ES2320814T3

ES2320814T3 - Procedimiento de sintesis de acido nucleico.

Info

Publication number: ES2320814T3
Application number: ES07014809T
Authority: ES
Inventors: Tsugunori Nasu Jigyosho Notomi; Tetsu c/o Nasu Kojo HASE
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1998-11-09
Filing date: 1999-11-08
Publication date: 2009-05-28
Anticipated expiration: 2019-11-08
Also published as: DE69937223D1; US7494790B2; EP1020534B1; ES2393056T3; MY117621A; EP2045337A1; DE1020534T1; ES2369818T3; JP4139424B2; EP1020534B2; US20020168676A1; DE69937223T3; ES2294862T5; ATE521718T1; WO2000028082A1; EP2045337B1; EP1020534A4; JP3313358B2; US6974670B2; MY157626A

Abstract

Un conjunto de cebadores para la síntesis de un ácido nucleico que tiene cadenas complementarias alternativamente unidas en una cadena monocatenaria, que comprende los siguientes elementos: i) un primer cebador oligonucleótido que comprende al menos dos regiones F2 y F1c, en el que F1c está unido al lado 5'' de F2, y en el que F2 es una región que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región arbitraria F2c en un ácido nucleico molde que tiene una secuencia de nucleótidos específica, y F1c es una región que tienen sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que una región F1c situada en el lado 5'' de la región F2c en el ácido nucleico molde que tiene una secuencia de nucleótidos específica; ii) un segundo cebador oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región arbitraria R2c en una cadena complementaria sintetizada con el primer oligonucleótido como origen de la síntesis, que tiene una secuencia de nucleótidos específica; iii) un primer cebador exterior que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región F3c situada en el lado 3'' de la región F2c en el ácido nucleico que sirve como un molde; iv) un segundo cebador exterior que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región R3c situada en el lado 3'' de la región R2c arbitraria en la cadena complementaria sintetizada con el primer oligonucleótido como origen de la síntesis.

Description

Procedimiento de síntesis de ácido nucleico.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis de un ácido nucleico compuesto de una secuencia específica de nucleótidos, que es útil como procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos.

Técnica (antecedente)

Un procedimiento de análisis basado en la complementaridad de una secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico puede analizar rasgos genéticos directamente. Por consiguiente, este análisis es un medio muy poderoso para la identificación de enfermedades genéticas, formación de cáncer, microorganismos, etc. Además, el propio gen es el objeto de la detección, y así en algunos casos se pueden omitir procedimientos difíciles y que requieren mucho tiempo tales como el cultivo.

No obstante, la detección de un gen diana presente en una cantidad muy pequeña en una muestra, en general no es fácil de modo que es necesaria la amplificación del propio gen diana o de su señal de detección. Como procedimiento para amplificar un gen diana, se conoce el procedimiento de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) (Science, 230, 1350-1354, 1985). Actualmente, el procedimiento de la PCR es el procedimiento más popular como técnica de amplificación de ácidos nucleicos in vitro. Este procedimiento está firmemente establecido como un procedimiento de detección excelente en virtud de la alta sensibilidad basada en el efecto de la amplificación exponencial. Además, puesto que el producto de amplificación se puede recuperar como ADN, este procedimiento se aplica ampliamente como una herramienta importante de respaldo de las técnicas de ingeniería genética tales como la clonación de genes y la determinación estructural. Sin embargo, en el procedimiento de la PCR hay los siguientes problemas notables: es necesario un controlador de la temperatura especial para la práctica; el progreso exponencial de la reacción de amplificación causa un problema en la cuantificación; y las muestras y las disoluciones de reacción se contaminan fácilmente desde el exterior al permitir que ácidos nucleicos mezclados por error funcionen como un molde.

Al acumularse la información genómica, ha empezado a llamar la atención el análisis del polimorfismo de un solo nucleótido (SNP). La detección de los SNP mediante la PCR es posible mediante el diseño de un cebador de modo que su secuencia de nucleótidos contenga el SNP. Es decir, si una secuencia de nucleótidos complementaria del cebador está presente o no se puede deducir determinando si está presente o no un producto de reacción. Sin embargo, una vez que una cadena complementaria es sintetizada por error en la PCR por casualidad, este producto funciona como un molde en la siguiente reacción, produciendo así un resultado erróneo. En la práctica, se dice que el control estricto de la PCR es difícil con la diferencia de solo una base dada en el extremo del cebador. Por consiguiente, es necesario mejorar la especificidad con el fin de aplicar la PCR a la detección de los SNP.

Por una parte, en la práctica también se usa un procedimiento de síntesis de ácido nucleico mediante una ligasa. El procedimiento de la LCR (reacción en cadena de la ligasa; Laffler T.G.; Garrino J.J.; Marshall R.L.; Ann. Biol. Clin. (Paris), 51:9, 821-6, 1993) se basa en la reacción en la que hibridan dos sondas adyacentes con una secuencia diana y se unen entre sí mediante una ligasa. Las dos sondas podrían no unirse en ausencia de la secuencia de nucleótidos diana, y por lo tanto, la presencia del producto unido es indicativa de la secuencia de nucleótidos diana. Debido a que el procedimiento de la LCR también requiere el control de la temperatura para separar una cadena complementaria de un molde, surge el mismo problema que en el procedimiento de la PCR. Para la LCR, también se ha publicado un procedimiento para mejorar la especificidad añadiendo la etapa de proporcionar un hueco entre sondas adyacentes y rellenar el hueco mediante una ADN polimerasa. Sin embargo, lo que puede esperarse en este procedimiento modificado es sólo especificidad, y sigue existiendo el problema de que se requiere el control de la temperatura. Además, el uso de la enzima adicional conduce a un aumento del coste.

También se conoce un procedimiento llamado el procedimiento de SDA (amplificación por desplazamiento de cadena) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-396, 1992] [Nucleic Acid. Res., 20, 1691-1696, 1992] como un procedimiento de amplificación de ADN que tiene una secuencia complementaria de la secuencia diana como molde. En el procedimiento de SDA se usa una ADN polimerasa especial para sintetizar una cadena complementaria que empieza a partir de un cebador complementario del lado 3' de una secuencia de nucleótidos determinada, a la vez que desplaza una cadena bicatenaria, si hay alguna, en el lado 5' de la secuencia. En la presente memoria descriptiva, la expresión sencilla "lado 5'" o "lado 3'" se refiere al de una cadena que sirve como molde. Debido a que la cadena bicatenaria en el lado 5' es desplazada por una cadena complementaria recién sintetizada, esta técnica se llama el procedimiento de SDA. La etapa de cambio de temperatura esencial en el procedimiento de la PCR se puede eliminar en el procedimiento de SDA insertando previamente una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción en una secuencia hibridada como cebador. Es decir, una mella generada por una enzima de restricción da un grupo 3'-OH que actúa como el origen de la síntesis de la cadena complementaria, y la cadena complementaria previamente sintetizada es liberada como una cadena monocatenaria por la síntesis por desplazamiento de cadena y después se usa otra vez como molde para la siguiente síntesis de cadena complementaria. De esta forma, el complicado control de la temperatura esencial en el procedimiento de la PCR no se requiere en el procedimiento de la SDA.

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El documento US 5.744.311 describe procedimientos para la amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) isotérmica que se pueden realizar a lo largo de un amplio intervalo de temperatura usando endonucleasas de restricción termófilas. Se describe que el uso de endonucleasas termófilas aumenta la eficacia de la reacción de SDA.

El documento EP 0678582 describe procedimientos para detectar, inmovilizar o localizar productos de extensión del cebador de una reacción SDA en tiempo real por generación simultánea de productos de amplificación secundarios que no interfieren con la reacción de SDA primaria.

Sin embargo, en el procedimiento de SDA, debe usarse la enzima de restricción que genera una mella además de la ADN polimerasa de tipo desplazamiento de cadena. Este requisito de enzima adicional es una causa importante del mayor coste. Además, debido a que la enzima de restricción se va a usar no para la escisión de ambas cadenas bicatenarias si no para la introducción de una mella (es decir, escisión de sólo una de las cadenas), debe usarse un derivado de dNTP tal como \alpha-tio-dNTP como sustrato para la síntesis para hacer a la otra cadena resistente a la digestión con la enzima. Por consiguiente, el producto de amplificación por la SDA tiene una estructura diferente de la del ácido nucleico natural, y hay un límite para la escisión con enzimas de restricción o aplicación del producto de amplificación a la clonación de genes. En relación con esto también, es una causa importante para el mayor coste. Además, cuando el procedimiento de SDA se aplica a una secuencia desconocida, hay la posibilidad de que la misma secuencia de nucleótidos que la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción usada para introducir una mella, pueda estar presente en una región que se va a sintetizar. En este caso, es posible que se impida sintetizar una cadena complementaria completa.

La NASBA (amplificación basada en secuencia de ácido nucleico, también llamada el procedimiento de amplificación mediado por TMA/transcripción) se conoce como un procedimiento de amplificación de ácido nucleico en el que no es necesario el complicado control de la temperatura. La NASBA es un sistema de reacción en el que el ADN es sintetizado por la ADN polimerasa en presencia de ARN diana como molde con una sonda que tiene un promotor T7 añadido a la misma, y el producto se forma con una segunda sonda en una cadena bicatenaria, seguido de la transcripción por la ARN polimerasa T7 con la cadena bicatenaria formada como molde para amplificar una gran cantidad de ARN (Nature, 350, 91-92, 1991). La NASBA requiere algunas etapas de desnaturalización térmica hasta que el ADN bicatenario se ha completado, pero la posterior reacción transcripcional por la ARN polimerasa T7 transcurre en condiciones isotérmicas. Sin embargo, es esencial una combinación de una pluralidad de enzimas tales como la transcriptasa inversa, RNasa H, ADN polimerasa y ARN polimerasa T7, y esto es desfavorable para el coste al igual que la SDA. Además, debido a que es completado fijar las condiciones para una pluralidad de reacciones enzimáticas, este procedimiento apenas se ha extendido como procedimiento analítico general. En las reacciones conocidas de amplificación de ácido nucleico, sigue habiendo problemas tales como el complicado control de la temperatura y la necesidad de enzimas plurales como se ha descrito antes.

Para estas reacciones conocidas de síntesis de ácido nucleico, hay pocas publicaciones de un intento de mejorar más la eficacia de la síntesis del ácido nucleico sin sacrificar la especificidad o el coste. Por ejemplo, en un procedimiento llamado RCA (amplificación por círculo rodante), se mostró que el ADN monocatenario que tenía una serie de secuencias de nucleótidos complementarias a una sonda cerrada se podía sintetizar de forma continua en presencia de una secuencia de nucleótidos diana (Paul M. Lizardi y col., Nature Genetics, 13, 225-232, July, 1998). En la RCA, se usa una sonda cerrada que tiene una estructura especial en la que cada uno de los extremos 5' y 3' de un solo oligonucleótido constituyen una sonda adyacente en la LCR. Después, se activa la reacción continua de síntesis de cadena complementaria con la sonda cerrada como molde que se une y cicla en presencia de una secuencia de nucleótidos diana, mediante la combinación con una polimerasa que cataliza la reacción de tipo desplazamiento de cadena de la cadena complementaria que se sintetiza. Así se forma un ácido nucleico monocatenario que tiene una estructura de una serie de regiones que consiste cada una en la misma secuencia de nucleótidos. Después hibrida un cebador con este ácido nucleico monocatenario para sintetizar su cadena complementaria y así se logra un grado alto de amplificación. Sin embargo, todavía sigue el problema de la necesidad de una pluralidad de enzimas. Además, la activación de la síntesis de la cadena complementaria depende de la reacción de unión de dos regiones adyacentes, y su especificidad es básicamente la misma que en la LCR.

Para el objetivo de suministrar el grupo 3'-OH, hay un procedimiento conocido en el que se proporciona una secuencia de nucleótidos en el extremo 3' con una secuencia complementaria de esta y se forma un bucle en horquilla en el extremo (Gene, 71, 29-40, 1988). La síntesis de la cadena complementaria con la propia secuencia diana como molde empieza en el bucle en horquilla para formar un ácido nucleico monocatenario compuesto de la secuencia de nucleótidos complementaria. Por ejemplo, en el documento WO 9601327 se logra una estructura en la que la hibridación ocurre en la misma cadena en el extremo al que se ha unido una secuencia de nucleótidos complementaria. Sin embargo, en este procedimiento, la etapa en la que el extremo cancela el apareamiento de bases con la cadena complementaria y se vuelve a constituir el apareamiento de bases en la misma cadena, es esencial. Se cree que esta etapa transcurre dependiendo de un estado de equilibrio sutil en el extremo de las secuencias de nucleótidos mutuamente complementarias que implica apareamiento de bases. Es decir, se usa un estado de equilibrio mantenido entre el apareamiento de bases con una cadena complementaria y el apareamiento de bases en la misma cadena, y la única cadena que hibrida con la secuencia de nucleótidos en la misma cadena sirve como el origen de la síntesis de una cadena complementaria. Por consiguiente, se considera que deben fijarse condiciones de reacción estrictas para lograr una eficacia de reacción alta. Además, en esta técnica anterior, el propio cebador forma una estructura de bucle. Por consiguiente, una vez se ha formado un dímero del cebador, la reacción de amplificación se inicia automáticamente independientemente de si hay presente o no una secuencia de nucleótidos diana, y así se forma un producto sintético inespecífico. Esto puede ser un problema grave. Además, la formación del dímero del cebador y posterior consumo del cebador por la reacción sintética inespecífica conduce a una reducción de la eficacia de la amplificación de la reacción deseada.

Además, hay una publicación en la que se usó una región que no servía como molde para la ADN polimerasa, para lograr una hibridación de la estructura del extremo 3' con la misma cadena (documento EP713922). Esta publicación también tiene el mismo problema que la WO 9601327 anterior, con respecto al uso del equilibrio dinámico en el extremo o la posibilidad de reacción sintética inespecífica debido a la formación de un cebador dímero. Además, debe prepararse una región especial que no sirve como molde para la ADN polimerasa como cebador.

Además, en diferentes reacciones de amplificación de señal en las que se aplica el principio de NASBA descrito antes, a menudo se usa un oligonucleótido que tiene una estructura de horquilla en su extremo para suministrar una región promotora bicatenaria (documento JP-A-5-211873). Sin embargo, estas técnicas no son las que permiten el suministro sucesivo del grupo 3'-OH para la síntesis de una cadena complementaria. Además, se usa una estructura de bucle de horquilla que tiene un extremo 3' hibridado en la misma cadena, con el propósito de obtener un molde de ADN transcrito por la ARN polimerasa, en el documento JP-A-10-510161 (WO96/17079). En este procedimiento, el molde se amplifica usando transcripción en ARN y transcripción inversa de ARN a ADN. Sin embargo, en este procedimiento, el sistema de reacción no se puede constituir sin la combinación de una pluralidad de enzimas.

Divulgación de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de síntesis de ácido nucleico basado en un principio nuevo. Un objetivo más específico es proporcionar un procedimiento capaz de realizar la síntesis de ácido nucleico que depende de la eficacia de secuencia con costes bajos. Es decir, un objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento capaz de lograr la síntesis y amplificación del ácido nucleico mediante una sola enzima, incluso en condiciones de reacción isotérmicas. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento de síntesis de ácido nucleico que puede lograr una alta especificidad difícil de conseguir en el principio de reacción conocido de síntesis de ácidos nucleicos, así como un procedimiento de amplificación de ácido nucleico aplicando dicho procedimiento sintético.

Los autores de la presente invención centran su atención en el hecho de que el uso de una polimerasa que cataliza la síntesis de tipo desplazamiento de cadena de la cadena complementaria, es útil para la síntesis de ácido nucleico que no depende del complicado control de la temperatura. Dicha ADN polimerasa es una enzima usada en la SDA y RCA. Sin embargo, incluso si se usa dicha enzima, siempre se requiere otra enzima de reacción para suministrar el grupo 3'-OH como origen de la síntesis en los medios conocidos basados en cebadores, tales como la SDA.

En estas circunstancias, los autores de la presente invención examinaron el suministro del grupo 3'-OH desde un punto de vista completamente diferente del procedimiento conocido. Como resultado, los autores de la presente invención encontraron que usando un oligonucleótido que tenía una estructura especial, el grupo 3'-OH puede suministrarse sin ninguna reacción enzimática adicional, completando así la presente invención. Es decir, la presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis de ácido nucleico, a un procedimiento de amplificación de ácido nucleico aplicando dicho procedimiento de síntesis de ácido nucleico y a un nuevo grupo de cebadores que permiten dichos procedimientos, como sigue:

1. Un conjunto de cebadores para la síntesis de un ácido nucleico que tiene cadenas complementarias alternativamente unidas en una cadena monocatenaria, que comprende los siguientes elementos:

i) un primer cebador oligonucleótido que comprende al menos dos regiones F2 y F1c, en el que F1c está unido al lado 5' de F2, y en el que

F2 es una región que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región arbitraria F2c en un ácido nucleico molde que tiene una secuencia de nucleótidos específica, y

F1c es una región que tienen sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que una región F1c situada en el lado 5' de la región F2c en el ácido nucleico molde que tiene una secuencia de nucleótidos específica;

ii) un segundo cebador oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región arbitraria R2c en una cadena complementaria sintetizada con el primer oligonucleótido como origen de la síntesis que tiene una secuencia de nucleótidos específica;

iii) un primer cebador exterior que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región F3c situada en el lado 3' de la región F2c en el ácido nucleico que sirve como molde;

iv) un segundo cebador exterior que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región R3c situada en el lado 3' de la región R2c arbitraria en la cadena complementaria sintetizada con el primer oligonucleótido como el origen de la síntesis.

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2. El conjunto de cebadores de acuerdo con la realización 1 anterior, en el que el segundo cebador oligonucleótido tiene una región R1c, en el que R1c está unido al lado 5' de R2, y en el que

R1c es una región que tiene sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que una región R1c situada en el lado 5' de la región R2c en el ácido nucleico molde que tiene una secuencia de nucleótidos específica.

3. Un kit para la síntesis de un ácido nucleico que tiene cadenas complementarias alternativamente unidas en una cadena monocatenaria, que comprende los siguientes elementos:

i) un primer cebador oligonucleótido que comprende al menos dos regiones F2 y F1c, en el que F1c está unida al lado 5' de F2, y en el que

F1c es una región que tiene sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que una región F1c situada en el lado 5' de la región F2c en el ácido nucleico molde que tiene una secuencia de nucleótidos específica;

ii) un segundo cebador de oligonucleótidos que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región R2c arbitraria en una cadena complementaria sintetizada con el primer oligonucleótido como el origen de la síntesis que tiene una secuencia de nucleótidos específica;

v) una ADN polimerasa que cataliza la reacción de tipo desplazamiento de cadena de la cadena complementaria que se sintetiza; y

vi) un nucleótido que sirve como sustrato para el elemento v).

4. Un procedimiento para sintetizar un ácido nucleico que tiene cadenas complementarias alternativamente unidas en una cadena monocatenaria, que comprende:

A) mezclar los siguientes componentes i) a vi) con el ácido nucleico de muestra como molde:

ii) un segundo cebador oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región R2c arbitraria en una cadena complementaria sintetizada con el primer oligonucleótido como el origen de la síntesis, que tiene una secuencia de nucleótidos específica;

vi) un nucleótido que sirve como un sustrato para el elemento v); y

B) incubar la mezcla a una temperatura tal que la secuencia de nucleótidos que constituye el primer y segundo cebadores oligonucleótidos pueda formar apareamiento de bases estable con el molde.

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El ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria como el objeto de síntesis de la presente invención, significa un ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos mutuamente complementarias unidas una al lado de la otra en una cadena monocatenaria. Además, debe contener una secuencia de nucleótidos para formar un bucle entre las cadenas complementarias. En la presente invención, esta secuencia se llama la secuencia formadora de bucle. El ácido nucleico sintetizado por la presente invención está compuesto sustancialmente de cadenas mutuamente complementarias unidas por la secuencia formadora de bucle. En general, una cadena no separada en 2 o más moléculas tras la disociación del apareamiento de bases se llama una cadena monocatenaria independientemente de si implica parcialmente o no apareamiento de bases. La secuencia de nucleótidos complementaria puede formar apareamiento de bases en la misma cadena. Un producto de apareamiento de bases intramolecular, que se puede obtener permitiendo que el ácido nucleico tenga secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria de acuerdo con la presente invención, para que forme apareamiento de bases en la misma cadena, da una región que constituye una cadena aparentemente bicatenaria y un bucle que no implica apareamiento de bases.

Es decir, el ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria de acuerdo con la presente invención, contiene secuencias de nucleótidos complementarias capaces de hibridar en la misma cadena, y su producto hibridado se puede definir como un ácido nucleico monocatenario que constituye un bucle que no implica apareamiento de bases en una porción bisagra doblada. Un nucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos complementaria en el mismo puede hibridar con el bucle que no implica apareamiento de bases. La secuencia formadora de bucle puede ser una secuencia de nucleótidos arbitraria. La secuencia formadora de bucle es capaz de apareamiento de bases de modo que inicia la síntesis de una cadena complementaria para el desplazamiento, y preferiblemente está provista de una secuencia distinguible de una secuencia de nucleótidos situada en la otra región, con el fin de lograr la hibridación específica. Por ejemplo, en una realización preferida, la secuencia formadora de bucle contiene sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que una región F2c (o R2c) situada en el lado 3' de una región (es decir, F1c o R1c) derivada del ácido nucleico como molde y hibridada en la misma cadena.

En la presente invención, sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos, se define como sigue. Es decir, cuando una cadena complementaria sintetizada con una determinada secuencia como molde hibrida con una secuencia de nucleótidos diana para dar el origen de la cadena complementaria que se sintetiza, esta secuencia determinada es sustancialmente la misma que la secuencia de nucleótidos diana. Por ejemplo, sustancialmente la misma secuencia que F2 incluye no solo absolutamente la misma secuencia de nucleótidos que F2 si no también una secuencia de nucleótidos capaz de funcionar como molde dando una secuencia de nucleótidos capaz de hibridar con F2 y actuar como el origen de la cadena complementaria que se sintetiza.

El término "hibridar" en la presente invención significa la formación de una estructura bicatenaria de ácido nucleico por el apareamiento de bases basado en la ley de Watson-Crick. Por consiguiente, incluso aunque una cadena de ácido nucleico que forma apareamiento de bases sea una cadena monocatenaria, la hibridación ocurre si las secuencias de nucleótidos complementarias intramoleculares están apareadas por bases. En la presente invención, hibridar e hibridación tienen el mismo significado en cuanto que el ácido nucleico forma una estructura bicatenaria por el apareamiento de bases.

El número de pares de secuencias de nucleótidos complementarias que constituyen el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención es al menos 1. De acuerdo con un modo deseado de la presente invención, puede ser 2 o más. En este caso teóricamente no hay límite superior del número de pares de secuencias de nucleótidos complementarias que constituyen el ácido nucleico. Cuando el ácido nucleico como producto sintético de la presente invención está constituido por una pluralidad de grupos de secuencias de nucleótidos complementarias, este ácido nucleico está compuesto de secuencias de nucleótidos idénticas repetidas.

El ácido nucleico que tiene las secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria sintetizada por la presente invención, puede no tener la misma estructura que el ácido nucleico natural. Se sabe que si se usa un derivado de nucleótido como sustrato cuando se sintetiza el ácido nucleico por acción de una ADN polimerasa, se puede sintetizar un derivado de ácido nucleico. El derivado de nucleótido usado incluye nucleótidos marcados con un radioisótopo o derivados de nucleótidos marcados con un ligando de unión tales como biotina o digoxina. Estos derivados de nucleótidos se pueden usar para marcar derivados de ácido nucleico como producto. Alternativamente, si se usan nucleótidos fluorescentes como sustrato, el ácido nucleico como producto, puede ser un derivado fluorescente. Además, este producto puede ser ADN o ARN. Cuál se forma está determinado por una combinación de la estructura de un cebador, el tipo de sustrato para la polimerización y los reactivos de polimerización para llevar a cabo la polimerización del ácido nucleico.

La síntesis del ácido nucleico que tiene la estructura descrita antes, se puede iniciar usando una ADN polimerasa que tiene la actividad de desplazamiento de cadena y el ácido nucleico que está provisto en su extremo 3' de una región F1 capaz de hibridar con una parte de F1c en la misma cadena y que tras la hibridación de la región F1 con F1c, es capaz de formar un bucle que contiene una región F2c capaz de apareamiento de bases. Hay muchas publicaciones sobre la reacción de síntesis de la cadena complementaria en la que se forma un bucle en horquilla y se usa la propia secuencia de muestra como molde, mientras que en la presente invención, la parte del bucle en horquilla está provista de una región que es capaz de apareamiento de bases, y hay una nueva característica en el uso de esta región en la síntesis de la cadena complementaria. Mediante el uso de esta región como el origen de la síntesis, se desplaza una cadena complementaria previamente sintetizada con la propia secuencia de muestra como molde. Después, una región R1c (región arbitraria) situada en el extremo 3' de la cadena de desplazamiento está en un estado listo para el apareamiento de bases. Una región que tiene una secuencia complementaria de esta R1c hibrida con la misma, dando como resultado la formación del ácido nucleico (2 moléculas) que tiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde F1 a R1c y su cadena complementaria unida alternativamente por la secuencia formadora de bucle. Dicha región arbitraria tal como la región R1c anterior, se puede seleccionar arbitrariamente con la condición de que pueda hibridar con un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos complementaria de esta región, y que una cadena complementaria sintetizada con el polinucleótido como el origen de la síntesis tenga necesariamente funciones para la presente invención.

En la presente invención, se usa la expresión "ácido nucleico". El ácido nucleico en la presente invención en general incluye tanto ADN como ARN. Sin embargo, el ácido nucleico cuyo nucleótido se sustituye por un derivado artificial o el ácido nucleico modificado del ADN o ARN natural, también está incluido en el ácido nucleico de la presente invención, siempre que funcione como un molde para la síntesis de la cadena complementaria. El ácido nucleico de la presente invención en general está contenido en una muestra biológica. La muestra biológica incluye tejidos animales, vegetales o microbianos, células, cultivos y excreciones, o extractos de los mismos. La muestra biológica de la presente invención incluye ADN o ARN genómico parasitario intracelular, tal como virus o micoplasma. El ácido nucleico de la presente invención se puede obtener de ácido nucleico contenido en dicha muestra biológica. Por ejemplo, el ADNc sintetizado a partir del ARNm, o el ácido nucleico amplificado basándose en el ácido nucleico obtenido de la muestra biológica, es un ejemplo típico del ácido nucleico de la presente invención.

El ácido nucleico característico de la presente invención que está provisto en su extremo 3' de una región F1 capaz de hibridar con una parte F1c en la misma cadena y el cual tras hibridación de la región F1 con F1c es capaz de formar un bucle que contiene una región F2c capaz de apareamiento de bases, se puede obtener por diferentes procedimientos. En la realización más preferida, se puede usar la reacción de síntesis de la cadena complementaria usando un oligonucleótido que tiene la siguiente estructura, para dar la estructura.

Es decir, el oligonucleótido útil en la presente invención, consiste en al menos dos siguientes regiones X2 y X1c, en el que X1c está unido al lado 5' de X2.

X2: una región que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región X2c en el ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos específica.

X1c: una región que tiene sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que una región X1c situada en el lado 5' de la región X2c en el ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos específica.

Aquí, el ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos específica por la cual se determina la estructura del oligonucleótido de la invención, se refiere al ácido nucleico que sirve como un molde, cuando el oligonucleótido de la presente invención se usa como un cebador. En el caso de que la detección del ácido nucleico se base en el procedimiento de síntesis de la presente invención, el ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos específica es una diana de detección o un ácido nucleico obtenido de la diana de detección. El ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos específica se refiere al ácido nucleico en el que al menos una parte de la secuencia de nucleótidos se desvela o es predecible. La parte de la secuencia de nucleótidos desvelada es la región X2c y la región X1c situada en su lado 5'. Se puede suponer que estas 2 regiones son contiguas o están situadas separadas una de otra. Mediante la relación de posiciones relativas de las dos, se determina el estado de un bucle formado tras la auto-hibridación del ácido nucleico como producto. La distancia entre las dos preferiblemente no es muy separada una de otra, con el fin de que el ácido nucleico como producto se someta a la auto-hibridación preferiblemente frente a la hibridación intermolecular. Por consiguiente, la relación de posiciones de las dos preferiblemente es que están contiguas a una distancia normalmente de 0 a 100 bases. Sin embargo, en la formación de un bucle por auto-hibridación descrito a continuación, puede darse el caso, que sería desventajoso para la formación de un bucle en un estado deseado, de que las dos estén demasiado cerca entre sí. En el bucle, es necesaria una estructura para la hibridación de un oligonucleótido nuevo y para iniciar fácilmente la reacción de desplazamiento de cadena de la síntesis de una cadena complementaria con dicho oligonucleótido como origen de la síntesis. Más preferiblemente, la distancia entre la región X2c y la región X1c situada en el lado 5' de X2c se diseña para que sea entre 0 y 100 bases, más deseablemente de 10 a 70 bases. Este valor numérico muestra una longitud que excluye a X1c y X2. El número de bases que constituyen la parte de un bucle es la de su longitud más una región correspondiente a X2.

Los términos tanto "mismo" como "complementario" usados para la caracterización de la secuencia de nucleótidos que constituye el oligonucleótido basado en la presente invención, no significa que sean totalmente los mismos o absolutamente complementarios. Es decir, la misma secuencia como una determinada secuencia incluye secuencias complementarias de secuencias de nucleótidos capaces de hibridar con una determinada secuencia. Por otra parte, la secuencia complementaria significa una secuencia capaz de hibridar en condiciones restrictivas para dar un extremo 3' que sirve como el origen de la síntesis de la cadena complementaria.

Normalmente, las regiones X2 y X1c que constituyen el oligonucleótido de la presente invención para el ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos específica, están situadas de forma contigua sin estar superpuestas. Si hay una parte común en ambas secuencias de nucleótidos, las dos pueden estar parcialmente superpuestas. Debido a que X2 debe funcionar como un cebador, debe haber siempre un extremo 3'. Por otra parte, X1c debe dar la función de un cebador como se describe a continuación, al extremo 3' de una cadena complementaria sintetizada con el ácido nucleico como molde, y por lo tanto debe estar dispuesta en el extremo 5'. La cadena complementaria obtenida con este oligonucleótido como origen de la síntesis, sirve como molde para la síntesis de la cadena complementaria en la dirección inversa en la siguiente etapa, y finalmente la parte del oligonucleótido de la presente invención se copia como molde en una cadena complementaria. El extremo 3' generado por copia tiene la secuencia de nucleótidos X1, que hibrida con X1c en la misma cadena para formar un bucle.

En la presente invención, el oligonucleótido significa el que satisface los 2 requisitos, es decir, debe poder formar el apareamiento de bases complementarias y dar un grupo -OH que sirva como origen de la síntesis de la cadena complementaria en el extremo 3'. Por consiguiente, su cadena principal no está limitada necesariamente a aquella por uniones fosfodiéster. Por ejemplo, puede estar compuesta de un derivado de fosfotioato que tiene S en lugar de O como cadena principal o un ácido nucleico peptídico basado en enlaces peptídicos. Las bases pueden ser aquellas capaces de apareamiento de bases complementarias. En la naturaleza, hay 5 bases, es decir A, C, T, G y U, pero la base puede ser un análogo tal como bromodesoxiuridina. El oligonucleótido usado en la presente invención funciona preferiblemente no solo como el origen de la síntesis si no también como un molde para la síntesis de la cadena complementaria. El término polinucleótido en la presente invención incluye oligonucleótidos. El término "polinucleótido" se usa en el caso en el que la longitud de cadena no está limitada, mientras que el término "oligonucleótido" se usa para referirse a un polímero de nucleótidos que tiene una longitud de cadena relativamente corta.

El oligonucleótido de acuerdo con la presente invención tiene una longitud de cadena tal que es capaz de dar apareamiento de bases con una cadena complementaria y mantener la especificidad necesaria en el entorno dado en las diferentes reacciones de síntesis de ácidos nucleicos descritas a continuación. Específicamente, está compuesto de 5 a 200 pares de bases, más preferiblemente de 10 a 50 pares de bases. La longitud de la cadena de un cebador que reconoce la polimerasa conocida que cataliza la reacción sintética del ácido nucleico dependiente de la secuencia tiene al menos aproximadamente 5 bases, de modo que la longitud de la cadena de la parte que hibrida debe ser más larga que esto. Además, estadísticamente se desea una longitud de 10 bases o más con el fin de esperar especificidad como secuencia de nucleótidos. Por otra parte, la preparación de una secuencia de nucleótidos demasiado larga por síntesis química es difícil, y por lo tanto la longitud de la cadena descrita antes se ha ilustrado como un intervalo deseado. La longitud de la cadena ilustrada aquí se refiere a la longitud de la cadena de una parte que hibrida con una cadena complementaria. Como se describe a continuación, el oligonucleótido de acuerdo con la presente invención puede hibridar finalmente con al menos 2 regiones individualmente. Por consiguiente, debe entenderse que la longitud de la cadena ilustrada aquí es la longitud de la cadena de cada región que constituye el oligonucleótido.

Además, el oligonucleótido de acuerdo con la presente invención se puede marcar con una sustancia marcadora conocida. La sustancia marcadora incluye ligandos de unión tales como digoxina y biotina, enzimas, sustancias fluorescentes y sustancias luminiscentes, y radioisótopos. Las técnicas de sustitución de una base que compone un oligonucleótido por un análogo fluorescente también se conocen (documento WO95/05391, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 6644-6640, 1994).

Otros oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención, también pueden estar unidos a una fase sólida. Alternativamente, una parte arbitraria del oligonucleótido se puede marcar con un ligando de unión tal como biotina, y se puede inmovilizar indirectamente mediante una pareja de unión tal como avidina inmovilizada. Cuando el oligonucleótido inmovilizado se usa como el origen de la síntesis, el ácido nucleico, como producto de reacción sintético, es capturado por la fase sólida, facilitando así su separación. El producto separado se puede detectar mediante un indicador específico de ácido nucleico o por hibridación con una sonda de marcaje. Los fragmentos de ácido nucleico diana también se pueden recuperar haciendo digerir el producto con enzimas de restricción arbitrarias.

El término "molde" usado en la presente invención significa ácido nucleico que sirve como molde para sintetizar una cadena complementaria. Una cadena complementaria que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de la del molde tiene el significado como el de una cadena que corresponde al molde, pero la relación entre las dos es simplemente relativa. Es decir, una cadena sintetizada como la cadena complementaria puede funcionar otra vez como molde. Es decir, la cadena complementaria puede convertirse en un molde.

El oligonucleótido útil en la presente invención no está limitado a las 2 regiones descritas antes y puede contener una región adicional. Aunque X2 y X1c están dispuestas en los extremos 3' y 5' respectivamente, se puede interponer entre ellas una secuencia arbitraria. Por ejemplo, puede haber un sitio de reconocimiento de enzima de restricción, un promotor reconocido por la ARN polimerasa, o ADN que codifica ribozimas. Usándolo como una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción, el ácido nucleico que tiene una secuencia complementaria alternativamente unida en una cadena monocatenaria, como producto sintético de la presente invención, puede escindirse en ácidos nucleicos bicatenarios de la misma longitud. Mediante la disposición de una secuencia promotora reconocida por la ARN polimerasa, el producto sintético de la presente invención sirve como molde para permitir la posterior transcripción en ARN. Disponiendo además ADN que codifica ribozima, se logra un sistema en el que el producto de transcripción se autoescinde. Estas secuencias de nucleótidos adicionales son las que funcionan después de formadas en una cadena bicatenaria. Por consiguiente, cuando el ácido nucleico monocatenario de acuerdo con la presente invención ha formado un bucle, estas secuencias no funcionan. No funcionan hasta que el ácido nucleico se ha alargado e hibridado en ausencia de un bucle, con una cadena que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria.

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Cuando se combina un promotor con el oligonucleótido basado en la presente invención en una dirección que permita la transcripción de la región sintetizada, el producto de reacción basado en la presente invención en el que se repite la misma secuencia de nucleótidos, logra un sistema de transcripción muy eficaz. Mediante la combinación de este sistema con un sistema de expresión adecuado, también es factible la traducción en una proteína. Es decir, el sistema se puede usar para la transcripción y traducción en proteína en bacterias o células animales o in vitro.

El oligonucleótido de la presente invención que tiene la estructura descrita antes, se puede sintetizar químicamente. Alternativamente, el ácido nucleico se puede escindir, p. ej. con enzimas de restricción, y modificar para que esté compuesto de, o ligado en, la secuencia de nucleótidos descrita antes.

El principio básico de la reacción para llevar a cabo la síntesis usando el oligonucleótido útil descrito antes combinado con la ADN polimerasa que tiene la actividad de desplazamiento de cadena, en la reacción de síntesis del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, se describe con referencia a las figuras 5 a 6. El oligonucleótido descrito antes (primer oligonucleótido, FA en la fig. 5) hibrida en X2 (correspondiente a F2) con el ácido nucleico como molde, para proporcionar el origen de la síntesis de la cadena complementaria. En la fig. 5, una cadena complementaria sintetizada a partir de FA como el origen de la síntesis se desplaza por síntesis de la cadena complementaria (descrita a continuación) a partir de un cebador exterior (primer cebador exterior, F3), para formar una cadena monocatenaria (fig. 5-A). Cuando después se lleva a cabo la síntesis de la cadena complementaria de la cadena complementaria resultante, el extremo 3' del ácido nucleico sintetizado como cadena complementaria en la fig. 5-A tiene una secuencia de nucleótidos complementaria del primer oligonucleótido de la presente invención. Es decir, debido a que el extremo 5' del primer oligonucleótido de la presente invención tiene la misma secuencia que una región X1c (correspondiente a F1c), el extremo 3' del ácido nucleico así sintetizado tiene una secuencia complementaria X1 (F1). La fig. 5 muestra que la cadena complementaria sintetizada a partir del segundo oligonucleótido, R1, como origen de la síntesis se desplaza por la síntesis de la cadena complementaria por el segundo cebador exterior R3 como el origen de la síntesis. Una vez que la parte del extremo 3' está lista para el apareamiento de bases mediante este desplazamiento, X1 (F1) en el extremo 3' hibrida con X1c (F1c) en la misma cadena, y se desarrolla la reacción de alargamiento consigo mismo como molde (Fig. 5-B). Después, X2c (F2c) situada en su extremo 3' se deja como un bucle que no implica apareamiento de bases. X2 (F2) en el primer oligonucleótido de acuerdo con la presente invención, hibrida con este bucle, y se sintetiza una cadena complementaria con dicho primer oligonucleótido como el origen de la síntesis (Fig. 5-B). Un producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria con el producto previamente sintetizado como molde, es desplazado por la reacción de desplazamiento de cadena, de modo que queda listo para el apareamiento de bases.

Mediante la constitución básica usando un tipo de oligonucleótido de acuerdo con la presente descripción y un cebador inverso arbitrario capaz de llevar a cabo la síntesis de ácido nucleico cuando se usa como molde una cadena complementaria sintetizada con dicho oligonucleótido como cebador, se puede obtener una pluralidad de productos sintéticos de ácidos nucleicos como se muestra en la fig. 6. Como puede verse en la fig. 6, (D) es el producto de ácido nucleico deseado de la invención que tiene la secuencia de nucleótidos complementaria alternativamente unida en una cadena monocatenaria. Una vez convertida en una cadena monocatenaria por un tratamiento tal como desnaturalización térmica, el otro producto (E) sirve otra vez como molde para formar (D). Si el producto (D) como ácido nucleico en forma de una cadena bicatenaria se convierte en una cadena monocatenaria por desnaturalización térmica, se produce la hibridación dentro de la misma cadena con una alta probabilidad sin formar la cadena bicatenaria original. Esto se debe a que una cadena complementaria que tiene la misma temperatura de fusión (Tf) experimenta reacción intramolecular de forma preferente frente a la reacción intermolecular. Cada cadena monocatenaria obtenida del producto (D) hibridado en la misma cadena hibrida en la misma cadena y vuelve al estado de (B), y cada cadena además da una molécula de (D) y (E) respectivamente. Repitiendo estas etapas, se puede sintetizar sucesivamente el ácido nucleico que tiene las secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria. El molde y el producto formado en el ciclo 1 aumentan exponencialmente, haciendo así la reacción muy eficaz.

Para lograr el estado de la fig. 5(A), la cadena complementaria inicialmente sintetizada, al menos en la parte en la que el cebador inverso hibrida, debe estar lista para el apareamiento de bases. Esta etapa se puede lograr mediante un procedimiento arbitrario. Es decir, se prepara por separado un primer cebador exterior (F3), que hibrida con el primer molde en una región F3c en el lado 3' de la región F2c en la que el primer oligonucleótido de la presente invención hibrida. Si este primer cebador se usa como el origen de la síntesis para sintetizar una cadena complementaria mediante una polimerasa que cataliza la síntesis de tipo desplazamiento de cadena de la cadena complementaria, la cadena complementaria sintetizada a partir de F2c como el origen de la síntesis en la invención se desplaza, y como resultado la región R1c que se va a hibridar con R1 se prepara para que este lista para el apareamiento de bases (Fig. 5). Usando la reacción de desplazamiento de cadena, la reacción hasta ahora puede transcurrir en condiciones isotérmicas.

Cuando se usa un cebador exterior, la síntesis a partir del cebador exterior (F3) debe iniciarse después de la síntesis a partir de F2c. En el procedimiento más sencillo, la concentración del cebador interior se hace mayor que la concentración del cebador exterior. Específicamente, los cebadores se usan normalmente con una diferencia de concentración de 2 a 50 veces, preferiblemente de 4 a 10 veces, de modo que la reacción pueda transcurrir como se espera. Además, la temperatura de fusión (Tf) del cebador exterior se fija para que sea menor que la Tf de X1 (correspondiente a F1 y R1) en el cebador interior, de modo que pueda controlarse el tiempo de la síntesis. Es decir, (cebador exterior F3:F3c) \leq (F2c/F2) \leq (F1c/F1) o (cebador exterior /región en el lado 3' en el molde) \leq (X2c:X2) \leq (X1c:X1). Aquí, la razón para (F2c/F2) \leq (F1c/F1) es para que se de la hibridación entre F1c/F1 antes que la hibridación de F2 con el bucle. La hibridación entre F1c/F1 es una reacción intramolecular y por lo tanto puede transcurrir de forma preferente con probabilidad alta. Sin embargo, es significativo considerar la Tf con el fin de dar condiciones de reacción más convenientes. Normalmente, deben considerarse condiciones similares incluso en el diseño de un cebador inverso. Usando dicha relación, se pueden lograr condiciones de reacción estadísticamente ideales. Si se fijan otras condiciones, la temperatura de fusión (Tf) se puede calcular teóricamente mediante una combinación de la longitud de una cadena complementaria de hibridación y las bases que constituyen el apareamiento de bases. Por consiguiente, los expertos en la materia pueden obtener las condiciones preferidas basándose en la descripción de esta memoria descriptiva.

Además, también se puede aplicar el fenómeno llamado apilamiento contiguo para controlar el momento de la hibridación del cebador exterior. El apilamiento contiguo es un fenómeno en el que un oligonucleótido que no es capaz de hibridar independientemente, se hace que sea capaz de hibridación después de ser contiguo a la parte de la cadena bicatenaria (Chiara Borghesi-Nicoletti y col., Bio Techniques, 12, 474-477 (1992)). Es decir, el cebador exterior se diseña para que sea contiguo a F2c (X2c) y que no sea capaz de hibridar de forma independiente. Haciendo esto, no se produce la hibridación del cebador exterior hasta que no hibrida F2c (X2c), y así ocurre de forma preferente la hibridación de F2c (X2c). Basándose en este principio, los ejemplos muestran el ajuste de la secuencia de nucleótidos de un oligonucleótido necesario como un cebador para una serie de reacciones. Esta etapa también puede lograrse por desnaturalización con calor o con una ADN helicasa.

Si el ácido nucleico molde que tiene F2c (X2c) es ARN, el estado de la Fig. 5-(A) también se puede lograr por un procedimiento diferente. Por ejemplo, si esta cadena de ARN se descompone, R1 queda lista para el apareamiento de bases. Es decir, F2 hibrida con F2c en el ARN y se sintetiza una cadena complementaria como ADN mediante una transcriptasa inversa. El ARN que sirve como molde se descompone por desnaturalización con álcali o por tratamiento enzimático con una ribonucleasa que actúa sobre el ARN en una cadena bicatenaria de ADN/ARN de modo que el ADN sintetizado a partir de F2 se forma en una cadena monocatenaria. Para que la enzima descomponga selectivamente el ARN en una cadena bicatenaria de ADN/ARN, se puede usar la actividad de ribonucleasa de la RNasa H o algunas transcriptasas inversas. De esta forma, el cebador inverso puede hibridar con R1c que es capaz de apareamiento de bases. Por consiguiente, se hace innecesario el cebador exterior para hacer que R1c esté listo para el apareamiento de bases.

Alternativamente, se puede usar la actividad de desplazamiento de cadena de la transcriptasa inversa para el desplazamiento de cadena mediante un cebador exterior como se ha descrito antes. En este caso, se puede constituir un sistema de reacción mediante una transcriptasa inversa solo. Es decir, usando el ARN como molde, mediante una transcriptasa inversa se puede sintetizar una cadena complementaria a partir de F2 que hibrida con F2c en el molde, y sintetizar una cadena complementaria a partir del cebador exterior F3 como el origen de la síntesis que hibrida con F3c situada en el lado 3' de F2c, y simultáneamente desplazar la cadena complementaria previamente sintetizada. Cuando la transcriptasa inversa lleva a cabo la reacción de síntesis de una cadena complementaria con ADN como molde, todas las reacciones de síntesis de cadenas complementarias, incluyendo la síntesis de una cadena complementaria con R1 como el origen de la síntesis que hibrida con R1c en la cadena complementaria desplazada como molde, la síntesis de una cadena complementaria con R3 como el origen de la síntesis que hibrida con R3c situada en el lado 3' de R1c y la reacción de desplazamiento simultánea, transcurren por la transcriptasa inversa. No puede esperarse que la transcriptasa inversa presente la actividad de desplazamiento de cadena de ADN/ARN en las condiciones de reacción dadas, y se puede combinar una ADN polimerasa que tenga la actividad de desplazamiento de cadena descrita antes. El modo de obtener un primer ácido nucleico monocatenario con ARN como molde como se ha descrito antes, constituye un modo preferido de la presente invención. Por otra parte, si se usa una ADN polimerasa tal como la ADN polimerasa Bca que tiene tanto actividad de desplazamiento de cadena como actividad de transcriptasa inversa, no solo la síntesis de un primer ácido nucleico monocatenario a partir de ARN, si no también la posterior reacción con ADN como molde, pueden transcurrir de forma similar por la misma enzima.

El sistema de reacción descrito antes implica diferentes variaciones inherentes en la presente invención usando el cebador inverso que tiene una estructura específica. La variación más eficaz se describe a continuación. Es decir, el oligonucleótido constituido como se ha descrito en [5] se usa como el cebador inverso en el modo más ventajoso de la presente invención. El oligonucleótido en [5] es un oligonucleótido en el que las regiones arbitrarias R2c y R1c en una cadena complementaria sintetizada con F2 como un cebador, son X2c y X1c, respectivamente. Mediante el uso de dicho cebador inverso, ocurren una serie de reacciones para formar un bucle y para sintetizar y desplazar una cadena complementaria de este bucle, tanto en la cadena homosentido como en la antisentido (lado directo y lado inverso). Como resultado, la eficacia de la reacción para la síntesis del ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos complementarias alternativamente unidas en una cadena monocatenaria de acuerdo con la presente invención, mejora mucho a la vez que una serie de estas reacciones es practicable en condiciones isotérmicas. En lo sucesivo, este modo se describe con más detalle con referencia a las figuras 1 a 3 en las que se resume este modo.

En el siguiente modo, se preparan 2 tipos de oligonucleótidos basados en la presente invención. Para la explicación, estos se denominan FA y RA. Las regiones que constituyen FA y RA son las siguientes:

	X2	X1c

FA	F2	F1c

RA	R2	R1c

Aquí, F2 es una secuencia de nucleótidos complementaria de una región F2c en el ácido nucleico como el molde. R2 es una secuencia de nucleótidos complementaria de una región R2c arbitraria contenida en una cadena complementaria sintetizada con F2 como cebador. F1c y R1c son secuencias de nucleótidos arbitrarias situadas secuencia abajo de F2c y R2c, respectivamente. La distancia entre F2 y R2 puede ser arbitraria. Incluso si su longitud es aproximadamente 1 kpb, es factible la síntesis suficiente en condiciones adecuadas, aunque dependiendo de la capacidad sintética de la ADN polimerasa para realizar la síntesis de una cadena complementaria. Específicamente, cuando se usa la ADN polimerasa Bst, el producto deseado es sintetizado con certeza si la distancia entre F2 y R2c es 800 pb, preferiblemente 500 pb o menos. En el ciclo de temperatura que implica la PCR, la reducción en la actividad de la enzima por el estrés del cambio de temperatura se considera que reduce la eficacia de la síntesis de una secuencia de nucleótidos larga. En un modo preferido de la presente invención, no se requiere el ciclo de temperatura en la etapa de amplificación del ácido nucleico, y así la síntesis y amplificación de una secuencia de nucleótidos incluso larga se puede lograr con certeza.

Primero, F2 en FA hibrida con el ácido nucleico como molde y se usa como el origen de la síntesis de una cadena complementaria. Las posteriores etapas de reacción hasta la Fig. 1(4) son las mismas que las descritas previamente en el modo básico (Fig. 5) en la presente invención. La secuencia hibridada como F3 en la Fig. 1(2) es el primer cebador exterior descrito antes. Se usa una ADN polimerasa para llevar a cabo la síntesis de tipo desplazamiento de cadena de una cadena complementaria con este cebador como el origen de la síntesis, de modo que la cadena complementaria sintetizada a partir de FA se desplaza y queda lista para el apareamiento de bases.

Cuando R2c está lista para el apareamiento de bases en (4), el segundo oligonucleótido RA como cebador inverso hibrida en el mismo en la combinación R2c/R2. La síntesis de una cadena complementaria con este sitio como el origen de la síntesis transcurre hasta que la cadena llega a F1c en el extremo 5' de FA. Después de esta reacción de síntesis de una cadena complementaria, el segundo cebador exterior R3 para el desplazamiento hibrida en la misma para sintetizar una cadena complementaria, durante la cual el desplazamiento de cadena también transcurre de modo que la cadena complementaria sintetizada a partir de RA como el origen de la síntesis se desplaza. En la cadena complementaria así desplazada, RA está situada en su lado 5' y una secuencia complementaria de FA está situada en su extremo 3'.

En el lado 3' del ácido nucleico monocatenario así desplazado, hay una secuencia F1 complementaria de F1c en la misma cadena. F1 hibrida rápidamente con F1c en la misma molécula para iniciar la síntesis de una cadena complementaria. Cuando el extremo 3' (F1) hibrida con F1c en la misma cadena, se forma un bucle que contiene F2c. Como es evidente a partir de las Fig. 2-(7), la parte de este bucle permanece lista para el apareamiento de bases. El primer oligonucleótido FA de la invención que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de F2c hibrida con la parte de este bucle y actúa como el origen de la síntesis de una cadena complementaria (7). La síntesis de una cadena complementaria a partir del bucle transcurre a la vez que se desplaza el producto de reacción en la síntesis de la cadena complementaria previamente iniciada a partir de F1. Como resultado, la cadena complementaria sintetizada consigo misma como molde se prepara para el apareamiento de bases otra vez en el extremo 3'. Este extremo 3' está provisto de una región R1 capaz de hibridar con R1c en la misma cadena, e hibridan con preferencia las dos debido a la rápida reacción intramolecular. La misma reacción que la reacción descrita antes partiendo del extremo 3' sintetizado con FA como molde también transcurre en esta región. Como resultado, el ácido nucleico que tiene las secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente en la misma cadena monocatenaria de acuerdo con la presente invención, continua extendiéndose a partir de R1 como el punto de partida en el extremo 3', mediante la síntesis sucesiva de una cadena complementaria y su posterior desplazamiento. Debido a que R2c está siempre contenida en el bucle formado por la hibridación intramolecular de R1 del extremo 3', el segundo oligonucleótido (RA) provisto de R2 hibrida con el bucle en el extremo 3' en la posterior reacción.

Cuando se presta atención al ácido nucleico sintetizado como cadena complementaria a partir del oligonucleótido que hibrida con el bucle en el ácido nucleico monocatenario alargado consigo mismo como molde, también transcurre la síntesis del ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente en la cadena monocatenaria de acuerdo con la presente invención. Es decir, la síntesis de una cadena complementaria a partir del bucle se completa cuando alcanza RA, p. ej., en la Fig. 2-(7). Después, cuando el ácido nucleico desplazado por esta síntesis de ácido nucleico inicia la síntesis de la cadena complementaria (Fig. 3-(8)), la reacción alcanza el bucle que era antes el origen de la síntesis, y se vuelve a iniciar el desplazamiento. De esta forma, el ácido nucleico que se ha empezado a sintetizar a partir del bucle también se desplaza, y como resultado, se obtiene R1 del extremo 3' capaz de hibridar en la misma cadena (Fig. 3-(10)). Esta R1 del extremo 3' hibrida con R1c en la misma cadena para iniciar la síntesis de la cadena complementaria. Esta reacción es la misma que en la Fig. 2-(7), excepto que se usa F en lugar de R. Por consiguiente, la estructura mostrada en la Fig. 3-(10) puede funcionar como un nuevo ácido nucleico que continúa el propio alargamiento y formación de nuevo ácido nucleico.

La reacción de síntesis del ácido nucleico, iniciada a partir del ácido nucleico mostrado en la Fig. 3-(10), produce el alargamiento a partir de F1 del extremo 3' como origen de la síntesis, en contraposición con la reacción descrita antes. Es decir, en la presente invención, cuando un ácido nucleico se alarga, prosigue la reacción de seguir suministrando un ácido nucleico nuevo que inicia el alargamiento por separado. Además, cuando se alarga la cadena, da lugar a una pluralidad de secuencias formadoras de bucle no sólo en el extremo si no también en la misma cadena. Cuando estas secuencias formadoras de bucle están listas para el apareamiento de bases por la reacción sintética de desplazamiento de cadena, un oligonucleótido hibrida en la misma para servir como una base para la reacción de formación de un ácido nucleico nuevo. Además, se logra una amplificación eficaz por la reacción sintética empezando no sólo en el extremo si no también en la cadena. El segundo oligonucleótido RA basado en la presente invención se combina como cebador inverso como se ha descrito antes, de modo que se produce el alargamiento y posterior formación de un ácido nucleico nuevo. Además, en la presente invención, el propio ácido nucleico recién formado se alarga y da lugar a la posterior formación de un nuevo ácido nucleico. Continúa una serie de estas reacciones teóricamente de forma permanente para lograr una amplificación muy eficaz del ácido nucleico. Además, la reacción en la presente invención, se puede llevar a cabo en condiciones isotérmicas.

Los productos de reacción así acumulados tienen una estructura que tiene una secuencia de nucleótidos entre F1 y R1 y su secuencia complementaria unidas alternativamente en la misma. Sin embargo, ambos extremos de la unidad que se repite tienen una región que consiste en la secuencia de nucleótidos sucesiva F2-F1 (F2c-F1c) y R2-R1 (R2c-R1c). Por ejemplo, en la Fig. 3-(9), las secuencias (R2-F2c)-(F1-R2c)-(R1-F1c)-(F2-R2c) están unidas en este orden desde el lado 5'. Esto se debe a que la reacción de amplificación basada en la presente invención transcurre según el principio de que la reacción se inicia a partir de F2 (o R2) con un oligonucleótido como el origen de la síntesis y después se alarga una cadena complementaria por la reacción sintética a partir de F1 (o R1) con el extremo 3' como el origen de la síntesis.

Aquí, en el modo más preferido, se usaron los oligonucleótidos FA y RA de acuerdo con la presente invención como oligonucleótidos que hibridan con la parte de un bucle. Sin embargo, incluso si no se usan estos oligonucleótidos que tienen una estructura limitada, la reacción de amplificación de acuerdo con la presente invención se puede llevar a cabo usando un oligonucleótido capaz de iniciar la síntesis de una cadena complementaria a partir del bucle. Es decir, el alargamiento del extremo 3', una vez desplazado por una cadena complementaria sintetizada a partir del bucle, da la parte de un bucle otra vez. Debido a que el ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria siempre se usa como molde en la síntesis de cadena complementaria partiendo del bucle, es evidente que se puede sintetizar el ácido nucleico deseado en la presente invención. Sin embargo, el ácido nucleico así sintetizado realiza la síntesis de una cadena complementaria formando un bucle después de desplazamiento, pero no hay extremo 3' disponible para la posterior formación de un bucle, y por lo tanto no puede funcionar como un nuevo molde. Por consiguiente, en este caso, el producto, a diferencia del ácido nucleico que se empieza a sintetizar por FA o RA, no puede esperarse que se amplifique exponencialmente. Por esta razón, un oligonucleótido que tiene la estructura de FA o RA es útil para una síntesis muy eficaz de ácido nucleico basado en la presente invención.

Una serie de estas reacciones transcurren por adición de los siguientes componentes al ácido nucleico monocatenario como molde y después incubando la mezcla a una temperatura tal que la secuencia de nucleótidos que constituyen FA y RA puede formar apareamiento de bases estable con su secuencia de nucleótidos complementaria a la vez que se puede mantener la actividad enzimática.

- 4 tipos de oligonucleótidos:

\quad: FA, (primer oligonucleótido)

\quad: RA, (segundo oligonucleótido)

\quad: primer cebador exterior F3, y

\quad: segundo cebador exterior R3,

- ADN polimerasa para realizar la síntesis de tipo desplazamiento de cadena, de la cadena complementaria,

- un oligonucleótido que sirve como sustrato para la ADN polimerasa.

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Por consiguiente, no se necesario el ciclo de temperatura como en la PCR. El apareamiento de bases estable al que se hace referencia en el presente documento, se refiere a un estado en el que al menos una parte de un oligonucleótido presente en el sistema de reacción, puede dar el origen de la síntesis de la cadena complementaria. Por ejemplo, la condición deseada para producir el apareamiento de bases estable es fijarla a menor temperatura que la temperatura de fusión (Tf). En general, la temperatura de fusión (Tf) se considera la temperatura a la que 50% de los ácidos nucleicos que tienen secuencias de nucleótidos mutuamente complementarias están apareadas por bases. El ajuste a la temperatura de fusión (Tf) o menor, no es una condición esencial en la presente invención, pero es una de las condiciones de reacción que hay que considerar para alcanzar una alta eficacia en la síntesis. Si el ácido nucleico que se va a usar como molde es una cadena bicatenaria, el ácido nucleico debe prepararse, al menos en la región con la que hibrida el oligonucleótido, para el apareamiento de bases. Para esto, en general se lleva a cabo la desnaturalización térmica, y esto se puede llevar a cabo solo una vez como tratamiento previo antes de iniciar la reacción.

Esta reacción se lleva a cabo en presencia de un tampón que da un pH adecuado a la reacción enzimática, sales necesarias para la hibridación o para mantener la actividad catalítica de la enzima, un agente de protección para la enzima y si es necesario, un regulador para la temperatura de fusión (Tf). Como tampón se puede usar, p. ej. Tris-HCl que tiene una acción de tamponamiento en un intervalo de neutro a ligeramente alcalino. El pH se ajusta dependiendo de la ADN polimerasa usada. Como sales, se añaden de forma adecuada KCl, NaCl, (NH_{4})_{2}SO_{4} etc. para mantener la actividad de la enzima y regular la temperatura de fusión (Tf) del ácido nucleico. El agente protector para la enzima usa albúmina de suero bovino o azúcares. Además, en general se usa dimetilsulfóxido (DMSO) o formamida como regulador de la temperatura de fusión (Tf). Mediante el uso del regulador de la temperatura de fusión (Tf), se puede regular la hibridación del oligonucleótido en condiciones de temperatura limitadas. Además, la betaína (N,N,N-trimetilglicina) o una sal de tetralquilamonio, también son eficaces para mejorar la eficacia del desplazamiento de la cadena, en virtud de su isoestabilización. Mediante la adición de betaína en una cantidad de 0,2 a 3,03 M, preferiblemente 0,5 a 1,5 M a la disolución de la reacción, se puede esperar su acción promotora en la amplificación del ácido nucleico de la presente invención. Debido a que estos reguladores de la temperatura de fusión actúan para reducir la temperatura de fusión, estas condiciones que dan una restricción y reactividad adecuadas, se determinan empíricamente considerando la concentración de sales, la temperatura de reacción, etc.

Una característica importante de la presente invención es que una serie de reacciones no se producen salvo que se mantenga la relación de posiciones de una pluralidad de regiones. Mediante esta característica, se previene de forma eficaz la reacción sintética inespecífica acompañada de síntesis inespecífica de cadena complementaria. Es decir, incluso aunque se de algo de reacción inespecífica, se minimiza la posibilidad de que el producto sirva como material de partida en la siguiente etapa de amplificación. Además, la regulación del transcurso de las reacciones mediante muchas regiones da lugar a la posibilidad de que se pueda constituir arbitrariamente un sistema de detección capaz de identificación estricta del producto deseado en secuencias de nucleótidos análogas.

Esta característica se puede usar para detectar mutaciones en un gen. En el modo de la invención en el que se usa el cebador exterior, se usan 4 cebadores, es decir, 2 cebadores exteriores y 2 cebadores que consisten en los oligonucleótidos de la presente invención. Es decir, salvo que las 6 regiones contenidas en los 4 nucleótidos trabajen como se ha diseñado, la reacción sintética de la presente invención no avanza. En particular, son importantes las secuencias del extremo 3' de cada oligonucleótido como origen de la síntesis de la cadena complementaria y el extremo 5' de la región X1c cuando la cadena complementaria sirve como origen de la síntesis. Por lo tanto, estas secuencias importantes se diseñan para que correspondan a una mutación que se va a detectar y el producto de reacción sintético de la presente invención se observa de forma que se puede analizar exhaustivamente la presencia o ausencia de una mutación, tal como una deleción o inserción de base, o polimorfismo genético tal como SNP. Específicamente, se diseñan bases que se cree que tienen una mutación o polimorfismo, de forma que correspondan a la proximidad del extremo 3' de un oligonucleótido como el origen de la síntesis de la cadena complementaria, o su extremo 5', cuando una cadena complementaria es el origen de la síntesis. Si hay un apareamiento erróneo en el extremo 3' como origen de la síntesis de la cadena complementaria o en su proximidad, la reacción de síntesis de la cadena complementaria del ácido nucleico se inhibe significativamente. En la presente invención, no se logra un alto grado de reacción de amplificación salvo que la estructura de los extremos de un producto en la reacción inicial de lugar a reacciones repetidas. Por consiguiente, incluso aunque se produzca síntesis errónea, la síntesis de la cadena complementaria que constituye la reacción de amplificación es interrumpida siempre en alguna de las etapas, y así no se produce un grado alto de reacción de amplificación en presencia de un apareamiento erróneo. Como resultado, el apareamiento erróneo inhibe eficazmente la reacción de amplificación, y da lugar finalmente a un resultado preciso. Es decir, se puede decir que la reacción de amplificación del ácido nucleico basado en la presente invención, tiene un mecanismo muy completo para comprobar la secuencia de nucleótidos. Estas características son una ventaja que difícilmente se pueden esperar, por ejemplo, en el procedimiento de la PCR en el que la reacción de amplificación se lleva a cabo en solo 2 regiones.

La región X1c que caracteriza el oligonucleótido usado en la presente invención, puede servir como el origen de la síntesis después de sintetizar una secuencia complementaria, y esta secuencia complementaria hibrida con la secuencia X1 en la misma cadena recién sintetizada, de modo que se produce la reacción sintética consigo misma como molde. Por lo tanto, incluso si se forma el llamado dímero del cebador, que a menudo es problemático en la técnica anterior, este oligonucléotido no forma un bucle. Por consiguiente, la amplificación inespecífica atribuible al dímero del cebador teóricamente no puede ocurrir, y así el presente oligonucleótido contribuye a una mejora en la especificidad de la reacción.

Además, los cebadores exteriores mostrados como F3 (Fig. 1-(2)) o R3 (Fig. 2-(5)) se combinan de modo que la serie de reacciones descritas antes se pueden llevar a cabo en condiciones isotérmicas. Es decir, la presente invención proporciona un procedimiento de amplificación de ácido nucleico que tiene secuencias complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria, que comprende las etapas mostradas en el artículo 9 anterior. En este procedimiento, se seleccionan las condiciones de temperatura en las que se produce hibridación estable entre F2c/F2, entre R2c/R2, entre F1c/F1 y entre R1c/R1, y preferiblemente se fijan para que F3c/F3 y R3c/R3 hibriden por el fenómeno del apilamiento contiguo facilitado por la hibridación de F2c/F2 y R2c/R2, respectivamente.

En la presente invención, se usan los términos "síntesis" y "amplificación" del ácido nucleico. La síntesis de ácido nucleico en la presente invención significa el alargamiento del ácido nucleico a partir de un oligonucleótido que sirve como el origen de la síntesis. Si no solo se produce esta síntesis si no también la formación de otro ácido nucleico y la reacción de alargamiento de este ácido nucleico formado se produce de forma continua, una serie de estas reacciones se llama comprensivamente amplificación.

El ácido nucleico monocatenario que está provisto en su extremo 3' de una región F1 capaz de hibridación con una parte F1c en la misma cadena y que tras hibridación de la región F1 con F1c en la misma cadena, es capaz de formar un bucle que contiene una región F2c capaz de apareamiento de bases, es un elemento importante de la presente invención. Dicho ácido nucleico monocatenario también se puede proporcionar según el siguiente principio. Es decir, se deja avanzar la síntesis de una cadena complementaria basándose en un cebador que tiene la siguiente estructura. 5'-[región X1 que hibrida con la región X1c situada en el cebador]-[secuencia formadora de bucle lista para el apareamiento de bases]-[región X1c]-[región que tiene una secuencia complementaria de un
molde]-3'.

Como región que tiene una secuencia complementaria de un molde, se preparan dos secuencias de nucleótidos, es decir, una secuencia de nucleótidos (cebador FA) complementaria de F1 y una secuencia (cebador RA) complementaria de R1c. La secuencia de nucleótidos que constituye el ácido nucleico que se va a sintetizar contiene una secuencia de nucleótidos que se extiende desde la región F1 a la región R1c y una secuencia de nucleótidos que se extiende desde la región R1 que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de esta secuencia de nucleótidos de la región F1c. X1c y X1 capaces de hibridar en el interior del cebador, pueden ser secuencias arbitrarias. Sin embargo, en una región entre los cebadores FA y RF, la secuencia de la región X1c/X1 preferiblemente se hace diferente.

Primero, se lleva a cabo la síntesis de una cadena complementaria mediante el cebador FA a partir de la región F1 en el ácido nucleico molde. Después, la región R1c en la cadena complementaria sintetizada se prepara para el apareamiento de bases, con la que hibrida el otro cebador para formar el origen de la síntesis de la cadena complementaria. El extremo 3' de la cadena complementaria sintetizada en esta etapa tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de la del cebador FA que constituye el extremo 5' de la cadena inicialmente sintetizada, por lo que se ha provisto en su extremo 3' de la región X1 que hibrida con la región X1c en la misma cadena para formar un bucle. Así se proporciona estructura del extremo 3' característica de acuerdo con la presente invención, y la posterior reacción constituye el sistema de reacción mostrado previamente como el modo más preferido. El oligonucleótido que hibrida con la parte del bucle está provisto en su extremo 3' de la región X2 complementaria de la región X2c situada en el bucle y su extremo 5' de la región X1. En el sistema de reacción previo, los cebadores FA y RA se usaron para sintetizar una cadena complementaria del ácido nucleico molde, dando así una estructura de bucle al extremo 3' del ácido nucleico. En este procedimiento, la estructura terminal característica de la presente invención se proporciona mediante cebadores cortos. Por otra parte, en este modo, el conjunto de una secuencia de nucleótidos que constituye un bucle se proporciona como cebador, y es necesaria la síntesis de este cebador
más largo.

Si se usa una secuencia de nucleótidos que contiene regiones de reconocimiento de enzimas de restricción como cebador inverso, se puede constituir un modo diferente de acuerdo con la presente invención. La reacción con un cebador inverso que contiene una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción se describe específicamente con referencia a la Fig. 6. Cuando se ha completado la Fig. 6-(D), se genera una mella mediante una enzima de restricción correspondiente a un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción en el cebador inverso. La reacción de tipo desplazamiento de cadena de la cadena complementaria que se sintetiza se inicia a partir de esta mella como el origen de la síntesis. Debido a que los cebadores inversos están situados en ambos extremos de un ácido nucleico bicatenario que constituye (D), la reacción de síntesis de la cadena complementaria también se inicia a partir de ambos extremos. Aunque se basa básicamente en el procedimiento de SDA descrito en la técnica anterior, la secuencia de nucleótidos que sirve como molde tiene una estructura que tiene secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente, de modo que se constituye el sistema de síntesis de ácido nucleico único de la presente invención. Debe diseñarse una parte que sirva como una cadena complementaria del cebador inverso para formar la mella para incorporar un derivado de dNTP de modo que se haga resistente a la nucleasa para prevenir la escisión de la cadena bicatenaria por la enzima de restricción.

También se puede insertar un promotor para la ARN polimerasa en el cebador inverso. La transcripción a partir de ambos extremos en la Fig. 6-(D) se realiza mediante una ARN polimerasa que reconoce este promotor en este caso demasiado similar al modo previo en el que se aplicaba el procedimiento de SDA.

El ácido nucleico sintetizado es una cadena monocatenaria, pero está compuesto de secuencias complementarias parciales, y por lo tanto la mayoría de estas secuencias están apareadas por bases. Mediante el uso de esta característica, se puede detectar el producto sintetizado. Llevando a cabo el procedimiento de síntesis de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, en presencia de un pigmento fluorescente como un intercalante específico de cadena bicatenaria tal como bromuro de etidio, verde I de SYBR o PicoGreen, se observa una densidad mayor de fluorescencia al aumentar el producto. Mediante su seguimiento, se puede trazar la reacción de síntesis en tiempo real en un sistema cerrado. También se ha considerado la aplicación de este tipo de sistema de detección al procedimiento de la PCR, pero se cree que hay muchos problemas porque la señal del producto no puede distinguirse de las señales de dímeros de cebadores etc. Sin embargo, cuando este sistema se aplica a esta invención, la posibilidad de apareamiento de bases inespecífico creciente es muy bajo, y por lo tanto se pueden esperar simultáneamente alta sensibilidad y ruido bajo. Al igual que el uso del intercalante específico de cadena bicatenaria, se puede usar la transferencia de energía de fluorescencia para un procedimiento de realizar un sistema de detección en un sistema uniforme.

El procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico está soportado por la ADN polimerasa que cataliza la reacción de tipo desplazamiento de cadena para la síntesis de la cadena complementaria. Durante la reacción descrita antes, también está incluida una etapa de reacción que no requiere necesariamente la polimerasa de tipo desplazamiento de cadena. Sin embargo, para simplificar en un reactivo constitucional y desde un punto de vista económico, se ventajoso usar un tipo de ADN polimerasa. De este tipo de ADN polimerasa se conocen las siguientes enzimas. Además, se pueden usar varios mutantes de estas enzimas en la presente invención, siempre que tengan tanto la actividad dependiente de la secuencia para la síntesis de la cadena complementaria como la actividad de desplazamiento de cadena. Los mutantes a los que se hace referencia en el presente documento, incluyen los que tienen solo una estructura que da lugar a la actividad catalítica requerida de la enzima, o aquellos con modificaciones de la actividad catalítica, estabilidad o termoestabilidad, por ejemplo, mutaciones en aminoácidos.

ADN polimerasa Bst

(exo-)ADN polimerasa Bca

fragmento Klenow de la ADN polimerasa I

ADN polimerasa Vent

(exo-)ADN polimerasa Vent (ADN polimerasa Vent deficiente en actividad de exonucleasa)

ADN polimerasa Deep Vent

(exo-)ADN polimerasa Deep Vent (ADN polimerasa Deep Vent deficiente en actividad de exonuclasa)

ADN polimerasa de fago \phi29

ADN polimerasa de fago MS-2

ADN polimerasa de Z-Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.)

ADN polimerasa de KOD (Toyobo Co., Ltd.)

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Entre estas enzimas, la ADN polimerasa Bst y la (exo-)ADN polimerasa Bca son enzimas particularmente convenientes porque tienen un cierto grado de termoestabilidad y alta actividad catalítica. La reacción de esta invención se puede llevar a cabo de forma isotérmica en una realización preferida, pero debido al ajuste de la temperatura de fusión (Tf) etc., no siempre es posible usar condiciones de temperatura deseadas para la estabilidad de la enzima. Por consiguiente, una de las condiciones deseadas es que la enzima sea termoestable. Aunque la reacción isotérmica es factible, se puede llevar a cabo la desnaturalización térmica para proporcionar el ácido nucleico como un primer molde, y con respecto a esto también, el uso de una enzima termoestable amplía la selección del protocolo de ensayo.

La (exo-)ADN polimerasa Vent es una enzima que tiene tanto actividad de desplazamiento de cadena como un grado alto de termoestabilidad. Se sabe que la reacción de síntesis de la cadena complementaria que implica el desplazamiento de la cadena por la ADN polimerasa, es promovida por la adición de una proteína de unión a una cadena (Paul M. Lizardi y col., Nature Genetics, 19, 225-232, Julio, 1998). Esta acción se aplica a la presente invención, y mediante la adición de la proteína de unión a una cadena, se puede esperar el efecto de promoción de la síntesis de la cadena complementaria. Por ejemplo, el gen 32 de T4 es eficaz como una proteína de unión de una cadena para la (exo-)ADN polimerasa Vent.

Para la ADN polimerasa que no tiene actividad de exonucleasa 3'-5', hay un fenómeno conocido en el que la síntesis de la cadena complementaria no para en el extremo 5' de un molde, dando como resultado la generación de un saliente de una base. En la presente invención, este fenómeno no es preferido porque cuando la síntesis de la cadena complementaria alcanza el extremo, la secuencia del extremo 3' lleva al inicio de la siguiente síntesis de la cadena complementaria. Sin embargo, puesto que hay una alta probabilidad de que la ADN polimerasa añada una base "A" al extremo 3', la secuencia se puede seleccionar de modo que la síntesis a partir del extremo 3' empiece en "A", de modo que no haya problema si la dATP añade una base adicional erróneamente. Además, incluso si el extremo 3' sobresale durante la síntesis de la cadena complementaria, se puede usar la actividad de exonucleasa 3'\rightarrow5' para digerir el extremo saliente para hacerlo un extremo romo. Por ejemplo, puesto que la ADN polimerasa Vent natural tiene esta actividad,
esta enzima se puede usar como una mezcla con la (exo-)ADN polimerasa Vent con el fin de resolver este problema.

Los diferentes reactivos necesarios para el procedimiento de la invención de síntesis o amplificación de ácido nucleico, se pueden empaquetar previamente y proporcionar en forma de un kit. Específicamente, se proporciona un kit para la presente invención, que comprende diferentes tipos de oligonucleótidos necesarios como cebadores para la síntesis de la cadena complementaria y como cebadores exteriores para el desplazamiento, dNTP como sustrato para la síntesis de la cadena complementaria, una ADN polimerasa para llevar a cabo la síntesis de tipo desplazamiento de cadena de la cadena complementaria, un tampón que da las condiciones adecuadas para la reacción enzimática, y si es necesario, reactivos para la detección de los productos de la reacción de síntesis. En particular, la adición de reactivos es necesaria durante la reacción en un modo preferido de la presente invención, y por lo tanto los reactivos necesarios para una reacción se suministran después de añadirlos con pipeta en el recipiente de reacción, de modo que la reacción puede iniciarse por la adición de sólo una muestra. Mediante la constitución de un sistema en el que el producto de reacción se pueda detectar in situ en un recipiente de reacción usando una señal luminiscente o una señal fluorescente, no es necesario abrir y cerrar el recipiente después de la reacción. Esto es muy conveniente para prevenir la contaminación.

El ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria, sintetizado de acuerdo con la presente invención tiene, por ejemplo, la siguiente utilidad. La primera característica que se usa como una ventaja resulta de la estructura especial que tienen las secuencias complementarias en una molécula. Se puede esperar que dicha característica facilite la detección. Es decir, hay un sistema conocido para detectar ácido nucleico en el que su señal varía dependiendo del apareamiento de bases con una secuencia de nucleótidos complementaria. Por ejemplo, mediante la combinación con el procedimiento de usar un intercalante específico de cadena bicatenaria como detector como se ha descrito antes, se puede lograr un sistema de detección que hace uso completo de las características del producto sintético de la presente invención. Si el producto de la reacción de síntesis de la presente invención se desnaturaliza con calor una vez en dicho sistema de detección y se devuelve a la temperatura original, se produce la hibridación intramolecular con preferencia, permitiendo así que las secuencias complementarias produzcan el apareamiento de bases rápidamente. Si hay productos de reacción inespecíficos, no tienen secuencias complementarias en la molécula, de modo que después de separarlos por desnaturalización en 2 o más moléculas, no pueden volver inmediatamente a la cadena bicatenaria original. Al proporcionar la etapa de desnaturalización térmica antes de la detección, se pueden reducir los ruidos que acompañan a la reacción inespecífica. Si se usa la ADN polimerasa no resistente al calor, la etapa de desnaturalización térmica tiene el significado de terminación de la reacción, y por lo tanto es ventajoso para el control de la temperatura de reacción.

La segunda característica es formar siempre un bucle capaz de apareamiento de bases. La estructura de un bucle capaz de apareamiento de bases se muestra en la Fig. 4. Como puede verse en la Fig. 4, el bucle está compuesto de la secuencia de nucleótidos F2c (X2c) que puede hibridar mediante el cebador y una secuencia de nucleótidos que intervienen entre F2c-F1c (X1c). La secuencia entre F2c-F1c (o entre X2c-X1c en una forma más universal) es una secuencia de nucleótidos derivada del molde. Por consiguiente, si una sonda que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria hibrida con esta región, la detección específica de molde es factible. Además, esta región siempre está lista para el apareamiento de bases, y por lo tanto, no es necesaria la desnaturalización térmica antes de la hibridación. La secuencia de nucleótidos que constituye un bucle en el producto de reacción de amplificación en la presente invención, puede tener una longitud arbitraria. Por consiguiente, si se desea la hibridación con una sonda, se disponen separadamente una región que se va a hibridar con el cebador y una región que se va a hibridar con la sonda, para prevenir su competición, de modo que se pueden constituir condiciones de reacción ideales.

De acuerdo con un modo preferido de la presente invención, en una sola cadena de ácido nucleico se da un gran número de bucles capaces de apareamiento de bases. Esto significa que un gran número de sondas pueden hibridar con una molécula de ácido nucleico para permitir la detección muy sensible. Por lo tanto se puede lograr no solo la mejora de la sensibilidad si no también un procedimiento de detección de ácido nucleico basado en un principio de reacción especial tal como la agregación. Por ejemplo, se añade una sonda inmovilizada sobre partículas finas tales como látex de poliestireno al producto de reacción de la presente invención, y se observa la agregación de partículas de látex a medida que avanza la hibridación del producto con la sonda. La observación altamente sensible y cuantitativa es factible por medición óptica de la concentración de la agregación. Debido a que también se puede observar la agregación a simple vista, también se puede constituir un sistema de reacción que no use un dispositivo de medición óptica.

Además, el producto de reacción de la presente invención al permitir que se le unan muchos marcadores por molécula de ácido nucleico, permite la detección cromatográfica. En el campo del inmunoensayo, en la práctica se usa un procedimiento analítico (inmunocromatografía) que usa un medio cromatográfico que usa un marcador detectable visualmente. Este procedimiento se basa en el principio de que un analito está interpuesto entre un anticuerpo inmovilizado sobre un medio cromatográfico y un anticuerpo marcado, y el componente marcado sin reaccionar se separa por lavado. El producto de reacción de la presente invención hace que este principio sea aplicable al análisis de ácido nucleico. Es decir, se prepara una sonda marcada hacia la parte del bucle y se inmoviliza sobre un medio cromatográfico para preparar una sonda de captura para la captura, permitiendo de esta forma el análisis en el medio cromatográfico. Como sonda de captura se puede usar una secuencia complementaria de la parte del bucle. Puesto que el producto de reacción de la presente invención tiene un número grande de bucles, el producto se une a un gran número de sondas marcadas para dar una señal visualmente reconocible.

El producto de reacción de acuerdo con la presente invención que siempre da una región como un bucle capaz del apareamiento de bases, permite una amplia variedad de otros sistemas de detección. Por ejemplo, es factible un sistema de detección que use la resonancia de plasmón superficial usando una sonda inmovilizada para esta parte de bucle. Además, si una sonda para la parte del bucle está marcada con un intercalante específico de cadena bicatenaria, se puede llevar a cabo un análisis de fluorescencia más sensible. Alternativamente, también se puede usar positivamente la capacidad del ácido nucleico sintetizado por la presente invención, para formar un bucle capaz de apareamiento de bases en los lados tanto 3' como 5'. Por ejemplo, se diseña un bucle para que tenga una secuencia de nucleótidos común entre un tipo normal y un tipo anómalo, mientras que el otro bucle se diseña para generar una diferencia entre ellos. Se puede constituir un sistema analítico característico en el que se confirme la presencia de un gen mediante la sonda para la parte común, mientras que la presencia de una anomalía se confirma en la otra región. Debido a que la reacción de síntesis de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención también puede transcurrir de forma isotérmica, una ventaja muy importante es que se puede realizar el análisis en tiempo real mediante un fotómetro fluorescente general. Hasta ahora se conocía la estructura de ácido nucleico que hibrida en la misma cadena. Si embargo, el ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria obtenido por la presente invención, es nuevo en cuanto que contiene un gran número de bucles capaces de apareamiento de bases con otros oligonucleótidos.

Por otra parte, un gran número de bucles dados por el producto de reacción de acuerdo con la presente invención, se pueden usar como sondas. Por ejemplo, en un chip de ADN, las sondas deben acumularse con alta densidad en una zona limitada. Sin embargo, en la presente tecnología, el número de oligonucleótidos que se pueden inmovilizar en una determinada zona está limitado. Por lo tanto, mediante el uso del producto de reacción de la presente invención, se pueden inmovilizar un gran número de sondas capaces de hibridación, con una alta densidad. Es decir, el producto de reacción de acuerdo con la presente invención se puede inmovilizar en forma de sondas sobre un chip de ADN. Después de la amplificación, el producto de reacción se puede inmovilizar por cualquier técnica conocida en la materia, o el oligonucleótido inmovilizado se usa como el oligonucleótido en la reacción de amplificación de la presente invención, dando como resultado la generación del producto de reacción inmovilizado. Mediante el uso de la sonda así inmovilizada, se pueden hibridar un gran número de ADN de muestra en una zona limitada, y como resultado se pueden esperar señales altas.

Breve descripción de los dibujos

la fig. 1 es una ilustración de una parte (1) a (4) del principio de reacción en un modo preferido de la presente invención;

la fig. 2 es una ilustración de una parte (5) a (7) del principio de reacción en un modo preferido de la presente invención;

la fig. 3 es una ilustración de una parte (8) a (10) del principio de reacción en un modo preferido de la presente invención;

la fig. 4 es una ilustración de la estructura de un bucle formado por el ácido nucleico monocatenario de acuerdo con la presente invención;

la fig. 5 es una ilustración de una parte (A) a (B) en un modo básico de la presente invención;

la fig. 6 es una ilustración de una parte (C) a (D) en un modo básico de la presente invención;

la fig. 7 es un dibujo que muestra la relación de posiciones de cada secuencia de nucleótidos que constituyen un oligonucleótido en la secuencia de nucleótidos diana de M13mp18;

la fig. 8 es una fotografía que muestra el resultado de la electroforesis en agarosa de un producto obtenido por el procedimiento de síntesis de ácido nucleico monocatenario con M13mp18 como molde de acuerdo con la presente invención.

Calle 1:: marcador de tamaño XIV

Calle 2:: ADNbc de M13mp19 1 fmol

Calle 3:: Sin diana

la fig. 9 es una fotografía que muestra el resultado de la electroforesis en gel de agarosa de un producto digerido por enzimas de restricción obtenido en el Ejemplo 1, por la reacción de síntesis de ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.

Calle 1:: marcador de tamaño XIV

Calle 2:: digestión con BamHI del producto purificado

Calle 3:: digestión con PvuII del producto purificado

Calle 4:: digestión con HindIII del producto purificado

la fig. 10 es una fotografía que muestra el resultado de la electroforesis en gel de agarosa de un producto obtenido por el procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico monocatenario, usando M13mp18 como molde en presencia de betaína. 0, 0,5, 1 y 2 indican la concentración (M) de la betaína añadida a la disolución de la reacción. N indica el control negativo, y -21 indica la concentración de 10^{-21} mol de ADN molde;

la fig. 11 es un dibujo que muestra la relación de posiciones de cada secuencia de nucleótidos que constituyen un oligonucleótido en una secuencia de nucleótidos diana obtenida del VHB;

la fig. 12 es una fotografía que muestra el resultado de la electroforesis en gel de agarosa de un producto obtenido por el procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico monocatenario, en el que se usó como molde VHB-M13mp18 integrado en M13mp18.

Calle 1:: marcador de tamaño XIV

Calle 2:: ADNbc de VHB-M13mp19 1 fmol

Calle 3:: Sin diana

la fig. 13 es una fotografía que muestra el resultado de la electroforesis en gel de agarosa de un producto desnaturalizado con álcali obtenido por el procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico monocatenario

Calle 1:: fragmento digerido con HindIII del fago lambda

Calle 2:: El producto de reacción del ejemplo 1

Calle 3:: El producto de reacción del ejemplo 3

la fig. 14 es una fotografía que muestra el resultado de la electroforesis en gel de agarosa de un producto obtenido por el procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico monocatenario, en el que se varió la concentración de M13mp18 como diana. Las fotografías superior e inferior muestran el resultado de la reacción para 1 y 3 horas respectivamente

Calle 1:: ADNbc de M13mp18 1x10^{-15} mol/tubo

Calle 2:: ADNbc de M13mp18 1x10^{-16} mol/tubo

Calle 3:: ADNbc de M13mp18 1x10^{-17} mol/tubo

Calle 4:: ADNbc de M13mp18 1x10^{-18} mol/tubo

Calle 5:: ADNbc de M13mp18 1x10^{-19} mol/tubo

Calle 6:: ADNbc de M13mp18 1x10^{-20} mol/tubo

Calle 7:: ADNbc de M13mp18 1x10^{-21} mol/tubo

Calle 8:: ADNbc de M13mp18 1x10^{-22} mol/tubo

Calle 9:: sin diana

Calle 10:: marcador de tamaño XIV

la fig. 15 es un dibujo que muestra la posición de una mutación y la relación de posiciones de cada región respecto a una secuencia (diana) de nucleótidos diana. La guanina subrayada se sustituye por adenina en el mutante;

la fig. 16 es una fotografía que muestra el resultado de la electroforesis en gel de agarosa de un producto de acuerdo con la reacción de amplificación de la presente invención,

M:: escala de 100 pb (New England Biolabs)

N:: sin molde (agua purificada)

WT:: molde de M13mp18 salvaje 1 fmol

MT:: molde de M13mp18 mutante 1 fmol

la fig. 17 es un dibujo que muestra la relación de posiciones de cada secuencia de nucleótidos que constituyen un oligonucleótido en una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm diana;

la fig. 18 es una fotografía que muestra el resultado de la electroforesis en gel de agarosa de un producto obtenido por el procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico monocatenario usando ARNm como una diana.

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Mejor modo de llevar a cabo la invención Ejemplo 1 Amplificación de una región en M13mp18

Se intentó el procedimiento de síntesis de ácido nucleico que tiene cadenas complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria de acuerdo con la presente invención, usando M13mp18 como molde. En este experimento se usaron 4 clases de cebadores, es decir, M13FA, M13RA, M13F3 y M13R3. M13F3 y M13R3 eran el primer y segundo cebadores exteriores para el desplazamiento del primer y segundo ácido nucleico obtenidos respectivamente con el primer oligonucleótido M13FA y el segundo oligonucleótido M13RA como origen de la síntesis. Debido a que los cebadores exteriores son cebadores que sirven como el origen de la síntesis de la cadena complementaria después de la síntesis con M13FA (o M13RA), estos se diseñaron para que hibridaran con una región contigua a M13FA (o M13RA) usando el fenómeno del apilamiento contiguo. Además, las concentraciones de estos cebadores se fijaron altas, de modo que se producía con preferencia la hibridación de M13FA (o M13RA).

La secuencia de nucleótidos que constituye cada cebador es como se muestra en la lista de secuencias. Las características estructurales de los cebadores se resumen a continuación. Además, la relación de las posiciones de cada región respecto a la secuencia (diana) de nucleótidos diana se muestra en la fig. 7.

Cebador: región en el lado 5'/región en el lado 3'

M13FA: La misma que la región F1c en la cadena complementaria sintetizada por M13FA/complementario de la región F2c en M13mp18

M13RA: La misma que la región R1c en la cadena complementaria sintetizada por M13RA/complementaria de la región R2c en la cadena complementaria sintetizada por M13FA

M13F3: Complementaria de F3c contigua al lado 3' de la región F2c en M13mp18

M13R3; Complementaria de R3c contigua al lado 3' de la región F2c en la cadena complementaria sintetizada por M13FA

Mediante dichos cebadores, se sintetiza el ácido nucleico en el que una región que se extiende desde F1c a R1c en M13mp18, y su secuencia de nucleótidos complementaria, están alternativamente unidas mediante una secuencia formadora de bucle que contiene F2c en una cadena monocatenaria. La composición de una disolución de reacción por el procedimiento de síntesis de ácido nucleico mediante estos cebadores de acuerdo con la invención, se muestra a continuación.

Composición de la disolución de la reacción (en 25 \mul)

Tris-HCl 20 mM pH 8,8

KCl 10 mM

(NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM

MgSO_{4} 6 mM

Triton X-100 al 0,1%

dimetilsulfóxido (DMSO) al 5%

dNTP 0,4 mM

Cebadores:

M13FA/ID SEC Nº: 1 800 nM

M13RA/ID SEC Nº: 2 800 nM

M13F3/ID SEC Nº: 3 200 nM

M13R3/ID SEC Nº: 4 200 nM

Diana: ADNbc de M13mp18/ID SEC Nº: 5

\newpage

Reacción: La disolución de la reacción anterior se calentó a 95ºC durante 5 minutos, y la diana se desnaturalizó en una cadena monocatenaria. La disolución de la reacción se transfirió a agua helada, y se le añadieron 4 U de ADN polimerasa Bst (New England Biolabs) y la mezcla se hizo reaccionar a 65ºC durante 1 h. Después de reacción, la reacción se terminó a 80ºC durante 10 minutos y se transfirió otra vez a agua helada.

Confirmación de la reacción: se añadió 1 \mul de tampón de carga a 5 \mul de la disolución de la reacción anterior, y la muestra se sometió a electroforesis durante 1 hora a 80 mV en gel de agarosa al 2% (TBE al 0,5%). Como marcador de peso molecular se usó XIV (escala de 100 pb, Boehringer Mannheim). El gel después de electroforesis se tiñó con verde I de SYBR (Molecular Probes, Inc.) para confirmar el ácido nucleico. Los resultados se muestran en la Fig. 8. Las respectivas calles corresponden a las siguientes muestras.

1. marcador de tamaño XIV

2. ADNbc de M13mp18 1 fmol

3. sin diana.

En la calle 3, no se confirmó banda excepto que se tiñeron los cebadores sin reaccionar. En la calle 2 en presencia de la diana, los productos se confirmaron como una escala de bandas de bajo peso molecular, como tinción difuminada a alto peso molecular y como una banda que apenas experimenta electroforesis en el gel. Entre las bandas de bajo peso molecular, las bandas en la proximidad de 290 pb y 450 pb están de acuerdo con los productos calculados en la reacción sintética de esta invención, es decir, cadenas bicatenarias de los ID SEC Nº: 11 y 12 (correspondientes a cadenas bicatenarias formadas como se muestra en las Figs. 2-(7) y 2-(10)) y una cadena monocatenaria de ID SEC Nº:13 (correspondiente a la cadena monocatenaria larga en la Fig. 3-(9)), y de esta forma se confirmó que la reacción transcurría como se esperaba. Se pensó que los resultados de la electroforesis del patrón difuminado de alto peso molecular y la banda que no experimentó electroforesis se habían obtenido porque esta reacción era básicamente una reacción continua que permitía pesos moleculares variables en el producto de reacción y además porque el producto tiene una estructura complicada que tienen una cadena parcialmente monocatenaria y un complejo
bicatenario.

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Ejemplo 2 Confirmación de los productos de reacción por digestión con enzimas de restricción

Con el propósito de clarificar la estructura del ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria, obtenido en el Ejemplo 1, se llevó a cabo la digestión de los productos con enzimas de restricción. Si los fragmentos son generados teóricamente por su digestión con enzimas de restricción y simultáneamente desaparecen el patrón difuminado de alto peso molecular y la banda que no experimenta electroforesis como se observa en el Ejemplo 1, entonces se puede pensar que ninguno de estos productos son el ácido nucleico que tiene secuencias complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria sintetizado de acuerdo con la presente invención.

Las disoluciones de reacción (200 \mul) de 8 tubos en el Ejemplo 1 se agruparon y se purificaron por tratamiento con fenol y precipitación con etanol. Los precipitados resultantes se recuperaron y se volvieron a disolver en 200 \mul de tampón TE, y se hicieron digerir 10 \mul de parte alícuota a 37ºC durante 2 horas con las enzimas de restricción BamHI, PvuII y HindIII, respectivamente. El producto digerido se sometió a electroforesis durante 1 hora a 80 mV en gel de agarosa al 2% (TBE al 0,5%). Como marcador molecular se usó Super Ladder-Low (escala de 100 pb) (Gensura Laboratories, Inc.). Después de la electroforesis el gel se tiñó con verde I de SYBR (Molecular Probes, Inc.) para confirmar el ácido nucleico. Los resultados se muestran en la Fig. 9. Las calles respectivas corresponden a las siguientes muestras.

1. marcador de tamaño XIV

2. digestión con BamHI del producto purificado

3. digestión con PvuII del producto purificado

4. digestión con HindIII del producto purificado

Se cree que las secuencias de nucleótidos que constituyen los productos de amplificación relativamente cortos son las de los ID SEC Nº: 13, 14, 15 y 16. A partir de estas secuencias de nucleótidos, el tamaño calculado de cada fragmento digerido con las enzimas de restricción es como se muestra en la Tabla 1. "L" en la tabla indica que su posición en la electroforesis no está establecida porque L es un fragmento que contiene un bucle (cadena monocatenaria).

TABLA 1 Fragmentos de digestión de enzimas de restricción de los productos de amplificación

1

Debido a que casi todas las bandas antes de la digestión se cambiaron a bandas estimadas, se confirmó que los productos de reacción objetivos se habían amplificado. Además, también se mostró que no había o había menos productos inespecíficos.

Ejemplo 3 Promoción de la reacción de amplificación por adición de betaína

Se llevó a cabo un experimento para examinar el efecto de la betaína (N,N,N-trimetilglicina, Sigma) añadida a la disolución de la reacción de amplificación del ácido nucleico. La síntesis del ácido nucleico que tiene cadenas complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria de acuerdo con la invención se llevó a cabo usando M13mp18 como molde de forma similar al Ejemplo 1, en presencia de betaína en diferentes concentraciones. Los cebadores usados en el experimento eran idénticos a los usados en el Ejemplo 1. La cantidad de ADN molde era 10^{-21} mol (M13mp18) y se usó agua como control negativo. La betaína se añadió en concentraciones de 0, 0,5, 1 y 2 M a la disolución de la reacción. La composición de la disolución de la reacción se muestra a continuación.

Composición de la disolución de la reacción (en 25 \mul)

Tris-HCl 20 mM pH 8,8

MgSO_{4} 4 mM

dNTP 0,4 mM

KCl 10 mM

(NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM

Triton X-100 al 0,1%

Cebadores:

M13FA/ID SEC Nº: 1 800 nM

M13RA/ID SEC Nº: 2 800 nM

M13F3/ID SEC Nº: 3 200 nM

M13R3/ID SEC Nº: 4 200 nM

Diana: ADNbc de M13mp18/ID SEC Nº: 5

La polimerasa, las condiciones de reacción y las condiciones para la electroforesis eran idénticas a las descritas en el Ejemplo 1.

Los resultados se muestran en la Fig. 10. En la reacción en presencia de betaína en concentraciones de 0,5 ó 1,0 M, aumentó la cantidad de producto de amplificación. Además, si su concentración aumentaba a 2,0 M, no se observaba amplificación. Por lo tanto, se mostró que la reacción de amplificación era promovida en presencia de betaína con una concentración adecuada. Se cree que la razón de que la cantidad de producto de amplificación disminuyera cuando la concentración de betaína era 2 M era que la Tf disminuía demasiado.

Ejemplo 4 Amplificación de secuencia de genes del VHB

Se intentó el procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico en el que se usó como molde ADNbc de M13mp18 que tenía una secuencia parcial del gen del VHB integrada en el mismo. En el experimento se usaron 4 clases de cebadores HB65FA (ID SEC Nº: 6), HB65RA (ID SEC Nº: 7), HBF3 (ID SEC Nº: 8) y HBR3 (ID SEC Nº: 9). HBF3 y HBR3 eran cebadores exteriores para el desplazamiento del primer ácido nucleico obtenido respectivamente con HB65FA y BB65RA como el origen de la síntesis. Debido a que los cebadores exteriores son cebadores que sirven como el origen de la síntesis de la cadena complementaria después de la síntesis con HB65FA (o HB65RA), estos se diseñaron para hibridar con una región contigua a HB65FA (o HB65RA), usando el fenómeno del apilamiento contiguo. Además, las concentraciones de estos cebadores se fijaron altas de modo que ocurría de forma preferente la hibridación con HB65FA (o HB65RA). La secuencia diana (430 bp) en este ejemplo, obtenida del VHB integrada en M13mp18, se muestra en el ID SEC Nº: 10.

La secuencia de nucleótidos que constituye cada cebador se muestra en la lista de secuencias. Las características estructurales de cada cebador se resumen a continuación. Además, la relación de posiciones de cada región respecto a la secuencia (diana) de nucleótidos diana, se muestra en la Fig. 11.

Cebador: región en el lado 5'/región en el lado 3'

HB65FA: La misma que la región F1c en la cadena complementaria sintetizada por HB65FA/complementaria de la región F2c en HBV-M13mp18

HB65RA: La misma que la región R1c en la cadena complementaria sintetizada por HB65RA/complementaria de la región R2c en la cadena complementaria sintetizada por HB65FA

HBF3: Complementaria de F3c contigua al lado 3' de la región F2c en HBV-M13mp18

HBR3; Complementaria de R3c contigua al lado 3' de la región F2c en la cadena complementaria sintetizada por HB65FA

Mediante dichos cebadores, se sintetiza el ácido nucleico en el que una región que se extiende desde F1c a R1c en M13mp18 (HBV-M13mp18) que tiene una secuencia parcial del gen del VHB integrada en la misma, y su secuencia de nucleótidos complementaria, están alternativamente unidas mediante una secuencia formadora de bucle que contiene F2c en una cadena monocatenaria. La reacción se llevó a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 1, excepto que se usaron los cebadores descritos antes, y la disolución de la reacción se analizó por electroforesis en agarosa. Los resultados se muestran en la Fig. 12. Las respectivas calles corresponden a las siguientes muestras.

1. marcador de tamaño XIV

2. ADNbc de VHB-M13mp18 1 fmol

3. Sin diana

De forma similar al Ejemplo 1, los productos se confirmaron solo en presencia de la diana como una escala de bandas de bajo peso molecular, como una tinción difusa de alto peso molecular y como una banda que casi no experimenta electroforesis en el gel (calle 2). Entre las bandas de bajo peso molecular, las bandas en la proximidad de 310 pb y 480 pb están de acuerdo con los productos calculados en la reacción sintética de esta invención, es decir, cadenas bicatenarias de los ID SEC Nº: 17 y 18 y por lo tanto se confirmó que la reacción transcurría como se esperaba. Como se describe en los resultados en el ejemplo 1, se pensó que los resultados de la electroforesis del patrón difuminado de alto peso molecular y la banda que no experimentó electroforesis se produjeron por la estructura del producto sintético característico de la presente invención. A partir de este experimento, se confirmó que la presente invención puede llevarse a la práctica incluso si se usa una secuencia (diana) diferente para la amplificación.

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Ejemplo 5 Confirmación de los tamaños de los productos de la reacción de síntesis

Para confirmar la estructura del ácido nucleico sintetizado de acuerdo con la presente invención, se analizó su longitud por electroforesis en condiciones de desnaturalización alcalinas. Se añadió 1 \mul de tampón de carga alcalino a 5 \mul de cada disolución de reacción en presencia de la diana en el Ejemplo 1 ó 4, y se sometieron a electroforesis a 50 mA en gel de agarosa al 0,7% (NaOH 50 mM, EDTA 1 mM) durante 14 horas. Como marcador de tamaño de peso molecular, se usaron fragmentos del fago lambda digeridos por HindIII. El gel después de la electroforesis se neutralizó con Tris 1 M, pH 8, y se tiñó con verde I de SYBR (Molecular Probes, Inc.) para confirmar el ácido nucleico. Los resultados se muestran en la Fig. 13. Las calles respectivas corresponden a las siguientes muestras.

1. Fragmentos del fago lambda digeridos por HindIII

2. El producto de reacción del Ejemplo 1

3. El producto de reacción del Ejemplo 4

Cuando el producto de reacción se sometió a electroforesis en condiciones de desnaturalización alcalinas, se pudo confirmar su tamaño en un estado monocatenario. Se confirmó que los tamaños de los productos principales tanto en el Ejemplo 1 (calle 2) como en el Ejemplo 4 (calle 3) estaban en los 2 kbases. Además, se puso de manifiesto que el producto se había extendido para tener un tamaño de al menos 6 kbases o más dentro del intervalo capaz de confirmación por este análisis. Además, se confirmó otra vez que las bandas que no experimentaban electroforesis en condiciones de no desnaturalización en los Ejemplo 1 y 4, se separaban en un estado desnaturalizado en cadenas monocatenarias individuales de tamaño menor.

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Ejemplo 6 Confirmación de la amplificación que depende de la concentración de una diana en la amplificación de una región en M-13mp13

Se observó la influencia de una concentración variable de una diana en el procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico. El procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico se llevó a cabo en las mismas condiciones que en el Ejemplo 1, excepto que la cantidad de ADNbc de M13mp18 como diana era de 0 a 1 fmol y el tiempo de reacción era 1 hora o 3 horas. De forma similar al Ejemplo 1, la muestra se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 2% (TBE al 0,5%) y se tiñó con verde I de SYBR (Molecular Probes, Inc.) para confirmar el ácido nucleico. Como marcador de peso molecular, se usó XIV (escala de 100 pb, Boehringer Mannheim). Los resultados se muestran en la Fig. 14 (superior: 1 hora de reacción, inferior: 3 horas de reacción). Las respectivas calles corresponden a las siguientes muestras:

1: ADNbc de M13mp18 1x10^{-15} mol/tubo

2: ADNbc de M13mp18 1x10^{-16} mol/tubo

3: ADNbc de M13mp18 1x10^{-17} mol/tubo

4: ADNbc de M13mp18 1x10^{-18} mol/tubo

5: ADNbc de M13mp18 1x10^{-19} mol/tubo

6: ADNbc de M13mp18 1x10^{-20} mol/tubo

7: ADNbc de M13mp18 1x10^{-21} mol/tubo

8: ADNbc de M13mp18 1x10^{-22} mol/tubo

9: sin diana

10: marcador de tamaño XIV.

Aparece una banda común entre las respectivas calles en la parte inferior del perfil electroforético y muestra los cebadores teñidos sin reaccionar. Independientemente del tiempo de reacción, no se observó producto de amplificación en ausencia de la diana. Se obtuvo un patrón de tinción, que dependía de la concentración de la diana, del producto de amplificación sólo en presencia de la diana. Además, el producto de amplificación se pudo confirmar con la menor concentración cuando se aumentó el tiempo de reacción.

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Ejemplo 7 Detección de una mutación puntual (1) Preparación de M13mp18M (mutante)

El ADN diana usado fue M13mp18 (salvaje) y M13mp18M (mutante). Para la construcción de M13mp18FM mutante, se usó el kit de mutagénesis in vitro LA PCR^{TM} (Takara Shuzo Co., Ltd.) para sustituir un nucleótido para la mutación. Después, la secuencia se confirmó por secuenciación. La secuencia de la región F1 se muestra a continuación:

\newpage

Tipo salvaje:	CCGGGGATCCTCTAGAGTCG	(ID SEC Nº: 19)

Mutante:	CCGGGGATCCTCTAGAGTCA	(ID SEC Nº: 20)

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(2) Diseño de los cebadores

Los cebadores FA usados para el tipo salvaje y el mutante se proporcionaron en el extremo 5' de su región F1c con secuencias de nucleótidos diferentes, respectivamente. La posición de la mutación y la relación de posiciones de cada región respecto a la secuencia (diana) de nucleótidos diana se muestran en la Fig. 15.

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(3) Reacción de amplificación

Se llevó a cabo un experimento para examinar si la reacción de amplificación específica de molde ocurre usando una combinación de cebadores específicos mostrados a continuación, usando M13mp18 (salvaje) y M13mp18M (mutante) como cebadores.

Conjunto de cebadores para la amplificación del tipo salvaje: FAd4, RAd4, F3, R3

Conjunto de cebadores para la amplificación del mutante: FAMd4, RAd4, F3, R3

La secuencia de nucleótidos de cada cebador es la siguiente:

FAd4:	CGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT	(ID SEC Nº: 21)

FAMd4:	TGACTCTAGAGGATCCCCGGTTTTTGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGAT	(ID SEC Nº: 22)

RAd4:	CGTCGTGACTGGGAAAACCCTTTTTGTGCGGGCCTCTTCGCTATTAC	(ID SEC Nº: 23)

F3:	ACTTTATGCTTCCGGCTCGTA	(ID SEC Nº: 24)

R3:	GTTGGGAAGGGCGATCG	(ID SEC Nº: 25)

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(4) Detección de la mutación puntual en M13mp18

La composición de la disolución de la reacción es la siguiente:

2

Se añadió 1 fmol (2 \mul) de M13mp18 o M13mp18M diana a la disolución de la reacción y se calentó a 95ºC durante 5 minutos, de modo que la diana se desnaturalizó en una cadena monocatenaria. La disolución de la reacción se transfirió a agua helada, y se le añadió 1 \mul (8 U) de la ADN polimerasa Bst (NEW ENGLAND Biolab) y se dejó reaccionar durante 1 h a 68ºC o 68,5ºC. Después de la reacción, la reacción se terminó a 80ºC durante 10 minutos, y la disolución de la reacción se volvió a transferir a agua helada.

Como se muestra en la Fig. 16, cuando se usó FAd4 para el tipo salvaje como cebador FA, se observó amplificación eficaz sólo en presencia del molde de tipo salvaje. Por otra parte, cuando se usó FAMd4 para el mutante como cebador FA, la amplificación eficaz se observó solo en presencia del molde de tipo salvaje [sic.].

A partir de los resultados descritos antes, se mostró que la mutación puntual podía detectarse de forma eficaz usando la reacción de amplificación de la presente invención.

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Ejemplo 8 Reacción de amplificación de ARNm como diana

Se intentó el procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico usando ARNm como ácido nucleico diana. Para preparar el ARNm diana, se mezclaron células LNCaP de línea celular de cáncer de próstata (Nº en ATCC CRL-1740) que expresan el antígeno específico prostático (PSA), con células K562 de la línea celular de leucemia mieloide crónica (Nº en ATCC CCL-243) como células que no expresan, con 1:10^{6} a 100:10^{6}, seguido de extracción del ARN total usando un kit RNeasy Mini de Qiagen (Alemania). Se usaron 4 clases de cebadores en el experimento, es decir PSAFA, PSARA, PSAF3 y PSAR3. PSAF3 y PSAR3 son cebadores exteriores para el desplazamiento del primer ácido nucleico obtenido respectivamente con PSAFA y PSARA como el origen de la síntesis. Además, las concentraciones de estos cebadores se fijaron altas de modo que ocurría de forma preferente la hibridación de PSAFA (o PSARA). Las secuencias de nucleótidos que constituyen los respectivos cebadores son las siguientes.

Cebador:

PSAFA:	TGTTCCTGATGCAGTGGGCAGCTTTAGTCTGCGGCGGTGTTCTG	(ID SEC Nº: 26)

PSARA:	TGCTGGGTCGGCACAGCCTGAAGCTGACCTGAAATACCTGGCCTG	(ID SEC Nº: 27)

PSAF3:	TGCTTGTGGCCTCTCGTG	(ID SEC Nº: 28)

PSAR3:	GGGTGTGGGAAGCTGTG	(ID SEC Nº: 29)

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Las características estructurales de los cebadores se resumen a continuación. Además, la relación de posiciones de cada cebador respecto a la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica el ARNm diana y los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción Sau3AI, se muestran en la Fig. 17.

Cebador: región en el lado 5'/región en el lado 3'

PSAFA: La misma que la región F1c en la cadena complementaria sintetizada por PSAFA/complementaria de la región F2c en la secuencia de nucleótidos diana

PSARA: La misma que la región R1c en la cadena complementaria sintetizada por PSARA/complementaria de la región R2c en la cadena complementaria sintetizada por PSAFA

PSAF3: Complementaria de F3c contigua al lado 3' de la región F2c en la secuencia de nucleótidos diana

PSAR3; Complementaria de R3c contigua al lado 3' de la región R2c en la cadena complementaria sintetizada por PSAFA

La composición de una disolución de la reacción para el procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico es la siguiente:

Composición de la disolución de la reacción (en 25 \mul)

Tris-HCl 20 mM pH 8,8

MgSO_{4} 4 mM

dNTP 0,4 mM

KCl 10 mM

(NH_{4})_{2}SO_{4} 10 mM

Triton X-100 al 0,1%

Betaína 0,8 M

DTT 5 mM

Cebador PSAFA y PSARA 1600 nM

Cebador PSAF3 y PSAR3 200 nM

ADN polimerasa Bst 8 U

Rever Tra Ace (Toyobo Co., Ltd., Japón) 100 U

ARN total 5 \mug

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Se mezclaron todos los ingredientes sobre hielo. En este experimento se usó el ARNm (cadena monocatenaria) como una diana, y por lo tanto la etapa de hacer la cadena monocatenaria por desnaturalización térmica no es necesaria. La reacción se llevó a cabo a 65ºC durante 45 minutos, y la reacción se terminó a 85ºC durante 5 minutos. Después de la reacción, se sometieron a electroforesis 5 \mul de la disolución de la reacción en agarosa al 2% y se detectaron con verde I de SYBR.

Los resultados se muestran en la Tabla 18. Las calles respectivas corresponden a las siguientes muestras.

3

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En ausencia de ADN polimerasa Bst o de Rever Tra Ace, no se pudo obtener producto de amplificación (calles 1 a 4). En presencia de ambas enzimas, se detectó un producto de amplificación (calles 5 a 7) si estaba presente el ARN obtenido de LNCaP. Se pudo detectar el ARN extraído de una célula LNCaP/1 millón de células K562 (calle 6). Cuando el producto de amplificación se hizo digerir en el sitio de la enzima de restricción Sau3AI situado en el interior de la diana, el producto se hizo digerir en un fragmento de tamaño calculado (calles 8 y 9).

A partir de los resultados descritos antes, se confirmó que se puede obtener el producto de reacción deseado en el procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico, incluso si se usa ARN como diana.

\newpage

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con el nuevo conjunto de cebadores de acuerdo con la presente invención y el procedimiento de síntesis de ácido nucleico usando dicho conjunto de cebadores, se proporciona un procedimiento de síntesis de ácido nucleico que tiene secuencias de nucleótidos complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria, sin requerir ningún control complicado de la temperatura. Una cadena complementaria sintetizada con el conjunto de cebadores basado en la presente invención, sirve como el origen de la síntesis de una nueva cadena complementaria con el extremo 3' de dicha cadena sintetizada como molde. A esto le acompaña la formación de un bucle que produce la hibridación de un nuevo cebador, y un producto de la reacción de síntesis de la cadena complementaria con la cadena sintetizada previamente como molde, se desplaza otra vez por la síntesis de la cadena complementaria a partir del bucle y se prepara para el apareamiento de bases. El ácido nucleico así obtenido, sintetizado consigo mismo como molde, se combina, por ejemplo, con un procedimiento de síntesis de ácido nucleico conocido tal como la SDA, para contribuir a la mejora de la eficacia de la síntesis del ácido nucleico.

De acuerdo con un modo preferido adicional de la presente invención, se proporciona un procedimiento nuevo de síntesis de ácido nucleico, que logra la mejora de la eficacia del procedimiento de síntesis de ácido nucleico conocido, no requiere el control complicado de la temperatura, se puede esperar que alcance una eficacia alta de la amplificación y puede lograr una especificidad alta. Es decir, el conjunto de cebadores basado en la presente invención, se aplica a una cadena molde y su cadena complementaria, de modo que se puede sintetizar sucesivamente el ácido nucleico que tiene secuencias complementarias unidas alternativamente en una cadena monocatenaria. Esta reacción continúa teóricamente hasta que se agotan los materiales de partida necesarios para la síntesis, y durante ésta sigue formándose el nuevo ácido nucleico cuya síntesis se ha iniciado a partir del bucle. El alargamiento a partir del oligonucleótido que ha hibridado con el bucle, produce el desplazamiento de cadena para suministrar el grupo 3'-OH para el alargamiento del ácido nucleico monocatenario largo (es decir, el ácido nucleico que tiene una pluralidad de pares de cadenas complementarias unidas en el mismo). Por otra parte, el grupo 3'-OH de la cadena monocatenaria larga produce la reacción de síntesis de la cadena complementaria consigo mismo como molde, de modo que se logra su alargamiento, y durante esta se desplaza una nueva cadena complementaria cuya síntesis se ha iniciado a partir del bucle. Dicha etapa de reacción de amplificación transcurre en condiciones isotérmicas, manteniéndose a la vez una alta especificidad.

Los oligonucleótidos en la presente invención, cuando dos regiones contiguas están dispuestas como se diseñan, pueden funcionar como cebadores para la reacción de síntesis de ácido nucleico. Esto contribuye significativamente a la conservación de la especificidad. Por comparación, por ejemplo, con la PCR en la que la reacción de amplificación inespecífica se inicia por apareamiento erróneo inespecífico independientemente de la relación de posiciones deseada de los dos cebadores, se puede explicar fácilmente que en la presente invención se puede esperar una alta especificidad. Esta característica se puede usar para detectar SNP de forma muy sensible y precisa.

Lo que caracteriza a la presente invención, reace en que dicha reacción se puede lograr fácilmente con una constitución de reactivos muy sencilla. Por ejemplo, los oligonucleótidos del conjunto de cebadores de la presente invención tienen una estructura especial, pero este es un problema de selección de la secuencia de nucleótidos, y el sustrato es un simple oligonucleótido. Además, en un modo preferido, la reacción puede transcurrir mediante solo una ADN polimerasa que cataliza la reacción de tipo desplazamiento de cadena de la cadena complementaria que se sintetiza. Además, si la presente invención se lleva a cabo con ARN como molde, se usa una ADN polimerasa tal como la ADN polimerasa Bca que tiene tanto actividad de transcriptasa inversa como actividad de ADN polimerasa de tipo desplazamiento de cadena, de modo que todas las reacciones enzimáticas se pueden llevar a cabo mediante una sola enzima. El principio de la reacción de conseguir un grado alto de la reacción de amplificación de ácido nucleico mediante dicha reacción enzimática sencilla no se conocía. Incluso para la aplicación de la presente invención a una reacción de síntesis de ácido nucleico conocida como la SDA, no es necesaria una enzima adicional para su combinación, y dicha combinación sencilla con el oligonucleótidos basado en la presente invención se puede aplicar a diferentes sistemas de reacción. Por consiguiente, se puede decir que el procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico también es ventajoso con respecto al coste.

Como se ha descrito antes, el procedimiento de la invención de síntesis de ácido nucleico y el conjunto de oligonucleótidos para la misma, proporcionan un nuevo principio de resolución simultánea de una pluralidad de problemas difíciles tales como la operatividad (no es necesario el control de la temperatura), mejora de la eficacia de la síntesis, economía y alta especificidad.

<110> Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha

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<120> Procedimiento de síntesis de ácido nucleico.

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<130> E2-00IPCT

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<140>

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<141>

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<150> JP-1998-317476

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<151> 1998-11-09

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<160> 29

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 52

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de cebador artificialmente sintetizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgactctaga ggatccccgg gtacttttg ttgtgtggaa ttgtgagcgg at

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220> Secuencia de cebador sintetizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaacgtcgt gactgggaaa accctttttg tgcgggcctc ttcgctatta c

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actttatgct tccggctcgt a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttgggaagg gcgatcg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 600

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacteriófago M13mp18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtggattcgc actcctcccg ctgatcggga cctgcctcgt cgt

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccacctggg tgggaa

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcgagggag ttcttcttct ag

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 430

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Virus de la hepatitis B

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia artificialmente sintetizada

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 293

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 459

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 458

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 790

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 789

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 310

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 465

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> M13mp18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggggatcc tctagagtcg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> M13mp18 mutante

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccggggatcc tctagagtca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgactctaga ggatccccgg tttttgttgt gtggaattgt gagcggat

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgactctaga ggatccccgg tttttgttgt gtggaattgt gagcggat

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgtcgtgact gggaaaaccc tttttgtgcg ggcctcttcg ctattac

\hfill

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actttatgct tccggctcgt a

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttgggaagg gcgatcg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgttcctgat gcagtgggca gctttagtct gcggcggtgt tctg

\hfill

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgctgggtcg gcacagcctg aagctgacct gaaatacctg gcctg

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcttgtggc ctctcgtg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggtgtggga agctgtg

\hfill

17

Claims

ii) un segundo cebador oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región arbitraria R2c en una cadena complementaria sintetizada con el primer oligonucleótido como origen de la síntesis, que tiene una secuencia de nucleótidos específica;

iii) un primer cebador exterior que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región F3c situada en el lado 3' de la región F2c en el ácido nucleico que sirve como un molde;

iv) un segundo cebador exterior que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región R3c situada en el lado 3' de la región R2c arbitraria en la cadena complementaria sintetizada con el primer oligonucleótido como origen de la síntesis.

2. El conjunto de cebadores de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el segundo cebador oligonucleótido tiene una región R1c, en el que R1c está unido al lado 5' de R2, y en el que

R1c es una región que tiene sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que la región R1c situada en el lado 5' de la región R2c en la cadena complementaria sintetizada con el primer oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos específica.

ii) un segundo cebador de oligonucleótidos que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región R2c arbitraria en una cadena complementaria sintetizada con el primer oligonucleótido como origen de la síntesis, que tiene una secuencia de nucleótidos específica;

vi) un nucleótido que sirve como un sustrato para el elemento v).

A) mezclar los siguientes componentes i) a vi) con el ácido nucleico de muestra como un molde:

ii) un segundo cebador oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria de una región R2c arbitraria en una cadena complementaria sintetizada con el primer oligonucleótido como origen de la síntesis, que tiene una secuencia de nucleótidos específica;

vi) un nucleótido que sirve como sustrato para el elemento v); y