CN109022618B - 一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物及其应用。根据本发明提供的成套引物由引物REO‑F3‑1，引物REO‑B3‑1，引物REO‑FIP‑1和引物REO‑BIP‑1组成，各条引物均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本发明还将上述成套引物应用于检测或辅助检测待测样品中是否含有小鼠呼肠孤病毒3型，以及鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为小鼠呼肠孤病毒3型。根据本发明建立的RT‑LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏、操作简单的特点，具有良好的应用前景和市场推广价值。

Description

一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物及其应用。

背景技术

小鼠呼肠孤病毒3型(Mouse reovirus type 3，Reo 3)在分类上属于呼肠孤病毒科(Reoviridae，正呼肠孤病毒属(Orthoreovims)。Reo 3主要通过消化道、呼吸道、空气和粪-口等途径传播，Reo-3在环境中能稳定生存是造成病毒污染的主要原因。小鼠发生感染时，急性病例主要见于新生乳鼠和断乳小鼠，慢性病例则见于28日龄以上的小鼠，其临床表现以油性被毛效应和脂肪性下痢为特征。病理变化主要表现为肝炎、脑炎和胰腺炎，它可使感染小鼠体内产生胰淀粉酶、脂肪酶活性降低，胰蛋白酶活性升高；也可破坏胰岛的β细胞，造成胰岛素分泌减少，产生类似糖尿病的代谢和病理改变，Reo 3在宿主对环境致癌物的应答中还起到免疫刺激的作用，严重干扰动物试验，是实验小鼠较严重的病毒病之一。

Reo 3也是国标《实验动物微生物学等级及监测》(GB14922.2-2011)要求SPF级实验大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠必检的项目之一，检测结果要求为阴性。定期抽样检测是预防和控制鼠群中Reo 3感染的重要手段。国标《实验动物呼肠孤病毒III型检测方法》(GB/T14926.25-2001)推荐间接ELISA方法检测小鼠血清中Reo 3抗体，间接ELISA简便快捷，但每种方法均有其局限性，以下几种情况用间接ELISA方法检测血清抗体不适用：①当小鼠感染病毒初期抗体尚未产生，或隐性带毒鼠的血清抗体水平较低，血清学检测方法有可能检不出。②裸小鼠有免疫缺陷，感染病毒后不易产生抗体，用间接ELISA方法检测易产生假阴性。③转基因小鼠存在非特异性抗体增高的现象，即特异性抗原孔OD值增高的同时，对照孔的OD值也同时增高，说明用间接ELISA方法检测费转基因小鼠病毒抗体的本底值较高，易产生假阳性。因此建立一种高效、便捷、稳定的直接检测Reo-3抗原的方法，与间接ELISA方法互为补充，以便应用于所有类型小鼠的检测对于控制Reo 3的发生具有重要意义。

环介导恒温扩增法(即LAMP法)是日本学者Notomi等在2000年发明一种新型的核酸扩增新技术。它通过内、外、环三对引物识别靶序列上的8个特异区域，和Bst DNA聚合酶在恒温(60～65℃)下形成瀑布式的核酸高效扩增。LAMP方法具有特异性强、等温高效、结果可视化、操作简单等优点，扩增效率远高于传统的核酸检测方法，因此LAMP技术自开发以来已广泛应用于细菌、病毒的定性定量检测，临床疾病的诊断，动植物中致病微生物的检测，胚胎性别鉴定等相关领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物及其应用，从而解决现有技术中缺乏有效检测小鼠呼肠孤病毒3型的方法的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物，所述成套引物由引物REO-F3-1，引物REO-B3-1，引物REO-FIP-1和引物REO-BIP-1组成，各条引物均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

所述成套引物中，所述引物REO-F3-1，引物REO-B3-1，引物REO-FIP-1和引物REO-BIP-1的摩尔比为1∶1∶8∶8。

本发明还提供一种如上所述的成套引物的应用，为如下a)或b)：a)检测或辅助检测待测样品中是否含有小鼠呼肠孤病毒3型；b)鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为小鼠呼肠孤病毒3型。

本发明还提供一种检测或辅助检测待测样品中是否含有小鼠呼肠孤病毒3型的方法，包括如下步骤：提取待测样品的总RNA，以权利要求1～2中任意一项所述成套引物进行反转录-环介导等温扩增，然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总RNA的反转录-环介导等温扩增，则所述待测样品中含有或疑似含有小鼠呼肠孤病毒3型；如果所述成套引物不能实现对所述总RNA的反转录-环介导等温扩增，则所述待测样品中不含或疑似不含小鼠呼肠孤病毒3型。

本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为小鼠呼肠孤病毒3型的方法，包括如下步骤：提取待测病毒的总RNA，以权利要求1～2中任意一项所述成套引物进行反转录-环介导等温扩增，然后进行如下评判：如果所述成套引物可以实现对所述总RNA的反转录-环介导等温扩增，则所述待测病毒中含有或疑似含有小鼠呼肠孤病毒3型；如果所述成套引物不能实现对所述总RNA的反转录-环介导等温扩增，则所述待测病毒中不含或疑似不含小鼠呼肠孤病毒3型。

本发明的主要目的是建立一种新型的Reo 3的核酸检测方法。RT-LAMP方法相比较传统PCR及其衍生方法而言有着检测更迅速、灵敏，特异性好，结果肉眼可见等优点，可用于各种实验条件(尤其是县市基层)的快速检测使用等优点，因而有很大潜力。LAMP引物的设计对特异性要求高，本实验通过对不同株Reo 3间全基因组序列以及Reo 3与其它小鼠相关病原体基因组序列进行比对分析后，筛选了特异性保守序列S1基因(X01161.1)，利用在线软件Primer Explorer V4设计了三套引物RS1，RS2和RS3，LAMP的引物组包括外引物F3/B3、内引物FIP和BIP和环引物LF/LB，其中外引物F3/B3、内引物FIP和BIP是LAMP反应所必需的，环引物的作用是缩短反应时间，提高反应效率，可以设计2条或1条环引物，也可以不加环引物。特异性试验结果证实，3套引物均存在与SV病毒发生非特异性扩增的问题，且RS2与水对照也发生反应。用RS1和RS2环引物去掉后的引物组RS1S和RS2S重复特异性试验，结果发现RS1S引物组与其它小鼠病原体无交叉反应，特异性良好，去掉环引物后反应启动时间略有延迟，但不影响整体反应效果。而RS2S引物组与水对照和SV病毒仍有交叉反应，因此最终选定RS1S引物组作为扩增Reo-3的RT-LAMP引物。

本发明还经过方法学评价证实以RS1S建立的RT-LAMP方法具有良好的特异性、敏感性，最低检出限为4fg/μL小鼠Reo3病毒基因组RNA。将该方法初步应用于Reo 3的检测，所检30份SPF小鼠样品，结果与ELISA结果相一致。由于近年来未见有Reo 3在上海地区实验鼠群中流行，因此人工饲养的实验小鼠基本上为Reo 3阴性。为了进一步验证，当人为在Reo 3细胞培养物随机混入小鼠血样中，提取核酸后就行检测结果发现阳性数量与混入Reo 3细胞培养物的数量相一致，说明本文所建立的检测Reo 3抗原的方法有效。该方法还可肉眼观察反应结果，全程闭管操作，因此可从源头上控制气溶胶污染，从而解决了在生产现场的可视化使用问题。

总之，根据本发明建立的RT-LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏、操作简单的特点，具有良好的应用前景和市场推广价值。

附图说明

图1是针对Reo 3的三套RT-LAMP引物的初步筛选结果；

图2是RS1引物的特异性试验；

图3是RS1S引物的特异性试验；

图4是RS1S引物的特异性试验在自然光下的显色反应，其中，从左往右所使用的模板依次为小鼠呼肠孤病毒3型(Reo3)、鼠痘病毒(SV)、仙台病毒天津株(PVM)、小鼠细小病毒(MHV)、小鼠肺炎病毒(Ect)、小鼠肝炎病毒(MVM)、嗜肺巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌；

图5是RS1S引物的特异性试验在紫外光下的显色反应；

图6是RS2S引物的特异性试验；

图7是RS3引物的特异性试验；

图8是RS1S引物的灵敏度结果；

图9是自然光下RS1S引物的灵敏度结果，其中，从左往右所使用模板的浓度依次为4ng/μL、400pg/μL、40pg/μL、4pg/μL、400fg/μL、40fg/μL、4fg/μL、400ag/μL、40ag/μL、4ag/μL；

图10是紫外光下RS1S引物的灵敏度结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的BHK-21细胞、小鼠呼肠孤病毒3型(Mouse reovirus type3，Reo3)、鼠痘病毒Ectromelia virus，ECTV)、仙台病毒天津株(Sendai virus，SeV)、小鼠细小病毒(Minute virus ofmice，MVM)、小鼠肺炎病毒(Pneumonia virus of mice，PVM)、小鼠肝炎病毒(Mouse hepatitis virus，MHV)、嗜肺巴氏杆菌(Pasteurella pneumotropica)、支气管鲍特杆菌(Bordetella bronchiseptica)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)和绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)均购自中国药品生物制品检定所，由上海实验动物研究中心增殖保存；现地试验样品为上海实验动物质量监督检验站检测的客户送检样品，采样在上海实验动物质量监督检验站屏障动物实验设施进行【SYXK(沪)2013-0056】。

下述实施例中的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司、Loopamp朗报脱氧核糖核酸扩增试剂盒(SLP204)、Loopamp朗报核糖核酸扩增试剂盒(SLP244)、环介导等温扩增法FDR荧光检测试剂盒(SLP221)购自北京蓝谱生物科技有限公司，Reo 3间接ELISA试剂盒(Express Biotech International)购自西山生物，LAMP RealTime Turbidimeter LA-302仪为日本荣研株式会社产品。

实施例1检测Reo 3的成套引物的设计、初步筛选以及反应体系的建立

将Genebank中各毒株Reo 3的基因序列进行比对分析，发现S1基因在各毒株之间高度保守，同时与小鼠其它常见的病原体基因组序列同源性低，是适合设计RT-LAMP引物的特异性保守序列。Reo-3的S1基因(X01161.1)序列如序列表中序列16所示。

根据Reo 3的S1基因序列利用在线软件Primer Explorer V4设计了三套引物，分别命名为RS1，RS2，RS3，其中RS1包括内、外、环引物各两条；RS2包括内、外引物各两条和环引物一条；RS3包括内、外引物各两条。具体的核苷酸序列如下表中的序列1-15所示：

表1 Reo 3的RT-LAMP引物序列

根据Loopamp朗报核糖核酸扩增试剂盒(SLP244)说明书，摸索LAMP的反应体系中各组分的浓度及比例，将含有反应液的反应管至于LAMP Real Time Turbidimeter LA-302仪器中进行等温扩增，根据该仪器预设的参考标准，设定反应速度曲线峰值超过0.1时判为阳性。

使用天根病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取Reo 3病毒的RNA作为模板，测其浓度约为27ng/μL，25μL反应体系的配制参照RNAAmplification kit说明书(2x反应缓冲液(RM)12.5μL：FIP引物40pmol(1μL)，BIP引物40pmol(1μL)，F3引物5pmol(1μL)，B3引物5pmol(1μL)，酶溶液1μL，去离子水2.5μL，样本RNA 5μL)，设定LA-320c实时浊度仪65℃反应55分钟，同时用三套引物进行扩增，浊度仪实时跟踪曲线(见图1)显示三套引物都能有效扩增Reo 3RNA，其中RS1引物启动时间最早，RS2引物在50分钟左右与水阴性对照发生了假阳性扩增，因此初步筛选出RS1和RS3引物进行后续试验，RS2去掉环引物进行后续试验。

实施例2 检测Reo 3的成套引物的特异性筛选以及Reo 3的RT-LAMP方法的建立

分别提取小鼠呼肠孤病毒3型、鼠痘病毒、仙台病毒天津株、小鼠细小病毒、小鼠肺炎病毒、小鼠肝炎病毒、嗜肺巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌等几种小鼠常见的病原体的核酸。

以小鼠呼肠孤病毒3型(Reo3)、鼠痘病毒(SV)、仙台病毒天津株(PVM)、小鼠细小病毒(MHV)、小鼠肺炎病毒(Ect)、小鼠肝炎病毒(MVM)、嗜肺巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌和绿脓杆菌等几种小鼠常见的病原体的核酸作为模板，在反应体系中预先加入荧光指示剂Fluorescence Detection Reagent，分别用三套引物建立的RT-LAMP方法检测在65℃下反应60分钟，检测结果显示RS1与SV病毒有交叉反应(见图2)，去掉环引物后特异性良好，仅能扩增出Reo 3，与其余病原体均不反应(见图3)，反应体系中预先加入荧光目视检测试剂，反应结束后阳性反应液均呈现混浊绿色荧光，阴性为透明浅橙黄色(见图4，图5)，与Real Time Turbidimeter LA-302仪监测结果一致，表明添加荧光目视检测试剂后所呈现的颜色反应具有特异性。RS1除了去掉环引物后出峰时间稍微延后，不影响试验进程，因此选择去掉RS1引物组的环引物进行后续试验，命名为RS1S。鉴于RS2引物与水对照发生假阳性扩增，作特异性试验时直接去掉环引物，命名为RS2S，但水对照仍有扩增，且与SV病毒有交叉反应(见图6)。RS3引物(无环引物)也与SV病毒发生非特异性扩增(见图7)。因此选不加环引物的RS1引物(即RS1S)建立一种RT-LAMP方法。

实施例3 检测Reo 3的RT-LAMP方法的敏感性试验

提取总RNA测定其浓度为40ng/μL，进行10倍比稀释，每反应管加入2μL的模板，然后进行10倍递进稀释，使其浓度依次为4ng/μL、400pg/μL、40pg/μL、4pg/μL、400fg/μL、40fg/μL、4fg/μL、400ag/μL、40ag/μL、4ag/μL等，每管加入2μL，以RS1S为引物在实时浊度仪上65℃反应60分钟。从反应曲线可见，RS1S引物能够最低检出最低检出限为4fg/μL小鼠Reo3病毒基因组RNA(见图8)。

LAMP体系中预先加入目测荧光染料，反应结束后阳性反应液均呈现绿色荧光，最低检出值的反应管绿色荧光沉淀清晰可见，阴性透明浅橙黄色(见图9，图10)与Real TimeTurbidimeter LA-302仪监测结果一致，表明用RS1S引物组所建立的Reo 3 RT-LAMP方法实现了可视化诊断。

实施例4 检测Reo 3的RT-LAMP方法的初步应用

经上述方法学评价试验证实，用RS1S引物组建立的Reo 3的RT-LAMP方法特异性、敏感性好，理论上该方法可用于Reo 3临床检测。为验证这一理论，将客户送检上海实验动物质量监督检验站30只SPF小鼠采血后同时用国标《实验动物呼肠孤病毒III型检测方法》(GB/T 14926.25-2001)推荐的间接ELISA方法和本文建立的RT-LAMP同时检测，检测结果一致，均为阴性。

当Reo-3细胞培养上清液随机混入其中5份血液中，提取核酸再次进行RT-LAMP检测时，结果为检出5份Reo-3阳性，其余25份为阴性。结果可见，根据本发明提供的RT-LAMP方法特异性强、敏感性高，实现了对Reo-3的高效快速的准确检测。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海实验动物研究中心

<120> 一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物及其应用

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 小鼠呼肠孤病毒3型

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gctattggtc ggatggatcc tcgcctacgt gaagaagtag tacggctgat aatcgcatta 60

acgagtgata atggagcatc actgtcaaaa gggcttgaat caagggtctc ggcgctcgag 120

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gtgaactccg acatttttat tgtagatgat tacatacata tatgtcttcc agcttttgac 1080

ggtttctcta tagctgacgg tggagatcta tcgttgaact ttgttaccgg attgttacca 1140

ccgttactta caggagacac tgagcccgct tttcataatg acgtggtcac atatggagca 1200

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tgggtggagc agtggcagga tggagtactt cggttacgtg ttgagggggg tggctcaatt 1320

acgcactcaa acagtaagtg gcctgccatg accgtttcgt acccgcgtag tttcacgtga 1380

ggatcagacc accccgcggc actggggcat ttcatc 1416

Claims (4)

1.一种用于快速检测小鼠呼肠孤病毒3型的成套引物，其特征在于，所述成套引物由引物REO-F3-1，引物REO-B3-1，引物REO-FIP-1和引物REO-BIP-1组成，各条引物均为单链DNA分子，核苷酸序列依次为序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。

2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于，所述成套引物中，所述引物REO-F3-1，引物REO-B3-1，引物REO-FIP-1和引物REO-BIP-1的摩尔比为1∶1∶8∶8。

3.一种根据权利要求1～2中任意一项所述的成套引物在制备用于检测或辅助检测待测样品中是否含有小鼠呼肠孤病毒3型的试剂中的应用。

4.一种根据权利要求1～2中任意一项所述的成套引物在制备用于鉴定或辅助鉴定待测病毒是否为小鼠呼肠孤病毒3型的试剂中的应用。