TWI461541B

TWI461541B - 檢測動物或植物病原之引子組、方法及套組

Info

Publication number: TWI461541B
Application number: TW101126506A
Authority: TW
Inventors: Gwo Bin Lee; Wen Hsin Chang; Chih Hung Wang; Tzong Yueh Chen; ting yu Wang; Long Huw Lee; Jia Ling Yang; hui liang Wang; I Chin Wang; Chih Chieh Chuang; Fuh Jyh Jan; ping chen Li
Original assignee: Univ Nat Cheng Kung
Priority date: 2012-07-23
Filing date: 2012-07-23
Publication date: 2014-11-21
Also published as: TW201404884A; US9238839B2; US20140024014A1

Description

檢測動物或植物病原之引子組、方法及套組

本發明係有關一種動物或植物病原之檢驗技術，詳言之，係有關利用圈環形核酸擴增反應(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)系統檢測動物或植物病原之技術。

核酸片段之檢測於各領域中應用廣泛且重要，例如快速且準確檢測一核酸標靶片段可迅速診斷病原感染，以供提早防治。

我國以農立國，農業曾對臺灣國內生產毛額有著極大的貢獻，但隨著社會變遷及國民所得的提高，近年來經濟結構已轉型為以工商服務業為主，臺灣農業目前面臨內在產業結構的變化，世界糧食供需不穩定及氣候變遷等嚴峻考驗，亦因疾病感染率過高而面臨瓶頸，故降低疾病感染率為精緻農業開發面臨的挑戰之一。

而動植物檢疫工作為國際間通行的重要措施，目的為避免或減少動植物及其產品遭受傳染病之危害，以維護國人健康。民國86年我國發生口蹄疫，共投注一百五十億於防疫工作，估計約造成一千七百億之經濟損失。若能早期診斷及早期進行防疫工作，則更能降低農民及國家的經濟損失。因此目前在國際前瞻性或國內重點研究領域中，動植物防檢疫之診斷鑑定技術的研究開發都是其中極為重要的核心目標。唯有在快速且靈敏的診斷鑑定技術協助下，生物監測、檢查、驗證、防治、及風險分析等防檢疫工作才能有效執行與落實，因此動植物防檢疫診斷鑑定技術的突破，是協助防疫檢疫政策與工作落實的核心環節。但是目前對於動植物防檢疫診斷鑑定技術開發工作仍缺乏積極有效的整合，因此雖有技術上點的突破，但難有全面性發展。

隨著分子診斷技術之發展，具有快速及高專一性與靈敏度的優勢，已成為動植物防檢疫中不可或缺的一環。目前以聚合酶鏈反應(PCR)技術進行核酸片段的增幅漸為專家與相關機構所接受，例如，基於結合供核酸擴增之特異性引子組之聚合酶鏈反應分子診斷已顯示可高靈敏度及特異性地準確診斷水產養殖疾病，例如反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)(Dhar等人，2002，J.Virol.Methods 104，69-82；Nishizawa等人，1995，J.Gen.Virol.76，1563-1569)或定量即時PCR(DallaValle等人，2005，Vet.Microbiol.110，167-179)，其中習知RT-PCR方法(Nishizawa等人，1995，J.Gen.Virol.76，1563-1569)係為當前用於偵測魚類病原之「黃金標準方法」，目前已證明在RT-PCR檢驗中活體外轉錄之病毒RNA的偵測極限為100至1000個複本(Grotmol等人，2000，Dis.Aquat.Organ.39，79-88)。

然而此等技術仍存在一些缺點，諸如需要昂貴且龐大的熱循環器、多個複雜的操作過程及低擴增效率等(Mori等人，2001，Biochem.Biophys.Res.Commun.289，150-154；Tomita等人，2008，Nat.Protoc.3，877-882)。樣品預處理亦為在技術上要求高且耗時的步驟。RNA萃取之品質會影響RNA-病毒診斷之結果。熱苯酚萃取或RNA純化套組為用於RNA純化及分離之常見方法。另一方面，基於PCR平台在技術上要求高，在溫度變化範圍為42℃至95℃之熱循環期間必需精確溫度控制，其通常由昂貴且龐大的裝置進行，此外漫長且昂貴的診斷過程始終需要由訓練有素的人員進行，且此等人工操作亦可能造成診斷不精確。

因此，業界另開發利用標靶核酸在恆定且低溫下指數擴增之「等溫擴增技術」，以用於快速偵測標靶DNA序列(Piepenburg等人，2006，PLoS Biol.4，e204；Starkey等人，2004，Dis.Aquat.Organ.59，93-100；Walker等人，1994，Nucleic Acids Res.22，2670-2677)，其中圈環形核酸擴增技術引起相當大的關注，可作為用於核酸擴增之潛在快速、準確及節省成本之方法。檢體中之標靶核酸序列可藉由使用四種指定引子，結合能夠在等溫條件(約60-65℃)下進行高度股置換之Bst DNA聚合酶來擴增(Notomi等人，2000，Nucleic Acids Res.28，e63)。圈環形核酸擴增技術包括初始步驟、循環擴增步驟及延長步驟在內之三個主要步驟皆在恆定熱條件下進行，且因為在LAMP過程期間無需花費時間進行溫度改變，故可達成有效擴增(Nagamine等人，2002，Mol.Cell.Probes 16，223-229)。另外，由具有多個環之類似花椰菜結構組成的最終擴增之莖-環DNA可產生標靶DNA分子之10⁹ 個複本的擴增，因此顯示LAMP擴增之靈敏度為習知PCR方法之約100倍。因此，LAMP技術係為快速及準確偵測標靶基因之新診斷策略。舉例而言，已報導藉由靶向溶血素基因對來自受感染之日本鰈魚的遲鈍愛德華菌(Edwardsiella tarda )進行基於LAMP之偵測(Savan等人，2004，Appl.Environ.Microbiol.70，621-624)，亦報導使用兩步驟RT-LAMP技術於鑑別魚之與感染性造血壞死病毒(IHNV)相關之G蛋白(Gunimaladevi等人，2005，Arch.Virol.150，899-909)。儘管LAMP技術具有吸引力，但在開發利用此等當前實驗室技術之快速診斷技術仍存在一些潛在缺點，整個核酸擴增過程成本仍相當昂貴且勞動強度大，且必須利用實驗室規模設備，諸如移液管及使用相對大量生物檢體/試劑之龐大加熱器。更重要的是，在分析之前，始終需要諸如DNA/RNA萃取之生物檢體預處理過程，此需要由有經驗的人員進行。再者，在整個檢測過程期間生物檢體存在高污染風險，導致無法在現場檢測，並妨礙實際應用。

因此，亟需開發以高特異性及靈敏度以自動方式進行所有診斷過程之整合式檢體-結果系統(sample-to-answer system)。

發明概述

本發明藉由提出一套利用專一性核酸探針磁珠與恆溫圈環形核酸擴增進行動物或植物病原體之快速檢測，具有簡化核酸萃取與純化、恆溫反應及高專一性與高靈敏度的優勢，此將有助於即時且快速篩檢動物或植物病原體。本發明使用專一性核酸探針與恆溫圈環形核酸擴增進行多種動物或植物病原體之快速診測，具有高檢測靈敏度、高專一性、低樣品及檢體消耗量、低耗能、成本低及反應時間短等優點，相較傳統分析檢測技術下，有著突破性的發展即具發展潛力與市場價值。

本發明提供一種適用於圈環形核酸擴增反應之引子組，其係選自由第一至十四引子組所組成之群，其中：第一引子組包含SEQ ID Nos.1至4或其互補股之引子；第二引子組包含SEQ ID Nos.6至9或其互補股之引子；第三引子組包含SEQ ID Nos.11至14或其互補股之引子；第四引子組包含SEQ ID Nos.16至19或其互補股之引子；第五引子組包含SEQ ID Nos.21至24或其互補股之引子；第六引子組包含SEQ ID Nos.26至29或其互補股之引子；第七引子組包含SEQ ID Nos.31至34或其互補股之引子；第八引子組包含SEQ ID Nos.36至39或其互補股之引子；第九引子組包含SEQ ID Nos.41至44或其互補股之引子；第十引子組包含SEQ ID Nos.46至49或其互補股之引子；第十一引子組包含SEQ ID Nos.51至54或其互補股之引子；第十二引子組包含SEQ ID Nos.56至59或其互補股之引子；第十三引子組包含SEQ ID Nos.61至64或其互補股之引子；及第十四引子組包含SEQ ID Nos.66至69或其互補股之引子。

本發明亦提供一種探針，其係選自由SEQ ID Nos.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 及其互補股所組成之群。

本發明再提供一種檢測動物或植物病原之方法，其包含使用至少一前述之引子組與待測樣品中之核酸進行圈環形核酸擴增反應，如有至少一擴增反應發生，則該待測樣品包含動物或植物病原。

本發明又提供一種檢測動物或植物病原之套組，其包含前述之引子組。

發明詳細說明

本發明提供一種適用於圈環形核酸擴增反應之引子組，其係選自由第一至十四引子組所組成之群，其中：第一引子組包含SEQ ID Nos.1至4或其互補股之引子；第二引子組包含SEQ ID Nos.6至9或其互補股之引子；第三引子組包含SEQ ID Nos.11至14或其互補股之引子；第四引子組包含SEQ ID Nos.16至19或其互補股之引子；第五引子組包含SEQ ID Nos.21至24或其互補股之引子；第六引子組包含SEQ ID Nos.26至29或其互補股之引子；第七引子組包含SEQ ID Nos.31至34或其互補股之引子；第八引子組包含SEQ ID Nos.36至39或其互補股之引子；第九引子組包含SEQ ID Nos.41至44或其互補股之引子；第十引子組包含SEQ ID Nos.46至49或其互補股之引子；第十一引子組包含SEQ ID Nos.51至54或其互補股之引子；第十二引子組包含SEQ ID Nos.56至59或其互補股之引子；第十三引子組包含SEQ ID Nos.61至64或其互補股之引子；及第十四引子組包含 SEQ ID Nos.66至69或其互補股之引子。

本文所使用之「互補股」一詞係指可與根據本發明之引子或探針雜合之核酸分子，較佳係可與根據本發明之引子或探針鹼基完全互補之核酸分子。

根據本發明之該第一引子組係針對抗病毒蛋白(Mx)所設計，其中SEQ ID No.1為外引子對之正向引子；SEQ ID No.2為外引子對之反向引子；SEQ ID No.3為內引子對之正向引子；SEQ ID No.4為內引子對之反向引子。

根據本發明之該第二引子組係針對弧菌(Vibrio spp.)所設計，其中SEQ ID No.6為外引子對之正向引子；SEQ ID No.7為外引子對之反向引子；SEQ ID No.8為內引子對之正向引子；SEQ ID No.9為內引子對之反向引子。

根據本發明之該第三引子組係針對傳染性喉頭氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis virus，ILTV)所設計，其中SEQ ID No.11為外引子對之正向引子；SEQ ID No.12為外引子對之反向引子；SEQ ID No.13為內引子對之正向引子；SEQ ID No.14為內引子對之反向引子；較佳地，該第三引子組另包含SEQ ID No.75之輔助正向引子及SEQ ID No.76之輔助反向引子。

根據本發明之該第四引子組係針對新城雞病病毒(newcastle disease virus，NDV)所設計，其中SEQ ID No.16為外引子對之正向引子；SEQ ID No.17為外引子對之反向引子；SEQ ID No.18為內引子對之正向引子；SEQ ID No.19為內引子對之反向引子。

根據本發明之該第五引子組係針對家禽里奧病毒(avian reovirus，ARV)所設計，其中SEQ ID No.21為外引子對之正向引子；SEQ ID No.22為外引子對之反向引子；SEQ ID No.23為內引子對之正向引子；SEQ ID No.24為內引子對之反向引子；較佳地，該第五引子組另包含SEQ ID No.77之輔助正向引子及SEQ ID No.78之輔助反向引子。

根據本發明之該第六引子組係針對禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)所設計，其中SEQ ID No.26為外引子對之正向引子；SEQ ID No.27為外引子對之反向引子；SEQ ID No.28為內引子對之正向引子；SEQ ID No.29為內引子對之反向引子；較佳地，該第六引子組另包含SEQ ID No.79之輔助正向引子及SEQ ID No.80之輔助反向引子。

根據本發明之該第七引子組係針對黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)所設計，其中SEQ ID No.31為外引子對之正向引子；SEQ ID No.32為外引子對之反向引子；SEQ ID No.33為內引子對之正向引子；SEQ ID No.34為內引子對之反向引子。

根據本發明之該第八引子組係針對煙草鑲嵌病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)所設計，其中SEQ ID No.36為外引子對之正向引子；SEQ ID No.37為外引子對之反向引子；SEQ ID No.38為內引子對之正向引子；SEQ ID No.39為內引子對之反向引子。

根據本發明之該第九引子組係針對細菌性軟腐病菌 (Pectobacterium carotovorum subsp.Carotovorum)所設計，其中SEQ ID No.41為外引子對之正向引子；SEQ ID No.42為外引子對之反向引子；SEQ ID No.43為內引子對之正向引子；SEQ ID No.44為內引子對之反向引子。

根據本發明之該第十引子組係針對瓜類細菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)所設計，其中SEQ ID No.46為外引子對之正向引子；SEQ ID No.47為外引子對之反向引子；SEQ ID No.48為內引子對之正向引子；SEQ ID No.49為內引子對之反向引子。

根據本發明之該第十一引子組係針對蘭花惠蘭嵌紋病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)所設計，其中SEQ ID No.51為外引子對之正向引子；SEQ ID No.52為外引子對之反向引子；SEQ ID No.53為內引子對之正向引子；SEQ ID No.54為內引子對之反向引子；較佳地，該第十一引子組另包含SEQ ID No.71之輔助反向引子。

根據本發明之該第十二引子組係針對齒舌蘭輪斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)所設計，其中SEQ ID No.56為外引子對之正向引子；SEQ ID No.57為外引子對之反向引子；SEQ ID No.58為內引子對之正向引子；SEQ ID No.59為內引子對之反向引子；較佳地，該第十二引子組另包含SEQ ID No.72之輔助反向引子。

根據本發明之該第十三引子組係針對番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)所設計，其中SEQ ID No.61為外引子對之正向引子；SEQ ID No.62為外引子對之反向引子；SEQ ID No.63為內引子對之正向引子；SEQ ID No.64為內引子對之反向引子；較佳地，該第十三引子組另包含SEQ ID No.73之輔助反向引子。

根據本發明之該第十四引子組係針對番椒黃化病毒(Capsicum chlorosis virus，CaCV)所設計，其中SEQ ID No.66為外引子對之正向引子；SEQ ID No.67為外引子對之反向引子；SEQ ID No.68為內引子對之正向引子；SEQ ID No.69為內引子對之反向引子；較佳地，該第十四引子組另包含SEQ ID No.74之輔助反向引子。

根據本發明之引子組可應用圈環形核酸擴增反應而檢測動物或植物病原體之存在，並可進一步鑑定病原體之種類，而可及早提供疾病防制。

根據本發明之該第一引子組至第十四引子組中之各內外引子對可於同一反應條件下進行反應，彼此間不產生交互反應，其檢測之靈敏度及專一性皆高。

於本發明之一較佳具體實施例中，可同時應用圈環形核酸擴增反應及雜合反應，以更快速且準確檢測動物或植物病原。

因此，本發明亦提供一種探針，其係選自由SEQ ID Nos.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70及其互補股所組成之群。

根據本發明之SEQ ID No.5探針係針對抗病毒蛋白所設計。

根據本發明之SEQ ID No.10探針係針對弧菌所設計。

根據本發明之SEQ ID No.15係針對傳染性喉頭氣管炎病毒所設計。

根據本發明之SEQ ID No.20係針對新城雞病病毒所設計。

根據本發明之SEQ ID No.25係針對家禽里奧病毒所設計。

根據本發明之SEQ ID No.30係針對禽流感病毒所設計。

根據本發明之SEQ ID No.35係針對黃瓜花葉病毒所設計。

根據本發明之SEQ ID No.40係針對煙草鑲嵌病毒所設計。

根據本發明之SEQ ID No.45係針對細菌性軟腐病菌所設計。

根據本發明之SEQ ID No.50係針對瓜類細菌性果斑病菌所設計。

根據本發明之SEQ ID No.55係針對蘭花惠蘭嵌紋病毒所設計。

根據本發明之SEQ ID No.60係針對齒舌蘭輪斑病毒所設計。

根據本發明之SEQ ID No.65係針對番茄斑萎病毒所設計。

根據本發明之SEQ ID No.70係針對番椒黃化病毒所設計。

探針設計原則為該探針所在位置序列不常發生變異及：1.探針長度介於17至27個核苷酸是最理想的範圍，探針過短會造成與目標DNA結合不易，過長容易產生非特異性的雜合反應；2. G+C比例介於40%至60%，以降低二級結構產生的機率；3.探針T _m 值(melting temperature)盡可能的設計在介於雜合反應(hybridization)時的雜合溫度(hybridization temperature)±5℃之間。例如雜合溫度若設定在50℃，則探針的T _m 值應該盡量為45℃至55℃；4.盡量避開可能會產生髮夾環結構(hairpin loops)、迴文結構(palindrome)或是重複鹼基(repeats)結構；5.把差異點設計在整個探針的中間位置，並在探針之3’端加入8至10個胸腺嘧啶(thymine)，以增加探針和尼龍膜(nylon membrane)的結合；設計完的探針經過BLAST搜索，以確定沒有與GenBank上其他菌種的序列相似，避免交叉反應(cross hybridization)。

本文所使用之「探針」一詞係指一包含連續至少8個核苷酸的分子，較佳為連續10至50個核苷酸，更佳為連續15至40個核苷酸，最佳為連續17至27個核苷酸。另一方面，較佳地，探針之3’端包含8至10個胸腺嘧啶。該探針可與標的DNA於雜合條件下進行雜合反應。本發明所屬技術領域中具通常知識者可決定雜合反應之條件，其中該雜合反應之較佳條件係於約40℃至約65℃中進行。

綜合上述，根據本發明之引子組及探針示於下表1：

於本發明之一較佳具體實施例中，該方法係可進一步鑑定病原之種類：如該待測樣品係源自於魚體，且該待測樣品中之核酸與該第一引子組產生擴增反應，則該魚體係經感染，且表現抗病毒蛋白；如該待測樣品中之核酸與該第二引子組產生擴增反應，則該病原包含弧菌；如該待測樣品中之核酸與該第三引子組產生擴增反應，則該病原包含傳染性喉頭氣管炎病毒；如該待測樣品中之核酸與該第四引子組產生擴增反應，則該病原包含新城雞病病毒；如該待測樣品中之核酸與該第五引子組產生擴增反應，則該病原包含家禽里奧病毒；如該待測樣品中之核酸與該第六引子組產生擴增反應，則該病原包含禽流感病毒；如該待測樣品中之核酸與該第七引子組產生擴增反應，則該病原包含黃瓜花葉病毒；如該待測樣品中之核酸與該第八引子組產生擴增反應，則該病原包含煙草鑲嵌病毒；如該待測樣品中之核酸與該第九引子組產生擴增反應，則該病原包含細菌性軟腐病菌；如該待測樣品中之核酸與該第十引子組產生擴增反應，則該病原包含瓜類細菌性果斑病菌；如該待測樣品中之核酸與該第十一引子組產生擴增反應，則該病原包含蘭花惠蘭嵌紋病毒；如該待測樣品中之核酸與該第十二引子組產生擴增反應，則該病原包含齒舌蘭輪斑病毒；如該待測樣品中之核酸與該第十三引子組產生擴增反應，則該病原包含番茄斑萎病毒；及如該待測樣品中之核酸與該第十四引子組產生擴增反應，則該病原包含番椒黃化病毒。

根據本發明之待測樣品可為包含待鑑定病原之培養物、取自動物或植物之檢體，或是自待鑑定病原培養物或自動物或植物檢體進一步處理以取得其中核酸資訊之樣品，其中動物之檢體較佳係為血液、肌肉或腦組織。

於本發明之一較佳具體實施例中，可對樣品中圈環形核酸擴增反應之產物實施標記。圈環形核酸擴增反應產物之標記方法，已為本發明所屬技術領域中具通常知識者所熟知。例如，當實施圈環形核酸擴增反應擴增時，該等引子係包含一標幟，較佳地，該標幟係為毛地黃素(digoxigenin)，或經標記之dUTP可用於將一標記引入產物。

在本發明一較佳實施例中，該方法進一步包括一陽性對照步驟。任何用於鑑定一確定片段之確定引子皆適用於此陽性對照步驟。

於本發明之一較佳具體實施例中，該方法進一步包含使用至少一探針與待測樣品中之核酸進行雜合反應，其中該至少一探針係選自由SEQ ID Nos.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70及其互補股所組成之群。

於本發明之一較佳具體實施例中，該至少一探針係連結至一磁珠上。

根據本發明之磁珠及連結於其上之該至少一探針係用以自檢體中純化該病原片段，並便於後續之核酸擴增反應操作。本發明所屬技術領域中具通常知識者可選擇合宜之磁珠材質及尺寸，於本發明之一較佳具體實施例中，該磁珠之直徑係為自約1 μm至約5.0 μm，該等尺寸同時適合於連結該至少一探針，及後續之核酸擴增反應。

根據本發明將該至少一探針連結至該磁珠之方法，係為本發明所屬技術領域中具通常知識者依本說明書之揭示可完成者。習用之寡核苷酸與磁珠間之連結方式可應用於本發明中。於本發明之一較佳具體實施例中，該磁珠與該至少一探針係經醯胺(amide)鍵或羧酸酯(carboxylate)鍵連結。

根據本發明，該至少一探針係用以藉雜合作用，使具互補特性之該至少一探針與該病原片段雜合，並藉由磁珠之磁力作用，將該經雜合作用之片段純化，再者，此雜合之兩股片段可於隨後之圈環形核酸擴增反應中分離，而進行擴增反應。

根據本發明之適用於圈環形核酸擴增反應之試劑係為本發明所屬技術領域中具通常知識者可設計者。例如Notomi等人，2000，Nucleic Acids Res.28，e63文獻所述，該文獻以引用方式併入本文。

於本發明之一較佳具體實施例中，如該病原核酸片段為一RNA片段，該方法可另包含反轉錄聚合酶反應，可先進行反轉錄後，再進行純化及擴增反應。

於本發明之一較佳具體實施例中，該方法包含(a)以該磁珠純化一檢體中之核酸；(b)以該引子組與由步驟(a)之核酸進行圈環形核酸擴增反應；及(c)檢測圈環形核酸擴增反應之產物。

本發明又提供一種檢測動物或植物病原之套組，其包含根據請前述引子組。

於本發明之一較佳具體實施例中，該套組包含前述之探針。

於本發明之一更佳具體實施例中，該套組另包含一磁珠，且該磁珠係連結該至少一探針。

於本發明之一較佳具體實施例中，該套組另包含圈環形核酸擴增反應所需之試劑。

於本發明之一較佳具體實施例中，該套組另包含反轉錄聚合酶反應所需之試劑，可先進行反轉錄後，再進行純化及擴增反應。

於本發明之一較佳具體實施例中，該套組包含一微流體晶片。本文中所言之「微流體晶片」乙詞係指將檢測程序中所需之元件，如樣品裝載腔室、氣動微泵、反應腔室、微閥與廢料腔室等，集中於同一晶片，再藉由外加電壓所產生的電滲流，或利用微泵或離心力等方式，驅動檢體或試劑在各元件間相連的微通道中移動，以完成檢測。微流體晶片亦稱「實驗室平台晶片」。利用微流體晶片進行生物醫學檢測或分析具有降低人工操作的實驗誤差、提高系統穩定性、降低耗能及檢體用量、降低能力和節省時間等優點。

於本發明之一較佳具體實施例中，包含微流體控制模組及等溫擴增模組之微流體晶片示於圖1。該微流體控制模組包含一具有金屬化圖案之玻璃基板及兩聚二甲基矽氧烷(PDMS)層，其中該PDMS層包含一具有用於微流體通道之結構的厚PDMS層及一用於空氣腔室之薄膜PDMS膜。該微流體控制模組包含一個樣品裝載腔室、一個純化/熱溶解/LAMP反應腔室、一個廢料腔室及兩組具有通常關閉之微閥的氣動微泵。此等閥係設計成用於液體傳遞且防止回流入微型系統中。該模組之最佳設計參數、微型製造及表徵係如Yang等人，2009所述(Yang等人，2009，Microfluid.Nanofluid.6,823-822)，此文獻以引用方式併入本文。

該微流體晶片之等溫擴增模組較佳係包含兩自補償陣列式微加熱器及一溫度感應器，以在熱溶解/LAMP反應腔室中產生伴有高熱均勻性之溫度分佈。該模組不使用其他控制電路，而係使用周圍具有加熱柵格的等溫擴增模組，以用作邊緣區域之補償加熱器。因此，LAMP過程之擴增效率可在具有高熱均勻性分佈之反應腔室中提高。該自補償等溫擴增模組及微型製造過程係可見於先前文獻(Hsieh等人，2009，Microfluid.Nanofluid.6，797-809)中。同時，該晶片較佳係使用特殊應用積體電路(ASIC)控制器來控制所有組件，包括微流體控制模組及等溫擴增模組。於本發明之一較佳具體實施例中使用直接連接於由電磁閥(Electromagnetic Valve，EMV)調節之壓縮氣體罐的散熱片，其具有置放永久磁鐵及可調節磁性平台之凹穴，可在純化過程期間藉由向EMV提供數位信號而使磁性平台上之永久磁鐵自動地嚙合並滑動至凹穴中，隨後在再懸浮及LAMP過程期間使其自凹穴脫齧。因此，可準確及自動地控制樣品傳送過程及溫度場分佈。

較佳地，該套組另包含可偵測經擴增反應產物之裝置或系統。於本發明之一較佳具體實施例中，該套組另包含膠體電泳系統、吸收光偵測系統(absorbance detection system)或螢光偵測系統(fluorescence detection system)以檢測圈環形核酸擴增反應之產物。

於本發明之一較佳具體實施例中，在使用LAMP之擴增過程中，釋放焦磷酸鹽，隨後為核酸延伸，且使該鹽與鎂離子反應以引起混合物渾濁度之變化，因此，可整合光學系統以針對終產物之量感應混濁度變化，以偵測擴增產物。

於本發明之一較佳具體實施例中，另包含裂解緩衝液，以使該檢體裂解。較佳地，該裂解緩衝液可初步裂解檢體，使便於後續之純化及擴增反應。

於本發明之較佳具體實施例中，本發明提出用於偵測動物或植物常見病原體之專一性探針及引子對。首先以對病原體具有專一性的探針處理磁珠表面，細胞裂解後，可特異性鑑別全組織溶解物中之病原核酸檢體，且將其雜合於該等磁珠之表面上，隨後結合內裝式微流體控制模組及永久磁鐵自檢體純化磁性複合物。另外，接著完成等溫單步LAMP過程以利用晶載等溫擴增模組來擴增標靶基因。因此，根據本發明之套組及方法提供一使水產養殖疾病之整個診斷在短時間內自動化的平台，而極少需要操作的干預。由檢體萃取核酸至取得結果僅需65分鐘，可大幅減少等待時間，再者，配合具高專一性之探針及磁珠可直接進行病原體核酸的抓取，可簡化核酸萃取與純化步驟，另一方面，根據本發明之引子組在恆溫下對病原體核酸進行擴增，經LAMP實驗證明具高專一性。

本發明之最低偵測極限可達20複本，約比傳統PCR之偵測極限高1000倍，其檢測靈敏度大幅提高，此外，LAMP使用四條引子進行反應，故專一性比傳統PCR高，可大幅減少錯誤率，可早期偵測出病原體的存在，以保護經濟價值高之漁種。

茲以下列實例予以詳細說明本發明，唯並不意味本發明僅侷限於此等實例所揭示之內容。

實例1

本實例使用如圖1所示之微流體晶片進行，其利用結合探針之磁珠自受感染之各病原分離核酸，隨後結合內裝式微冷卻器，及溫度感應器進行等溫擴增。首先對動物或植物進行隨機取樣，隨後在1.5 mL微量離心管中用研棒進行研磨。接著啟動晶載微冷卻器，當將動物或植物之組織流體裝入微流體晶片之純化腔室中時進行生物樣品之熱溶解。

接著可藉由在55至65℃將結合特異性探針之磁珠裝入純化腔室中來進行所釋放之核酸的雜合。接著，將永久磁鐵連接於晶片底部以吸引雜合之結合核酸-探針的磁性複合物至純化腔室之表面上，隨後使用整合式微泵使洗滌緩衝液連續流過純化腔室。隨後將生物溶液中之所有其他未結合的干擾物洗滌至廢料腔室中。再將LAMP試劑裝入樣品裝載腔室中，隨後傳送至純化腔室中以同時進行後續等溫擴增，使多個反應同時發生且標靶基因之等溫擴增得以進行。使用此方法，可自生物組織分離病原核酸，接著將其用於隨後鑑別病原種類。

實際操作步驟詳述如下：

感染性樣品製備

首先，將感染之動物或植物隨機取樣且加以收集。在病原核酸萃取過程及晶載分析之前，將所有樣品儲存於- 80℃下。為避免大或硬的組織堵塞微通道，使用組織研磨機研磨器官以自萃取樣品中獲得病原核酸粒子。

探針及引子設計

使用生物資訊分析網站Eiken Genome site(http：//primerexplorer.jp/elamp3.0.0/index.html)與Primer3(http：//frodo.wi.mit.edu/primer3/)選取抗病毒蛋白、弧菌、神經壞死病毒、傳染性喉頭氣管炎病毒、新城雞病病毒、家禽里奧病毒、禽流感病毒、黃瓜花葉病毒、煙草鑲嵌病毒、細菌性軟腐病菌、瓜類細菌性果斑病菌、蘭花惠蘭嵌紋病毒、齒舌蘭輪斑病毒、番茄斑萎病毒及番椒黃化病毒之引子與核酸探針，如表1所示。

基於磁珠之核酸萃取及雜合

特異性探針利用羧酸酯鍵結合於磁珠(MAGBEAD AGT-003-05，Applied gene technologies，USA)之表面上(Hawkins等人，1994，Nucleic Acids Res.22，4543-4544)。首先在1.5 mL微量離心管中使用研棒及200 μL溶解緩衝液[62.5 mM Tris(pH 8.3)、95 mM KCl、3.8 mM MgCl₂ 、12.5 mM二硫蘇糖醇(DTT)及0.63%辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)]進行研磨過程以收集全組織溶解物。接著將25 μL全組織溶解物裝入預裝有10 μL體積的特異性探針之磁珠的純化腔室中，以在90℃至97℃下進行病毒之熱溶解過程達5至15分鐘。隨後，在純化腔室中產生55℃至65℃之溫度場並保持15分鐘以使病原體之病原核酸與結合特異性探針之磁珠之間進行雜合反應。接著使用由永久磁鐵產生之磁場(約300高斯(Gauss))將結合病原核酸之磁性複合物集中並收集於純化腔室之表面上，隨後結合微泵及微閥將所有其他生物物質洗滌至廢料腔室中。接著以微泵把LAMP試劑傳送入反應中以進行隨後的單步LAMP過程。

單步LAMP

對於單步LAMP過程使用25 μL之最終反應體積且如先前所述修改LAMP反應(Notomi等人，2000，Nucleic Acids Res.28,e63.)。其反應物如下表2所示。

將反應混合物裝入LAMP反應腔室中以進行60℃等溫擴增。

LAMP產物藉由平板電泳技術在2%瓊脂糖凝膠中加以分析。

此外，本發明為了確保精確性，亦提供了以ddH₂ O取代樣品之負向控制組。

圖2顯示根據本發明可利用LAMP偵測出三種易感染石斑魚之病原微生物與一種抗病毒蛋白；圖3顯示根據本發明可利用LAMP或RT-LAMP偵測出四種易感染禽類之病原微生物；圖4顯示根據本發明可利用LAMP或RT-LAMP偵測出四種易感染植物種苗之病原微生物；圖5顯示根據本發明可利用LAMP或RT-LAMP偵測出四種易感染蘭花之病原微生物。結果顯示本發明之方法具有高度專一性。

圖1為包含微流體控制模組及核酸擴增模組之整合式微流體LAMP系統圖，測得微流體晶片之尺寸為44 mm×22 mm。

圖2為根據本發明之LAMP偵測出三種易感染石斑魚之病原微生物與一種抗病毒蛋白結果圖。(a)神經壞死病毒，泳道1：75分鐘；泳道2：60分鐘；泳道3：45分鐘；泳道L：100 bp DNA階梯標記；(b)抗病毒蛋白；泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：負向控制組(dd H₂ O)；泳道2：樣品組；(c)弧菌；泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：負向控制組(dd H₂ O)；泳道2：樣品組。

圖3為根據本發明之利用LAMP或RT-LAMP偵測出四種易感染禽類之病原微生物結果圖。(a)傳染性喉頭氣管炎病毒；泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：負向控制組(dd H₂ O)；泳道2及3：樣品組(DNA)；(b)新城雞病病毒；泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：負向控制組(dd H₂ O)；泳道2：樣品組；(c)家禽里奧病毒；泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：樣品組(RNA)；泳道2：負向控制組；(d)禽流感病毒；泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：負向控制組(dd H₂ O)；泳道2：樣品組(RNA)。

圖4為根據本發明之利用LAMP或RT-LAMP偵測出四種易感染植物種苗之病原微生物結果圖。(a)黃瓜花葉病毒；泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：傳統負向控制組；泳道2：傳統樣品組；泳道3：微流體負向控制組；泳道4：微流體樣品組；(b)細菌性軟腐病菌；泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：Aa負向控制組(dd H₂ O)；泳道2：Aa樣品組；泳道3：Pcc負向控制組(dd H₂ O)；泳道4：Pcc樣品組；(c)瓜類細菌性果斑病菌泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：負向控制組；泳道2：樣品組1；泳道3：樣品組2；(d)煙草鑲嵌病毒泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：負向控制組；泳道2：樣品組。

圖5為根據本發明之利用LAMP或RT-LAMP偵測出四種易感染蘭花之病原微生物結果圖。(a)蘭花惠蘭嵌紋病毒；泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：DEPC-H₂ O；泳道2：健康組織之RNA；泳道3：於67℃進行雜合反應；泳道4：於63℃進行雜合反應；泳道5：於60℃進行雜合反應；泳道6：於57℃進行雜合反應；(b)齒舌蘭輪斑病毒；泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：健康組織之RNA；泳道2：感染ORSV之組織；(c)番茄斑萎病毒；泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：ddH₂ O(微流體)；泳道2：健康組織之RNA(微流體)；泳道3：感染組織之RNA(微流體)；泳道4：ddH₂ O(傳統)；泳道5：健康組織之RNA(傳統)；泳道6：感染組織之RNA(傳統)；(d)番椒黃化病毒；泳道L：100 bp DNA階梯標記；泳道1：ddH₂ O(微流體)；泳道2：健康組織之RNA(微流體)；泳道3：感染組織之RNA(微流體)；泳道4：ddH₂ O(傳統)；泳道5：健康組織之RNA(傳統)；泳道6：感染組織之RNA(傳統)。

<110> 國立成功大學

<120> 檢測動物或植物病原之引子組、方法及套組

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<170> PatentIn version 3.5

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<400> 71

<210> 72

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 72

<210> 73

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 73

<210> 74

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 74

<210> 75

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 75

<210> 76

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 76

<210> 77

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 77

<210> 78

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 78

<210> 79

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 79

<210> 80

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 80

Claims

一種適用於圈環形核酸擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)反應之套組，其包含第一引子組及第二引子組，其中：第一引子組包含SEQ ID Nos.1至4或其互補股之引子；及第二引子組包含SEQ ID Nos.6至9或其互補股之引子。
根據請求項1之套組，其另包含選自第三引子組至第十四引子組之至少一引子組，其中第三引子組包含SEQ ID Nos.11至14或其互補股之引子；第四引子組包含SEQ ID Nos.16至19或其互補股之引子；第五引子組包含SEQ ID Nos.21至24或其互補股之引子；第六引子組包含SEQ ID Nos.26至29或其互補股之引子；第七引子組包含SEQ ID Nos.31至34或其互補股之引子；第八引子組包含SEQ ID Nos.36至39或其互補股之引子；第九引子組包含SEQ ID Nos.41至44或其互補股之引子；第十引子組包含SEQ ID Nos.46至49或其互補股之引子；第十一引子組包含SEQ ID Nos.51至54或其互補股之引子；第十二引子組包含SEQ ID Nos.56至59或其互補股之引子；第十三引子組包含SEQ ID Nos.61至64或其互補股之引子；及第十四引子組包含SEQ ID Nos.66至69或其互補股之引子。
根據請求項2之套組，其中該第三引子組另包含SEQ ID No.75之輔助正向引子及SEQ ID No.76之輔助反向引子；該第五引子組另包含SEQ ID No.77之輔助正向引子及SEQ ID No.78之輔助反向引子；該第六引子組另包含SEQ ID No.79之輔助正向引子及SEQ ID No.80之輔助反向引子；該第十一引子組另包含SEQ ID No.71之輔助反向引子；該第十二引子組另包含SEQ ID No.72之輔助反向引子；該第十三引子組另包含SEQ ID No.73之輔助反向引子；及該第十四引子組另包含SEQ ID No.74之輔助反向引子。
根據請求項1之套組，其另包含一種探針，其係選自由SEQ ID Nos.5、10及其互補股所組成之群。
根據請求項2之套組，其另包含一種探針，其係選自由SEQ ID Nos.15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70及其互補股所組成之群。
根據請求項4之套組，其另包含一磁珠，且該磁珠係連結該至少一探針。
根據請求項5之套組，其另包含一磁珠，且該磁珠係連結該至少一探針。
根據請求項1至7任何一項之套組，其另包含圈環形核酸擴增反應所需之試劑。
根據請求項1至7任何一項之套組，其另包含一微流體晶片。
根據請求項1至7任何一項之套組，其另包含膠體電泳系統、吸收光偵測系統(absorbance detection system)或螢光偵測系統(fluorescence detection system)以檢測圈環形核酸擴增反應之產物。
根據請求項1至7任何一項之套組，其另包含裂解緩衝液，以使一檢體裂解。
一種檢測動物或植物病原之方法，其包含使用至少一根據請求項1、4、6及8至11任何一項之套組與待測樣品中之核酸進行圈環形核酸擴增反應，如有至少一擴增反應發生，則該待測樣品包含動物或植物病原。
根據請求項12之方法，其另包含使用至少一根據請求項2、3、5及7任何一項之套組與待測樣品中之核酸進行圈環形核酸擴增反應。
根據請求項12之方法，其中：如該待測樣品係源自於魚體，且該待測樣品中之核酸與該第一引子組產生擴增反應，則該魚體係經感染，且表現抗病毒蛋白(Mx)；及如該待測樣品中之核酸與該第二引子組產生擴增反應，則該病原包含弧菌(Vibrio spp.)。
根據請求項13之方法，其中：如該待測樣品係源自於魚體，且該待測樣品中之核酸與該第一引子組產生擴增反應，則該魚體係經感染，且表現抗病毒蛋白(Mx)；如該待測樣品中之核酸與該第二引子組產生擴增反應，則該病原包含弧菌(Vibrio spp.)；如該待測樣品中之核酸與該第三引子組產生擴增反應，則該病原包含傳染性喉頭氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis virus，ILTV)；如該待測樣品中之核酸與該第四引子組產生擴增反應，則該病原包含新城雞病病毒(newcastle disease virus，NDV)；如該待測樣品中之核酸與該第五引子組產生擴增反應，則該病原包含家禽里奧病毒(avian reovirus，ARV)；如該待測樣品中之核酸與該第六引子組產生擴增反應，則該病原包含禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)；如該待測樣品中之核酸與該第七引子組產生擴增反應，則該病原包含黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)；如該待測樣品中之核酸與該第八引子組產生擴增反應，則該病原包含煙草鑲嵌病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)；如該待測樣品中之核酸與該第九引子組產生擴增反應，則該病原包含細菌性軟腐病菌(Pectobacterium carotovorum subsp.Carotovorum)；如該待測樣品中之核酸與該第十引子組產生擴增反應，則該病原包含瓜類細菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp.citrulli)；如該待測樣品中之核酸與該第十一引子組產生擴增反應，則該病原包含蘭花惠蘭嵌紋病毒(Cymbidium mosaic virus，CymMV)；如該待測樣品中之核酸與該第十二引子組產生擴增反應，則該病原包含齒舌蘭輪斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV)；如該待測樣品中之核酸與該第十三引子組產生擴增反應，則該病原包含番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus，TSWV)；及如該待測樣品中之核酸與該第十四引子組產生擴增反應，則該病原包含番椒黃化病毒(Capsicum chlorosis virus，CaCV)。
根據請求項12之方法，其另包含使用至少一探針與待測樣品中之核酸進行雜合反應，其中該至少一探針係選自由SEQ ID Nos.5、10及其互補股所組成之群。
根據請求項13之方法，其另包含使用至少一探針與待測樣品中之核酸進行雜合反應，其中該至少一探針係選自由SEQ ID Nos.、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70及其互補股所組成之群。
根據請求項16之方法，其中該至少一探針係連結至一磁珠上。
根據請求項17之方法，其中該至少一探針係連結至一磁珠上。
根據請求項12至19任何一項之方法，其另包含：(a)以該磁珠純化一檢體中之核酸；(b)以該引子組與由步驟(a)之核酸進行圈環形核酸擴增反應；及(c)檢測圈環形核酸擴增反應之產物。