JP2022190130A - ヌクレアーゼ切断を評価する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2017年10月10日に出願された米国仮特許出願第62/570,300号明細書、2017年5月5日に出願された同第62/502,434号明細書、および2017年1月6日に出願された同第62/443,212号明細書の利益を主張するものであり、これらの明細書のそれぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
Drug Administration)(FDA)は、2016年11月15日に、こうしたシステムの使用、およびそれによって生じる法的問題点の可能性に取り組む科学委員会(Science Board Meeting)を開催した。この委員会では、FDAは、Cas9/ガイドRNA(gRNA)リボ核タンパク質(RNP)複合体を、対象となる遺伝子座での正確な編集をもたらすようにカスタマイズすることができるが、この複合体は、他の「オフターゲット」位置とも相互作用し、切断する可能性があることを指摘した。オフターゲット切断(「オフターゲット」)の可能性は、ひいては、少なくとも、これらのヌクレアーゼを利用する治療法の承認に関する法的問題点の可能性を生じる。
ゲノム編集の修復結果を解析するための一般的方法は、標的とされるゲノム領域のPCR増幅、および塩基ミスマッチでのエンドヌクレアーゼ切断または配列決定によるその後の解析を含む(Mashal et al.Nat.Genet.1995;9:177-183;Vouillot et al.G3 2015;5:407-415;Hendel et al.Trends Biotechol.2015:33:132-140;Tykco et al.Mol.Cell.2016;63:355-370;Brinkman et al.Nucleic Acids Res.2014;42:e168)。しかし、PCR介在性の分析は、根本的に、小さいインデルと共に、ゲノムへの構造的変化(例えば、欠失(100bpよりも大きいもの)、逆位、および転座)を測定することができない。予期せぬ転座、および他の構造的変化は、NIHの組換えDNA諮問委員会(Recombinant DNA Advisory Committee)(RAC)およびFDAによるゲノム編集療法の研究について、具体的に挙げられている(Atkins et al.RAC Review 2016;Witten,Cell and Gene Meeting on the Mesa,La Jolla,CA,2016)。構造的変化を測定することは、発癌性の転座の臨床的検出を意図するAMP-Seq(アンカードマルチプレックスPCR(Anchored Multiplex PCR)配列決定)と呼ばれる方法、およびHTGTS(ハイスループット、ゲノムワイド転座配列決定(High Throughput, Genome-wide Translocation Sequencing))またはLAM-HTGTS(線形増幅を介するHTGTS(Linear Amplification-Mediated-HTGTS))と呼ばれる類似の方法を使用して、最近、より実現可能になりつつある(Zheng et al.Nat.Med.2014;20:1479-1484;Chiarle et al.Cell 2011;147:107-119;Hu et al.Nat.Protocol.2016;11:853-871)。GUIDE-seq、すなわちAMP-seqの改変は、CRISPR RNAガイド型ヌクレアーゼによる新規オフターゲット編集を捉えるための強力なツールである(Tsai et al.Nat.Biotechnol.2014;33:187-197)。これらの方法はすべて、「一方向性の」増幅、および配列決定を達成するために、剪断されたDNA上のアダプター連結ユニバーサルプライミング部位に加えて、標的特異的なプライマーを利用する。しかし、DNA剪断は、これらのすべての方法において使用されるライブラリ調製における厄介なステップである。DNA剪断は、特殊化された設備を必要とし、また、多数の試料の研究を容易に行いやすくはない。したがって、DNA剪断は、遺伝子編集分野において、広くは適用されていない。さらに、DNAを剪断することは、低レベル(例えば:1%未満)の遺伝子編集頻度を評価する場合に問題となり得る塩基のミスコールをもたらすDNA損傷を誘発することが示されている(Chen et al.Science 2017;355:752-6;Costello et al.Nucleic Acids Res.2013;41:1-12)。
この明細書全体を通して、以下の段落で定義されるいくつかの用語が用いられる。この明細書の本文内では、他の定義も参照することができる。本出願では、文脈からそうではないと明らかでない限り、(i)用語「a」は、「少なくとも1つ」を意味すると理解することができ;(ii)用語「または」は、「および/または」を意味すると理解することができ;(iii)用語「~を含むこと」および「~を含めて」は、それらだけで示されるか、1つまたは複数の追加の構成要素またはステップと共に示されるかにかかわらず、列挙された構成要素またはステップを包含すると理解することができ;(iv)用語「約」および「およそ」は、当業者によって理解されるであろう標準偏差を許容すると理解することができ;(v)範囲が提供される場合、両端が含まれる。
J.,1996,15(19):5470-5479)、Tc1(Vos et al.,Genes Dev.,1996,10(6):755-61)、Tn5(Park
et al.,J.Korean Soc.Microbiol.27:381-389(1992))、P因子(Kaufman and Rio,Cell,1992,69(1):27-39)およびTn3(Ichikawa and Ohtsubo,J.Biol.Chem.,1990,265(31):18829-32)、細菌性挿入配列(Ohtsubo and Sekine,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,1996,204:1-26)、レトロウイルス(Varmus Retroviruses.in Mobile DNA.Berg D.E.and Howe M.M.eds.American society for microbiology,Washington D.C.pp.53-108(1989))、および酵母のレトロトランスポゾン(Boeke,Berg D.E.and Howe M.M.eds.American society for microbiology,Washington D.C.pp.335-374(1989))である。
本開示は、特に、トランスポゾン組成物を使用してDNAを断片化およびタグ付けすることによるヌクレアーゼ活性の特徴付けのための方法およびシステムを提供する。本明細書に記載した方法、組成物、およびキットは、本明細書に記載したヌクレアーゼでの切断を受けている標的または鋳型核酸(例えばDNA、例えばゲノムDNA)から核酸断片を産生および増幅するのに有用である。いくつかの実施態様では、こうした増幅された核酸断片は、例えばヌクレアーゼ活性を特徴付けるために、配列決定することができる。
いくつかの態様では、本開示は、ヌクレアーゼおよび/またはヌクレアーゼバリアントを、ある特定の標的部位を切断する能力について評価する方法を提供する。いくつかの実施態様では、UDiTaSは、可変長のPCR増幅に伴うバイアスを除去し、単一の反応で、小さな挿入および欠失事象(インデル)に加えて、構造的変化を測定する。いくつかの実施態様では、UDiTaS方法は、全長のIlluminaフォワードアダプター(i5)、試料バーコード、および/または固有分子識別子(UMI)を含むカスタム設計されたTn5トランスポゾンを使用する(図2A)。一般に、こうした方法は、核酸鋳型(例えばDNA、例えばゲノムDNA、例えば、本明細書に記載したヌクレアーゼを使用して切断、改変、および/または編集されているゲノムDNA)を、トランスポゾンと、トランスポゾンが核酸鋳型に挿入される条件下で接触させることを含む。
本明細書に開示した方法において使用されるゲノムDNA試料は、一般に、あらゆる種類の細胞および/または組織、例えば、初代細胞および/または組織、少なくともある期間培養した細胞または組織、または初代と培養細胞および/または組織の組み合わせから得ることができる。
検出配列は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載した核酸鋳型、トランスポゾン、および/またはプライマー上に存在することができる、また、それを含有する核酸、または核酸断片の回収および/または検出を容易にする配列要素を指す。いくつかの実施態様では、1つまたは複数の検出配列が、オリゴヌクレオチドアレイによる捕捉を容易にするまたは媒介する、および/または配列決定、例えば、本明細書に記載した連結産物の配列決定を容易にするまたは媒介する。
本明細書に記載した通り、ゲノムDNAは、二本鎖オリゴヌクレオチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、(ゲノムDNA試料が得られる)細胞または組織が、二本鎖オリゴヌクレオチドおよびヌクレアーゼ(例えば、部位特異的ヌクレアーゼおよび/またはRNAガイド型ヌクレアーゼ)と、例えば、ヌクレアーゼによるゲノムDNAの切断に好都合な条件下で接触される。二本鎖オリゴヌクレオチドが使用される場合、二本鎖オリゴヌクレオチドを、ゲノムDNA内の1つまたは複数のヌクレアーゼ切断部位に組み込むことができる。例えば、ヌクレアーゼは、ゲノムDNA中の1つまたは複数の二本鎖切断を誘発することができ、二本鎖オリゴヌクレオチドが、1つまたは複数の二本鎖切断の少なくとも1つに組み込まれることができる。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載したトランスポゾン、二本鎖オリゴヌクレオチド、および/またはプライマーは、検出可能な標識で標識される。こうした標識は、例えば、トランスポゾン、二本鎖オリゴヌクレオチド、および/またはプライマーを含有する核酸を捉える、精製する、および/または濃縮するために有用であり得る。例えば、ビオチン、蛍光標識、抗体標識、抗体断片標識、および/または本明細書に言及した他の検出可能な標識を含めた、非常に様々な検出可能な標識のいずれかが、この目的のために好適であり得る。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載した核酸鋳型、トランスポゾン、および/またはプライマーは、固有分子識別子(本明細書では「UMI」と省略される)を含むことができる。UMIは、核酸鋳型またはその一部分に関する情報を検索するために使用することができる配列を指す。例えば、複数のプライマーを含む開示の方法では、各UMIは、特定のプライマー、例えば、特異的な標的配列と結合するプライマーと関係がある可能性がある。いくつかの実施態様では、UMIは、UMIバーコードと呼ばれる。
本開示の方法は、周知のヌクレアーゼとそれほど特徴づけられていないヌクレアーゼとの両方を含めた、様々なヌクレアーゼの切断プロフィールを評価するのに適している。一般に、ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼの「標的部位」と呼ばれる特定の配列または配列のセットでのみ切断することが知られているまたは予想される点において、部位特異的である。
本開示によるRNAガイド型ヌクレアーゼには、限定はされないが、天然起源のクラス2 CRISPRヌクレアーゼ、例えばCas9、およびCpf1、ならびにそれに由来するまたはそこから得られる他のヌクレアーゼが含まれる。RNAガイド型ヌクレアーゼは、機能面では、(a)gRNAと相互作用(例えば複合体形成)する;および(b)gRNAと共に、(i)gRNAのターゲティングドメインに相補的な配列、および場合によっては(ii)「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「PAM」と呼ばれる追加の配列(これは、以下により詳細に記載される)を含むDNAの標的領域と結合し、場合によっては切断するまたは改変するヌクレアーゼと定義される。以下の実施例が説明する通り、RNAガイド型ヌクレアーゼは、同じPAM特異性または切断活性を有する個々のRNAガイド型ヌクレアーゼの間に差異が存在する可能性があるとしても、大まかに、そのPAM特異性および切断活性によって定義することができる。当業者は、本開示のいくつかの態様が、ある種のPAM特異性および/または切断活性を有するあらゆる好適なRNAガイド型ヌクレアーゼを使用して実行することができるシステム、方法、および組成物に関することを認識するであろう。この理由から、そうではないと指定されない限り、RNAガイド型ヌクレアーゼという用語は、包括的な用語と理解されるべきであり、RNAガイド型ヌクレアーゼの、いずれかの特定の型(例えば、Cpf1に対するCas9)、種(例えば、黄色ブドウ球菌(S.aureus)に対する化膿レンサ球菌(S.pyogenes))、または差異(例えば、切り詰めまたは分断に対する全長;操作されたPAM特異性に対する天然起源のPAM特異性など)に限定されない。
化膿レンサ球菌(S.pyogenes)Cas9について(Jinek et al.,Science 343(6176),1247997,2014(“Jinek 2014”)、また、単分子ガイドRNAと標的DNAとの複合体の黄色ブドウ球菌(S.aureus)Cas9について(Nishimasu 2014;Anders et al.,Nature.2014 Sep 25;513(7519):569-73(“Anders 2014”);およびNishimasu 2015)、結晶構造が決定されている。
crRNAと二本鎖(ds)DNA標的(TTTN PAM配列を含む)との複合体のアシダミノコッカス(Acidaminococcus)種Cpf1の結晶構造は、Yamanoらによって解明されている(参照により本明細書に組み込まれるCell.2016 May 5;165(4):949-962(“Yamano”))。Cpf1は、Cas9のように、2つのローブ:REC(認識)ローブ、およびNUC(ヌクレアーゼ)ローブを有する。RECローブは、あらゆる公知のタンパク質構造との類似性がないREC1およびREC2ドメインを含む。一方、NUCローブは、3つのRuvCドメイン(RuvC-I、-II、および-III)、ならびにBHドメインを含む。しかし、Cas9とは対照的に、Cpf1 RECローブは、HNHドメインがなく、やはり公知のタンパク質構造との類似性がない他のドメイン:構造的に固有のPIドメイン、3つのくさび(Wedge)(WED)ドメイン(WED-I、-II、および-III)、ならびにヌクレアーゼ(Nuc)ドメインを含む。
RNAガイド型ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、またはその機能性断片をコードする核酸は、本明細書で提供される。RNAガイド型ヌクレアーゼをコードする例示的な核酸は、以前に記載されている(例えば、Cong et al.,Science.2013 Feb 15;339(6121):819-23(“Cong 2013”);Wang et al.,PLoS One.2013 Dec 31;8(12):e85650(“Wang 2013”);Mali 2013;Jinek 2012を参照のこと)。
用語「ガイドRNA」および「gRNA」は、Cas9またはCpf1などのRNAガイド型ヌクレアーゼの、細胞内のゲノムまたはエピソーム配列などの標的配列に対する特異的な結合(または「ターゲティング」)を促進するあらゆる核酸を指す。gRNAは、単分子(単一のRNA分子を含み、あるいはキメラとも呼ばれる)またはモジュール式(2つ以上、典型的には2つの別のRNA分子(crRNAおよびtracrRNAなど)を含み、これらは通常、例えば二本鎖化によって互いに結合されている)であり得る。gRNAおよびその構成部分は、文献を通して、例えば、Briner et al.(参照により組み込まれるMolecular Cell 56(2),333-339,October 23,2014(“Briner”))に、また(and)Cotta-Ramusinoに記載されている。
本明細書によって開示された方法のいくつかの実施態様は、核酸配列、例えば、核酸鋳型の切断された末端を、オリゴヌクレオチド捕捉プローブまたはその混合物と連結するステップを含む。いくつかの実施態様では、連結のステップは、核酸、例えば、DNAおよび/またはRNAリガーゼ上で作用するリガーゼ酵素を使用して達成される。様々なこうしたリガーゼは、当技術分野で公知であり、これらの多くは、市販品として入手可能である。
いくつかの実施態様では、本明細書に記載した複数の連結産物が分析される。いくつかの実施態様では、複数の連結産物は、増幅される。複数の連結産物が1つまたは複数の検出配列を含むいくつかの実施態様では、1つまたは複数の検出配列を認識する増幅プライマーを使用することができる。
D=N×L/G(式1)
(式中、Nは、読み取りの数であり、Lは、実際のゲノムの長さであり、Gは、配列決定されるポリヌクレオチドの長さである)として算出される。
部位特異的ヌクレアーゼおよび種々のガイドRNAで処理したK562細胞由来のゲノムDNA試料を配列決定するための本開示の方法において、トランスポゾンを使用した。第1の実験では、(1)G1遺伝子の一部分に対して相補的な配列を含む第1の固定プライマーと、(2)トランスポゾンに相補的なヌクレオチド配列を含む選択的プライマーとを含むプライマー対を使用した。第2の実験では、(1)G2遺伝子の一部分に対して相補的な配列を含む第1の固定プライマーと、(2)トランスポゾンに相補的なヌクレオチド配列を含む選択的プライマーとを含むプライマー対を使用した。これらのプライマーを、図4に示す(固定プライマー「G1_F1」および「G2_F1」;選択的プライマー「Seq15_G1_F_UDITASdev」および「Seq16_G2_F_UDITASdev」)。その後、DNA断片を増幅および配列決定した。
UDiTaSがモデルゲノム標的についての小さいインデルの割合を特定する能力を検定した。モデルゲノム標的をトランスポゾンと接触させた後、(1)モデルゲノム標的の一部分に相補的な配列を含む第1の固定プライマーと、(2)トランスポゾンに相補的なヌクレオチド配列を含む選択的プライマーとを含むプライマー対を使用して、DNA断片を増幅した。UDiTaS方法を、2つの公知の方法-アンプリコン配列決定およびT7E1配列決定と比較した。図7に示す通り、UDiTaSがインデルを検出する能力は、標的配列決定およびT7E1アッセイと良く相関していた。
ゲノムDNAを部位特異的ヌクレアーゼおよびデュアルガイドで処理することは、複数の結果の可能性を得る可能性がある。図8に示す通り、デュアルガイドは、欠失、一方または両方の鎖におけるインデル、および逆位をもたらす可能性がある。UDiTaS方法が、こうした染色体内再構成を検出するために使用できるかどうかを決定するために、野生型HEK293T細胞由来のまたは安定なHEK293Tクローン由来のゲノムDNAを使用した。安定なクローンのゲノムDNAは、そのゲノムDNAの66%における欠失、およびそのゲノムDNAの33%における逆位を含む(図9、左側参照)。野生型由来とクローン由来のゲノムDNAを、様々な比率で混合し、本明細書に記載した通りのUDiTaSによる配列決定にかけた。配列決定の結果を、ddPCR配列決定と比較した。
ある例示的な方法では、配列決定データを、バイオインフォマティクス・パイプラインを使用して処理した。特殊化されたステップのための追加ソフトウェアと呼ばれるパイソン(python)コードを使用して、解析パイプラインを構築した。このバイオインフォマティクス・パイプラインを、図12に模式的に示し、また、これは、次のステップからなる。
配列決定リードを、最初に、適切な配列決定バーコード(各バーコードにおいて1つまでのミスマッチが可能である)を使用して、その実行における異なる実験に逆多重化した。各リードについてのUMIを、さらなるダウンストリーム解析のために抽出した。
3’アダプターを、cutadapt(Martin,EMBnet.journal
17:10-12(2011)),version 1.9.1を使用して取り除いた。
予想された切断部位を使用して、予想された染色体再構成:野生型、大きい欠失、重複、逆位、転座、小さいインデルなどを有する参照アンプリコンを構築した。参照アンプリコンは、あらゆる予測される遺伝子編集事象、例えば「オフターゲット」事象を含むことができる。いくつかの実施態様では、参照アンプリコンは、ベクターまたはプラスミド配列を含むことができる。ベクターまたはプラスミドからの配列を含む参照アンプリコンはまた、1つまたは複数の予測される遺伝子編集事象、例えば「オフターゲット」事象を含むことができる。
次いで、対形成させたリードを、bowtie2(Langmead et al.,Nat.Methods 9:357-9(2012)),version 2.1.0を使用して、すべての参照アンプリコンに対して包括的に整列させた。最後に、SAMtools (Li et al.,Bioinformatics 25:2078-9(2009)),version 1.3-5-g664cc5fを使用して、インデックスソートされたbamファイルを作成した。
予測される接合部(15bp)の周囲のウィンドウを完全にカバーするリードを抽出し、固有のUMIの総数を計数した。
最後に、参照アンプリコンに対してマッピングできなかったリードを抽出し、適切なバックグラウンド参照ゲノムに対してbowtie2を使用して、包括的にマッピングした。
複雑な遺伝子編集事象の評価の、ある例示的な方法では、Gene3のイントロン内の領域を標的にするために、一対の黄色ブドウ球菌(S.aureus)Cas9(SaCas9)sgRNAを使用した。Gene3発現の低下は、いくつかのヒト疾患をもたらす。有害なイントロンスプライスドナー部位の除去が、Gene3の機能を回復させることが予測される。スプライスドナーの周囲の約1000塩基対を切断する単一のガイドRNA対、Gene3-ガイド1とGene3-ガイド2を、特徴付けのための内部スクリーニングから選択した。
この方法の線形性、精度、および検出下限(Lower Level of Detection)(LLoD)を特徴付けるために、所望される大きい編集事象に対して、Gene3イントロン野生型遺伝子座、欠失、および逆位を含有する安定な細胞株およびプラスミドを構築した。HEK293細胞は、Gene3遺伝子座の3つのコピーを有し、クローンは、2つの欠失と1つの逆位を有していた。編集されたHEK293細胞株由来のゲノムDNA(gDNA)を、親の編集されていないゲノムDNAと混合して、5桁の対数レンジにわたる約1.1kb欠失および逆位のタイトレーションをもたらした。欠失および逆位についてのUDiTaS測定された編集率に対する予想された率のプロットは、およそ0.1%までの優れた相関を示した(図14B)。このUDiTaSプロトコルは、50ngのインプットDNA(これは、およそ14,300のヒトハプローム(haplome)と同等である)を使用した。標本抽出の二項分布および約20%工程歩留まりと仮定すると、UDiTaSライブラリにおける0.1%での2~3例の観察が予想された(95%の信頼度)。これは、観察された割合と一致していた(図16)。感度は、インプットDNAを増大させることによって、また、配列決定読み取り深度を高めることによって、どちらも、解析における固有のUMIの数を増加させるために必要とされるので、増大した。ゲノムに対するオンターゲットマッピング率は、>95%であり、これは、このプロセスが頑強かつ生産的であることを示していた(図17)。
UDiTaSはまた、染色体間転座率を測定した。これを示すために、Gene1およびGene2遺伝子を標的にするsgRNAとの、2つの化膿レンサ球菌(S.pyogenes)Cas9(SpCas9)リボ核タンパク質(RNP)複合体を、活性化されたヒトCD4+T細胞にヌクレオフェクト(nucleofect)させた。これらの細胞からのUDiTaSライブラリを、各ガイド部位に隣接するプライマーを使用して調製した。10例の末端連結結果の可能性のうち、2つのターゲティングプライマーを使用して、7例を測定することが可能であった。7つのすべての結果が検出され、定量化された。これらには、切断部位でのNHEJ(非相同末端連結)編集、ならびに相同染色体または姉妹染色体間の、また別個の無関係の染色体間の、均衡型の、無動原体性の、および二動原体性の融合が含まれていた(図14C)。いくつかの研究が、遺伝子編集の状況での転座の特徴付けを公表しているが、どれも、すべての事象を測定していない(Hu et
al.,Nat.Protoc.2016;11:853-71;Jiang et al.,Sci.Rep.2016;6:21918;Ghezraoui et al.Mol.Cell.2014;55:829-42;Frock et al.,Nat.Biotechnol.2015;33:179-186)。代わりに、これらの研究は、転座をつなぎ合わせることを必要とする転座分析に頼っており、より小さなインデルの割合という状況に沿うことはできなかった。この実施例は、インデルを伴う二重の遺伝子編集転座率の定量化を示した。この実施例はまた、各ガイドRNAに対してそれぞれ約82%および約91%というオンターゲットインデル編集と共に、約2.5%の染色体間転座率を示した(図14C)。Gene1およびGene2転座位置でのアッセイの線形性および約0.01%というLLoDが、Gene3遺伝子座と同様の様式で、プラスミドを用いて特徴付けられ、転座事象を検出するためのUDiTaSの高い感度が実証された(図18Aおよび図19B)。
U-2 OSバルク編集トランスフェクション実験
U-2 OS細胞(ATCC)を、DMEM(高グルコース、Glutamaxおよびピルビン酸ナトリウム(ThermoFisher)、10%ウシ胎児血清を含有、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加)中で維持した。細胞は、4D nucleofectorシステムを使用して、Lonzaヌクレオフェクションによって遺伝子導入した。簡単に言うと、250,000個の細胞に、CMVプロモーターによって駆動されるSaCas9を発現する1.5μgプラスミドpAF003と、U6プロモーターによって駆動されるgRNAを発現する500ngの線状DNA断片(250ngの各ガイド)を導入した。細胞を、SEキットおよびパルス符号DN-100を使用してヌクレオフェクトし、6ウェルプレートにプレーティングした。細胞を、ヌクレオフェクション後、3日間培養し、トランスフェクション技術の3連の反復物を共にプールした。ゲノムDNAは、製造業者の説明書に従ってAgencourt DNAdvanceキット(Beckman Coulter)を使用して単離した。
HEK293細胞(ATCC)を、DMEM(高グルコース、Glutamaxおよびピルビン酸ナトリウム(ThermoFisher)、10%ウシ胎児血清を含有、1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加)中で維持した。細胞は、製造業者の説明書に従ってMirus TransIT 293キットを使用して遺伝子導入した。簡単に言うと、120,000個の細胞を、トランスフェクションの24時間前に、24ウェルプレートのウェルに播種した。細胞に、CMVプロモーターによって駆動されるSaCas9を発現する750ngプラスミドpAF003と、U6プロモーターによって駆動されるgRNAを発現する250ngの線状DNA断片(125ngの各ガイド)を導入した。増殖後、細胞を、トリプシン処理し、希釈し、3つのウェルあたりおよそ1つの細胞の希釈度で96ウェルプレートに再プレーティングした。細胞を、視覚によって観察して、単一細胞コロニーを確認し、24ウェルプレートで増殖させた。編集を決定するために、ゲノムDNAを、製造業者の説明書に従ってAgencourt DNAdvanceキット(Beckman Coulter)を使用して、クローンから単離した。クローンを、ddPCRによってスクリーニングし、サンガー配列決定によって確認した。
Gene1およびGene2遺伝子座を標的にする化膿レンサ球菌(S.pyogenes)ガイドRNAを、製造業者のプロトコルに従ってT7-ScribeTM Standard RNA IVT Kit(CELLSCRIPT)を使用して、PCR産物のインビトロ転写によって産生した。インビトロ転写反応のためのPCR産物は、鋳型としてのプラスミドPLA380、および通共通のリバースプライマー(OLI7078)と共に示されたフォワードプライマー(Gene2のためのOLI7076、およびGene1のためのOLI7077)を使用して産生した。
Gene3については、プラスミドに基づく感度実験PLA370、PLA367、およびPLA379を使用した(図19A)。Gene1/Gene2転座については、プラスミドに基づく感度実験PLA365、PLA366、PLA377、およびPLA378を使用した(図19B)。プラスミド濃度は、NanoDrop2000分光光度計を使用して決定し、すべてのプラスミドについて、10ng/μlの作業用希釈液を作製した。簡単に言うと、Gene2感度実験については、第1の試料は、PLA370(逆位)とPLA367(大きい欠失)の50%混合物からなり、対照プラスミド(PLA379)を含有しない。その後、PLA370/PLA367混合物を、様々な希釈全体を通して10ng/μLの全プラスミド濃度を維持しながら、対照プラスミド(PLA379)で連続的に希釈する(sqrt10希釈係数)ことによって、10種の希釈物を作製した。最後の試料は、対照プラスミド(PLA379)のみから構成されていた。Gene1/Gene2感度実験については、第1の試料は、PLA365とPLA366の50%混合物からなり、対照プラスミド(PLA377/PLA378)を含有しない。その後、PLA366を、様々な希釈全体を通して10ng/μLの全プラスミド濃度を維持しながら、対照プラスミドPLA377/PLA378の等量混合物で連続的に希釈する(sqrt10希釈係数)ことによって、10種の希釈物を作製した。最後の試料は、対照プラスミド(PLA377/PLA378の等量混合物)のみから構成されていた。その後、すべての試料を、UDiTaSにかけた:Gene1/Gene2転座試料は、OLI6256およびOLI6259を用いて増幅させ、一方で、Gene3プラスミドは、OLI6062を用いて増幅させた。UDiTaSプロトコルを、次の改変:第1および第2ラウンドのPCRについて6サイクルを伴って適用した。
本発明を、その詳細な説明と共に記載してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することが意図され、本発明の範囲を限定しないことが理解されよう。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
方法であって、
(a)部位特異的ヌクレアーゼと接触させた細胞または組織から得られたゲノムDNA試料を、トランスポゾンの5’末端に第1の検出配列を含む前記トランスポゾンと、前記トランスポゾンが前記ゲノムDNA試料に挿入され、かつ前記ゲノムDNA試料が断片化されて、複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片であって、前記核酸断片の5’末端に付着された前記トランスポゾンを含む二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることと;
(b)
(i)前記ゲノムDNA内のあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその5’末端に第2の検出配列を含む第1の固定のプライマーと、
(ii)前記第1の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の選択的プライマーと
を使用して、前記タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、前記第1の検出配列、前記核酸断片の前記5’末端に付着された前記トランスポゾン、および前記第2の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと;
(c)前記増幅された核酸断片を配列決定することと
を含む方法。
(項目2)
前記第1の検出配列が、第1の配列決定タグを含む、項目1に記載の方法。
(項目3)
ステップ(c)が、前記増幅された核酸断片を、前記第1の配列決定タグとハイブリッド形成する第1の配列決定プライマーと接触させることを含む、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記第2の検出配列が、第2の配列決定タグを含む、項目1~3のいずれか一項に記載の方法。
(項目5)
ステップ(c)が、前記増幅された核酸断片を、前記第2の配列決定タグとハイブリッド形成する第2の配列決定プライマーと接触させることを含む、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記ゲノムDNA試料が、単一の細胞から得られる、項目1~5のいずれか一項に記載の方法。
(項目7)
ステップ(b)が、それぞれが前記ゲノムDNA内の異なるあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含む、複数の第1の固定プライマーを使用することを含む、項目1~6のいずれか一項に記載の方法。
(項目8)
ステップ(b)が、それぞれの反応が異なる第1の固定プライマーを使用する、複数の増幅反応を実施することを含む、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記複数の第1の固定プライマーのそれぞれが、(i)同じ配列決定タグと(ii)固有のバーコードとを含む検出配列を含む、項目7または8に記載の方法。
(項目10)
前記二本鎖核酸断片が、約500~約5000bpを含む、項目1~9のいずれか一項に記載の方法。
(項目11)
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Cas9である、項目1~10のいずれか一項に記載の方法。
(項目12)
方法であって、
(a)細胞または組織から得られたゲノムDNA試料を、RNAガイド型ヌクレアーゼと、前記ヌクレアーゼによる前記ゲノムDNAの切断に好都合な条件下で接触させることと;
(b)前記切断されたゲノムDNAを、トランスポゾンの5’末端に第1の検出配列を含む前記トランスポゾンと、前記切断されたゲノムDNAに前記トランスポゾンが挿入され、かつ前記切断されたゲノムDNAが断片化されて、複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片であって、前記核酸断片の5’末端に付着された前記トランスポゾンを含む二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることと;
(c)
(i)前記ゲノムDNA内のあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその5’末端に第2の検出配列を含む第1の固定プライマーと、
(ii)前記第1の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の選択的プライマーと
を使用して、前記タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、前記第1の検出配列、前記核酸断片の前記5’末端に付着された前記トランスポゾン、および前記第2の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと;
(d)増幅された核酸断片を配列決定することと
を含む方法。
(項目13)
前記第1の検出配列が、第1の配列決定タグを含む、項目12に記載の方法。
(項目14)
ステップ(d)が、前記増幅された核酸断片を、前記第1の配列決定タグとハイブリッド形成する第1の配列決定プライマーと接触させることを含む、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記第2の検出配列が、第2の配列決定タグを含む、項目12~14のいずれか一項に記載の方法。
(項目16)
ステップ(d)が、前記増幅された核酸断片を、前記第2の配列決定タグとハイブリッド形成する第2の配列決定プライマーと接触させることを含む、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記ゲノムDNA試料が、単一の細胞から得られる、項目12~16のいずれか一項に記載の方法。
(項目18)
ステップ(c)が、それぞれが前記ゲノムDNA内の異なるあらかじめ決定された位置に相補的なヌクレオチド配列を含む、複数の第1の固定プライマーを使用することを含む、項目12~17のいずれか一項に記載の方法。
(項目19)
ステップ(c)が、それぞれの反応が異なる第1の固定プライマーを使用する、複数の増幅反応を実施することを含む、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記複数の第1の固定プライマーのそれぞれが、(i)同じ配列決定タグと(ii)固有のバーコードとを含む検出配列を含む、項目18または19に記載の方法。
(項目21)
前記二本鎖核酸断片が、約500~約5000bpを含む、項目12~20のいずれか一項に記載の方法。
(項目22)
前記RNAガイド型ヌクレアーゼが、Cas9である、項目12~21のいずれか一項に記載の方法。
(項目23)
方法であって、
(a)細胞または組織から得られたゲノムDNA試料を、トランスポゾンの5’末端に第1の検出配列を含む前記トランスポゾンと、前記トランスポゾンが前記ゲノムDNAに挿入され、かつ前記ゲノムDNAが断片化されて、複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片であって、前記核酸断片の5’末端に付着された前記トランスポゾンを含む二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることであって、前記ゲノムDNAは、部位特異的ヌクレアーゼによって切断された少なくとも1つの部位に組み込まれた二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、ことと;
(b)
(i)前記二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその5’末端に第2の検出配列を含む第1の固定プライマーと、
(ii)前記第1の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の選択的プライマーと
を使用して、前記タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、前記第1の検出配列、前記核酸断片の前記5’末端に付着された前記トランスポゾン、および前記第2の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと;
(c)前記増幅された核酸断片を配列決定することと
を含む方法。
(項目24)
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Cas9である、項目19に記載の方法。
(項目25)
(a)細胞または組織から得られたゲノムDNA試料を、ヌクレアーゼによるゲノムDNAの切断、および二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも1つの切断部位への組み込みに好都合な条件下で、前記RNAガイド型ヌクレアーゼおよび前記二本鎖オリゴヌクレオチドと接触させることであって、それによって、前記組み込まれた二本鎖オリゴヌクレオチドを含むタグ付けされたゲノムDNAが産生される、ことと;
(b)前記タグ付けされたゲノムDNAを、トランスポゾンの5’末端に第1の検出配列を含む前記トランスポゾンと、前記タグ付けされたゲノムDNAに前記トランスポゾンが挿入され、かつ前記タグ付けされたゲノムDNAが断片化されて、複数のタグメンテーションされた二本鎖核酸断片であって、前記核酸断片の5’末端に付着された前記トランスポゾンを含む二本鎖核酸断片になる条件下で接触させることと;
(c)
(i)前記二本鎖オリゴヌクレオチドの少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含み、かつその5’末端に第2の検出配列を含む第1の固定プライマーと、
(ii)前記第1の検出配列の少なくとも一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む第2の選択的プライマーと
を使用して、前記タグメンテーションされた核酸断片を増幅させて、前記第1の検出配列、前記核酸断片の前記5’末端に付着された前記トランスポゾン、および前記第2の検出配列を含む、増幅された核酸断片を形成させることと;
(d)前記増幅された核酸断片を配列決定することと
を含む方法。
(項目26)
前記RNAガイド型ヌクレアーゼが、Cas9である、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記二本鎖オリゴヌクレオチドのどちらの鎖も、前記ゲノムDNAに対してオルソロガスである、項目23~26のいずれか一項に記載の方法。
(項目28)
前記二本鎖オリゴヌクレオチドの各5’末端が、リン酸基を含む、項目23~27のいずれか一項に記載の方法。
(項目29)
前記二本鎖オリゴヌクレオチドの各3’末端が、ホスホロチオエート結合を含む、項目23~28のいずれか一項に記載の方法。
(項目30)
前記二本鎖オリゴヌクレオチドの各5’末端が、ホスホロチオエート結合を含む、項目23~29のいずれか一項に記載の方法。
(項目31)
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、30~35個のヌクレオチドまたは60~65個のヌクレオチドを含む、項目23~30のいずれか一項に記載の方法。
(項目32)
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、平滑末端化される、項目23~31のいずれか一項に記載の方法。
(項目33)
前記二本鎖オリゴヌクレオチドが、1、2、3、または4塩基の突出ヌクレオチドを有する5’末端を含む、項目23~31のいずれか一項に記載の方法。
(項目34)
前記第1の検出配列が、第1の配列決定タグを含む、項目23~33のいずれか一項に記載の方法。
(項目35)
配列決定することが、前記増幅された核酸断片を、前記第1の配列決定タグとハイブリッド形成する第1の配列決定プライマーと接触させることを含む、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記第2の検出配列が、第2の配列決定タグを含む、項目23~35のいずれか一項に記載の方法。
(項目37)
配列決定することが、前記増幅された核酸断片を、前記第2の配列決定タグとハイブリッド形成する第2の配列決定プライマーと接触させることを含む、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記二本鎖核酸断片が、約500~約5000bpを含む、項目19~37のいずれか一項に記載の方法。
(項目39)
前記配列決定された核酸断片が、参照ゲノムDNA試料に対する転座を含む、項目1~38のいずれか一項に記載の方法。
(項目40)
前記ゲノムDNA試料が、ウイルスによって導入された配列を含む、項目1~39のいずれか一項に記載の方法。
(項目41)
前記ゲノムDNA、前記切断されたゲノムDNA、または前記タグ付けされたゲノムDNAを前記トランスポゾンと接触させる前に、ウイルスベクターを使用して、配列を前記ゲノムDNAに導入するステップをさらに含む、項目1~40のいずれか一項に記載の方法。
(項目42)
前記配列決定された核酸断片を前記参照ゲノムDNA試料と比較することをさらに含む、項目1~41のいずれか一項に記載の方法。
(項目43)
少なくとも1つの配列決定された核酸が、前記参照ゲノムDNA試料に対する転座を含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記配列決定された核酸の1%未満が、前記参照ゲノムDNA試料に対する転座を含む、項目43に記載の方法。
(項目45)
前記ゲノムDNA試料が、生きている細胞または組織を含有しない試料から得られる、項目1~44のいずれか一項に記載の方法。
(項目46)
前記ゲノムDNA試料が、痕跡量の細胞および/または組織を含有する試料から得られる、項目1~44のいずれか一項に記載の方法。
(項目47)
前記ゲノムDNA試料が、真核細胞から得られる、項目1~44または46のいずれか一項に記載の方法。
(項目48)
前記ゲノムDNA試料が、原核細胞から得られる、項目1~44または46のいずれか一項に記載の方法。
(項目49)
前記ゲノムDNA試料が、1つまたは複数の微生物叢から得られる、項目1~44、46、または48のいずれか一項に記載の方法。
(項目50)
1つまたは複数の処理装置によって実施される方法であって、
複数の実体についてのヌクレオチド配列を含むデータセットであって、次世代配列決定データを含むデータセットを受け取ることと;
前記データセットから第1のデータを得るために前記データセットを逆多重化することであって、前記第1のデータは、前記複数の実体の中のある実体から得られるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、前記実体を特定するバーコードを含み、前記ヌクレオチド配列はまた、1つまたは複数の識別子を含み、前記1つまたは複数の識別子は、前記ヌクレオチド配列上で実施される遺伝子編集事象に基づいている、ことと;
前記第1のデータに基づいて、第2のデータによって表される参照アンプリコンに対して、前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部を整列させることであって、前記参照アンプリコンは、変異、欠失、挿入、インデル、転座、逆位、および/または重複を含む1つまたは複数の予測される遺伝子編集事象の提示を含む参照ヌクレオチド配列を含む、ことと;前記参照アンプリコンに対して整列される前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部に含有される、前記識別子の数を決定することと;
識別子の前記数に基づいて、前記遺伝子編集事象の結果を評価することと
を含む方法。
(項目51)
前記1つまたは複数の識別子が、前記ヌクレオチド配列上で実施される複数の遺伝子編集事象に基づいており;かつ
評価することが、識別子の前記数に基づく前記複数の遺伝子編集事象の結果を評価することを含む、項目50に記載の方法。
(項目52)
前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部を、前記参照アンプリコンに対して整列させることが、前記ヌクレオチド配列のヌクレオチドを、前記参照アンプリコンのヌクレオチドと適合させることを含む、項目50に記載の方法。
(項目53)
バーコードを含む前記ヌクレオチド配列が、前記バーコード中の前記ヌクレオチドの1つを除いてすべてが適合するならば、前記実体を特定する、項目50に記載の方法。
(項目54)
整列の前に、前記ヌクレオチド配列から1つまたは複数のアダプターを取り除くことをさらに含む、項目50に記載の方法。
(項目55)
1つまたは複数の表示装置を与えるために、前記遺伝子編集事象の精度を代表する画像データを作成することと;
前記1つまたは複数の表示装置上に、前記画像データに基づいて、1つまたは複数の画像を与えることと
をさらに含む、項目50に記載の方法。
(項目56)
前記参照アンプリコンが、1つまたは複数のベクター配列または1つまたは複数のプラスミド配列を含む、項目50に記載の方法。
(項目57)
前記1つまたは複数の識別子が、固有分子インデックス(UMI)を含む、項目50に記載の方法。
(項目58)
前記1つまたは複数の識別子が、1つまたは複数の予測される遺伝子編集事象を示すものである、項目50に記載の方法。
(項目59)
前記参照アンプリコンに対して整列される前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部における前記識別子の前記数を決定することが、予測される遺伝子編集事象に対して整列される識別子の数を計数することを含む、項目50に記載の方法。
(項目60)
前記データセットが、UDiTaSライブラリに基づいている、項目50に記載の方法。
(項目61)
前記バーコードが、前記ヌクレオチド配列に対して固有であり、その結果、前記ヌクレオチド配列に由来する配列決定ライブラリのすべてのメンバーが、同じバーコードを含むようになる、項目50に記載の方法。
(項目62)
前記遺伝子編集事象の精度に基づいて、遺伝子編集プロセスを選択すること
をさらに含む、項目50に記載の方法。
(項目63)
1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体であって、
複数の実体についてのヌクレオチド配列を含むデータセットであって、次世代配列決定データを含むデータセットを受け取ることと;
前記データセットから第1のデータを得るために前記データセットを逆多重化することであって、前記第1のデータは、前記複数の実体の中のある実体から得られるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、前記実体を特定するバーコードを含み、前記ヌクレオチド配列はまた、1つまたは複数の識別子を含み、前記1つまたは複数の識別子は、前記ヌクレオチド配列上で実施される遺伝子編集事象に基づいている、ことと;
前記第1のデータに基づいて、第2のデータによって表される参照アンプリコンに対して、前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部を整列させることであって、前記参照アンプリコンは、1つまたは複数のオンターゲット遺伝子編集事象、1つまたは複数のオフターゲット遺伝子編集事象、または1つまたは複数のオンターゲット遺伝子編集事象と1つまたは複数のオフターゲット遺伝子編集事象との両方の提示を含む参照ヌクレオチド配列を含む、ことと;
前記参照アンプリコンに対して整列される前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部に含有される、前記識別子の数を決定することと;
識別子の前記数に基づいて、前記遺伝子編集事象の結果を評価することと
を含む、動作を実施するための1つまたは複数の処理装置によって実行可能である、命令を保存する1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目64)
前記1つまたは複数の識別子が、前記ヌクレオチド配列上で実施される複数の遺伝子編集事象に基づいており;かつ
評価することが、識別子の前記数に基づく前記複数の遺伝子編集事象の結果を評価することを含む、項目63に記載の1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目65)
前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部を、前記参照アンプリコンに対して整列させることが、前記ヌクレオチド配列のヌクレオチドを、前記参照アンプリコンのヌクレオチドと適合させることを含む、項目63に記載の1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目66)
前記バーコードを含む前記ヌクレオチド配列が、前記バーコード中の前記ヌクレオチドの1つを除いてすべてが適合するならば、前記実体を特定する、項目63に記載の1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目67)
前記動作が、
整列の前に、前記ヌクレオチド配列から1つまたは複数のアダプターを取り除くことを含む、項目63に記載の1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目68)
前記動作が、
1つまたは複数の表示装置を与えるために、前記遺伝子編集事象の精度を代表する画像データを作成することと;
前記1つまたは複数の表示装置上に、前記画像データに基づいて、1つまたは複数の画像を与えることと
を含む、項目63に記載の1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目69)
前記参照アンプリコンが、1つまたは複数のベクター配列または1つまたは複数のプラスミド配列を含む、項目63に記載の1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目70)
前記1つまたは複数の識別子が、固有分子インデックス(UMI)を含む、項目63に記載の1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目71)
前記1つまたは複数の識別子が、1つまたは複数の予測される遺伝子編集事象を示すものである、項目63に記載の1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目72)
前記参照アンプリコンに対して整列される前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部における前記識別子の前記数を決定することが、予測される遺伝子編集事象に対して整列される識別子の数を計数することを含む、項目63に記載の1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目73)
前記データセットが、UDiTaSライブラリに基づいている、項目63に記載の1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目74)
前記バーコードが、前記ヌクレオチド配列に対して固有であり、その結果、前記ヌクレオチド配列に由来する配列決定ライブラリのすべてのメンバーが、同じバーコードを含むようになる、項目63に記載の1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目75)
前記遺伝子編集事象の精度に基づいて、遺伝子編集プロセスを選択すること
をさらに含む、項目63に記載の1つまたは複数の非一過性の機械可読記憶媒体。
(項目76)
システムであって、
実行可能である命令を保存する非一過性の機械可読ストレージと;
複数の実体についてのヌクレオチド配列を含むデータセットであって、次世代配列決定データを含むデータセットを受け取ることと;
前記データセットから第1のデータを得るために前記データセットを逆多重化することであって、前記第1のデータは、前記複数の実体の中のある実体から得られるヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列は、前記実体を特定するバーコードを含み、前記ヌクレオチド配列はまた、1つまたは複数の識別子を含み、前記1つまたは複数の識別子は、前記ヌクレオチド配列上で実施される遺伝子編集事象に基づいている、ことと;
前記第1のデータに基づいて、第2のデータによって表される参照アンプリコンに対して、前記ヌクレオチド配列の少なくとも一部を整列させることであって、前記参照アンプリコンは、1つまたは複数のオンターゲット遺伝子編集事象、1つまたは複数のオフターゲット遺伝子編集事象、または1つまたは複数のオンターゲット遺伝子編集事象と1つまたは複数のオフターゲット遺伝子編集事象との両方の提示を含む参照ヌクレオチド配列を含む、ことと;
前記参照アンプリコンに対して整列される前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部に含有される、前記識別子の数を決定することと;
識別子の前記数に基づいて、前記遺伝子編集事象の結果を評価することと
を含む動作を実施するための前記命令を遂行するための1つまたは複数の処理装置と
を含むシステム。
(項目77)
前記1つまたは複数の識別子が、前記ヌクレオチド配列上で実施される複数の遺伝子編集事象に基づいており;かつ
評価することが、識別子の前記数に基づく前記複数の遺伝子編集事象の結果を評価することを含む、項目76に記載のシステム。
(項目78)
前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部を、前記参照アンプリコンに対して整列させることが、前記ヌクレオチド配列のヌクレオチドを、前記参照アンプリコンのヌクレオチドと適合させることを含む、項目76に記載のシステム。
(項目79)
バーコードを含む前記ヌクレオチド配列が、前記バーコード中の前記ヌクレオチドの1つを除いてすべてが適合するならば、前記実体を特定する、項目76に記載のシステム。
(項目80)
前記動作が、
整列の前に、前記ヌクレオチド配列から1つまたは複数のアダプターを取り除くことを含む、項目76に記載のシステム。
(項目81)
前記動作が、
1つまたは複数の表示装置を与えるために、前記遺伝子編集事象の精度を代表する画像データを作成することと;
前記1つまたは複数の表示装置上に、前記画像データに基づいて、1つまたは複数の画像を与えることと
を含む、項目76に記載のシステム。
(項目82)
前記参照アンプリコンが、1つまたは複数のベクター配列または1つまたは複数のプラスミド配列を含む、項目76に記載のシステム。
(項目83)
前記1つまたは複数の識別子が、固有分子インデックス(UMI)を含む、項目76に記載のシステム。
(項目84)
前記1つまたは複数の識別子が、1つまたは複数の予測される遺伝子編集事象を示すものである、項目76に記載のシステム。
(項目85)
前記参照アンプリコンに対して整列される前記ヌクレオチド配列の前記少なくとも一部における前記識別子の前記数を決定することが、予測される遺伝子編集事象に対して整列される識別子の前記数を計数することを含む、項目76に記載のシステム。
(項目86)
前記データセットが、UDiTaSライブラリに基づいている、項目76に記載のシステム。
(項目87)
前記バーコードが、前記ヌクレオチド配列に対して固有であり、その結果、前記ヌクレオチド配列に由来する配列決定ライブラリのすべてのメンバーが、同じバーコードを含むようになる、項目76に記載のシステム。
(項目88)
前記遺伝子編集事象の精度に基づいて、遺伝子編集プロセスを選択すること
をさらに含む、項目76に記載のシステム。
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- 明細書に記載の発明。
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