグメントをバーコードに連結するように、一方の側でバーコードを増幅するための１セットのプライマー、及び他方の側で変異体を増幅するための別のセットのプライマーを使用することによって、タイル状ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アンプリコンを生成することを含み得る。
本明細書におけるいくつかの例は、セミランダムバーコードを含むレンチウイルスベクターを提供する。
本明細書におけるいくつかの例は、複数のレンチウイルスベクターを含む組成物を提供し、レンチウイルスベクターの各々は、異なるセミランダムバーコードを含む。
いくつかの例では、組成物は、複数のレンチウイルスベクターと接触している突然変異誘発飽和変異体ライブラリーを更に含む。
本明細書に記載されている利益を実現するため、本明細書に記載されている本開示の態様の各々の任意のそれぞれの特徴／例は、任意の適切な組み合わせで一緒に実施されてもよいこと、及びこれらの態様のいずれか１つ以上からの任意の特徴／例は、任意の適切な組み合わせで、本明細書に記載されている他の態様の特徴のいずれかと一緒に実施されてもよいことを理解すべきである。
細胞におけるタンパク質コード変異体の発現の分析を本明細書で提供する。
本明細書におけるいくつかの例は、バーコード化タンパク質コード変異体のライブラリーに関する。ライブラリーの変異体をそれぞれの細胞に導入し、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を使用して、各変異体の細胞のそれぞれの発現を分析することができる。並行して、ＤＮＡ配列決定を用いて変異体を配列決定することができる。異なるバーコードを使用して、各変異体のＤＮＡ配列を、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑによって測定された対応する細胞によるその変異体の発現と相関させることができる。いくつかの例では、ライブラリー中のバーコード化変異体を飽和突然変異誘発して、タンパクのコード領域中の全ての塩基を他の３つの代替塩基に突然変異誘発することができ、それによって、各コドンに対して最大９個の異なるアミノ酸又は終止コドンを生成することができる。したがって、遺伝子のコード領域上のあらゆる可能な変異体から生じる発現を分析することができる。しかしながら、任意の適切にゲノム編集された変異体を導入し、得られた発現を分析してもよいことが理解されよう。ライブラリーで使用されるバーコード化変異体の特定の種類にかかわらず、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ及びＤＮＡ配列決定を相乗的に使用して、スケーラブルな、高度に多重化された、ハイスループットな様式で、細胞によるそれらの変異体の発現を分析することができる。
最初に、本明細書で使用されるいくつかの用語を簡単に説明する。次に、タンパク質コード変異体のライブラリーを生成及びアッセイするためのいくつかの例示的な操作及び組成物を記載する。
用語
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。「含むこと（including）」という用語、並びに「含む（include）」、「含む（includes）」及び「含まれた（included）」などの他の形態の使用は、限定ではない。「有すること（having）」という用語、並びに「有する（have）」、「有する（has）」及び「有した（ｈａｄ）」などの他の形態の使用は、限定ではない。本明細書で使用される場合、移行句中か又は請求項の本文中のいずれであっても、「含む（comprise）」及び「含む（comprising）」という用語は、オープンエンドの意味を有するものとして解釈されるべきである。すなわち、上記の用語は、語句「少なくとも有する」又は「少なくとも含む」と同義であると解釈されるべきである。例えば、プロセスの文脈において使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、プロセスが少なくとも列挙された工程を含むが、追加の工程を含み得ることを意味する。化合物、組成物、又はデバイスの文脈で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、化合物、組成物、又はデバイスが少なくとも列挙された特徴又は構成要素を含むが、追加の特徴又は構成要素も含み得ることを意味する。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。「含むこと（including）」という用語、並びに「含む（include）」、「含む（includes）」及び「含まれた（included）」などの他の形態の使用は、限定ではない。「有すること（having）」という用語、並びに「有する（have）」、「有する（has）」及び「有した（ｈａｄ）」などの他の形態の使用は、限定ではない。本明細書で使用される場合、移行句中か又は請求項の本文中のいずれであっても、「含む（comprise）」及び「含む（comprising）」という用語は、オープンエンドの意味を有するものとして解釈されるべきである。すなわち、上記の用語は、語句「少なくとも有する」又は「少なくとも含む」と同義であると解釈されるべきである。例えば、プロセスの文脈において使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、プロセスが少なくとも列挙された工程を含むが、追加の工程を含み得ることを意味する。化合物、組成物、又はデバイスの文脈で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、化合物、組成物、又はデバイスが少なくとも列挙された特徴又は構成要素を含むが、追加の特徴又は構成要素も含み得ることを意味する。
本明細書で使用される場合、単数形「１つ（a）」、「１つ（an）」及び「この（the）」は、内容が明確に別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。
本明細書全体を通して使用される「実質的に」、「およそ（approximately）」、及び「約」という用語は、処理のばらつきなどに起因する小さな変動を記載及び考慮するために使用されている。例えば、それらは、±５％以下など、±２％以下など、±１％以下など、±０．５％以下など、±０．２％以下など、±０．１％以下など、±０．０５％以下などの、±１０％以下を指し得る。
本明細書中で使用される場合、「ハイブリダイズする」及び「ハイブリダイゼーション」などの用語は、ポリヌクレオチドを、それらのポリヌクレオチドの長さに沿って互いに非共有結合的に会合させて、二重鎖「二本鎖」、三重鎖「三本鎖」、又はより高次の構造を形成することを意味することが意図される。例えば、２つのＤＮＡポリヌクレオチド鎖は、相補的塩基対合を介して会合して、二本鎖を形成し得る。ポリヌクレオチド鎖間の一次相互作用は、典型的にはヌクレオチド塩基特異的であり、例えば、ワトソン－クリック及びフーグスティーン型水素結合による、Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、及びＧ：Ｃであり得る。塩基スタッキング及び疎水性相互作用もまた、二本鎖の安定性に寄与し得る。ハイブリダイゼーション条件は、約１Ｍ未満、より典型的には約５００ｍＭ未満、又は約２００ｍＭ未満の塩濃度を含み得る。ハイブリダイゼーション緩衝液は、５％ＳＳＰＥなどの緩衝塩溶液、又は当技術分野で公知の他の適切な緩衝液を含み得る。ハイブリダイゼーション温度は５℃まで低くすることができるが、典型的には２２℃を超え、より典型的には約３０℃を超え、典型的には３７℃を超える。第１及び第２のポリヌクレオチド間の会合の強度は、それらのポリヌクレオチド内のヌクレオチド配列間の相補性と共に増加する。ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの強度は、二本鎖の５０％のポリヌクレオチド鎖が分離する融解温度（Ｔｍ）によって特徴付けられ得る。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、糖、及び少なくとも１つのホスフェート基を含み、一部の例では、核酸塩基もまた含む分子を意味することが意図される。核酸塩基を欠くヌクレオチドは、「脱塩基」と称され得る。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、修飾ペプチドヌクレオチド、修飾ホスフェート糖骨格ヌクレオチド、及びそれらの混合物を含む。ヌクレオチドの例には、アデノシン一リン酸（adenosine monophosphate、ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（adenosine diphosphate、ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（adenosine triphosphate、ＡＴＰ）、チミジン一リン酸（thymidine monophosphate、ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（thymidine diphosphate、ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（thymidine triphosphate、ＴＴＰ）、シチジン一リン酸（cytidine monophosphate、ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（cytidine diphosphate、ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（cytidine triphosphate、ＣＴＰ）、グアノシン一リン酸（guanosine monophosphate、ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（guanosine diphosphate、ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（guanosine triphosphate、ＧＴＰ）、ウリジン一リン酸（uridine monophosphate、ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（uridine diphosphate、ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（uridine triphosphate、ＵＴＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（deoxyadenosine monophosphate、ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（deoxyadenosine diphosphate、ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（deoxyadenosine triphosphate、ｄＡＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（deoxythymidine monophosphate、ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（deoxythymidine diphosphate、ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（deoxythymidine triphosphate、ｄＴＴＰ）、デオキシシチジン二リン酸（deoxycytidine diphosphate、ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（deoxycytidine triphosphate、ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（deoxyguanosine monophosphate、ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（deoxyguanosine diphosphate、ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（deoxyguanosine triphosphate、ｄＧＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（deoxyuridine monophosphate、ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（deoxyuridine diphosphate、ｄＵＤＰ）及びデオキシウリジン三リン酸（deoxyuridine triphosphate、ｄＵＴＰ）が含まれる。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語はまた、天然に存在するヌクレオチドと比較して修飾された核酸塩基、糖、骨格及び／又はリン酸部分を含むタイプのヌクレオチドである、任意のヌクレオチドアナログを包含することが意図される。ヌクレオチド類似体はまた、「修飾核酸」と称され得る。例となる修飾核酸塩基の例には、イノシン、キササニン、ヒポキササニン、イソシトシン、イソグアニン、２－アミノプリン、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、２－プロピルグアニン、２－プロピルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、１５－ハロウラシル、１５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル、４－チオウラシル、８－ハロアデニン又はグアニン、８－アミノアデニン又はグアニン、８－チオールアデニン又はグアニン、８－チオアルキルアデニン又はグアニン、８－ヒドロキシルアデニン又はグアニン、５－ハロ置換ウラシル又はシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニンなどが含まれる。当技術において公知のとおり、ある特定のヌクレオチドアナログは、ポリヌクレオチド、例えば、アデノシン５’－ホスホスルフェートなどのヌクレオチドアナログに組み込まれた状態にはなり得ない。ヌクレオチドは、任意の好適な数のホスファート、例えば、３、４、５、６、又は６を超えるホスフェートを含み得る。ヌクレオチド類似体には、ロック核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、及び５－ヒドロキシルブチニル－２’－デオキシウリジン（「スーパーＴ」）も含まれる。
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、相互に結合しているヌクレオチドの配列を含む分子を指す。ポリヌクレオチドは、ポリマーの非限定的な一例である。ポリヌクレオチドの例としては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、並びにロック核酸（ＬＮＡ）及びペプチド核酸（ＰＮＡ）などの、それらの類似体が挙げられる。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又は一重鎖ＤＮＡなどのヌクレオチドの一重鎖配列であり得、二重鎖ＤＮＡなどのヌクレオチドの二重鎖配列であるか、又はヌクレオチドの一重鎖及び二重鎖配列の混合物を含み得る。二重鎖ＤＮＡ（double stranded DNA、ｄｓＤＮＡ）は、ゲノムＤＮＡ、及びＰＣＲ及び増幅生成物を含む。一重鎖ＤＮＡ（single stranded DNA、ｓｓＤＮＡ）は、ｄｓＤＮＡに変換され得、その反対もあり得る。ポリヌクレオチドには、エナンチオマーＤＮＡ、ＬＮＡ、又はＰＮＡなどの非自然発生ＤＮＡが含まれ得る。ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの正確な配列は、既知であっても未知であってもよい。以下は、ポリヌクレオチドの例である：遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、発現配列タグ（expressed sequence tag、ＥＳＴ）、又は遺伝子発現連続分析（serial analysis of gene expression、ＳＡＧＥ）タグ）、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いかなる配列の単離されたＤＮＡ、いかなる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、前述のいずれかのプライマー又は増幅されたコピー。
本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドをポリヌクレオチドに重合することによってポリヌクレオチドを組み立てる活性部位を有する酵素を意味することが意図される。ポリメラーゼは、プライミングされた一重鎖標的ポリヌクレオチドに結合し、ヌクレオチドをプライマーに連続的に付加して成長させ、標的ポリヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する「相補的コピー」ポリヌクレオチドを形成することができる。次いで、別のポリメラーゼ、又は同じポリメラーゼは、その相補的コピーポリヌクレオチドの相補的コピーを形成することによって、標的ヌクレオチドのコピーを形成することができる。ＤＮＡポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに結合し、次いで、標的ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド鎖の３’末端の遊離ヒドロキシル基に連続的に付加して成長させ（アンプリコン成長）つつ、標的ポリヌクレオチドを下流へ移動することができる。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡ分子を合成し得、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡ分子を合成し得る（転写）。ポリメラーゼは、短いＲＮＡ又はＤＮＡ鎖（プライマー）を使用して、鎖成長を開始し得る。いくつかのポリメラーゼは、それらが鎖に塩基を付加する部位の上流の鎖を置換し得る。かかるポリメラーゼは、鎖置換であるとも言われ得、これは、ポリメラーゼによって読み取られる鋳型鎖から相補鎖を除去する活性を有すると言われ得る。
ポリメラーゼの例としては、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、９°Ｎｍ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（大腸菌）、ＤＮＡポリメラーゼＩ（大）、（クレノウ）断片、クレノウ断片（３’－５’エキソ－）、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ－）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ ＤＮＡ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＩＩ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（商標）（エキソ－）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲｅｐｌｉＰＨＩ（商標）Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＢｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ（大）、断片（ＩｓｏＴｈｅｒｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ）、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（商標）ＡｍｐｌｉＴｈｅｒｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｂｒ ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼベータ、及びＴｈｅｒｍｏＰｈｉ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。特定の非限定的な例では、ポリメラーゼは、Ｂｓｔ、Ｂｓｕ、及びＰｈｉ２９からなる群から選択される。ポリメラーゼはハイブリダイズした鎖を伸長させるので、一重鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）を含むことが有益であり得る。ＳＳＢは、置換された（非鋳型）鎖を安定化し得る。鎖置換活性を有する例示的なポリメラーゼには、Ｂｓｔ（バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus））ポリメラーゼ、エキソ－クレノウポリメラーゼ又は配列決定グレードＴ７エキソ－ポリメラーゼの大きな断片が含まれるが、これらに限定されない。いくつかのポリメラーゼは、それらの前の鎖を切断し、それを成長する鎖に効果的に置き換える（５’エキソヌクレアーゼ活性）。いくつかのポリメラーゼは、それらの後ろの鎖を分解する活性を有する（３’エキソヌクレアーゼ活性）。いくつかの有用なポリメラーゼは、３’及び／又は５’エキソヌクレアーゼ活性を低減又は排除するために変異又は他の方法で修飾されている。
本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、ヌクレオチドが遊離３’ＯＨ基を介して付加され得るポリヌクレオチドとして定義される。プライマーは、ブロックが除去されるまで重合を阻害する３’ブロックを含み得る。プライマーは、カップリング反応を可能にするか、又はプライマーを別の部分にカップリングすることを可能にするための、５’末端の修飾を含み得る。プライマーは、例えば、ＵＶ光、化学物質、酵素などの適切な条件下で切断され得る、８－オキソ－Ｇなどの１つ以上の部分を含み得る。プライマーの長さは、任意の好適な数の塩基の長さであり得、天然及び／又は非天然ヌクレオチドの好適な組み合わせを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、プライマーにハイブリダイズする（プライマーに相補的な配列を有する）「増幅アダプター」又はより単純には「アダプター」を含み得、プライマーの遊離３’ＯＨ基にヌクレオチドを付加することによって相補的コピーポリヌクレオチドを生成するように増幅され得る。
本明細書で使用するとき、用語「複数の」とは、２つ以上の異なるメンバーの集団を意味することを意図する。複数とは、小さい、中程度、大きい、から非常に大きいサイズまでの範囲であり得る。小さいサイズの複数とは、例えば、数メンバー～数十メンバーの範囲であり得る。中程度のサイズの複数とは、例えば、数十メンバー～約１００メンバー又は数百メンバーの範囲であり得る。大きい複数とは、例えば、約数百メンバー～約１０００メンバー、数千メンバー、及び数万メンバーの範囲であり得る。非常に大きな複数とは、例えば、数万メンバー～約数十万、数百万、数千万、又は数億以上のメンバーの範囲であり得る。したがって、複数は、２から１億をはるかに超えるメンバーのサイズの範囲、並びにメンバーの数によって測定される全てのサイズの間及び上記の例示的な範囲よりも大きい範囲であり得る。複数のポリヌクレオチドの例としては、例えば、約１×１０５以上、５×１０５以上又は１×１０６以上の異なるポリヌクレオチドの集団が挙げられる。したがって、この用語の定義は、２より大きい全ての整数値を含むことが意図される。複数値の上限は、例えば、試料中のポリヌクレオチド配列の理論的多様性によって設定され得る。
本明細書で使用される場合、「二重鎖」という用語は、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの全て又は実質的に全てが、相補的ポリヌクレオチド内のそれぞれのヌクレオチドに水素結合していることを意味することが意図される。二重鎖ポリヌクレオチドはまた、「二本鎖」と称され得る。本明細書で使用される場合、「一重鎖」という用語は、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドのいずれも、相補的ポリヌクレオチド中のそれぞれのヌクレオチドに水素結合していないことを意味する。
本明細書で使用される場合、用語「標的ポリヌクレオチド」は、分析又は動作の対象であるポリヌクレオチドを意味することが意図される。分析又は作用としては、ポリヌクレオチドを捕捉、増幅、配列決定、及び／又は他の手順に供することが挙げられる。標的ポリヌクレオチドは、分析される標的配列に追加のヌクレオチド配列を含み得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、分析対象の標的ポリヌクレオチド配列に隣接するプライマー結合部位として機能する増幅アダプターを含む１つ以上のアダプターを含み得る。プライマーにハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドの全てが伸長に適するようにはならないように、オリゴヌクレオチドの５’又は３’末端を超えて伸長するヌクレオチドを含み得る。特定の例では、複数の標的ポリヌクレオチドは、互いに異なる配列を有し得るが、互いに同じである第１及び第２のアダプターを有し得る。特定の標的ポリヌクレオチド配列に隣接し得る２つのアダプターは、互いに同じ配列、又は互いに相補的配列を有し得るか、又は２つのアダプターは、異なる配列を有し得る。したがって、複数の標的ポリヌクレオチド中の種は、例えば、配列決定（例えば、ＳＢＳ）によって評価される未知の配列領域が隣接した、既知の配列領域を含み得る。いくつかの例では、標的ポリヌクレオチドは、単一の末端で増幅アダプターを担持し、かかるアダプターは、標的ポリヌクレオチドの３’末端又は５’末端のいずれかに位置し得る。標的ポリヌクレオチドは、アダプターなしで使用され得、その場合、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドに存在する配列を直接用い得る。
「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書においては交換可能に使用される。用語の違いは、特に明記しない限り、サイズ、配列、又は他の特性の任意の特定の違いを示すことを意図するものではない。説明を明確にするために、いくつかのポリヌクレオチド種を含む特定の方法又は組成物を説明する際に、１つの種のポリヌクレオチドを別の種と区別するために用語を使い分けてもよい。
用語「配列」及び「部分配列」は、いくつかの場合においては、本明細書中で交換可能に使用され得る。例えば、配列は、その中に１つ以上の部分配列を含み得る。そのような部分配列の各々は、配列とも呼ばれ得る。
本明細書で使用される場合、「アンプリコン」という用語は、核酸に関して使用する場合、核酸の複製による生成物を意味し、この生成物は、核酸のヌクレオチド配列の少なくとも一部と実質的に同じ又は相補的なヌクレオチド配列を有する。「増幅」及び「増幅すること」は、ポリヌクレオチドのアンプリコンを作製するプロセスを指す。標的ポリヌクレオチドの第１のアンプリコンは、典型的には相補的なコピーであり得る。追加的なアンプリコンは、第１のアンプリコンの生成後に、標的ポリヌクレオチド又は第１のアンプリコンから作成されたコピーである。後続のアンプリコンは、標的ポリヌクレオチドと実質的に相補的であるか、又は標的ポリヌクレオチドと実質的に同一である配列を有し得る。ポリヌクレオチドの（例えば、増幅アーチファクトによる）少数の変異が、そのポリヌクレオチドのアンプリコンを生成するときに起こり得ることは理解されるであろう。
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム」、「Ｃａｓ－ｇＲＮＡリボ核タンパク質」、及びＣａｓ－ｇＲＮＡ ＲＮＰなどの用語は、標的ポリヌクレオチド内の配列に相補的又は実質的に相補的なオリゴヌクレオチド配列を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）配列と、Ｃａｓタンパク質とを含む酵素系を指す。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、一般に、コアエレメント含量及び配列に基づいて、更に１０のサブタイプに細分される３つの主要なタイプに分類することができる；例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，「Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ，」Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９（６）：４６７－４７７（２０１１）参照。Ｃａｓタンパク質は、様々な活性、例えばヌクレアーゼ活性を有し得る。したがって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、（例えば、ｇＲＮＡを介して）特定の配列を標的化するための機構、並びに（例えば、Ｃａｓタンパク質を介して）配列に対するある特定の酵素活性を提供する。
Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、別個のヘリカーゼ活性及びＤＮａｓｅ活性を有するＣａｓ３タンパク質を含み得る。例えば、１－Ｅ型システムにおいて、ｃｒＲＮＡは、カスケード（抗ウイルス防御のためのＣＲＩＳＰＲ関連複合体）と呼ばれるマルチサブユニットエフェクター複合体に組み込まれ、これは、標的ＤＮＡに結合し、Ｃａｓ３タンパク質による分解を誘発する；例えば、Ｂｒｏｕｎｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｍａｌｌ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡｓ ｇｕｉｄｅ ａｎｔｉｖｉｒａｌ ｄｅｆｅｎｓｅ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２１（５８９１）：９６０－９６４（２００８）；Ｓｉｎｋｕｎａｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｃａｓ３ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｎｄ ＡＴＰ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈｅｌｉｃａｓｅ ｉｎ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ」，ＥＭＢＯ Ｊ ３０：１３３５－１３４２（２０１１）；及びＢｅｌｏｇｌａｚｏｖａ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａｓ３ ＨＤ ｎｕｃｌｅａｓｅ ＭＪ０３８４，ａｎ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｅｎｚｙｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ，ＥＭＢＯ Ｊ ３０：４６１６－４６２７（２０１１）を参照されたい。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ｃｒＲＮＡを生成して標的ＤＮＡを切断することができる単一タンパク質（約１６０ｋＤａ）である、シグネチャーＣａｓ９タンパク質を含む。Ｃａｓ９タンパク質は、典型的には、２つのヌクレアーゼドメインである、アミノ末端付近のＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインと、タンパク質の中央付近のＨＮＨ（又はＭｃｒＡ様）ヌクレアーゼドメインとを含む。Ｃａｓ９タンパク質の各ヌクレアーゼドメインは、二重らせんの一方の鎖を切断するように特殊化されている；例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）を参照されたい。ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ポリメラーゼ及びＲＡＭＰモジュールを含む。ＩＩＩ型システムは、ＩＩＩ－Ａ及びＩＩＩ－Ｂのサブタイプに更に分けることができる。ＩＩＩ－Ａ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、プラスミドを標的化することが示されており、ＩＩＩ－Ａ型システムのポリメラーゼ様タンパク質は、標的ＤＮＡの切断に関与する；例えば、Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｌｉｍｉｔｓ ｈｏｒｉｚｏｎｔａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ ｂｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＤＮＡ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２２（５９０９）：１８４３－１８４５（２００８）を参照されたい。ＩＩＩ－Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムもまた、ＲＮＡを標的化することが示されている；例えば、Ｈａｌｅ ｅｔ ａｌ．，「ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｂｙ ａ ＣＲＩＳＰＲ－ＲＮＡ－Ｃａｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ」，Ｃｅｌｌ １３９（５）：９４５－９５６（２００９）を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムに由来する操作された及び／又はプログラムされたヌクレアーゼ系を含む。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、操作された及び／又は変異したＣａｓタンパク質を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、操作された及び／又はプログラムされたガイドＲＮＡを含み得る。
いくつかの特定の例では、本発明のＣａｓ－ｇＲＮＡ ＲＮＰのうちの１つにおけるＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９、又はｇＲＮＡが相補的である配列で標的ポリヌクレオチドを切断することができる他の適切なＣａｓを、以下の参照文献に記載されているような様式で含むことができ、これらの文献のそれぞれの全内容は参照により本明細書に組み込まれる：Ｎａｃｈｍａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｅｎａｂｌｅｓ ｆａｓｔ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｓｍａｌｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｎｄ ｕｌｔｒａ－ａｃｃｕｒａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ＤＮＡ ｉｎｐｕｔ（ＣＲＩＳＰＲ－ＤＳ）」，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２８（１０）：１５８９－１５９９（２０１８）；Ｖａｋｕｌｓｋａｓ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｃａｓ９ ｍｕｔａｎｔ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ａｓ ａ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２４：１２１６－１２２４（２０１８）；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｉｎｉｍａｌ ＰＡＭ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ ＳｐＣａｓ９ ｏｒｔｈｏｌｏｇ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｄｖａｎｃｅｓ ４（１０）：ｅａａｕ０７６６，１－１０（２０１８）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｐ：ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７（１）：１－１３（２０１９）。Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムから単離されたＣａｓ９－ｃｒＲＮＡ複合体、並びに、別個の要素からインビトロで組み合わされた複合体は、それが合成オリゴデオキシヌクレオチド及びｃｒＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を有するプラスミドＤＮＡの両方に結合することが実証される。Ｃａｓ９は、ＲｕｖＣ及びＨＮＨ活性部位／ヌクレアーゼドメインの２つのヌクレアーゼドメインを有し、これらの２つのヌクレアーゼドメインは、反対のＤＮＡ鎖の切断に関与することが示されている。いくつかの例では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ－ＣａｓシステムのＣａｓ９タンパク質に由来する。いくつかの例では、Ｃａｓ９タンパク質は、約１，４０９アミノ酸残基を有するマルチドメインタンパク質である。
他の例では、Ｃａｓを、ｇＲＮＡが相補的である配列で標的ポリヌクレオチドを切断しないように、例えば、以下の参照文献に記載されているような様式で操作してもよく、これらの文献のそれぞれの全内容は参照により本明細書に組み込まれる：Ｇｕｉｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，「Ｆｕｓｉｏｎ ｏｆ ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖｅ Ｃａｓ９ ｔｏ Ｆｏｋｌ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２：５７７－５８２（２０１４）；Ｂｈａｔｔ ｅｔ ａｌ．，「Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｄＣａｓ９－ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ」，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／５７１６５３，ｐａｇｅｓ １－８９（２０１９）；Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＣＡＴＥ－ｓｅｑ）」，ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ ＵＲＬ ｗｗｗ．ｂｉｏｒｘｉｖ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１０．１１０１／６７２８１６ｖ１，１－３０（２０１９）；及びＴｉｊａｎ ｅｔ ａｌ．，「ｄＣａｓ９－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｌｏｃｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｈｉｓｔｏｎｅ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ」，ＰＮＡＳ １１５（１２）：Ｅ２７３４－Ｅ２７４１（２０１８）。ヌクレアーゼ活性を欠くＣａｓは、不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）と称され得る。いくつかの例では、ｄＣａｓは、ＲｕｖＣ及びＨＮＨ活性部位／ヌクレアーゼドメインの両方が変異している、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ欠損変異体を含んでもよい。Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ欠損変異体（ｄＣａｓ９）は、二重鎖ＤＮＡに結合するが、ＤＮＡを切断しない。Ｃａｓ９タンパク質の別の変異体は、ｃｒＲＮＡに相補的な鎖を切断するドメイン中の第１の突然変異と、ｃｒＲＮＡに非相補的な鎖を切断するドメイン中の第２の突然変異とを有する、２つの不活性化ヌクレアーゼドメインを有する。いくつかの例では、Ｃａｓ９タンパク質は第１の突然変異Ｄ１０Ａ及び第２の突然変異Ｈ８４０Ａを有する。
更に他の例では、Ｃａｓタンパク質はカスケードタンパク質を含む。大腸菌（E. coli）のカスケード複合体は、配列特異的な様式で二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的を認識する。大腸菌（E. coli）のカスケード複合体は、５つの機能的に必須のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（ＣａｓＡ１Ｂ２Ｃ６Ｄ１Ｅ１、カスケードタンパク質とも呼ばれる）と６１ヌクレオチドのｃｒＲＮＡとを含む、４０５ｋＤａの複合体である。ｃｒＲＮＡは、相補的ＤＮＡ鎖と塩基対を形成する一方で、非相補鎖を置換してＲループを形成することによって、カスケード複合体をｄｓＤＮＡ標的配列に誘導する。カスケードは、ＡＴＰを消費することなく標的ＤＮＡを認識し、これは、連続的なインベーダーＤＮＡ監視がエネルギー投資なしに行われることを示唆する；例えば、Ｍａｔｔｈｉｊｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｓｃａｄｅ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８（５）：５２９－５３６（２０１１）を参照されたい。更に他の例では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ３タンパク質を含む。一例では、大腸菌（E. coli）Ｃａｓ３は、ＲＮＡとＤＮＡとのＡＴＰ非依存的アニーリングを触媒してＲループ、及びＲＮＡ塩基対のハイブリッドを二本鎖ＤＮＡに形成し得る。Ｃａｓ３タンパク質は、Ｃａｓ９よりも長いｇＲＮＡを使用し得る；例えば、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｅｌｉｃａｓｅ ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ－ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃａｓ３ ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．４３９（１）：８５－９５（２０１１）を参照されたい。そのようなより長いｇＲＮＡは、標的ＤＮＡへの他のエレメントのより容易なアクセス、例えば、ポリメラーゼによって伸長されるプライマーのアクセスを可能にし得る。Ｃａｓ３タンパク質によって提供される別の特徴は、Ｃａｓ３タンパク質がＣａｓ９のようにＰＡＭ配列を必要とせず、したがって、所望の配列を標的化するためにより高い柔軟性を提供することである。Ｃａｓ３によるＲループ形成は、補因子としてマグネシウムを利用し得る；例えば、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，「Ｈｅｌｉｃａｓｅ ｄｉｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ－ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｃａｓ３ ｐｒｏｔｅｉｎ」，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．４３９（１）：８５－９５（２０１１）を参照されたい。カチオンなどの任意の適切な補因子が、本発明の組成物及び方法において使用されるＣａｓタンパク質と一緒に使用され得ることが理解されるであろう。
二重鎖ポリヌクレオチドを破壊し、ループ構造を作り出すことができる任意のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが使用され得ることも理解されるべきである。例えば、Ｃａｓタンパク質としては、以下の参考文献に記載されているようなＣａｓタンパク質を挙げることができるが、これらに限定されず、これらの文献のそれぞれの全内容は参照により本明細書に組み込まれる：Ｈａｆｔ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｇｕｉｌｄ ｏｆ ４５ ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ（Ｃａｓ）ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｅｘｉｓｔ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅｓ」，ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ Ｂｉｏｌ．１（６）：ｅ６０，１－１０（２００５）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ ｃａｓ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅｓ」，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４２（４）：２４４８－２４５９（２０１３）；及びＳｔｒｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，「ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６５（６４４８）：４８－５３（２０１９）（Ｃａｓタンパク質はＣａｓＫ１２を含み得る）。いくつかのこれらのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、標的配列を認識して結合するために特異的配列を利用し得る。例えば、Ｃａｓ９は、５’－ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在を利用し得る。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムはまた、操作された及び／又はプログラムされたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み得る。本明細書で使用されるとき、「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」（当該技術分野では単一ガイドＲＮＡ又はｓｇＲＮＡと呼ばれることもある）という用語は、標的ＤＮＡ配列の領域に相補的又は実質的に相補的であり、Ｃａｓタンパク質をその領域に誘導する配列を含むＲＮＡを意味することが意図される。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列の領域に相補的又は実質的に相補的であるヌクレオチド配列に加えて、ヌクレオチド配列を含み得る。ｇＲＮＡを設計するための方法は、当該技術分野において周知であり、非限定的な例は、以下の参考文献に提供されており、これらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる：Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｎｏｖｅｌ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」，ＰＬｏＳ ＯＮＥ １４（４）：ｅ０２１５４４１，ｐａｇｅｓ １－７（２０１９）；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３２（３）：２７９－２８４（２０１４）；Ｋｏｃａｋ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３７：６５７－６６６（２０１９）；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｐ：ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７（１）：ｅ１，１－１３（２０１９）；Ｑｕａｎ ｅｔ ａｌ．，「ＦＬＡＳＨ：ａ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＣＲＩＳＰＲ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７（１４）：ｅ８３，１－９（２０１９）；及びＸｕ ｅｔ ａｌ．，「ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ－ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＣＡＴＥ－ｓｅｑ）」，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６７２８１６，１－３０（２０１９）。
いくつかの例では、ｇＲＮＡは、キメラ、例えば、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）に融合されたＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を含む。そのようなキメラ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，「Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２）に記載されている。Ｃａｓタンパク質は、キメラｓｇＲＮＡによって、５’－ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が続く任意のゲノム遺伝子座に指向され得る。１つの非限定的な例では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｔ７プロモーターを含む合成二重鎖ＤＮＡ鋳型を使用して、インビトロ転写によって合成され得る。ｔｒａｃｒＲＮＡは固定配列を有してもよいが、標的配列はｃｒＲＮＡの配列の一部を決定してもよい。等モル濃度のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを混合し、５５℃で３０秒間加熱してもよい。Ｃａｓ９を３７℃にて同じモル濃度で添加し、ＲＮＡミックスと共に１０分間インキュベートすることができる。次いで、１０～２０倍モル過剰の得られたＣａｓ９－ｇＲＮＡ ＲＮＰを標的ＤＮＡに添加してもよい。結合反応は１５分以内に起こり得る。他の適切な反応条件を容易に使用することができる。
本明細書中で使用される場合、用語「ヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチドのヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断し得る酵素を意味することが意図される。「エンドヌクレアーゼ」という用語は、ポリヌクレオチド鎖内のホスホジエステル結合を切断することができる酵素を指し、「ニッカーゼ」という用語は、ＤＮＡ二本鎖の一重鎖のみを切断するエンドヌクレアーゼを指す。「Ｃａｓ９ニッカーゼ」という用語は、典型的にはＣａｓ９タンパク質の１つのヌクレアーゼドメインを不活性化することによってＣａｓ９タンパク質に由来するニッカーゼを指す。
ポリヌクレオチドの文脈において、本明細書で使用される「変異体（variant）」及び「誘導体（derivative）」という用語は、アミノ酸残基の置換、欠失又は付加の導入によって変更された、ポリペプチド又はポリペプチドの断片を含むポリペプチドを指す。ポリペプチドの変異体又は誘導体は、ポリペプチドのアミノ酸配列の一部を含む融合タンパク質であり得る。ポリペプチドの文脈において、本明細書で使用される「変異体」又は「誘導体」という用語はまた、例えば、ポリペプチドへの任意のタイプの分子の共有結合によって化学的に修飾されたポリペプチド又はポリペプチドの断片を指す。例えば、限定するものではないが、ポリペプチド又はポリペプチドの断片は、例えばグリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞リガンド又は他のタンパク質への結合などによって化学的に修飾することができる。変異体又は誘導体は、結合した分子の種類又は位置のいずれかが天然に存在する又は出発ペプチド又はポリペプチドとは異なる様式で修飾される。変異体又は誘導体は、ペプチド又はポリペプチド上に天然に存在する１つ以上の化学基の欠失を更に含む。ポリペプチド又はポリペプチドの断片の変異体又は誘導体は、特定の化学的切断、アセチル化、製剤、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがそれらに限定されない、当業者に公知の技術を使用した化学修飾によって化学的に修飾することができる。更に、ポリペプチド又はポリペプチドの断片の変異体又は誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含むことができる。ポリペプチド変異体又は誘導体は、本明細書に記載のポリペプチド又はポリペプチドの断片と類似又は同一の機能を有し得る。ポリペプチド変異体又は誘導体は、本明細書に記載のポリペプチド又はポリペプチドの断片と比較して、追加の又は異なる機能を有し得る。
本明細書で使用される場合、「配列決定」という用語は、ポリヌクレオチドの配列を決定することを意味することが意図される。配列決定は、合成による配列決定（ＳＢＳ）、ブリッジＰＣＲ、鎖終結配列決定、ハイブリダイゼーションによる配列決定、ナノポア配列決定、及びライゲーションによる配列決定のうちの１つ以上を含み得る。
本明細書中で使用される場合、「種特異的反復エレメント」という用語は、所与の種のポリヌクレオチド内に存在し、かつ別の種のポリヌクレオチド内には存在し得ない反復配列を意味することが意図される。複数の染色体を有する種（例えば哺乳動物、例えばヒト）は、各染色体上に異なる種特異的エレメントを含んでもよく、又は各染色体上に同じ種特異的エレメント、もしくは各染色体上に同じ種特異的エレメントと異なる種特異的エレメントとの混合物を含んでもよい。種特異的反復エレメントの一例は、フォトスペーサ隣接モチーフ又はＰＡＭ配列（例えば、ＮＧＧ）である。Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ＲＮＰのｇＲＮＡは、種特異的反復エレメントにハイブリダイズする配列を有してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「分子バーコード」及び「ＵＭＩ」は、ポリヌクレオチドにカップリングさせることができ、それを介してポリヌクレオチドを同定することができるオリゴヌクレオチドを意味することが意図される。例えば、異なるＵＭＩのセットを複数の異なるポリヌクレオチドにカップリングさせてもよく、それらのポリヌクレオチドの各々を、そのポリヌクレオチドにカップリングした特定のＵＭＩを用いて同定してもよい。
本明細書で使用される場合、エレメントに対して「選択的」であることは、その標的にカップリングし、かつ異なるエレメントにカップリングしないことを意味することが意図される。例えば、種特異的反復エレメントに対して選択的であるＣａｓ－ｇＲＮＡ ＲＮＰは、その種特異的反復エレメントにカップリングしてもよく、異なる種特異的反復エレメントにカップリングしなくてもよい。ガイドＲＮＡ又は他のポリヌクレオチドに関して使用される場合、「標的特異的」及び「選択的」などの用語は、別のポリヌクレオチド内の配列に特異的な（実質的に相補的であり、ハイブリダイズし得る）配列を含むポリヌクレオチドを意味することが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「相補的」及び「実質的に相補的」は、ポリヌクレオチドに関して使用される場合、そのポリヌクレオチドが、特定の条件下で別のポリヌクレオチド中の配列に選択的にハイブリダイズすることの可能な配列を含むことを意味することが意図される。
本明細書で使用される場合、「増幅」及び「増幅する」などの用語は、ポリヌクレオチドのアンプリコンを生成するための任意の適切な増幅方法の使用を指す。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、１つの非限定的な増幅方法である。当該分野で公知の他の適切な増幅方法としては、ローリングサークル増幅、（例えば、米国特許出願第７，４１３，８５７号に記載されているような）リボプライマー増幅、ＩＣＡＮ、ＵＣＡＮ、ｒｉｂｏｓｐｉａ、（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１５３３３３号に記載されているような）末端タグ付け、及びＥｂｅｒｗｉｎｅ型ａＲＮＡ増幅又は鎖置換増幅が挙げられるが、これらに限定されない。増幅方法の更なる非限定的な例は、国際公開第０２／１６６３９号、国際公開第００／５６８７７号、オーストラリア特許出願公開第００／２９７４２号、米国特許第５，５２３，２０４号、米国特許第５，５３６，６４９号、米国特許第５，６２４，８２５号、米国特許第５，６３１，１４７号、米国特許第５，６４８，２１１号、米国特許第５，７３３，７５２号、米国特許第５，７４４，３１１号、米国特許第５，７５６，７０２号、米国特許第５，９１６，７７９号、米国特許第６，２３８，８６８号、米国特許第６，３０９，８３３号、米国特許第６，３２６，１７３号、米国特許第５，８４９，５４７号、米国特許第５，８７４，２６０号、米国特許第６，２１８，１５１号、米国特許第５，７８６，１８３号、米国特許第６，０８７，１３３号、米国特許第６，２１４，５８７号、米国特許第６，０６３，６０４号、米国特許第６，２５１，６３９号、米国特許第６，４１０，２７８号、国際公開第００／２８０８２号、米国特許第５，５９１，６０９号、米国特許第５，６１４，３８９号、米国特許第５，７７３，７３３号、米国特許第５，８３４，２０２号、米国特許第６，４４８，０１７号、米国特許第６，１２４，１２０号及び米国特許第６，２８０，９４９号に記載されている。
用語「ポリメラーゼ連鎖反応」及び「ＰＣＲ」は、本明細書で使用される場合、少量のポリヌクレオチド、例えば、ＲＮＡ及び／又はＤＮＡが増幅される手順を指す。一般的に、増幅プライマーは、ＰＣＲ中に使用するためにポリヌクレオチドにカップリングされる。例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献を参照されたい：Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号、Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３（１９８７）；及びＥｒｌｉｃｈ，ｅｄ．，ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９）。当業者に知られているように、多種多様な酵素及びキットがＰＣＲを行うために利用可能である。例えば、いくつかの例では、ＰＣＲ増幅は、米国ウィスコンシン州マディソンのＥＰＩＣＥＮＴＲＥ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製のＦＡＩＬＳＡＦＥ（商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ又はＭＡＳＴＥＲＡＭＰ（商標）Ｅｘｔｒａ－Ｌｏｎｇ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍのいずれかを製造業者によって記載されるように使用して実施される。
本明細書で使用される場合、「ライゲーション」及び「ライゲーションする」などの用語は、２つ以上のポリヌクレオチドの末端間に共有結合又は連結を形成することを意味することが意図される。結合又は連鎖の性質は大きく異なり得、ライゲーションは酵素的又は化学的に実行され得る。ライゲーションを酵素的に行って、あるオリゴヌクレオチドの５’炭素末端ヌクレオチドと別のヌクレオチドの３’炭素との間にホスホジエステル結合を形成してもよい。鋳型駆動ライゲーション反応は、各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献に記載されている：：米国特許第４，８８３，７５０号、米国特許第５，４７６，９３０号、米国特許第５，５９３，８２６号及び米国特許第５，８７１，９２１号。ライゲーションはまた、ホスホジエステル結合の非酵素的形成、又はホスホロチオエート結合、ジスルフィド結合などのポリヌクレオチドの末端間の非ホスホジエステル共有結合の形成を用いて行われてもよい。
ポリヌクレオチドの文脈において、「変異体」という用語は、所与のポリヌクレオチドが、元のゲノム配列などの別のポリヌクレオチドの配列と少なくとも１塩基異なる配列を有することを意味することが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「飽和突然変異誘発された」は、遺伝子中の全ての塩基が他の３つの塩基で置換されていることを意味することが意図される。
本明細書で使用される場合、用語「ライブラリー」は、５’末端に共通の配列及び３’末端に共通の配列を共有し、これら共通の配列間では互いに異なる配列を有するポリヌクレオチドの集合体又は複数のポリヌクレオチドを意味することが意図される。一例として、飽和突然変異誘発されたポリヌクレオチドのライブラリーは、５’末端に共通の配列及び３’末端に共通の配列を共有し、これらのポリヌクレオチド中の所与の遺伝子中の全ての塩基が他の３つの塩基で置換されているポリヌクレオチドの集合体を指す。別の例として、ゲノム編集されたポリヌクレオチドのライブラリーは、５’末端に共通の配列及び３’末端に共通の配列を共有し、これらのポリヌクレオチドのうちの異なるポリヌクレオチドが互いに異なる方法でゲノム編集されているポリヌクレオチドの集合体を指す。
細胞におけるタンパク質コード変異体の発現の分析
現在利用可能な変異体アッセイは、低スループットであり得る。例えば、未知の機能を有する変異体のアッセイに対する現在利用可能なアプローチは、特定の表現型アッセイによって制限される。このようなアプローチが提供する変異体に関する情報は限定される可能性があり、また、各遺伝子が異なるアッセイを必要とするため、ハイスループットな様式で多くの遺伝子にスケールアップすることが困難な場合がある。本発明者らは、飽和編集された変異体の読み出しとしてｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを使用するいかなる研究も把握していない。
現在利用可能な変異体アッセイは、低スループットであり得る。例えば、未知の機能を有する変異体のアッセイに対する現在利用可能なアプローチは、特定の表現型アッセイによって制限される。このようなアプローチが提供する変異体に関する情報は限定される可能性があり、また、各遺伝子が異なるアッセイを必要とするため、ハイスループットな様式で多くの遺伝子にスケールアップすることが困難な場合がある。本発明者らは、飽和編集された変異体の読み出しとしてｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを使用するいかなる研究も把握していない。
比較すると、本明細書のいくつかの例は、飽和編集された遺伝子と共にｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを使用するハイスループット変異体アッセイを提供し得る。これらの例は、分子表現型、細胞表現型及び生物表現型に関する多くの遺伝子及び／又は経路から豊富な情報を提供し、全ての遺伝子に一般化可能であり、変異体機能に関する有意により細かい情報を提供するゲノム編集の読み出しとしてｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを使用する。本明細書で提供されるように、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑは、遺伝子中の任意のエクソン突然変異について、一般的なワークフロー内の変異体機能の読み出しとして使用され得る。例えば、本発明者らは、ハイスループット変異体アッセイのためにｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを使用することの課題が、大きなセットの変異体、特に転写末端から遠く離れたエクソンの場合に、どのように細胞バーコードを変異体に連結（関連付け）するかであることを認識した。本明細書で提供されるように、編集された変異体対立遺伝子を作製するのと同時に、ノックイン突然変異誘発法を使用して、細胞バーコードを編集された変異体に連結することができる。
本明細書におけるいくつかの例は、バーコード化飽和突然変異誘発された変異体ライブラリーを細胞に導入し、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを読み出しとして使用して変異体効果をアッセイすることができる。このアプローチでは、タンパク質のコード領域内の全ての塩基を他の３つの代替的な塩基に突然変異誘発することにより、各コドンに対して最大９個の異なるアミノ酸又は終止コドンを生成することができる。したがって、あらゆる遺伝子のコード領域に対するあらゆる可能な変異体の機能的影響をアッセイすることができる。例えば、本発明者らは、ハイスループット変異体アッセイのためにｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを使用することの課題が、大きなセットの変異体の場合に、どのように細胞バーコードを変異体に連結するかであることを認識した。本明細書で提供されるように、ランダムにバーコード化されたベクターを使用して、ＵＴＲ領域上の各変異体をバーコード化し、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑでこの変異体バーコードを読み出すことができる。別個の配列決定（アンプリコン配列決定又はロングリード配列決定）を用いて、変異体バーコードを変異体に連結してもよい。
図１Ａ～図１Ｅは、細胞におけるタンパク質コード変異体の発現を分析するためのプロセスフローにおける例示的な組成物及び操作を概略的に示す。図１Ａに示す組成物１０１は、異なるタンパク質コード変異体の発現を分析することが所望される細胞１１１及び１１２を含む。例えば、細胞１１１及び１１２は、最初に、同じタンパク質コード領域１３０、一例では天然に存在するタンパク質コード領域を含む同じＤＮＡ配列Ｓ１を含み得る。細胞の領域１３０の発現は、その特徴が明らかにされていてもよく、細胞によるそのタンパク質コード領域の発現にそのタンパク質コード領域のＤＮＡ配列の変化が及ぼす効果を、存在する場合には特定することが望ましくてもよい。本明細書で提供されるように、細胞１１１、１１２中のタンパク質コード領域１３０は、タンパク質コード領域の変異体及びその変異体を同定する第１のバーコードを含むドナーベクター１２１、１２２を使用して置換され得る。一例では、組成物１０１は、細胞１１１、１１２と接触させられるベクター１２１、１２２を含み得る。図１Ａは、簡略化のために２つの細胞及び２つのベクターの使用を示しているが、図１Ａ～図１Ｅを参照して記載されるような操作及び組成物は、任意の適切な数の細胞及び任意の適切な数のベクター、例えば、１個の細胞、又は１個を超える細胞、又は１０個を超える細胞、又は１００個を超える細胞、又は１，０００個を超える細胞、又は１０，０００個を超える細胞、又は１００，０００個を超える細胞、及び１個のベクター、又は１個を超えるベクター、又は１０個を超えるベクター、又は１００個を超えるベクター、又は１，０００個を超えるベクター、又は１０，０００個を超えるベクター、又は１００，０００個を超えるベクターの任意の適切な組み合わせに対して使用され得ることが理解されよう。
図１Ｂの組成物１０２に示すように、図１Ａのベクター１２１、１２２を使用して、図１Ａのそれぞれの細胞１１１、１１２中のタンパク質コード領域１３０を、図１Ｂの組成物１０２に示すように、タンパク質コード領域１３０と少なくとも１塩基異なる配列を含むそれぞれの変異体１３１、１３２で置換することができる。更に、ベクター１２１、１２２を使用して、それぞれの第１のバーコード１４１、１４２を、変異体に対応する細胞１１１、１１２のＤＮＡに挿入することができる。必要に応じて、ベクターの更なる部分１５０（例えば、変異体１３１、１３２のいずれかの側、第１のバーコード１４１、１４２のいずれかの側、及び／又は変異体とそのそれぞれのバーコードとの間の１つ以上の更なる塩基）もまた、細胞１１１、１１２のＤＮＡに挿入され得る。タンパク質コード領域１３０をそれぞれの変異体で置換し、それぞれのバーコードをＤＮＡ配列Ｓ１に挿入した結果として、細胞１１１、１１２は、互いに異なる配列を有し得る。例えば、細胞１１１は、変異体１３１及び第１のバーコード１４１を含むＤＮＡ配列Ｓ１’を含んでもよく、細胞１１２は、変異体１３２及び第１のバーコード１４２を含むＤＮＡ配列Ｓ１’’を含んでもよい。変異体１３１は、変異体１３２とは異なる配列を有してもよく、第１のバーコード１４１は、第１のバーコード１４２とは異なる配列を有してもよい。コード領域をバーコードにカップリングされたそれぞれの変異体で置換するためのベクター及び操作の非限定的な例は、例えば、図３Ａ～図３Ｃ及び図４Ａ～図４Ｅを参照して、本明細書の他の箇所に記載されている。
図１Ｃの組成物１０３に示すように、細胞１１１、１１２は、ＤＮＡ配列Ｓ１’、Ｓ１’’を発現して、変異体１３１、１３２の発現及び対応する第１のバーコード１４１、１４２の発現をそれぞれ含むｍＲＮＡを生成し得る。一例では、細胞１１１は、変異体１３１の発現１３１’を含むｍＲＮＡ分子Ｍ１として、及び第１のバーコード１４１の発現１４１’を含むｍＲＮＡ分子Ｍ２として、配列Ｓ１’を発現し得る。同様に、細胞１１２は、変異体１３２の発現１３２’を含むｍＲＮＡ分子Ｍ３として、及び第１のバーコード１４２の発現１４２’を含むｍＲＮＡ分子Ｍ４として、配列Ｓ１’’を発現し得る。変異体１３１及び１３２は互いに異なる配列を有するので、細胞１１１及び１１２はそれらの配列を互いとは異なる形で発現し得ることが理解されるであろう。例えば、変異体１３１及び１３２の配列の違いは、それぞれの細胞の遺伝子発現の調節に対して異なる効果を有してもよく、そのような効果を分析し、そのような効果を互いに比較することが望ましくてもよい。いくつか又は全ての変異体が最初は未知の機能を有し得るので、変異体の機能を理解するため、疾患の診断及び治療のためのゲノムの実施可能性を高めるため、及び／又は創薬プロセスをスピードアップするために、そのような情報を使用することができる。
変異体及び細胞によるその変異体の発現によって生成されたｍＲＮＡのそれぞれの配列を相関させることができる。いくつかの例では、ｍＲＮＡの配列は、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を使用して決定される。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑは、細胞に対応する第２のバーコードをｍＲＮＡにカップリングすることを含み得る。例えば、図１Ｄに示すように、細胞１１１に対応するバーコード分子１６１をｍＲＮＡ分子Ｍ１にカップリングして、発現された変異体１３１’を含む分子Ｍ１’を形成することができ、細胞１１１に対応する別のバーコード分子１６１をｍＲＮＡ分子Ｍ２にカップリングして、発現された第１のバーコード１４１’を含む分子Ｍ２’を形成することができる。更に、細胞１１２に対応するバーコード分子１６２をｍＲＮＡ分子Ｍ３にカップリングして、発現された変異体１３２’を含む分子Ｍ３’を形成することができ、細胞１１２に対応する別のバーコード分子１６２をｍＲＮＡ分子Ｍ４にカップリングして、発現された第１のバーコード１４２’を含む分子Ｍ４’を形成することができる。バーコード１４１’、１４２’はそれぞれの転写産物Ｍ２’、Ｍ４’の内側にあり、バーコード１６１、１６２はそれぞれの転写産物Ｍ１’、Ｍ２’、Ｍ３’、Ｍ４’の末端にカップリングされることに留意されたい。必要に応じて、バーコードは、それぞれの細胞からｍＲＮＡを放出するためのプロセスの一部としてｍＲＮＡ分子にカップリングされ得る。次いで、ｍＲＮＡ分子は、図１Ｄに示す組成物１０４のように、一緒にプールされ得る。
第２のバーコードがそれぞれカップリングされたｍＲＮＡは、例えば、別のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ操作として、相補的ｃＤＮＡに逆転写され得る。例えば、図１Ｅに示すように、ｍＲＮＡ分子Ｍ１’は、図１Ｄの発現された変異体１３１’のｃＤＮＡ １３１’’を含むｃＤＮＡ分子Ｍ１’’に逆転写されてもよく、ｍＲＮＡ分子Ｍ２’は、図１Ｄの発現された第１のバーコード１４１’のｃＤＮＡ １４１’’を含むｃＤＮＡ分子Ｍ２’’に逆転写されてもよい。同様に、ｍＲＮＡ分子Ｍ３’は、図１Ｄの発現された変異体１３２’のｃＤＮＡ １３２’’を含むｃＤＮＡ分子Ｍ３’’に逆転写されてもよく、ｍＲＮＡ分子Ｍ４’は、図１Ｄの発現された第１のバーコード１４２’のｃＤＮＡ １４２’’を含むｃＤＮＡ分子Ｍ４’’に逆転写されてもよい。
次いで、得られたｃＤＮＡを、例えば別のｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ操作として配列決定することができる。これに関して、図１Ｄ～図１Ｅを参照して説明したようなｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ操作は、既知の技法を使用して行われてもよく、実際に任意選択的に、１０ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（米国カリフォルニア州プレザントン）から入手可能なＣＨＲＯＭＩＵＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ３’Ｓｏｌｕｔｉｏｎなどの市販の技術を使用して行われてもよいことに留意されたい。更に、ドナーベクター１２１、１２２、突然変異ライブラリーＤＮＡ Ｓ１’、Ｓ１’’、及び／又はｃＤＮＡ Ｍ１’’、Ｍ２’’、Ｍ３’’、Ｍ４’’は、変異体１３１、１３２をそれぞれの変異体バーコード１４１、１４２に連結するためにアンプリコンの合成による配列決定（ＳＢＳ）を利用するアンプリコン配列決定などの公知の技術を使用して配列決定されてもよい。このようなアンプリコン配列決定は、図４Ｃを参照して説明するような様式で行われてもよく、ＳＢＳは、必要に応じて、市販の技術（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能なＭＩＳＥＱ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して行われ得る。
ドナーベクター配列及びｃＤＮＡ配列を互いに相関させて、変異体及び細胞によるその変異体の発現を同定することができる。例えば、図１Ｅを参照すると、ｃＤＮＡ分子Ｍ１’’、Ｍ２’’、Ｍ３’’、Ｍ４’’はプールされているが、同じバーコード１６１’がｃＤＮＡ分子Ｍ１’’及びＭ２’’の両方の分子の配列中に存在するので、これらのバーコードを相関させて、これらの分子が互いに同じ細胞に由来すると判定することができる。同様に、同じバーコード１６２’がｃＤＮＡ分子Ｍ３’’及びＭ４’’の両方の分子の配列中に存在するので、これらのバーコードを相関させて、これらの分子が互いに同じ細胞に由来すると判定することができる。更に、図１Ａを参照すると、どの特定のドナーベクターがどの細胞に対応する変異体１３１又は１３２を付加するために使用されるかは必ずしも知られていないか、あるいは制御されていないかもしれないが、ドナーベクターのそれぞれの配列を相関させて、これらが互いに同じ分子内にあることからバーコード１４１がタンパク質コード領域１３１に対応すること、また、これらが互いに同じ分子内にあることからバーコード１４２がタンパク質コード領域１３２に対応することを判定してもよい。したがって、再び図１Ｅを参照すると、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ配列とドナーベクター配列との間の相関に基づいて、ｃＤＮＡバーコード１４１’が変異体１３１’’に対応し、変異体１３１’’が細胞１１１内にあったこと、及びｃＤＮＡバーコード１４２’が変異体１３２’’に対応し、変異体１３２’’が細胞１１２内にあったことを判定してもよい。そのような相関は、細胞バーコードを変異体に「連結する」と称され得る。
いくつかの例では、ネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）操作を使用して、比較的長い場合があるドナーベクターを配列決定することができる。例えば、図３Ｃを参照して説明するような様式で、第１のプロセスを使用して、変異体、第１のバーコード、及び右ホモロジーアームを含み、左ホモロジーアームを実質的に除外する、ドナー配列の第１のアンプリコンを生成してもよい。次いで、第２のＰＣＲプロセスを使用して、変異体及び第１のバーコードを含み、右ホモロジーアーム及び左ホモロジーアームを実質的に除外する、第１のアンプリコンの第２のアンプリコンを生成してもよい。ドナーベクターを配列決定することは、いくつかの例では約１０００塩基以下の長さを有し得る第２のアンプリコンを配列決定することを含み得る。ドナーベクターを配列決定するための別の例示的なプロセスを、図４Ｃを参照して説明する。
任意の適切なドナーベクターを使用して、細胞内のタンパク質コード領域を任意の適切な変異体で置換し、そのような変異体に対応する第１のバーコードを付加することができることが理解されよう。いくつかの例では、ドナーベクターは、例えば、細胞がバーコード、変異体、又はバーコード及び変異体の両方の発現を開始するために使用することができるプロモーター領域を含んでもよい。一例では、バーコードは、プロモーター領域と変異体との間に位置してもよく、この場合、細胞は、図４Ａ～図４Ｅを参照してより詳細に説明するような様式で、プロモーター領域を使用してバーコード及び変異体の両方の発現を開始してもよい。他の例では、プロモーター領域は逆方向プロモーター領域を含んでもよく、任意選択的に、逆方向プロモーター領域は第１のバーコードと変異体との間に配置され、この場合、細胞は逆方向プロモーター領域を使用して、図３Ａ～図３Ｃを参照して説明するような様式でバーコード又は変異体のいずれかの発現を開始してもよい。例えば、図３Ａ～図３Ｃを参照して説明するような様式で、タンパク質コード領域の変異体の発現は順方向であってもよく、第１のバーコードの発現は逆方向であってもよい。加えて、又は代わりに、図３Ａ～図３Ｃを参照して説明するような様式で、ドナーベクターが右ホモロジーアーム及び左ホモロジーアームを含み、変異体及び第１のバーコードが右ホモロジーアームと左ホモロジーアームとの間にあってもよい。
ここで図３Ａ～図３Ｃを参照すると、単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）によるハイスループットタンパク質コード変異体アッセイのためのランダムバーコード化飽和ゲノム編集のためのプロセスにおける例示的な組成物及び操作が概略的に示されている。図３Ａに示すように、ランダムにバーコード化されたホモロジードナーベクター３２１は、図示の例ではプロモーター及びピューロマイシン耐性遺伝子に連結する外来転写物３７１のＵＴＲ末端内又はその上にセミランダムバーコード３４１を置くことによって構築され得る。タンパク質コード領域の変異体３３１は、外来転写物３７１に隣接して位置し得る。一方で、このドナーベクター３２１は、ホモロジーアーム３５１、３５２及びドナー修復鋳型上（例えば、タンパク質コード領域の変異体３３１内）に所望の突然変異を含み、エクソン上に変異体を作製してもよく、これはその後、Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ＲＮＰによって切断されて、正常な対立遺伝子上のタンパク質コード領域３３０内又はその近傍に二重鎖切断（ＤＳＢ）を生成し、正常なタンパク質コード領域３３０を置換するために変異体３３１が使用される相同組換え修復（ＨＤＲ）プロセスを細胞に開始させてもよい。一方、セミランダムバーコード３４１を有するこの外来遺伝子３７１は、エクソンの近傍にノックインされて逆方向に編集されてもよい。セミランダムバーコードは、発現され、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑで検出可能であり得るように、外来遺伝子３７１のＵＴＲ末端に配置される。ピューロマイシン耐性遺伝子を用いたノックイン突然変異誘発の非限定的な例を図３Ａに示す。図３Ａでは、外来遺伝子３７１がイントロン中に逆方向プロモーター３７２を含み得ることが分かる。そのため、逆方向プロモーター３７２によって駆動される外来遺伝子３７１は、スプライスアウトすることができ、正常なタンパク質翻訳に影響を及ぼさない。細胞は、変異体３３１に連結された逆方向プロモーターによって駆動されるセミランダムバーコード３４１を発現し、セミランダムバーコード３４１及びピューロマイシン耐性遺伝子３６１を逆方向に発現して第１のｍＲＮＡ分子にし、変異体３３１を順方向に発現して第２のｍＲＮＡ分子にする。例えば、ピューロマイシン耐性遺伝子のＵＴＲ末端にバーコード３４１を配置してもよく、後に細胞をピューロマイシンと接触させて、細胞を濃縮してもよい。ホモロジードナーベクター２３１が配置されたプラスミドを細胞に挿入することによって、ドナーベクターを細胞に挿入してもよい。更に、ＨＤＲプロセスで使用するためのＣａｓ－ｇＲＮＡ ＲＮＰを細胞に発現させる第２のプラスミドを細胞に挿入してもよい。
図３Ｂは、バーコード化ピューロマイシン耐性遺伝子を首尾よくノックインすることができ、エクソンも首尾よく編集することができることを実証する予備データを含む。図３Ｂの上部パネル３１１０は、突然変異が存在すべきノックイン部分の位置及びサイズを示している。パネル３１２０において、赤色ボックス内のＰＣＲ検証のためのゲル上のバンドは、ノックイン突然変異誘発の成功後に生成されたバンドを示している。パネル３１３０において、配列決定検証は、バーコード及び変異体の導入が成功したことを示している。これは、本「ノックイン突然変異誘発」アプローチが機能し、変異体をバーコード化するために使用可能であることを示している。
バーコードを編集された変異体に連結するために、２段階ＰＣＲ及びアンプリコン配列決定を図３Ｃに示すような様式で行うことができる。第１のＰＣＲは、ゲノム編集された対立遺伝子を有するノックイン領域を特異的に増幅し得る。第２のＰＣＲは、第１のＰＣＲからのＰＣＲ生成物を鋳型として使用することができ、バーコードを最長１ｋｂのアンプリコン中の変異体に連結することができる。アンプリコン配列決定を、第２のＰＣＲからの生成物を使用して実施する。アンプリコン配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から市販されているＭＩＳＥＱシーケンサーなどの市販のシーケンサーを使用して実施することができる。
細胞バーコードを変異体バーコードに連結するために、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーは、細胞バーコード及び変異体バーコード領域の両方をカバーするように、例えば、１５０ｂｐｓだけ配列決定されてもよい。このようにして、隣接するイントロン領域にノックインされた外来転写物からのリードを使用して、細胞バーコードを変異体バーコードに連結することができる。
どの細胞がどの変異体に連結されているかを復号化することができる計算復号化パイプラインを使用して、これらの２つのデータセット（アンプリコン配列決定及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）を連結してもよい。別の計算パイプライン及び深層学習アルゴリズムを使用し、復号化された細胞バーコード－変異体関係、及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータに基づいて、各細胞における遺伝子発現に対する各変異体の影響を分析してもよい。
他の例では、図４Ａ～図４Ｅは、飽和突然変異誘発された外因性変異体ライブラリーを使用する単一細胞ＲＮＡ－ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑ）によるハイスループットタンパク質コード変異体アッセイのためのプロセスフローにおける例示的な組成物及び操作を概略的に示す。図４Ａに示し、図１Ａ～図１Ｅを参照してより詳細に説明するような様式でどのセルが変異体にリンクされているかを復号化する計算復号化パイプラインを使用して、これらの２つのデータセットをリンクすることができる。バーコード化ベクターにおいて、セミランダムバーコードは、変異体ライブラリーのプールがクローニングされた後にこのバーコードが変異体転写物のＵＴＲ領域内にあるように、クローニングされる変異体ライブラリーのプールのためのプロモーターの下流又はターミネーターの上流に配置されてもよい。このようにして、全ての変異体は、ＵＴＲ領域内で発現される固有のバーコードを有することができる。変異体は、図１Ｅを参照して上述したようなアンプリコン配列決定、又はロングリード配列決定を使用して、変異体バーコードに連結され得る。発現された変異体及び発現された変異体バーコードは、図１Ｅを参照して説明するような様式でｓｃＲＮＡ－ｓｅｑを使用して細胞バーコードに連結されてもよい。変異体バーコードは、図１Ｅを参照して説明するような様式で、ベクター配列を発現された配列に相関させることによって、発現された変異体バーコードに連結され得る。
図４Ｂは、図１Ａ～図１Ｂ又は図３Ａを参照して説明するような様式で第１のバーコードを細胞のＤＮＡに挿入し、細胞内のタンパク質コード領域を変異体で置換するために使用され得る例示的なベクターを示す。図４Ｂに示すベクター４１００は、ｐＬｅｎｔｉ ５’バーコードベクターなどの５’バーコード化のために構築されたレンチウイルスベクターを含み得る。分子クローニングを使用して、変異体及び第１のバーコードを、ベクターの任意の適切な領域、例えば、ＷＰＲＥ配列とＥＦｓ配列との間に挿入することができる。ベクターの細胞発現から生じ得る例示的なｍＲＮＡ配列及びタンパク質配列も図４Ｂに示す。
図１Ｅを参照して上述したように、いくつかの例では、バーコードを変異体に連結するために、一方の側でバーコードを増幅するための１セットのプライマー、及び他方の側で変異体を増幅するための別のセットのプライマーを使用することによって、タイル状ＰＣＲアンプリコンを生成することができる。各アンプリコンは、変異体のセグメントをバーコードに連結するために使用され得る。アンプリコン配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（米国カリフォルニア州サンディエゴ）から市販されているＭＩＳＥＱシーケンサーなどのシーケンサーで、改変されたレシピを使用して実施することができる。このようにして、変異体バーコードは、図４Ｃに示すような様式で、図４Ｄに示す例示的なデータと共に、このデータセットを有する計算パイプラインを使用して変異体にリンクされ得る。より具体的には、図４Ｃは、ベクターＤＮＡ、突然変異誘発されたライブラリーＤＮＡ、及び／又はｃＤＮＡに対して実施されたアンプリコンアッセイを示し、ここで、一方のＰＣＲプライマー（領域全体にわたってタイル状となっている）は、変異体を増幅するために使用され、他方のＰＣＲプライマーは、変異体バーコードを増幅するために使用される。いくつかの例では、市販のＳＢＳを、約１５０塩基対以下の領域に対して配列決定を行うためにのみ使用することができ、約１５０塩基対以下のそれぞれの領域を個別にカバーするが配列全体を集合的にカバーするタイル状アンプリコンを使用することができる。図４Ｄは、アンプリコン配列決定が良好に機能し、バーコードと変異体とを連結する際に使用するためのバーコード領域及び変異体領域の所望のカバレッジを有することを示す。
細胞バーコードを変異体バーコードに連結するために、ｓｃＤＮＡ－ｓｅｑライブラリーは、細胞バーコード及び変異体バーコード領域の両方をカバーするように、例えば、約１５０塩基対だけ配列決定され得る。このようにして、細胞バーコードを変異体バーコードに連結することができる。例示的なデータを図４Ｅに示す。図４Ｅは、細胞バーコード及び変異体バーコードの両方についての情報を同じリード（ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑのリード１）で示している。
計算パイプライン及び深層学習アルゴリズムを開発及び使用し、復号化された細胞バーコード－変異体関係、及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータに基づいて、各細胞における遺伝子発現に対する各変異体の影響を分析することができる。
図１Ａ～図１Ｅ、図３Ａ～図３Ｃ、図４Ａ～図４Ｅを参照して説明したようなプロセスフローの任意の適切な組み合わせを、細胞の集合体におけるＤＮＡのタンパク質コード領域の発現を分析するために使用することができることが理解されよう。例えば、細胞の各々におけるＤＮＡの初期タンパク質コード領域は、タンパク質コード領域の変異体及びその変異体を同定する第１のバーコードを含むドナーベクターで置換されてもよく、ここで細胞は互いに異なる変異体を受け取る。ｍＲＮＡを細胞から得ることができ、各細胞からのｍＲＮＡは、その細胞におけるタンパク質コード領域の変異体の発現及び第１のバーコードの発現を含み得る。各細胞からのｍＲＮＡは、その細胞に対応する第２のバーコードにカップリングされ得る。第２のバーコードがカップリングされたｍＲＮＡは、相補的ｃＤＮＡに逆転写され得る。ｃＤＮＡを配列決定することができ、ドナーベクターも配列決定することができる。ドナーベクター配列及びｃＤＮＡ配列は、細胞の各々における変異体及びその細胞によるその変異体の発現を同定するために相関され得る。必要に応じて、図３Ａ～図３Ｃ又は図４Ａ～図４Ｅを参照して説明したようないくつかの例では、異なる変異体を飽和変異誘発することができる。
本発明のプロセスフローの一部として、集合体中の各細胞のＤＮＡがタンパク質コード領域の変異体及びその変異体を同定する第１のバーコードを含み得る細胞の集合体を生成することができることが更に理解されよう。細胞は、互いに異なる変異体を有し得る。必要に応じて、図３Ａ～図３Ｃ又は図４Ａ～図４Ｅを参照して説明したようないくつかの例では、異なる変異体を飽和変異誘発することができる。
本発明のプロセスフローの一部として、細胞の各々からの第１及び第２のｍＲＮＡ分子を含む、細胞の集合体からのポリヌクレオチドの集合体を生成することができることが更に理解されるであろう。各細胞について、第１のｍＲＮＡ分子は、その細胞に対応するバーコードの第１の分子及びその細胞における変異体の発現を含むことができ、第２のｍＲＮＡ分子は、その細胞に対応するバーコード及びその変異体に対応する第１のバーコードの発現を含むことができる。必要に応じて、図３Ａ～図３Ｃ又は図４Ａ～図４Ｅを参照して説明したようないくつかの例では、異なる変異体を飽和変異誘発することができる。
本発明のプロセスフローの一部として、いくつかの例は、複数のレンチウイルスベクターを提供し、レンチウイルスベクターの各々は、異なるセミランダムバーコードを含むことが更に理解されるであろう。突然変異誘発飽和変異体ライブラリーは、複数のレンチウイルスベクターと接触して提供されてもよい。
本明細書中に記載の特定のベクター、組成物、及び操作は、細胞におけるタンパク質コード変異体の発現を分析するための任意の適切な方法での使用のために改変されてもよい。例えば、図２は、細胞におけるタンパク質コード変異体の発現を分析するための例示的な方法２０００における操作の流れを示す。
方法２０００は、細胞におけるＤＮＡのタンパク質コード領域を、タンパク質コード領域の変異体及びその変異体を同定する第１のバーコードを含むドナーベクターで置換することを含んでもよく、細胞は、変異体の発現及び第１のバーコードの発現を含むｍＲＮＡを生成する（操作２００１）。例えば、図１Ａ～図１Ｂを参照して説明するような様式で、ドナーベクター１２１、１２２を使用して、それぞれの細胞１１１、１１２内のＤＮＡ配列Ｓ１のタンパク質コード領域１３０を、バーコード１４１にカップリングされた変異体１３１又はバーコード１４２にカップリングされた変異体１３２で置換することができる。ベクター及び挿入方法の非限定的な例を、図３Ａ及び図４Ｂを参照して説明する。ｍＲＮＡは、図１Ｃを参照して説明するような様式で生成され得る。
方法２０００はまた、細胞に対応する第２のバーコードをｍＲＮＡにカップリングすることを含み得る（操作２００２）。例えば、図１Ｄを参照して説明するような様式で、変異体及びバーコードの挿入に応答して細胞によって生成される任意のｍＲＮＡ分子に第２のバーコードをカップリングしてもよい。方法２０００はまた、第２のバーコードがカップリングされたｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することを含んでもよい（操作２００３）。例えば、図１Ｅを参照して説明するような様式で、第２のバーコードを有するｍＲＮＡをｃＤＮＡに転写してもよい。方法２０００はまた、ｃＤＮＡを配列決定することを含み得る（操作２００４）。いくつかの例では、操作２００２、２００３、２００４は、本明細書の他の箇所に記載されているような市販の機器を任意に使用して、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑプロセスで実施される。方法２０００はまた、ドナーベクター及び／又はｃＤＮＡを配列決定することを含み得る（操作２００５）。いくつかの例では、操作２００５は、本明細書の他の箇所に記載されているような市販のＳＢＳ装置を任意に使用して、図４Ｃを参照して説明するようなアンプリコン配列決定で実施され得る。必要に応じて、配列決定は、図１Ｅ、図３Ｃ又は図４Ｃを参照して説明するようなネステッドＰＣＲプロセスにおいて生成され得る長いリードを使用して、又は短縮されたアンプリコンを使用して行われてもよい。方法２０００はまた、ドナーベクター配列とｃＤＮＡ配列とを相関させて、変異体及び細胞によるその変異体の発現を同定することを含み得る（操作２００６）。そのような相関が実行される様式の非限定的な例を、図１Ｅ、図３Ｂ、及び図４Ａを参照して説明する。
以下のプロトコルは、純粋に例示的であることを意図しており、本発明を限定するものではない。特に、提供される特定のサイズ、時間、温度、及び量は、純粋に例示的なものであることを理解されたい。
実施例１
次に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して、臨床的意義不明の変異体（Variants of Uncertain Significance、ＶＵＳ）機能を研究するための飽和ゲノム編集（Saturation Genome Editing、ＳＧＥ）の非限定的で純粋に例示的な例を記載する。
次に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用して、臨床的意義不明の変異体（Variants of Uncertain Significance、ＶＵＳ）機能を研究するための飽和ゲノム編集（Saturation Genome Editing、ＳＧＥ）の非限定的で純粋に例示的な例を記載する。
（Ａ）アプローチＩのプロトコルの例：ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９プラスミド及びバーコード化変異体ＨＤＲプラスミドライブラリーの同時トランスフェクション
序論
例示的なアプローチＩは、２セットのエクソン特異的プラスミドを使用して、ヒト細胞における飽和ゲノム編集（ＳＧＥ）を行う。プラスミドの第１のセット、例えば、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９プラスミドは、ヒト細胞におけるｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼの効率的な発現を駆動するための発現カセットを含む。ｓｇＲＮＡは、目的の各エクソンに特異的に設計されている。第２のセットのプラスミド、例えば、バーコード化変異体ＨＤＲプラスミドは、バーコード化変異体及びピューロマイシン耐性（ＰｕｒｏＲ）遺伝子を含むか、又は本質的にそれらからなる、切断部位及び挿入領域に対する相同アームを担持する。このプラスミドのセットを使用して、その後のスクリーニング及び濃縮のための選択マーカーとしてピューロマイシンを使用してバーコード化変異体を挿入しながら、切断部位で相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘導する。合わせて、これら２セットのプラスミドを一緒に使用して、ヒト細胞内の標的部位に二重鎖切断を導入し、その後、読み出し方法としてアンプリコン配列決定及びｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑを使用して、バーコード化変異体を用いてＳＧＥを実施する。
例示的なアプローチＩは、２セットのエクソン特異的プラスミドを使用して、ヒト細胞における飽和ゲノム編集（ＳＧＥ）を行う。プラスミドの第１のセット、例えば、ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９プラスミドは、ヒト細胞におけるｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼの効率的な発現を駆動するための発現カセットを含む。ｓｇＲＮＡは、目的の各エクソンに特異的に設計されている。第２のセットのプラスミド、例えば、バーコード化変異体ＨＤＲプラスミドは、バーコード化変異体及びピューロマイシン耐性（ＰｕｒｏＲ）遺伝子を含むか、又は本質的にそれらからなる、切断部位及び挿入領域に対する相同アームを担持する。このプラスミドのセットを使用して、その後のスクリーニング及び濃縮のための選択マーカーとしてピューロマイシンを使用してバーコード化変異体を挿入しながら、切断部位で相同組換え修復（ＨＤＲ）を誘導する。合わせて、これら２セットのプラスミドを一緒に使用して、ヒト細胞内の標的部位に二重鎖切断を導入し、その後、読み出し方法としてアンプリコン配列決定及びｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑを使用して、バーコード化変異体を用いてＳＧＥを実施する。
例示的な手順
ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９プラスミドの構築。ｓｇＮＲＡ－Ｃａｓ９プラスミドのベクター骨格を、ＰＣＲを使用して２つの断片（例えば、それぞれ約４～５ｋｂ）に線状化し、続いてＥ－ゲルで精製する。ＩＤＴオンラインツールによってｓｇＲＮＡを設計し、ｓｇＲＮＡ及び骨格との重複領域を含むか、又は本質的にそれらからなるｇＢｌｏｃｋｓ遺伝子断片をＩＤＴを通して注文する。続いて、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙキットを使用してｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９プラスミドを構築し、Ｅｎｄｕｒａエレクトロコンピテントセルに形質転換する。コロニーが形成された後、ランダムなコロニーをプレートから採取し、アンピシリンを含むＬＢブロスに接種して一晩増殖させる。次いで、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐキットを使用して、細胞パレットからプラスミドを抽出する。次いで、構築されたプラスミドを、配列検証のために完全プラスミドサンガー配列決定に供する。
ｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９プラスミドの構築。ｓｇＮＲＡ－Ｃａｓ９プラスミドのベクター骨格を、ＰＣＲを使用して２つの断片（例えば、それぞれ約４～５ｋｂ）に線状化し、続いてＥ－ゲルで精製する。ＩＤＴオンラインツールによってｓｇＲＮＡを設計し、ｓｇＲＮＡ及び骨格との重複領域を含むか、又は本質的にそれらからなるｇＢｌｏｃｋｓ遺伝子断片をＩＤＴを通して注文する。続いて、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙキットを使用してｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９プラスミドを構築し、Ｅｎｄｕｒａエレクトロコンピテントセルに形質転換する。コロニーが形成された後、ランダムなコロニーをプレートから採取し、アンピシリンを含むＬＢブロスに接種して一晩増殖させる。次いで、Ｑｉａｇｅｎ Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐキットを使用して、細胞パレットからプラスミドを抽出する。次いで、構築されたプラスミドを、配列検証のために完全プラスミドサンガー配列決定に供する。
バーコード化変異体ＨＤＲプラスミドライブラリーの構築。ＨＤＲ鋳型プラスミドのベクター骨格を、ＰＣＲを使用して線状化し（例えば、約５．３ｋｂ）、その後、Ｅ－ゲルで精製する。ホモロジーアームは、ＰＣＲを使用してＨＡＰ１ Ｌｉｇ４ノックアウト（ＫＯ）細胞株のゲノムＤＮＡから増幅される。ＰｕｒｏＲ遺伝子及びランダムバーコード領域を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔに注文したランダムバーコード化ベクターから増幅した。続いて、初期ＨＤＲ鋳型プラスミドを、これらの４つの断片を有するＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙキットを使用して構築し、続いてＥｎｄｕｒａエレクトロコンピテントセルに形質転換する。Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ－Ｐｒｅｐキットを使用して、寒天プレート上で増殖した１０５個を超えるコロニーからプラスミドを抽出する。Ｎｅｘｔｅｒａ Ｆｌｅｘ Ｌｉｂｒａｒｙを構築し、配列決定してプラスミドの全体構造を検証し、ランダムバーコード領域を標的とするアンプリコン配列決定を使用してバーコード多様性を確実にする。続いて、ＨＤＲ鋳型プラスミド骨格を、ＰＣＲを使用して２つの断片に線状化し（例えば、それぞれ約４～５ｋｂ）、続いてＥ－ゲルで精製する。ＳＮＰを目的のエクソンに沿った全てのヌクレオチドに各々導入するオリゴを含むオリゴプールを設計し、ＩＤＴに注文する。次いで、オリゴプールを、ＰＣＲを用いてｄｓＤＮＡに増幅する。最後に、ＨＤＲ鋳型プラスミド骨格及びＰＣＲ生成物を、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙキットを使用して組み立て、続いてＥｎｄｕｒａエレクトロコンピテントセルに形質転換する。Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉ－Ｐｒｅｐキットを、寒天プレート上で増殖させた例えば約１０５個を超えるコロニーからの別のラウンドのプラスミド抽出に使用して、トランスフェクションの準備ができているランダムバーコード化変異体を含むプラスミドプールを得る。
ゲノム編集が成功した細胞集団のトランスフェクション及び濃縮。構築されたｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９プラスミド及びバーコード化変異体ＨＤＲプラスミドライブラリーを、ユーザーガイドに従ってリポフェクタミン３０００を使用して細胞株、例えばＨＡＰ１ Ｌｉｇ４ ＫＯ細胞株に同時トランスフェクトする。簡潔に述べると、細胞（例えば、約５×１０５個の細胞）を、トランスフェクションの約１日前にマルチウェル（例えば、約６ウェル）プレートの各ウェルに播種する。細胞を一晩増殖させて、例えば約７５％の細胞密集度に到達させる。トランスフェクションの日に、リポフェクタミン３０００試薬（例えば、約３．７５μＬ）を、例えば、約１２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地、例えば、合計約２．５μｇのｓｇＲＮＡ－Ｃａｓ９プラスミド及びバーコード化変異体ＨＤＲプラスミドライブラリー（例えば、各々約１．２５μ）も、例えば、５μＬのＰ３０００試薬と共に約１２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地で希釈する。次いで、希釈した成分を組み合わせ、マルチウェルプレートの各ウェルに添加する。約２日間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、例えば約１０ｍＬの新鮮な培地を含む細胞培養フラスコに移す。ピューロマイシンを各フラスコに添加して、例えば約１μｇ／ｍＬの最終濃度にする。トランスフェクションの約５日後及び約７日後に、培養物を一定のＰｕｒｏ選択で再度分割する。７日目に、例えば、約２ｍＬの培養物を使用し、Ｌｕｃｉｇｅｎ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液を使用して溶解物を抽出する。次いで、溶解物をＰＣＲ用のＤＮＡ鋳型として使用して、ノックイン領域を検証する。
バーコードと変異体とを連結するためのアンプリコン配列決定。７日目（トランスフェクション後）の溶解物ＰＣＲのうちの１つは、バーコード、変異体及び右ホモロジーアーム領域をカバーするアンプリコン（例えば、約３ｋｂ）を生じ、これを２回目のＰＣＲ用のＤＮＡ鋳型として使用して、バーコード及び変異体領域をカバーする領域（例えば、約１ｋｂ領域）を増幅する。アダプター及び配列決定インデックスをＰＣＲによってアンプリコンに付加する。アンプリコンを、リード１及びリード２の両方で１５１塩基についてＭｉＳｅｑを使用して配列決定する。両方のインデックスはそれぞれ１０塩基である。次いで、配列決定データを、適切なバイオインフォマティクスパイプラインを使用して分析して、変異体バーコードと変異体との間の相関を確立する。
変異体の表現型を研究するための１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑ。溶解物抽出及びアンプリコン配列決定と同じ日（例えば、トランスフェクションの約７日後）に、細胞を使用して１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑを行い、単一細胞のトランスクリプトームを特徴付けて変異体を研究することもできる。細胞を、細胞調製プロトコルに従って調製する。簡潔には、例えば、約１０７個の細胞を各試料に使用し、続いて、例えば、約０．０４％ＢＳＡを含む１Ｘ ＰＢＳで洗浄する。洗浄した細胞をセルストレーナーで濾過して細胞残屑及び大きな塊を除去し、例えば約１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁する。細胞調製後、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑを、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ５’Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ ｖ２（Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘ）のユーザーガイドに従って開始する。例えば約１０，０００個の細胞を、ＧＥＭ生成及びバーコード化のための入力として使用する。ＧＥＭ ＲＴ後浄化及びｃＤＮＡ増幅の後、５’遺伝子発現（ＧＥＸ）ライブラリーを構築する。次いで、１０×１０のインデックス付けされたリードを有するリード１については２１０サイクル、リード２については９０サイクルのＳＰフローセルを使用して、ライブラリーをＮｏｖａＳｅｑ上で配列決定する。生成された配列決定データを、適切なバイオインフォマティクスパイプラインを使用して分析する。
（Ｂ）アプローチＩＩのプロトコルの例：バーコード化変異体線状ＨＤＲライブラリー及びリボ核タンパク質（ＲＮＰ）の同時トランスフェクション
序論
例示的なアプローチＩＩは、バーコード化変異体線状ＨＤＲライブラリー（例えば、約３ｋｂのｄｓＤＮＡ）及びＲＮＰを利用してＳＧＥを行う。線状ＨＤＲライブラリーは、バーコード化変異体及びＰｕｒｏＲ遺伝子を含むか、又は本質的にそれらからなる切断部位及び挿入領域に対するホモロジーアームを含む、アプローチＩからの構築されたバーコード化変異体ＨＤＲプラスミドライブラリーからＰＣＲを使用して増幅される。ＲＮＰ複合体を、インビトロで精製Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを使用して形成する。次いで、線状ＨＤＲライブラリー及びＲＮＰ複合体を、適切な細胞株、例えば、ＨＡＰ１ Ｌｉｇ４ ＫＯ細胞株にエレクトロポレーションしてＳＧＥを行い、続いて、読み出し方法としてアンプリコン配列決定及びｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑを行う。
例示的なアプローチＩＩは、バーコード化変異体線状ＨＤＲライブラリー（例えば、約３ｋｂのｄｓＤＮＡ）及びＲＮＰを利用してＳＧＥを行う。線状ＨＤＲライブラリーは、バーコード化変異体及びＰｕｒｏＲ遺伝子を含むか、又は本質的にそれらからなる切断部位及び挿入領域に対するホモロジーアームを含む、アプローチＩからの構築されたバーコード化変異体ＨＤＲプラスミドライブラリーからＰＣＲを使用して増幅される。ＲＮＰ複合体を、インビトロで精製Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びｓｇＲＮＡを使用して形成する。次いで、線状ＨＤＲライブラリー及びＲＮＰ複合体を、適切な細胞株、例えば、ＨＡＰ１ Ｌｉｇ４ ＫＯ細胞株にエレクトロポレーションしてＳＧＥを行い、続いて、読み出し方法としてアンプリコン配列決定及びｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑを行う。
例示的な手順
１．バーコード化変異体線状ＨＤＲライブラリーの構築。アプローチＩから構築されたバーコード化変異体ＨＤＲプラスミドライブラリーをＰＣＲ用のＤＮＡ鋳型として使用して、切断部位に対するホモロジーアーム、ランダムバーコード、ＰｕｒｏＲ遺伝子、及び変異体領域を含むか、又は本質的にそれらからなる線状ＨＤＲライブラリーを生成する。ＰＣＲ生成物を精製し、ユーザーガイドに従ってＺｙｍｏ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキットを使用して濃縮する。
１．バーコード化変異体線状ＨＤＲライブラリーの構築。アプローチＩから構築されたバーコード化変異体ＨＤＲプラスミドライブラリーをＰＣＲ用のＤＮＡ鋳型として使用して、切断部位に対するホモロジーアーム、ランダムバーコード、ＰｕｒｏＲ遺伝子、及び変異体領域を含むか、又は本質的にそれらからなる線状ＨＤＲライブラリーを生成する。ＰＣＲ生成物を精製し、ユーザーガイドに従ってＺｙｍｏ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒキットを使用して濃縮する。
２．ＲＮＰ複合体の形成。Ａｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡ及びＡｌｔ－Ｒ Ｓ．ｐ．ＨｉＦｉ Ｃａｓ９ヌクレアーゼＶ３を、ＩＤＴから購入する。ＲＮＰ複合体を形成するために、５．３μＬのｓｇＲＮＡ（１００μＭストック溶液）、７．３μＬのＣａｓ９ヌクレアーゼ（６２μＭストック溶液）、及び９．４μＬのＤＰＢＳを０．５ｍＬ遠心分離管中で反応毎に混合し、ＲＮＰ複合体形成のために室温で２０分間インキュベートする。
３．細胞調製及びエレクトロポレーション。以下のプロトコルは、ＩＤＴからのＲＮＰユーザーガイドのエレクトロポレーションから修正されたものである。簡潔には、エレクトロポレーションの約１日前に細胞培養培地をリフレッシュする。エレクトロポレーションの日に、トリプシン細胞をフラスコ（例えば、約３０ｍＬフラスコ）に入れ、次いで、培地を例えば約１０ｍＬまで添加し、細胞を定量する。（約１０回の反応について）例えば約１×１０７個の細胞を、ＤＰＢＳで例えば約４０ｍＬに希釈し、例えば約２００×ｇで、例えば室温で約５分間遠心分離する。ペレットを乱さずに上清を除去し、５ｍＬのＤＰＢＳ中で細胞を洗浄する。例えば、室温で約５分間、約２００×ｇで遠心分離する。上清を除去し、細胞を、例えば、約６００ｕＬのＤＰＢＳ中に再懸濁し、例えば６０ｕＬ当たり約１×１０６個の細胞を得る。エレクトロポレーション毎に、例えば約６０μＬの再懸濁した細胞を、例えば、約１．５ｍＬの微量遠心分離管にアリコートする。エレクトロポレーションの前に、細胞を少なくとも約５分間氷上に保つ。
エレクトロポレーション用に、約３７℃のインキュベーター内で、ウェル当たり例えば約２ｍＬの培養培地で満たされたマルチウェルプレート（例えば、約６ウェルプレート）を調製する。以下の成分を、例えば約０．５ｍＬ遠心管中で混合する：約２０μＬの工程２由来のＡｌｔ－Ｒ ＲＮＰ複合体、約５μＬのＡｌｔ－Ｒエレクトロポレーションエンハンサー（約９６μＭ）、約１５μＬの工程１由来の二重鎖線状ＨＤＲ鋳型（例えば、約１００ｎｇ／μＬストック）、及び約６０μＬの等分した細胞懸濁液。混合物を冷却したキュベット（０．２ｃｍギャップのＢｉｏ－Ｒａｄ＃１６５２０８２）に直ちに移し、約１５０Ｖ、２ｍｓのパルス幅、１パルス、ユニポーラ極性でエレクトロポレーションを実施する。エレクトロポレーション後、細胞をマルチウェルプレートに移す（例えば、２０μＬピペットチップを使用して、キュベットから全ての細胞を取り出す）。約２日間のインキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、例えば、約１０ｍＬの新鮮な培地を含む細胞培養フラスコに移す。ピューロマイシンを各フラスコに添加して、例えば約１μｇ／ｍＬの最終濃度にする。例えばトランスフェクションの約５日後及び７日後に、培養物を一定のＰｕｒｏ選択で再度分割する。７日目に、約２ｍＬの培養物を使用し、Ｌｕｃｉｇｅｎ ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ＤＮＡ抽出溶液を使用して溶解物を抽出する。次いで、溶解物をＰＣＲ用のＤＮＡ鋳型として使用して、ノックイン領域を検証する。
４．バーコードと変異体とを連結するためのアンプリコン配列決定。約７日目（トランスフェクション後）の溶解物ＰＣＲのうちの１つは、バーコード、変異体及び右ホモロジーアーム領域をカバーするアンプリコン（例えば、約３ｋｂ）を生じ、これを２回目のＰＣＲ用のＤＮＡ鋳型として使用して、バーコード及び変異体領域をちょうどカバーする約１ｋｂの領域を増幅する。アダプター及び配列決定インデックスをＰＣＲによってアンプリコンに付加する。アンプリコンを、リード１及びリード２の両方で約１５１塩基についてＭｉＳｅｑを使用して配列決定する。両方のインデックスはそれぞれ、例えば約１０塩基である。次いで、配列決定データを、適切なバイオインフォマティクスパイプラインを使用して分析して、変異体バーコードと変異体との間の相関を確立する。
５．変異体の表現型を研究するための１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑ。溶解物抽出及びアンプリコン配列決定と同じ日（例えば、トランスフェクションの約７日後）に、細胞を使用して１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑを行い、単一細胞のトランスクリプトームを特徴付けて変異体を研究する。細胞を、細胞調製プロトコルに従って調製する。簡潔には、例えば、約１０７個の細胞を各試料に使用し、続いて、０．０４％ＢＳＡを含む１Ｘ ＰＢＳで洗浄する。洗浄した細胞をセルストレーナーで濾過して細胞残屑及び大きな塊を除去し、例えば約１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁する。細胞調製後、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｓｃＲＮＡ－Ｓｅｑを、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ ＧＥＭ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ５’Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔｓ ｖ２（Ｄｕａｌ Ｉｎｄｅｘ）のユーザーガイドに従って開始する。例えば、約１０，０００個の細胞を、ＧＥＭ生成及びバーコード化のための入力として使用する。ＧＥＭ ＲＴ後浄化及びｃＤＮＡ増幅の後、５’遺伝子発現（ＧＥＸ）ライブラリーを構築する。次いで、１０×１０のインデックス付けされたリードを有するリード１については２１０サイクル、リード２については９０サイクルのＳＰフローセルを使用して、ライブラリーをＮｏｖａＳｅｑ上で配列決定する。生成された配列決定データを、適切なバイオインフォマティクスパイプラインを使用して分析する。
実施例１の結果
図３Ｂ及び図５は、ＴＰ５３のエクソン７を標的とする飽和ゲノム編集（ＳＧＥ）実験のためのＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ利用アプローチからの結果を示す。実施例１は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用するＳＧＥの方法の例示的な例を提供する。他の適切な方法を使用してもよいことが理解されよう。
図３Ｂ及び図５は、ＴＰ５３のエクソン７を標的とする飽和ゲノム編集（ＳＧＥ）実験のためのＣＲＩＳＰＲ－ＨＤＲ利用アプローチからの結果を示す。実施例１は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用するＳＧＥの方法の例示的な例を提供する。他の適切な方法を使用してもよいことが理解されよう。
図３Ｂのパネル３１１０は、ノックイン配列を含む遺伝子（バーコード及び突然変異を有するピューロマイシン遺伝子）を示す。図３Ｂのパネル３１３０はまた、プライマーが結合する場所を示している。プライマーを、染色体のホモロジーアームの外側の配列に結合するように設計した。
細胞を、ノックイン配列を含むベクターでトランスフェクトした。非トランスフェクト細胞を対照として使用した。図３Ｂのパネル３１３０に示すプライマーを使用して、トランスフェクト細胞及び非トランスフェクト細胞からＰＣＲ生成アンプリコンを生成した。
図３Ｂのパネル３１２０は、実施例１の実験細胞及び対照細胞からのＰＣＲ生成アンプリコンが分離されたアガロースゲルを示す。図３Ｂのパネル３１２０に示すように、トランスフェクト細胞からのＰＣＲ生成アンプリコンは、天然染色体よりも約１．７ｋｂ大きいバンド（約３ｋｂ）をもたらし、これは、バーコード及び突然変異を有するピューロマイシン遺伝子の予想されるサイズである。非トランスフェクト対照試料では、この１．７ｋｂの大きなバンドは存在しなかった。
図５は、ＴＰ５３のエクソン７を標的とした飽和ゲノム編集実験からＰＣＲ増幅されたアンプリコンの次世代配列決定を示す。ノックイン配列の領域において、変異体バーコード及びプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は、編集されたゲノムのそれぞれに一貫して存在した。図５の要素１０は、ＰＡＭの位置を示す。ＰＡＭ部位は、シングルガイドＲＮＡによる編集されたＤＮＡの再切断を防止する。図５の要素２０は、変異体バーコードの例を示す。図３Ｂ及び図５からのこれらのデータは共に、ＴＰ５３のエクソン７上の実質的に全ての塩基が、アンプリコン配列決定データ及びｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータを使用して編集及び同定され得ることを示している。
実施例２
ここで、５’ＵＴＲバーコード化レンチウイルスベクターへのライブラリーＤＮＡのクローニングの非限定的な純粋に例示的な例を提供する（パートＩ）。
ここで、５’ＵＴＲバーコード化レンチウイルスベクターへのライブラリーＤＮＡのクローニングの非限定的な純粋に例示的な例を提供する（パートＩ）。
ＰＣＲ管を密封し、サーマルサイクラー中、例えば、約３７℃で約９０分間消化を行う。
２．消化生成物のゲル抽出
ａ．製造業者の指示に従って、１％ Ｅ－Ｇｅｌ（登録商標）ＥＸ Ａｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｇ４０２００１）上で消化反応を実行する。
ｂ．カセットを開き、所望のバンドを切り取る。
ｃ．Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｄ４００２）を使用して、所望の消化されたＤＮＡを含有するゲル片を精製する。製造業者のプロトコルに従ってＤＮＡを抽出する。最大４つのレーンからのゲル片を組み合わせて単一の抽出にすることができる。ＤＮＡを、例えば約１０～２０μｌで溶出する。
ｄ．Ｑｕｂｉｔを使用してＤＮＡを定量化する。
３．ライゲーション
ライゲーション用に、例えば約２０ｎｇの消化されたベクターＤＮＡ及び適切な量の消化されたＴｗｉｓｔライブラリー（インサート：ベクター＝約７：１のモル比）を使用する。計算に、ｈｔｔｐ：／／ｎｅｂｉｏｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／＃！／ｌｉｇａｔｉｏｎを使用する。
以下の、例えば約２０μｌのライゲーション反応を設定する。
上下にピペッティングすることによって反応物を穏やかに混合し、短時間回転させる。
ＰＣＲ管を密封し、以下のプログラムを使用してサーマルサイクラー中でライゲーションを行う：
室温付近で約９０分
約６５℃で約１０分間
約４℃で維持
形質転換前に氷上で冷却するか、又は約－２０℃で保存する
室温付近で約９０分
約６５℃で約１０分間
約４℃で維持
形質転換前に氷上で冷却するか、又は約－２０℃で保存する
４．大腸菌（E.coli）形質転換
使用するコンピテント細胞の例：Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｅｎｄｕｒａエレクトロコンピテントセル（Ｌｕｃｉｇｅｎ ６０２４２－２）
製造業者の指示に従う。各形質転換反応について、例えば、約１μｌのライゲーション反応を使用する。
例えば、約５００μｌの形質転換体を、ＤＮＡ抽出のために、例えば、約１５ｃｍのＬＢ－アンピシリン寒天プレート（Ｔｅｋｎｏｖａ：Ｌ５００４）の各々に広げる。
また、例えば、約１～２μｌの形質転換体（例えば、約１００μｌ培地に添加）を別の、例えば、約１０ｃｍプレート（Ｔｅｋｎｏｖａ：Ｌ１００４）にプレーティングして、コロニーを計数し、サンガー配列決定のために単一コロニーを採取する。
ＤＮＡ抽出のために、例えば約１００，０００コロニー超の総コロニー数に達するのに十分な形質転換を行う。
５．ＤＮＡ抽出
形質転換体を載せた例えば約１５ｃｍプレートからＤＮＡを直接抽出する。例えば約１００，０００コロニー超の総コロニー数に達するのに十分なプレートを抽出する。
ａ．寒天プレートから全ての細胞を回収する。
ｂ．例えば、約５ｍＬの新鮮なＬＢブロスをピペッティングし、例えば、約５～１０個のＲａｔｔｌｅｒ Ｐｌａｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（Ｚｙｍｏ：Ｓ１００１－５）をプレートに置き、オービタルシェーカーを使用してそれらをゆっくりと振盪する（５～１０分）。
ｃ．例えば約５～１０分後、直ちに細胞を例えば約５０ｍＬ管に回収し、ＬＢブロスを使用してプレートを数回洗浄して、実質的に全ての細胞を回収する。
ｄ．Ｑｉａｇｅｎ Ｍａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ １２１６２）から製造者のプロトコルに従ってＤＮＡを抽出する。詳細は以下のとおりである。
ｉ）例えば、約４℃で約１５分間、約６０００ｇで遠心分離する。
ｉｉ）全ての上清をデカントし、ペレット（例えば、各抽出について約３００～５００ｍｇ）を例えば約１０ｍＬの緩衝液中に再懸濁する。
ｉｉｉ）例えば、約１０ｍＬの緩衝液Ｐ２を添加し、約４～６回激しく反転させることによって完全に混合し、ほぼ室温（例えば、約１５－２５℃）で約５分間インキュベートする。
ｉｖ）例えば、約１０ｍＬの予冷した緩衝液Ｐ３を添加し、約４～６回激しく反転させることによって完全に混合する。氷上で約２０分間インキュベートする。
ｖ）例えば、約４℃で約３０分間、約２０，０００×ｇ以上で遠心分離する。
ｖｉ）例えば約１０ｍＬの緩衝液ＱＢＴを適用することによってＱＩＡＧＥＮチップ５００を平衡化し、重力流によってカラムを空にする。
ｖｉｉ）工程ｖ）からの上清をＱＩＡＧＥＮチップに適用し、重力流によって樹脂に入れる。
ｖｉｉｉ）ＱＩＡＧＥＮチップを、例えば約２×３０ｍＬの緩衝液ＱＣで洗浄する。緩衝液ＱＣを重力流によってＱＩＡＧＥＮチップを通って移動させる。
ｉｘ）例えば約１５ｍＬの緩衝液ＱＦを用いて、ＤＮＡを清浄な５０ｍＬ容器に溶出させる。
ｘ）例えば、約１０．５ｍＬ（約０．７体積）のＲＴイソプロパノールを溶出したＤＮＡに添加することによってＤＮＡを沈殿させ、混合する。例えば、約４℃で約３０分間、約１５，０００×ｇ以上で遠心分離する。上清を慎重にデカントする。
ｘｉ）ＤＮＡペレットを例えば約５ｍＬのＲＴ ７０％エタノールで洗浄し、例えば約１５，０００×ｇ以上で約１０分間遠心分離する。上清を慎重にデカントする。
ｘｉｉ）ペレットを例えば約５～１０分間風乾し、例えば約１５０μｌのＴＥ緩衝液にＤＮＡを再溶解させる。
６．サンガー配列決定によるＱＣ（任意選択）
プライマー４９９７Ｆ ＥＦｓ（例えば、配列ｔｇａｔｇｔｃｇｔｇｔａｃｔｇｇｃｔｃ（配列番号１７））を使用したサンガー配列決定のために、１つ以上のコロニー（例えば、約１６コロニー）を採取する。このプライマーは、クローニングされた遺伝子中のバーコード領域及び約００ｎｔを良好な品質で読み取ると予想される。遺伝子が例えば約５００ｂｐ超の長さである場合、追加の遺伝子特異的配列決定プライマーを使用することができる。
７．全ゲノム配列決定によるＱＣ
抽出されたＤＮＡ及び２×２００ｂｐのＭｉｓｅｑ上の配列を使用して、Ｎｅｘｔｅｒａ ＤＮＡ調製済みライブラリーを調製する。ゲノムへのアラインメントをチェックし、重複領域を使用して変異体を同定する（適切なデータ分析パイプラインをこのために使用することができる）。
ここで、レンチウイルスパッケージング及び力価測定（パートＩＩ）の非限定的で純粋に例示的な例を提供する。
１．レンチウイルスパッケージング
使用する細胞株の例：２９３ＦＴ細胞株（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｒ７０００７）
使用するパッケージングプラスミドの例：ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｋ４９７５００）
トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム）を用いて、標準的なプロトコルを使用して実施することができる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、以下のプロトコルの図２を参照されたい：ｈｔｔｐｓ： ／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｄａｍ／ＬｉｆｅＴｅｃｈ／ｇｌｏｂａｌ／ｌｉｆｅ－ｓｃｉｅｎｃｅｓ／ＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅａｎｄＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ／ｐｄｆｓ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００－ＬｅｎｔｉＶｉｒｕｓ－ＡｐｐＮｏｔｅ－Ｇｌｏｂａｌ－ＦＨＲ．ｐｄｆ）。最良の結果のために、レンチウイルスパッケージング用に１０ｃｍプレートカラムを使用し、ウイルス上清を一度だけ回収する。
２．ＰＥＧ－ｉｔによるウイルスの濃縮（任意選択）
ａ）ウイルス上清を回収した後、上清を滅菌容器に移し、例えば、約１容量の冷ＰＥＧ－ｉｔウイルス沈殿溶液（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＬＶ８１０Ａ－１）を約４容量のレンチベクター含有上清毎に添加する。（例：１２ｍｌのウイルス上清を含む３ｍｌのＰＥＧ－ｉｔ）。約４℃で約３日間冷蔵する。
ｂ）上清／ＰＥＧ－ｉｔ混合物を、例えば、約１５００×ｇで約３０分間、約４℃で遠心分離する。遠心分離後、レンチベクター粒子は、容器の底にベージュ色又は白色のペレットとして現れ得る。
ｃ）上清を新しい管に移す。残留ＰＥＧ－ｉｔ溶液を、例えば、約１５００×ｇで約５分間の遠心分離によってスピンダウンする。ペレット中の沈殿したレンチウイルス粒子を乱さないように十分に注意しながら、吸引によって実質的に全ての微量の流体を除去する。
ｄ）冷滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して、例えば元の体積の約１／１００～１／２００のレンチウイルスペレットを再懸濁／混合する。
３．ゼオシン耐性コロニーの計数によるレンチウイルス力価測定
レンチウイルスストックの力価を決定するために、以下の工程を行う：（１）レンチウイルスストックの連続希釈物を調製する；（２）レンチウイルスの希釈物を哺乳動物細胞株に形質導入する；（３）標準的な方法を使用して、安定的に形質導入された細胞を選択する；（４）安定的に形質導入された細胞のコロニーを計数する（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる以下のプロトコルの１５頁～２１頁を参照のこと：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔ－ｃｏｎｎｅｃｔ／ｄｏｃｕｍｅｎｔ－ｃｏｎｎｅｃｔ．ｈｔｍｌ？ｕｒｌ＝ｈｔｔｐｓ％３Ａ％２Ｆ％２Ｆａｓｓｅｔｓ．ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ．ｃｏｍ％２ＦＴＦＳ－Ａｓｓｅｔｓ％２ＦＬＳＧ％２Ｆｍａｎｕａｌｓ％２Ｆｖｉｒａｐｏｗｅｒ＿ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ＿ｓｙｓｔｅｍ＿ｍａｎ．ｐｄｆ＆ｔｉｔｌｅ＝ＶｍｌｙＹＶＢｖｄ２ＶｙＩＥｘｌｂｎＲｐｄｍｌｙＹＷｗｇＲＸｈｗｃｍＶｚｃ２ｌｖｂｉＢＴｅＸＮ０ＺＷ０＝）。
１０Ｘ実験のために選択した細胞株を使用して力価測定を行う。一例では、ＨＥＫ２９３細胞及びＡ５４９細胞株における選択のために２５０ｕｇ／ｍＬゼオシン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｒ２５００１）を使用する（他の細胞株については、使用するゼオシンの適切な量を決定するために死滅曲線を実施することができる）。クリスタルバイオレット染色後約１４日目にコロニーを計数する。
ここで、レンチウイルス形質導入及び１０Ｘ（パートＩＩＩ）の非限定的で純粋に例示的な例を提供する。
１）１日目の午後：約３００万個のＡＴＣＣ ＨＥＫ ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５７３）を、各々約１０ｃｍプレートに播種して、翌日に約４００万個の細胞にする。約３枚のプレートに播種し、１枚はレンチウイルス形質導入用、１枚は非形質導入対照用、３枚目は翌日に細胞を計数するために使用する。
２）２日目：形質導入の日に、余分な３枚目のプレートを用いて細胞数を計数する。これは、どの程度のウイルスを添加するかを計算するために使用される。レンチウイルスストックを解凍し、適切な量のウイルスを新鮮な完全培地（例えば、約１０ｍＬ）に希釈して、約０．０５のＭＯＩを得る。ボルテックスしない。例えば、約１０μＬの約６ｍｇ／ｍＬポリブレン（最終濃度＝約６μｇ／ｍＬ）を添加する。非形質導入対照のプレートも行う。
３）加湿した約５％ ＣＯ２インキュベーター中、約３７℃で一晩インキュベートする。
４）３日目：約１０ｍｌの培地に交換する。
５）４日目：培地を除去し、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、例えば、約０．２５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｙｐｓｉｎ－約０．５３ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で細胞をトリプシン処理する。全ての試料を約１０ｃｍプレートから約１５ｃｍプレートに移し、例えば、選択のために約２５０μｇ／ｍＬゼオシンを添加する。
６）約３～４日毎に培地を新鮮な抗生物質と交換する。
７）非形質導入対照が完全に死滅する時点を観察する。
８）非形質導入細胞プレート上の細胞が完全に死滅した後、細胞を１０Ｘライブラリー調製のために回収することができる。
９）例えば約１０，０００個の細胞を標的とした１０Ｘ Ｃｈｒｏｍｉｕｍ Ｎｅｘｔ Ｇｅｍ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ ５’試薬キットＶ２を使用し、製造者のプロトコル（１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、米国カリフォルニア州プレザントン）に従って、１０Ｘライブラリーを調製する
（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ｈｔｔｐｓ：Ｂ．／／ａｓｓｅｔｓ．ｃｔｆａｓｓｅｔｓ．ｎｅｔ／ａｎ６８ｉｍ７９ｘｉｔｉ／４ｏＢ７１ＴｅＴ０ｋＤｏＩＨｈｆｑ９ｄＰｘｄ／０５ｃｅ９１２１ｄ０２７７１５３２１ｄ２ａ９７６５ｂ１ｅ９ｂ７０／ＣＧ０００３３１＿ＣｈｒｏｍｉｕｍＮｅｘｔＧＥＭＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌ５＿ｖ２＿ＵｓｅｒＧｕｉｄｅ＿ＲｅｖＡ．ｐｄｆ）。
（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ｈｔｔｐｓ：Ｂ．／／ａｓｓｅｔｓ．ｃｔｆａｓｓｅｔｓ．ｎｅｔ／ａｎ６８ｉｍ７９ｘｉｔｉ／４ｏＢ７１ＴｅＴ０ｋＤｏＩＨｈｆｑ９ｄＰｘｄ／０５ｃｅ９１２１ｄ０２７７１５３２１ｄ２ａ９７６５ｂ１ｅ９ｂ７０／ＣＧ０００３３１＿ＣｈｒｏｍｉｕｍＮｅｘｔＧＥＭＳｉｎｇｌｅＣｅｌｌ５＿ｖ２＿ＵｓｅｒＧｕｉｄｅ＿ＲｅｖＡ．ｐｄｆ）。
ここで、変異体バーコードを変異体に連結するためのアンプリコン配列決定の非限定的な例（パートＩＶ）を提供する。
この部分は、変異体バーコードを変異体に連結するためのＰＣＲの基質として、１０Ｘキットからのクローン化プラスミドＤＮＡ又は増幅ｃＤＮＡのいずれかを使用することができる。これらの２つの入力のＰＣＲサイクルは異なる。
バーコード側のフォワードＰＣＲプライマーは、スタッガード（staggered）プライマーミックスを使用し、以下の例示的配列を有する。
全遺伝子をカバーするリバースプライマーは、遺伝子特異的配列が終止コドンの後にある以下の例示的配列を有する。
ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧｃｃａｇａｇｇｔｔｇａｔｔｇｔｃｇａｃａ（配列番号５）
ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧｃｃａｇａｇｇｔｔｇａｔｔｇｔｃｇａｃａ（配列番号５）
ＯＲＦ領域をタイル化するための他のリバースプライマーを、各遺伝子について設計してもよく、例えば、以下のＡ１４－ＭＥアダプター配列：
ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号６）
を、遺伝子特異的配列の前に付加してもよい。１００～１５０ｂｐ毎にプライマーを設計して遺伝子全体をタイル化する。
ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号６）
を、遺伝子特異的配列の前に付加してもよい。１００～１５０ｂｐ毎にプライマーを設計して遺伝子全体をタイル化する。
例示的な手順：
１．遺伝子特異的ＰＣＲ：
以下の反応を設定する。
以下のＰＣＲプログラムを実行する
約９５℃で約３分間
約１０サイクル（クローン化プラスミドＤＮＡの場合）又は約１６サイクル（１０Ｘ ｃＤＮＡの場合）
約９５℃で約３０秒間
約５５℃又は約６０℃で約３０秒間
約７２℃で約３０秒間
約７２℃で約５分間
約４℃で保持する
約９５℃で約３分間
約１０サイクル（クローン化プラスミドＤＮＡの場合）又は約１６サイクル（１０Ｘ ｃＤＮＡの場合）
約９５℃で約３０秒間
約５５℃又は約６０℃で約３０秒間
約７２℃で約３０秒間
約７２℃で約５分間
約４℃で保持する
２．遺伝子特異的ＰＣＲクリーンアップ：
ａ．ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを約３０秒間ボルテックスして、ビーズが均一に分散していることを確認する。
ｂ．約２０μｌのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（約０．８Ｘ）を各ウェルに添加し、全量を約１０回穏やかに上下にピペッティングする。
ｃ．振盪せずに室温で約５分間インキュベートする。
ｄ．磁気スタンド上に置き、液体が透明になるまで待つ（約２分間）。全ての上清を除去して廃棄する。
ｅ．例えば約２００μｌの新鮮な８０％エタノールでビーズを洗浄する。全ての上清を除去して廃棄する。
ｆ．短時間遠心分離し、微細なピペットチップを有するＰ２０マルチチャンネルピペットを使用して、余分なエタノールを除去する。ビーズを約１０分間風乾させる。
ｇ．例えば約５２．５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５をビーズに添加する。
ｈ．全量を約１０回穏やかに上下にピペッティングする。室温で約２分間インキュベートする。磁気スタンド上に置き、液体が透明になるまで待つ（約２分間）。
ｉ．例えば約５０μｌの上清を新しいＰＣＲ管に注意深く移し、それらを適宜標識する。
３．インデックスＰＣＲ
以下の反応を設定する。
以下のＰＣＲプログラムを実行する
約９５℃で約３分間
約８サイクル（クローン化プラスミドＤＮＡの場合）又は約９サイクル（１０Ｘ ｃＤＮＡの場合）
約９５℃で約３０秒間
約５５℃又は約６０℃で約３０秒間
約７２℃で約３０秒間
約７２℃で約５分間
４℃で保持する
約９５℃で約３分間
約８サイクル（クローン化プラスミドＤＮＡの場合）又は約９サイクル（１０Ｘ ｃＤＮＡの場合）
約９５℃で約３０秒間
約５５℃又は約６０℃で約３０秒間
約７２℃で約３０秒間
約７２℃で約５分間
４℃で保持する
４．インデックスＰＣＲクリーンアップ
ａ．ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを約３０秒間ボルテックスして、ビーズが均一に分散していることを確認する。
ｂ．例えば約５０μｌのＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（１Ｘ）を各ウェルに添加し、全量を約１０回穏やかに上下にピペッティングする。
ｃ．振盪せずに室温で約５分間インキュベートする。
ｄ．磁気スタンド上に置き、液体が透明になるまで待つ（約２分間）。実質的に全ての上清を除去して廃棄する。
ｅ．例えば約２００μｌの新鮮な８０％エタノールでビーズを洗浄する。全ての上清を除去して廃棄する。
ｆ．短時間遠心分離し、微細なピペットチップを有するＰ２０マルチチャンネルピペットを使用して、余分なエタノールを除去する。ビーズを約１０分間風乾させる。
ｇ．例えば約２７．５μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．５をビーズに添加する。
ｈ．全量を約１０回穏やかに上下にピペッティングする。室温で約２分間インキュベートし、磁気スタンド上に置き、液体が透明になるまで待つ（約２分間）。
ｉ．例えば約２５μｌの上清を新しいＰＣＲ管に注意深く移し、それらを適宜標識する。
５．定量ライブラリー
例えば、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ＤＮＡ Ｈｉｇｈ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ Ｃｈｉｐ上で最終ライブラリーの約１：２０希釈物約１μｌをランして、ライブラリーの最終濃度を得る。各ＰＣＲについて単一のピークが見られると予想される。定量するピークを選択する。
６．配列決定
ライブラリーを少なくとも約５％のｐｈｉＸ（ＦＣ－１１０－３００１）と混合して、Ｍｉｓｅｑ又はＮｏｖａｓｅｑで配列決定する。
実施例２の結果
図６は、実施例２でバーコード化ベクターを用いてＨＥＫ２９３細胞に導入された飽和突然変異誘発ＴＰ５３ライブラリーの変異体の分布を示す。ライブラリーは約３，５４６個の変異体を含んでいた。１０Ｘ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、ＨＥＫ２９３細胞を使用して調製した。ＨＥＫ２９３細胞に由来するｃＤＮＡのアンプリコン配列決定によって、変異体の各々を変異体バーコードに連結した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータでアンプリコンデータを調べることによって、変異体を細胞バーコードに連結した。実施例２は、ＤＮＡのライブラリーを５’ＵＴＲバーコード化レンチウイルスベクターにクローニングする方法の例示的で非限定的な例を提供する。他の適切な方法を使用してもよいことが理解されよう。
図６は、実施例２でバーコード化ベクターを用いてＨＥＫ２９３細胞に導入された飽和突然変異誘発ＴＰ５３ライブラリーの変異体の分布を示す。ライブラリーは約３，５４６個の変異体を含んでいた。１０Ｘ ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑライブラリーを、ＨＥＫ２９３細胞を使用して調製した。ＨＥＫ２９３細胞に由来するｃＤＮＡのアンプリコン配列決定によって、変異体の各々を変異体バーコードに連結した。ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑデータでアンプリコンデータを調べることによって、変異体を細胞バーコードに連結した。実施例２は、ＤＮＡのライブラリーを５’ＵＴＲバーコード化レンチウイルスベクターにクローニングする方法の例示的で非限定的な例を提供する。他の適切な方法を使用してもよいことが理解されよう。
更なるコメント
本開示の実施は、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用することができ、これらは当技術分野の技術の範囲内である。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｔｈ ｅｄ．，（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２）などの文献に十分に説明されている。
本開示の実施は、別段の指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来の技術を使用することができ、これらは当技術分野の技術の範囲内である。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ２００３）、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｔｈ ｅｄ．，（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ａｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１２）などの文献に十分に説明されている。
本明細書に記載されている全ての特許及び刊行物は、それぞれの独立した特許及び刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
様々な例示的な例が上に記載されているが、様々な変更及び改変が、本発明から逸脱することなく、本明細書において行われ得ることは、当業者に明白であろう。添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨及び範囲内に収まる、このような変更及び改変の全てを包含することが意図される。
本明細書に記載されている利益を実現するため、本明細書に記載されている本開示の態様の各々の任意のそれぞれの特徴／例は、任意の適切な組み合わせで一緒に実施されてもよいこと、及びこれらの態様のいずれか１つ以上からの任意の特徴／例は、任意の適切な組み合わせで、本明細書に記載されている他の態様の特徴のいずれかと一緒に実施されてもよいことを理解すべきである。
Claims (36)
- 細胞におけるＤＮＡのタンパク質コード領域の発現を分析する方法であって、
前記細胞における前記ＤＮＡのタンパク質コード領域を、前記タンパク質コード領域の変異体及びその変異体を同定する第１のバーコードを含むドナーベクターで置換することであって、
前記細胞は、前記変異体の発現及び前記第１のバーコードの発現を含むｍＲＮＡを生成する、置換することと、
前記細胞に対応する第２のバーコードを前記ｍＲＮＡにカップリングすることと、
前記第２のバーコードがカップリングされた前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することと、
前記ｃＤＮＡを配列決定することと、
アンプリコン配列決定を使用して前記ドナーベクター又はｃＤＮＡを配列決定することと、
前記ドナーベクター配列と前記ｃＤＮＡ配列とを相関させて、前記変異体及び前記細胞による前記変異体の発現を同定することと、
を含む、方法。 - 前記ドナーベクターはプロモーター領域を含む、請求項１に記載の方法。
- 前記バーコードは、前記プロモーター領域と前記変異体との間に位置する、請求項２に記載の方法。
- 前記ドナーベクターは右ホモロジーアーム及び左ホモロジーアームを含み、前記変異体及び前記第１のバーコードは前記右ホモロジーアームと前記左ホモロジーアームとの間にある、請求項２に記載の方法。
- 前記プロモーター領域は逆方向プロモーター領域を含む、請求項２又は請求項４に記載の方法。
- 前記逆方向プロモーター領域は、前記第１のバーコードと前記変異体との間に位置する、請求項５に記載の方法。
- 前記タンパク質コード領域の前記変異体の発現は順方向であり、前記第１のバーコードの発現は逆方向である、請求項５に記載の方法。
- 第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスを使用して、前記変異体、前記第１のバーコード、及び前記右ホモロジーアームを含み、前記左ホモロジーアームを実質的に除外する、前記ドナー配列の第１のアンプリコンを生成することと、
第２のＰＣＲプロセスを使用して、前記変異体及び前記第１のバーコードを含み、前記右ホモロジーアーム及び前記左ホモロジーアームを実質的に除外する、前記第１のアンプリコンの第２のアンプリコンを生成することと、
を更に含む、請求項４に記載の方法。 - 前記ドナーベクターを配列決定することは、前記第２のアンプリコンを配列決定することを含む、請求項８に記載の方法。
- 前記第２のアンプリコンは約１０００塩基以下の長さを有する、請求項８に記載の方法。
- 前記ｍＲＮＡは、
前記変異体の発現を含む第１のｍＲＮＡ分子と、
前記第１のバーコードの発現を含む第２のｍＲＮＡ分子と、
を含む、請求項１に記載の方法。 - 前記第２のバーコードを前記ｍＲＮＡにカップリングすることは、
前記第２のバーコードの第１の分子を前記第１のｍＲＮＡ分子にカップリングすることと、
前記第２のバーコードの第２の分子を前記第２のｍＲＮＡ分子にカップリングすることと、
を含む、請求項１１に記載の方法。 - 前記ｃＤＮＡは、前記変異体の逆転写及び前記第２のバーコードを含む第１のｃＤＮＡ分子と、前記タンパク質コード領域の逆転写及び前記第２のバーコードを含む第２のｃＤＮＡ分子とを含み、前記ｃＤＮＡを配列決定することは、前記第１及び第２のｃＤＮＡ分子を配列決定することを含む、請求項１２に記載の方法。
- 初期タンパク質コード領域を置換することが、
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ガイドＲＮＡリボ核タンパク質（Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ＲＮＰ）を使用して、前記細胞の前記ＤＮＡを切断することと、
前記ドナーベクターを使用して前記ＤＮＡ中の前記切断を修復するために相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用することと、
を含む、請求項１に記載の方法。 - 第１及び第２のプラスミドを前記細胞に挿入することであって、
前記ドナーベクターは、前記第１のプラスミド上に位置し、
前記細胞は、前記第２のプラスミドを使用して前記Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ＲＮＰを発現する、
ことを更に含む、請求項１４に記載の方法。 - 前記ドナーベクターはレンチウイルスベクターを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ドナーベクターはピューロマイシン耐性遺伝子を更に含み、前記方法は、前記細胞をピューロマイシンと接触させて前記細胞を濃縮することを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 前記第１のバーコードは前記ピューロマイシン耐性遺伝子のＵＴＲ末端に位置する、請求項１７に記載の方法。
- 前記細胞における前記変異体から前記第１のバーコードを切断することを更に含む、請求項１に記載の方法。
- 細胞の集合体におけるＤＮＡのタンパク質コード領域の発現を分析する方法であって、
前記細胞の各々における前記ＤＮＡの初期タンパク質コード領域を、前記タンパク質コード領域の変異体及びその変異体を同定する第１のバーコードを含むドナーベクターで置換することであって、前記細胞は互いに異なる変異体を受け取る、ことと
前記細胞からｍＲＮＡを得ることであって、各細胞からの前記ｍＲＮＡは、その細胞における前記タンパク質コード領域の前記変異体の発現及び前記第１のバーコードの発現を含む、ことと、
各細胞からの前記ｍＲＮＡに、その細胞に対応する第２のバーコードをカップリングすることと、
前記第２のバーコードがカップリングされた前記ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することと、
前記ｃＤＮＡを配列決定することと、
前記ドナーベクターを配列決定することと、
前記ドナーベクター配列と前記ｃＤＮＡ配列とを相関させて、前記細胞の各々における前記変異体及びその細胞によるその変異体の発現を同定することと、
を含む、方法。 - 前記異なる変異体は飽和突然変異誘発されている、請求項２０に記載の方法。
- 細胞の集合体であって、前記集合体中の前記細胞の各々のＤＮＡが、タンパク質コード領域の変異体と、その変異体を同定する第１のバーコードとを含み、前記細胞は互いに異なる変異体を有する、集合体。
- 前記異なる変異体は飽和突然変異誘発されている、請求項２２に記載の細胞の集合体。
- 細胞の集合体からのポリヌクレオチドの集合体であって、前記ポリヌクレオチドは、前記細胞の各々からの第１及び第２のｍＲＮＡ分子を含み、各細胞について、
前記第１のｍＲＮＡ分子は、その細胞に対応するバーコードの第１の分子と、その細胞における変異体の発現とを含み、
前記第２のｍＲＮＡ分子は、その細胞に対応するバーコードと、前記変異体に対応する第１のバーコードの発現とを含む、
ポリヌクレオチドの集合体。 - 前記異なる変異体は飽和突然変異誘発されている、請求項２４に記載のポリヌクレオチドの集合体。
- 方法であって、
外来転写物の末端にセミランダムバーコードを含むバーコード化ホモロジードナーベクターを提供することであって、前記ドナーベクターはホモロジーアーム及び突然変異を含む、ことと、
前記バーコード化ホモロジードナーベクターを編集対象のエクソンの近傍にノックインして、前記エクソン上に変異体を作製することと、
ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質ガイドＲＮＡリボ核タンパク質（Ｃａｓ－ｇＲＮＡ ＲＮＰ）を使用して前記変異体を切断することと、
を含む、方法。 - 前記バーコードは、発現され、ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑで検出可能であり得るように、前記ドナーベクターのＵＴＲ末端に配置される、請求項２６に記載の方法。
- 前記ドナーベクターはピューロマイシン耐性遺伝子を含む、請求項２６又は請求項２７に記載の方法。
- 前記バーコード化ホモロジードナーベクターを提供することは、
第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ゲノム編集された対立遺伝子を有する前記ノックイン領域を特異的に増幅することと、
前記第１のＰＣＲの前記生成物を鋳型として使用する第２のＰＣＲを使用して、前記バーコードをアンプリコン中の変異体に連結することと、
前記第２のＰＣＲからの前記生成物を使用してアンプリコン配列決定を実施することと、
を含む、請求項２６に記載の方法。 - 前記アンプリコン配列決定は前記バーコード及び前記変異体の両方をカバーする、請求項２７に記載の方法。
- 方法であって、
飽和突然変異誘発された変異体ライブラリーのＵＴＲ領域にセミランダム変異体バーコードを付加することと、
細胞バーコードを前記変異体バーコードにカップリングすることと、
ｓｃＲＮＡ－ｓｅｑで前記変異体バーコードを読み出すことと、
別個の配列決定操作を使用して、前記変異体バーコードを前記ライブラリーの前記変異体に連結することと、
を含む、方法。 - 前記セミランダム変異体バーコードは、前記変異体ライブラリーのプロモーターの下流又はターミネーターの上流に配置され得る、請求項３１に記載の方法。
- 前記変異体バーコードを前記ライブラリーの前記変異体に連結することは、各アンプリコンが前記変異体のそれぞれのセグメントを前記バーコードに連結するように、一方の側で前記バーコードを増幅するための１セットのプライマー、及び他方の側で前記変異体を増幅するための別のセットのプライマーを使用することによって、タイル状ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アンプリコンを生成することを含む、請求項３１又は請求項３２に記載の方法。
- セミランダムバーコードを含むレンチウイルスベクター。
- 組成物であって、
複数のレンチウイルスベクターを含み、前記レンチウイルスベクターの各々は、異なるセミランダムバーコードを含む、
組成物。 - 前記複数のレンチウイルスベクターと接触している突然変異誘発飽和変異体ライブラリーを更に含む、請求項３５に記載の組成物。
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