TWI435935B - 快速檢測標靶核酸片段之套組及方法 - Google Patents

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Description

快速檢測標靶核酸片段之套組及方法
本發明係有關一種核酸片段檢驗技術，詳言之，係有關利用圈環形核酸擴增反應(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)系統檢測一標靶核酸片段之技術。
核酸片段之檢測於各領域中應用廣泛且重要，例如快速且準確檢測一核酸標靶片段可迅速診斷病原感染，以供提早防治。
在漁業方面，水產養殖疾病之快速及準確診斷至為關鍵。特別近年來許多高經濟價值物種(例如石斑魚、鰻或鯛)感染性疾病之快速鑑別已成為一重要課題。魚類之免疫系統可在各種發育階段交叉感染到各種病原體(諸如病毒、細菌、真菌或寄生蟲)，因此，用於病原體鑑定之快速、準確及靈敏診斷平台開發在治療、控制或甚至根除此等感染性水產養殖疾病中扮演重要角色。傳統上，業界係使用包括細菌學分析、病毒分離及培養、組織病理學及酶聯免疫吸附檢驗(ELISA)(Adams及Thompson，2008，Rev. Sci. Technol. 27，197-209)之方法以檢測水產養殖病原體之表型表徵及隨後的鑑定。舉例而言，病毒性神經壞死症(viral nervous necrosis)為石斑魚養殖業中之一種嚴重病毒性疾病。石斑魚生命週期內之許多階段可感染神經壞死病毒(NNV)，尤其在孵化場飼養的仔魚及稚魚中(Chi等人，2003，Dis. Aquat. Organ. 55，221-228)。已報導神經壞死病毒為全世界養殖海魚之仔魚及稚魚的主要死因(Shieh及Chi，2005，Dis. Aquat. Organ. 63，53-60)，其造成之中樞神經組織壞死及空泡形成導致受感染物種之異常游動行為，從而導致受感染魚之高死亡率。受感染之石斑魚會變成帶菌者，若不強制進行檢疫，疫情會迅速擴散，因此亟需快速及準確的用於預防及控制此類疾病之診斷方法。
另一方面，基於結合供核酸擴增之特異性引子組之聚合酶鏈反應(PCR)分子診斷已顯示可高靈敏度及特異性地準確診斷水產養殖疾病，例如反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)(Dhar等人，2002，J. Virol. Methods 104，69-82；Nishizawa等人，1995，J. Gen. Virol. 76，1563-1569)或定量即時PCR(DallaValle等人，2005，Vet. Microbiol. 110，167-179)，其中習知RT-PCR方法(Nishizawa等人，1995，J. Gen. Virol. 76，1563-1569)係為當前用於偵測NNV之「黃金標準方法」，目前已證明在RT-PCR檢驗中活體外轉錄之病毒RNA的偵測極限為100至1000個複本(Grotmol等人，2000，Dis. Aquat. Organ. 39，79-88)。
然而此等技術仍存在一些缺點，諸如需要昂貴且龐大的熱循環器、多個複雜的操作過程及低擴增效率等(Mori等人，2001，Biochem. Biophys. Res. Commun. 289，150-154；Tomita等人，2008，Nat. Protoc. 3，877-882)。樣品預處理亦為在技術上要求高且耗時的步驟。RNA萃取之品質會影響RNA-病毒診斷之結果。熱苯酚萃取或RNA純化套組為用於RNA純化及分離之常見方法。另一方面，基於PCR平台在技術上要求高，在溫度變化範圍為42℃至95℃之熱循環期間必需精確溫度控制，其通常由昂貴且龐大的裝置進行，此外漫長且昂貴的診斷過程始終需要由訓練有素的人員進行，且此等人工操作亦可能造成診斷不精確。
因此，業界另開發利用標靶核酸在恆定且低溫下指數擴增之「等溫擴增技術」，以用於快速偵測標靶DNA序列(Piepenburg等人，2006，PLoS Biol. 4，e204；Starkey等人，2004，Dis. Aquat. Organ. 59，93-100；Walker等人，1994，Nucleic Acids Res. 22，2670-2677)，其中圈環形核酸擴增技術引起相當大的關注，可作為用於核酸擴增之潛在快速、準確及節省成本之方法。檢體中之標靶核酸序列可藉由使用四種指定引子，結合能夠在等溫條件(約60-65℃)下進行高度股置換之Bst DNA聚合酶來擴增(Notomi等人，2000，Nucleic Acids Res. 28，e63)。圈環形核酸擴增技術包括初始步驟、循環擴增步驟及延長步驟在內之三個主要步驟皆在恆定熱條件下進行，且因為在LAMP過程期間無需花費時間進行溫度改變，故可達成有效擴增(Nagamine等人，2002，Mol. Cell. Probes 16，223-229)。另外，由具有多個環之類似花椰菜結構組成的最終擴增之莖-環DNA可產生標靶DNA分子之109 個複本的擴增，因此顯示LAMP擴增之靈敏度為習知PCR方法之約100倍。因此，LAMP技術係為快速及準確偵測標靶基因之新診斷策略。舉例而言，已報導藉由靶向溶血素基因對來自受感染之日本鰈魚的遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda )進行基於LAMP之偵測(Savan等人，2004，Appl. Environ. Microbiol. 70，621-624)，亦報導使用兩步驟RT-LAMP技術於鑑別魚之與感染性造血壞死病毒(IHNV)相關之G蛋白(Gunimaladevi等人，2005，Arch. Virol. 150，899-909)。儘管LAMP技術具有吸引力，但在開發利用此等當前實驗室技術之快速診斷技術仍存在一些潛在缺點，整個核酸擴增過程成本仍相當昂貴且勞動強度大，且必須利用實驗室規模設備，諸如移液管及使用相對大量生物檢體/試劑之龐大加熱器。更重要的是，在分析之前，始終需要諸如DNA/RNA萃取之生物檢體預處理過程，此需要由有經驗的人員進行。再者，在整個檢測過程期間生物檢體存在高污染風險，導致無法在現場檢測，並妨礙實際應用。因此，亟需開發以高特異性及靈敏度以自動方式進行所有診斷過程之整合式檢體-結果系統(sample-to-answer system)。
 發明概述
本發明開發一種使用整合式微流體LAMP系統，可快速檢測標靶核酸片段。
本發明提供一種快速檢測標靶核酸片段之套組，該標靶核酸片段包含一純化辨識片段及一擴增特異片段，該套組包含：一磁珠，其連結至可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸；針對該擴增特異片段所設計之一內引子對及一外引子對，該內引子對及該外引子對係適用於圈環形核酸擴增反應；及圈環形核酸擴增反應所需之試劑。
本發明亦提供一種檢測魚體病原之套組，其係偵測一檢體中是否包含病原標靶核酸片段，該套組包含前述之快速檢測標靶核酸片段之套組。
本發明再提供一種快速檢測標靶核酸片段之方法，該標靶核酸片段包含一純化辨識片段及一擴增特異片段，該方法包含：
(a)　以一磁珠純化核酸，其中該磁珠連結至可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸；
(b)　以針對該擴增特異片段所設計之一內引子對及一外引子對與由步驟(a)之核酸進行圈環形核酸擴增反應，其中該內引子對及該外引子對係適用於圈環形核酸擴增反應；及
(c)　檢測圈環形核酸擴增反應之產物。
本發明又提供一種檢測魚體病原之方法，其係偵測一檢體中是否包含病原標靶核酸片段，該方法包含前述之快速檢測標靶核酸片段之方法。
發明詳細說明
本發明提供一種快速檢測標靶核酸片段之套組，該標靶核酸片段包含一純化辨識片段及一擴增特異片段，該套組包含：一磁珠，其連結至可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸；針對該擴增特異片段所設計之一內引子對及一外引子對，該內引子對及該外引子對係適用於圈環形核酸擴增反應；及圈環形核酸擴增反應所需之試劑。
根據本發明之該標靶核酸片段較佳係為病原體之特異核酸片段或免疫相關基因，可用以檢測病原體感染。於本發明之較佳具體實施例中，該標靶核酸片段係選自由神經壞死病毒特異片段、虹彩病毒特異片段、弧菌特異片段及石斑魚免疫基因Mx所組成之群。更佳地，該標靶核酸片段係為神經壞死病毒特異片段。NNV含有兩段正義單股RNA(ssRNA)，亦即NNV之分別編碼RNA依賴性RNA聚合酶及主要鞘蛋白的RNA1及RNA2(Mori等人，1992，Virology 187，368-371；Nishizawa等人，1997，Appl. Environ. Microbiol. 63，1633-1636)，可作為根據本發明之標靶核酸片段。
根據本發明，該純化辨識片段係為該標靶核酸片段中一具特異性之片段，可用以純化且與檢體中其他核酸片段區隔。本發明所屬技術領域中具通常知識者可利用相關商用序列分析軟體取得該純化辨識片段。
根據本發明，該擴增特異片段係為該標靶核酸片段中一具特異性之片段，經擴增後可與檢體中其他核酸片段區隔。本發明所屬技術領域中具通常知識者可利用相關商用序列分析軟體取得該擴增特異片段。
較佳地，根據本發明，於標靶核酸片段中，該純化辨識片段與擴增特異片段之距離為自約200 bp至約500 bp。此等距離便於純化後，進行圈環形核酸擴增反應，可得較佳之反應效率。
根據本發明之磁珠及連結於其上之可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸係用以自檢體中純化該標靶片段，並便於後續之核酸擴增反應操作。本發明所屬技術領域中具通常知識者可選擇合宜之磁珠材質及尺寸，於本發明之一較佳具體實施例中，該磁珠之直徑係為自約1 μm至約5.0 μm，該等尺寸同時適合於連結可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸，及後續之核酸擴增反應。
根據本發明將可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸連結至該磁珠之方法，係為本發明所屬技術領域中具通常知識者依本說明書之揭示可完成者。習用之寡核苷酸與磁珠間之連結方式可應用於本發明中。於本發明之一較佳具體實施例中，該磁珠與該可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸係經醯胺(amide)鍵或羧酸酯(carboxylate)鍵連結。
根據本發明，可與該純化辨識片段雜合之該寡核苷酸係用以藉雜合作用，使具互補特性之該可與純化辨識片段雜合之寡核苷酸與該標靶核酸之純化辨識片段雜合，並藉由磁珠之磁力作用，將該經雜合作用之片段純化，再者，此雜合之兩股片段可於隨後之圈環形核酸擴增反應中分離，而進行擴增反應。
根據本發明之可與純化辨識片段雜合之該寡核苷酸片段長度及序列為視該純化辨識片段而定，本發明所屬技術領域中具通常知識者可設計該純化辨識片段。於本發明之一較佳具體實施例中，可與純化辨識片段雜合之該寡核苷酸片段長度為自約20 bp至約40 bp。
根據本發明之適用於圈環形核酸擴增反應之該內引子對及外引子對與試劑係為本發明所屬技術領域中具通常知識者基於該標靶核酸片段與本說明書之例示而可設計者。例如Notomi等人，2000，Nucleic Acids Res. 28，e63文獻所述，該文獻以引用方式併入本文。
於本發明之一較佳具體實施例中，該標靶核酸片段為一RNA片段，故該套組另包含反轉錄聚合鏈反應所需之試劑，可先進行反轉錄後，再進行純化及擴增反應。
於本發明之一較佳具體實施例中，該套組包含一微流體晶片。本文中所言之「微流體晶片」乙詞係指將檢測程序中所需之元件，如樣品裝載腔室、氣動微泵、反應腔室、微閥與廢料腔室等，集中於同一晶片，再藉由外加電壓所產生的電滲流，或利用微泵或離心力等方式，驅動檢體或試劑在各元件間相連的微通道中移動，以完成檢測。微流體晶片亦稱「實驗室平台晶片」。利用微流體晶片進行生物醫學檢測或分析具有降低人工操作的實驗誤差、提高系統穩定性、降低耗能及檢體用量、降低能力和節省時間等優點。
於本發明之一較佳具體實施例中，包含微流體控制模組及等溫擴增模組之微流體晶片示於圖1。該微流體控制模組包含一具有金屬化圖案之玻璃基板及兩聚二甲基矽氧烷(PDMS)層，其中該PDMS層包含一具有用於微流體通道之結構的厚PDMS層及一用於空氣腔室之薄膜PDMS膜。該微流體控制模組包含一個樣品裝載腔室、一個純化/熱溶解/LAMP反應腔室、一個廢料腔室及兩組具有通常關閉之微閥的氣動微泵。此等閥係設計成用於液體傳遞且防止回流入微型系統中。該模組之最佳設計參數、微型製造及表徵係如Yang等人，2009所述(Yang等人，2009，Microfluid. Nanofluid. 6,823-833)，此文獻以引用方式併入本文。
該微流體晶片之等溫擴增模組較佳係包含兩自補償陣列式微加熱器及一溫度感應器，以在熱溶解/LAMP反應腔室中產生伴有高熱均勻性之溫度分佈。該模組不使用其他控制電路，而係使用周圍具有加熱柵格的等溫擴增模組，以用作邊緣區域之補償加熱器。因此，LAMP過程之擴增效率可在具有高熱均勻性分佈之反應腔室中提高。該自補償等溫擴增模組及微型製造過程係可見於先前文獻(Hsieh等人，2009，Microfluid. Nanofluid. 6，797-809)中。同時，該晶片較佳係使用特殊應用積體電路(ASIC)控制器來控制所有組件，包括微流體控制模組及等溫擴增模組。於本發明之一較佳具體實施例中使用直接連接於由電磁閥(Electromagnetic Valve，EMV)調節之壓縮氣體罐的散熱片，其具有置放永久磁鐵及可調節磁性平台之凹穴，可在純化過程期間藉由向EMV提供數位信號而使磁性平台上之永久磁鐵自動地嚙合並滑動至凹穴中，隨後在再懸浮及LAMP過程期間使其自凹穴脫齧。因此，可準確及自動地控制樣品傳送過程及溫度場分佈。
較佳地，該套組另包含可偵測經擴增反應產物之裝置或系統。於本發明之一較佳具體實施例中，該套組另包含膠體電泳系統或吸收光偵測系統以檢測圈環形核酸擴增反應之產物。
於本發明之一較佳具體實施例中，在使用LAMP之擴增過程中，釋放焦磷酸鹽，隨後為核酸延伸，且使該鹽與鎂離子反應以引起混合物渾濁度之變化，因此，可整合光學系統以針對終產物之量感應混濁度變化，以偵測擴增產物。
於本發明之一較佳具體實施例中，另包含裂解緩衝液，以使該檢體裂解。較佳地，該裂解緩衝液可初步裂解檢體，使便於後續之純化及擴增反應。
本發明亦提供一種檢測魚體病原之套組，其係偵測一檢體中是否包含病原標靶核酸片段，該套組包含前述之快速檢測標靶核酸片段之套組。
本發明再提供一種快速檢測標靶核酸片段之方法，該標靶核酸片段包含一純化辨識片段及一擴增特異片段，該方法包含：
(a)　以一磁珠純化核酸，其中該磁珠連結至可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸；
(b)　以針對該擴增特異片段所設計之一內引子對及一外引子對與由步驟(a)之核酸進行圈環形核酸擴增反應，其中該內引子對及該外引子對係適用於圈環形核酸擴增反應；及
(c)　檢測圈環形核酸擴增反應之產物。
本發明又提供一種檢測魚體病原之方法，其係偵測一檢體中是否包含病原標靶核酸片段，該方法包含前述之快速檢測標靶核酸片段之方法。
於本發明之一較佳具體實施例中，根據本發明之方法可應用於檢測石斑魚是否感染神經壞死病毒，其可自魚組織檢體之神經壞死病毒純化RNA及快速偵測水產養殖石斑魚體內之神經壞死病毒。利用磁珠及結合可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸作為特異性探針，可特異性鑑別全組織溶解物中之標靶RNA檢體，且將其雜合於該等磁珠之表面上，隨後結合內裝式微流體控制模組及永久磁鐵自臨床檢體純化磁性複合物。另外，接著完成等溫單步RT-LAMP過程以利用晶載等溫擴增模組來擴增標靶基因。因此，根據本發明之套組及方法提供一使水產養殖疾病之整個診斷在短時間內自動化的平台，而極少需要人類的干預。
為簡化RNA萃取之過程，本發明使用與磁珠結合之序列特異性探針來提供快速及靈敏偵測核酸之方法。為縮短操作時間，第一培育步驟可縮短至20分鐘或10分鐘而不影響RT-LAMP檢驗之最終結果，根據本發明之方法可在1小時內完成。
RT-LAMP檢驗已顯示為用於偵測石斑魚組織中之NNV的快速、靈敏及特異性方法。如實例中所示，與利用磁珠之兩個功能模組整合的新微流體LAMP系統用於快速RNA萃取及用於反轉錄-等溫擴增。
茲以下列實例予以詳細說明本發明，唯並不意味本發明僅侷限於此等實例所揭示之內容。
 材料及方法 實驗程序
本實例使用如圖1所示之微流體晶片進行，其利用結合探針之磁珠自受感染之石斑魚分離NNV之RNA1，隨後結合內裝式微加熱器及溫度感應器進行單步反轉錄及等溫擴增。首先對漁場中之石斑魚仔魚進行隨機取樣，隨後在1.5 mL微量離心管中用研棒進行研磨。接著啟動晶載微加熱器，當將石斑魚之組織流體裝入微流體晶片之純化腔室中時進行生物樣品之熱溶解。
接著可藉由在室溫下將結合RNA1特異性探針之磁珠裝入純化腔室中來進行所釋放之NNV之RNA1的雜合。接著，將永久磁鐵連接於晶片底部以吸引雜合之結合RNA1-探針的磁性複合物至純化腔室之表面上，隨後使用整合式微泵使洗滌緩衝液連續流過純化腔室。隨後將生物溶液中之所有其他未結合的干擾物洗滌至廢料腔室中。再將單步RT-LAMP試劑裝入樣品裝載腔室中，隨後傳送至純化腔室中以同時進行後續cDNA合成及等溫擴增，並使用具有高熱穩定性之反轉錄酶，使得包括自ssRNA合成cDNA在內之多個反應同時發生且標靶基因之等溫擴增得以進行。使用此方法，可自生物組織分離標靶病毒RNA，接著將其用於隨後鑑別與水產養殖疾病相關之遺傳型態。
實際操作步驟詳述如下：
感染性魚樣品製備
首先，對Qigu及Yong'an(Taiwan)之養殖場中感染NNV之石斑魚隨機取樣且加以收集。在病毒RNA萃取過程及晶載分析之前，將所有魚樣品(包括腦及其他組織)儲存於-80℃下。為避免大或硬的魚組織堵塞微通道，使用組織研磨機研磨魚器官以自萃取樣品中獲得病毒粒子。
探針及引子設計
為自石斑魚組織樣品純化NNV之標靶RNA1，已設計針對NNV RNA依賴性RNA聚合酶(GenBank寄存編號AY721616)之RNA1特異性探針。另外，藉由使用經純化之RNA樣品及兩組引子對進行習知RT-PCR過程來檢驗結合RNA-探針之磁珠的特異性，該等引子對包括NNV RNA1及NNV RNA2引子組，其分別由來自國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI，USA)GeneBank之寄存編號AY721616及AY721615設計得到。此外，亦開發用於LAMP過程之兩組引子，包括外引子對(NNV-F3/NNV-B3)及內引子對(NNV-FIP/NNV-BIP)。所有特異性引子組均使用Primer Explorer Software(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index) 來設計。引子組及探針序列之詳情可見於表1中。
基於磁珠之RNA1萃取及雜合
在晶載分析之前，將特異性NNV RNA1-探針利用羧酸酯鍵結合於磁珠(MAGBEAD AGT-003-05，Applied gene technologies，USA)之表面上(Hawkins等人，1994，Nucleic Acids Res. 22，4543-4544)。首先在1.5 mL微量離心管中使用研棒及200 μL溶解緩衝液[62.5 mM Tris(pH 8.3)、95 mM KCl、3.8 mM MgCl2 、12.5 mM二硫蘇糖醇(DTT)及0.63%辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)]進行研磨過程以收集全組織溶解物。接著將50 μL全組織溶解物裝入預裝有5 μL體積的結合RNA1特異性探針之磁珠的純化腔室中，以在95℃下進行病毒之熱溶解過程達5分鐘。隨後，在純化腔室中產生60℃之溫度場並保持15分鐘以使NNV之標靶RNA1與結合特異性探針之磁珠之間進行雜合反應。已針對操作溫度及反應時間最佳化雜合之溫度(58℃至65℃)及反應時間(10分鐘至45分鐘)。接著使用由永久磁鐵產生之磁場(約300高斯(Gauss))將結合標靶RNA之磁性複合物集中並收集於純化腔室之表面上，隨後結合微泵及微閥將所有其他生物物質洗滌至廢料腔室中。接著使經純化之磁性複合物再懸浮於50 μL體積之再蒸餾水(ddH2 O)中。僅使用10 μL結合RNA之磁性複合物進行隨後的單步RT-LAMP過程。或者，亦可藉由使用移液管自純化腔室萃取結合RNA之磁性複合物來儲存經純化之RNA以供進一步生物醫學應用。
單步RT-LAMP
對於單步RT-LAMP過程使用30 μL之最終反應體積且如先前所述修改LAMP反應(Notomi等人，2000，Nucleic Acids Res. 28,e63.)。將由10 μL結合標靶RNA之磁性複合物、60 pM NNV-FIP及NNV-BIP引子、10 pM NNV-F3及NNV-B3引子、3 μL 10×Bst 聚合酶反應緩衝液及1 μLBst DNA聚合酶大片段(8 U/μL，NEW ENGLAND Bio-Lab Inc.,USA)及0.5 μL ThermoScriptTM RNase H- 反轉錄酶(15 U/μL，Invitrogen，USA)組成之反應混合物裝入LAMP反應腔室中以同時進行cDNA合成及等溫擴增。在80℃下加熱樣品2分鐘，隨後由RNA1合成cDNA且在63℃下擴增cDNA之標靶區域45分鐘，藉此終止反應。RT-LAMP檢驗之擴增效率的最佳化亦藉由檢驗兩個主要反應條件，即反應溫度(57℃至67℃)及反應時間(30分鐘至90分鐘)來進行。RT-LAMP產物藉由平板電泳技術在2%瓊脂糖凝膠中加以分析。
結果及討論 微流體系統之表徵
使用包含由兩組氣動微泵及三個PDMS膜及一個浮動塊結構之微流體控制模組來準確地傳送生物樣品及防止回流。微通道下方之連續PDMS膜的分時段變形產生蠕動作用，以致當壓縮空氣依序充滿互連空氣腔室時，沿微通道驅動液體。可使用包括電磁閥(EMV)之驅動頻率(f d )及所施加之壓縮空氣壓力在內的兩個基本參數來控制樣品傳送之流動泵送速率。使用EMV(SMC Inc.,S070M-5BG-32,Japan)藉由調節EMV之操作頻率來控制微泵，以使得薄膜PDMS膜在所供應之壓縮空氣壓力下偏轉。此等參數已在先前研究中經由微泵流速之表徵而得以最佳化(Yang等人，2009，Microfluid. Nanofluid. 6，823-833)。已測得在f d =90 Hz及20 psi之空氣壓力下最大流速為900 μL/min。另外，亦已顯示能夠提高流動泵送速率之通常關閉之微閥的浮動塊結構可在微通道中成功阻斷液體樣品。薄膜PDMS膜及置於浮動塊結構底部之另一空氣腔室允許PDMS膜偏轉以使得流體可流過微通道中之閥結構。應注意，浮動塊結構不與薄膜PDMS膜結合且可用於防止回流產生，使得流體可僅在一個方向上流動。可在f d =90 Hz及20 psi之空氣壓力下產生高達8509 N/m2 之回壓。因此，微流體控制模組能夠在微流體通道內傳送樣品/試劑或阻斷流體。
除微流體控制模組外，亦整合包含兩組微加熱器及一個溫度感應器之自補償陣列式等溫擴增模組以用於擴增標靶基因。儘管微加熱器具有高溫勻變速率，但反應腔室內之熱均勻性亦為RT-LAMP過程期間之重要因素。發現反應腔室內之溫度均勻分佈，其在設定點之變化小於0.5℃(Hsieh等人，2009，Microfluid. Nanofluid. 6，797-809)。因此，此原型微流體LAMP系統之均勻溫度分佈能夠使等溫擴增以高擴增效率完成。
RNA -探針雜合及單步RT-LAMP過程之最佳化
用於快速病毒RNA萃取及單步RT-LAMP過程之微流體LAMP系統的操作條件已藉由測試五個關鍵實驗因素而得以最佳化，該等因素亦即(1)單步RT-LAMP過程期間之反應溫度、(2)單步RT-LAMP過程之反應時間、(3)結合RNA-探針之磁珠的特異性、(4)RNA雜合之反應溫度及(5)RNA雜合過程之反應時間。在單步RT-LAMP過程期間對此等因素之實驗檢驗首先利用習知thermo-block PCR機(MyCyclerTM 熱循環儀，BioRad，USA)來進行且如圖2中所示。圖2(a)展示在不同反應溫度下單步RT-LAMP檢驗之實驗結果。測試範圍為57℃(泳道1)至67℃(泳道6)之反應溫度。
發現NNV RNA1之標靶基因已在介於57℃(泳道1)與65℃(泳道5)之間的等溫溫度條件下成功地擴增(圖2(a))。結果顯示可在單步RT-LAMP過程期間使用61℃之最佳反應溫度分佈。LAMP過程之反應時間亦被視為單步RT-LAMP檢驗之主要實驗參數。結果顯示，標靶基因亦可藉由使用thermo-block PCR機在約60分鐘內擴增。此外，組織樣品中之NNV的標靶RNA1可藉由與結合RNA1特異性探針之磁珠雜合快速地加以純化及萃取。類似地，已測試在58℃(泳道1)、60℃(泳道2)、63℃(泳道3)及65℃(泳道4)之不同溫度條件下的雜合且如圖2(b)中所示，隨後進行標準單步RT-PCR過程。發現NNV RNA1已在60℃(泳道2)之溫度下成功地雜合及擴增。此外，亦已測試雜合之反應時間且結果顯示，NNV之標靶RNA1亦可在約15分鐘內結合於磁珠之表面上。然而，為協調整個診斷過程期間之溫度場，將反應腔室設定為60℃之溫度以完成整個檢驗，包括RNA雜合及RT-LAMP過程。因此，所提出之RNA純化及單步RT-LAMP檢驗可使用以下三個最佳化步驟來完成：(1)在95℃下進行熱溶解達5分鐘、(2)在60℃下進行RNA雜合達15分鐘及(3)在60℃下進行單步RT-LAMP達60分鐘。
所開發之用於RNA純化及等溫擴增的方案亦以自動方式在整合式微流體LAMP系統中進行。應注意，單步RT-LAMP試劑之組成與先前所述者相同，除了當用於微流體系統中時，其按比例減少一半，最終體積為15 μL。圖3展示由thermo-block PCR機與微流體LAMP系統所進行之習知單步RT-LAMP之間的反應時間比較。在微流體LAMP系統之泳道3(在60℃下45分鐘)中觀察到成功擴增，此表明等溫擴增可在較短時間內利用微型系統來完成。顯著地，高擴增效率可由於具有自補償溫度控制模組之微流體LAMP系統所產生之均勻分佈的溫度場而達成。
因此，具有高擴增效率之單步RT-LAMP過程可在較短時間內達成。
靈敏度
RT-LAMP方案的靈敏度如圖4中所示。在42℃下經60分鐘培育由2 μg所萃取之總RNA、2 μM隨機六聚體、0.4 μM dNTP、5 μL 5反轉錄酶工作緩衝液及200 U MMLV反轉錄酶(Promega，USA)製備10 ng NNV cDNA樣品。使用此等所測試之cDNA樣品進行10倍連續稀釋且在習知RT-PCR過程(圖4(a))與單步RT-LAMP檢驗(圖4(b))中進行測試。
所開發之系統的偵測極限見於圖4(a)之泳道4及圖4(b)之泳道7。亦即，分別成功地偵測1-10 pg用於習知RT-PCR過程之cDNA及10-100 fg用於單步RT-LAMP檢驗之cDNA。檢驗到與傳統單步RT-PCR方案相比，所提出之單步RT-LAMP方案具有高靈敏度。
特異性
高特異性為本發明之主要優點之一，因為僅標靶RNA將結合於結合探針之磁珠的表面上。接著，利用自感染NNV之石斑魚、登革熱病毒、B型肝炎病毒、A型流感病毒、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、弧菌屬及人類肺癌A549細胞萃取的不同總DNA/RNA樣品來檢驗所開發之方案的特異性。應注意，DNA/RNA模板藉由在95℃下進行熱溶解而經萃取且所萃取之10 ng樣品各用於NNV-LAMP偵測中。可利用單步RT-LAMP檢驗達成對自不同養殖場分離之感染NNV之石斑魚的高特異性。NNV-RT-LAMP之反應特異性亦藉由使用上述不同來源之RNA/DNA進行交叉反應性檢驗來測定(圖5)。自結果明顯觀察到，僅自感染NNV之石斑魚萃取的樣品成功地擴增。因此，結果顯示所提出之單步RT-LAMP檢驗的高特異性，因為利用具有特異性探針之磁珠自臨床樣品成功地捕捉及分離標靶RNA。
<110>　國立成功大學
<120>　快速檢測標靶核酸片段之套組及方法
<130>　無
<160>　5
<170>　PatentIn version 3.3
<210>　1
<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<400>　1
<210>　2
<211>　19
<212>　DNA
<213>　人工序列
<400>　2
<210>　3
<211>　46
<212>　DNA
<213>　人工序列
<400>　3
<210>　4
<211>　42
<212>　DNA
<213>　人工序列
<400>　4
<210>　5
<211>　31
<212>　DNA
<213>　人工序列
<400>　5
圖1為包含微流體控制模組及核酸擴增模組之整合式微流體LAMP系統圖，測得微流體晶片之尺寸為44 mm×22 mm。
圖2顯示單步RT-LAMP檢驗之最佳條件。(a)反應溫度最佳化。泳道1-6分別指示在57℃、59℃、61℃、63℃、65℃及67℃下進行之RT-LAMP的結果。泳道L：50-bp DNA梯狀條帶。泳道NC使用ddH2 O。(b)結合RNA1-探針之磁珠的雜合溫度最佳化。泳道1-4分別表示在58℃、60℃、63℃及65℃下使用與來自NNV RNA1之cDNA預雜合的探針之RT-LAMP之結果。泳道L：50-bp DNA梯狀條帶。泳道NC：ddH2 O。
圖3為使用習知PCR機與微流體LAMP系統之NNV偵測的反應時間比較。泳道L：100-bp DNA梯狀條帶。泳道1-3及泳道4-6分別為使用微流體LAMP系統及習知LAMP之結果。泳道1、4指示RT-LAMP進行75分鐘，泳道2、5及泳道3、6指示RT-LAMP分別進行60分鐘及45分鐘。
圖4為RT-LAMP與RT-PCR檢驗之靈敏度比較。(a)RT-PCR產物；(b)RT-LAMP產物。泳道L：50-bp DNA梯狀條帶，泳道NC：使用ddH2 O之陰性對照組，泳道1-8：來自NNV RNA1之10-ng cDNA的10-1 稀釋液。
圖5為感染NNV之石斑魚及非NNV測試樣品之RT-LAMP檢驗的特異性(泳道L：50-bp DNA梯狀條帶，泳道NC：使用ddH2 O之陰性對照組，泳道1：來自感染NNV之石斑魚的RNA，泳道2-8指示所測試之樣品分別來自登革熱病毒(Dengue virus)、HBV、A型流感病毒(influenza A virus)、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、弧菌屬(Vibrio spp.)及人類A549細胞。對於RT-LAMP使用10 ng DNA/RNA)。
(無元件符號說明)

Claims (22)

  1. 一種檢測魚體神經壞死病毒病原之套組，其係偵測一檢體中是否包含魚體病原標靶核酸片段，該魚體病原標靶核酸片段包含一擴增特異片段，該套組包含：一內引子對及一外引子對，其針對該擴增特異片段所設計，該內引子對及該外引子對係適用於圈環形核酸擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)反應，其中該內引子對具有SEQ ID Nos：3及4所示之序列及該外引子對具有SEQ ID Nos：1及2所示之序列；及試劑，用於圈環形核酸擴增反應。
  2. 根據請求項1之套組，其中該魚體病原標靶核酸片段另包含一純化辨識片段，該套組包含一可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸，且該可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸具有SEQ ID No：5所示之序列。
  3. 根據請求項1之套組，其中該魚體病原標靶核酸片段另包含一純化辨識片段，該套組包含一可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸及一磁珠，該磁珠連結至該可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸。
  4. 根據請求項3之套組，其中該磁珠之直徑係為自約1μm至約5.0μm。
  5. 根據請求項3之套組，其中磁珠與該可與該純化辨識片段雜合之該寡核苷酸係經醯胺(amide)或羧酸酯(carboxylate)鍵連結。
  6. 根據請求項3之套組，其中該可與該純化辨識片段雜合 之該寡核苷酸之長度為自約20bp至約40bp。
  7. 根據請求項2或3之套組，其中於魚體病原標靶核酸片段中，該純化辨識片段與擴增特異片段之距離為自約200bp至約500bp。
  8. 根據請求項1至6任何一項之套組，其另包含反轉錄聚合反應所需之試劑。
  9. 根據請求項1至6任何一項之套組，其另包含一微流體晶片。
  10. 根據請求項1至6任何一項之套組，其另包含膠體電泳系統或吸收光偵測系統(absorbance detection system)以檢測圈環形核酸擴增反應之產物。
  11. 根據請求項1至6任何一項之套組，其另包含裂解緩衝液，以使該檢體裂解。
  12. 一種檢測魚體神經壞死病毒病原之方法，其係檢測一檢體中是否包含魚體病原標靶核酸片段，該魚體病原標靶核酸片段包含一擴增特異片段，該方法包含：(a)以針對該擴增特異片段所設計之一內引子對及一外引子對與由該檢體中之核酸進行圈環形核酸擴增反應，其中該內引子對及該外引子對係適用於圈環形核酸擴增反應，其中該內引子對具有SEQ ID Nos：3及4所示之序列及該外引子對具有SEQ ID Nos：1及2所示之序列；及(b)檢測圈環形核酸擴增反應之產物。
  13. 根據請求項12之方法，其中該魚體病原標靶核酸片段另 包含一純化辨識片段，且該方法另包含(i)以一可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸純化該檢體中之核酸；其中該可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸具有SEQ ID No：5所示之序列。
  14. 根據請求項12之方法，其中該魚體病原標靶核酸片段另包含一純化辨識片段，且該方法另包含(ii)以一磁珠純化核酸，其中該磁珠連結至一可與該純化辨識片段雜合之寡核苷酸。
  15. 根據請求項14之方法，其中該磁珠之直徑係為自約1μm至約5.0μm。
  16. 根據請求項14之方法，其中該磁珠與可與該純化辨識片段雜合之該寡核苷酸係經醯胺鍵或羧酸酯鍵連結。
  17. 根據請求項14之方法，其中可與該純化辨識片段雜合之該寡核苷酸之長度為自約20bp至約40bp。
  18. 根據請求項13或14之方法，其中於魚體病原標靶核酸片段中，該純化辨識片段與擴增特異片段之距離為自約200bp至約500bp。
  19. 根據請求項12至17任何一項之方法，其於步驟(a)前另包含以該檢體中之核酸進行反轉錄聚合反應之步驟。
  20. 根據請求項12至17任何一項之方法，其係於一微流體晶片上進行。
  21. 根據請求項12至17任何一項之方法，其中步驟(b)係以膠體電泳系統或吸收光偵測系統檢測圈環形核酸擴增反應之產物。
  22. 根據請求項12至17任何一項之方法，其於步驟(a)前另包含以裂解緩衝液裂解該檢體之步驟。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI461541B (zh) 2012-07-23 2014-11-21 Univ Nat Cheng Kung 檢測動物或植物病原之引子組、方法及套組
KR101557844B1 (ko) 2013-11-29 2015-10-06 한국해양과학기술원 이리도바이러스를 검출하기 위한 등온증폭 반응용 프라이머 세트, 이를 포함하는 프라이머 조성물, 및 이를 이용한 이리도바이러스 검출방법
DE102014221345A1 (de) * 2014-10-21 2016-05-04 Robert Bosch Gmbh Verfahren und Vorrichtung zum Bestimmen zumindest eines Parameters eines Analysematerials in einem Analysepuffer unter Verwendung einer Reaktionskammer
WO2017184845A1 (en) * 2016-04-20 2017-10-26 The Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona Methods and systems for rna or dna detection and sequencing
GB201703233D0 (en) 2017-02-28 2017-04-12 Ge Healthcare Bio Sciences Ab A modular bio-processing unit and a bio-processing system employing plural units
CN109355429B (zh) * 2018-11-13 2022-04-15 湖南工程学院 基于微流控微珠阵列芯片循环核酸检测试剂盒及应用方法
CN110575852B (zh) * 2019-07-25 2020-08-11 浙江大学 一种集成样品前处理的多重数字rpa微流控芯片
CN113430106A (zh) * 2021-06-15 2021-09-24 皖南医学院 一种新型可视化病原体核酸快速检测芯片
CN118086596A (zh) * 2024-04-22 2024-05-28 中国海洋大学三亚海洋研究院 一种用于检测石斑鱼神经坏死病毒的引物组、试剂盒及其应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3313358B2 (ja) * 1998-11-09 2002-08-12 栄研化学株式会社 核酸の合成方法
US6672458B2 (en) * 2000-05-19 2004-01-06 Becton, Dickinson And Company System and method for manipulating magnetically responsive particles fluid samples to collect DNA or RNA from a sample
KR20050010902A (ko) * 2002-06-12 2005-01-28 카이론 코포레이션 Ａ형 간염 바이러스 핵산의 포획, 검출 및 정량을 위한올리고뉴클레오티드의 동정방법
EP2250283A2 (en) * 2008-02-12 2010-11-17 Nugen Technologies, Inc. Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions
KR20120051709A (ko) * 2009-07-21 2012-05-22 인터젠엑스 인크. 미세유체 장치 및 이의 용도

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