CN110819724B - 用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列、试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列、试剂盒及检测方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及细菌检测领域，具体讲，涉及一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列、试剂盒及检测方法和应用。本发明用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列。本发明的多交叉置换扩增反应引物序列可针对特异性基因MPB64结核分枝杆菌复合群进行检测。本发明试剂盒及检测方法具有低检测下限、高灵敏度、高特异性，以及简单、快速、准确、易操作的技术优势。

Description

用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列、试剂盒及检测方 法和应用
技术领域
本发明涉及细菌检测领域，具体讲，涉及一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列、试剂盒及检测方法和应用。
背景技术
结核分枝杆菌(Mycobacterium tubercμLosis，MTB)是引起结核病的重要病原菌。在全球引起死亡的原因中排名第九，根据世界卫生组织2017年的报道，我国在全球结核病高负担国家中发病率仅次于印度和印度尼西亚排在第三位。2016年我国结核病患者估算约为89.5万，新发的MDR(耐多药结核病)和RR-TB(利福平耐药结核病)患者达7.3万。因此，结核病是我国重点控制的重大传染病之一。
结核病可通过空气，主要引起人及动物肺部感染。肺结核症状表现为咯血、气胸、胸腔积液、呼吸衰竭等症状，严重威胁着患者的生命安全。结核病患者咳嗽或者打喷嚏产生含有结核分枝杆菌的飞沫，在人口密集空气流通较差的公共场所如医院、工厂、学校容易引起暴发。近年来由结核病引发的突发公共卫生事件，特别是学校聚集性疫情及口岸事件的发生，引起了社会的广泛关注及恐慌。结核病的诊断是结核病疫情防控的首要环节，只有快速准确的确诊结核病患者才能进一步对患者进行精确的治疗及隔离。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗以及避免结核病疫情的扩散，研发一个快速、简便和准确的结核分枝杆菌检测方法是很有必要的。
目前对于结核分枝杆菌的检测主要依靠抗酸涂片法(萋尼法和荧光染色法)和培养法，涂片法虽然简便易行，但是其灵敏度较低；培养法虽然具有灵敏度较高，但是获得结果的周期太长，操作繁琐并且容易造成生物安全事件。由此以上两种方法均难以满足临床及检疫检验的要求。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如GeneXpert MTB/RIF，基因芯片)被用于结核分枝杆菌的快速检测，然而这些方法依赖昂贵的仪器设备，并且反应的成本较高，这些都限制它们的广泛推广使用。
随着恒温技术的出现，环介导恒温扩增技术(LAMP)及交叉恒温扩增技术(CPA)已经应用于结核分枝杆菌的快速检测，其中LAMP技术在扩增反应后，需要在特定的仪器中读取变色反应结果，增加了检测步骤及仪器成本，不利于该技术的推广。将CPA技术结合免疫层析乳胶标记试纸条检测技术可以避免对仪器的依赖，但是该种方法需要开盖操作，极易造成后续检测试验的假阳性结果。
多交叉置换扩增(MμLtiple Cross Displacement Amplification，MCDA)是一种新型核酸扩增技术，具有扩增速度快、反应灵敏、特异性高等优点。该技术已被广泛用于分子诊断领域。MCDA针对靶序列10个特异部位设计10条引物，利用具有链置换活性的Bst2.0DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增。10条引物中2条为置换引物F1和F2；2条交叉引物，即CP1和CP2；6条扩增引物，即C1和C2，D1和D2，R1和R2。交叉引物包含CP1包含C1和P1，即5’-C1-P1；CP2包含C2和P2,即5’-C2-P2。MCDA扩增反应包括两个过程，即扩增引物介导的循环扩增和交叉引物介导的置换扩增。
插入序列IS6110是仅存在于结核分枝杆菌符合群中(MTBC)的特异性基因，但研究表明部分MTBC菌株基因组中的IS6110基因为0拷贝，因此针对IS6110基因的检测结核分枝杆菌的方法可能产生假阴性结果，造成漏诊。因此，创建一种基于其他结核分枝杆菌符合群特异基因的检测方法弥补当时方法的不足是很有必要的。
发明内容
本发明的首要发明目的在于提出一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列。
本发明的第二发明目的在于提出一种用于结核分枝杆菌复合群检测的试剂盒。
本发明的第三发明目的在于提出一种结核分枝杆菌复合群的检测方法。
本发明的第四发明目的在于提出该核酸序列在结核分枝杆菌复合群检测中的应用。
为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：
本发明提出一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列，所述核酸序列具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列。
可选的，SEQ ID No.7所示引物序列的5’端连接有荧光素，部分SEQ ID No.3所示引物序列的5’端连接有生物素。
可选的，所述核酸序列根据结核分枝杆菌的特异性基因MPB64设计并进行优化后得到。
本发明还提出一种用于结核分枝杆菌复合群检测的试剂盒，所述试剂盒包含核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列；
优选的，EQ ID No.7所示引物序列的5’端连接有荧光素，部分SEQ ID No.3所示引物序列的5’端连接有生物素。
可选的，所述核酸扩增试剂中还含有dCTP、dTTP、dUTP、dATP、dGTP以及南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶。
可选的，所述试剂盒还包括检测试纸条，所述检测试纸条包括一背板，所述背板上依次设置有样品垫、共轭垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测区及对照区，所述共轭垫包被有胶体金颗粒，所述检测区包被有抗荧光素抗体，所述对照区包被有生物素偶联的牛血清蛋白。
本发明还提出一种结核分枝杆菌复合群的检测方法，所述检测方法使用SEQ IDNo.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列检测结核分枝杆菌的特异性基因MPB64并对检测结果进行信息分析。
可选的，至少包括以下步骤：
(1)提取结核分枝杆菌的基因组DNA；
(2)将提取得到的基因组DNA作为模板进行多交叉置换扩增反应；
(3)采用胶体金检测试纸条进行检测。
可选的，所述多交叉置换扩增反应的反应体系为：
SEQ ID No.3和生物素标记的SEQ ID No.3的浓度均为1.2μM，SEQ ID No.5的浓度为2.4μM；SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的浓度均为0.4μM，SEQ ID No.7～SEQ ID No.10的浓度均为1.2μM，SEQ ID No.4和SEQ ID No.6的浓度均为0.8μM；
dATP、dCTP、dGTP的浓度均为1.4mM，dUTP的浓度为0.7mM，dTTP的浓度为0.7mM。
本发明还提出上述核酸序列在结核分枝杆菌复合群检测中的应用。
本发明的技术方案至少具有以下有益的效果：
MPB64基因是广泛存在于结核分枝杆菌符合群中的特异基因，本发明的多交叉置换扩增反应引物序列根据结核分枝杆菌的特异性基因MPB64设计并进行优化后得到，可针对特异性基因MPB64结核分枝杆菌复合群进行检测。
本发明试剂盒采用胶体金检测试纸条，具有简单、快速、准确、结果易读的技术优势。
本发明的试剂盒及检测方法的检测下限为100fg/μL，且具有高灵敏度和高特异性。
附图说明：
图1为本发明实施例多交叉置换扩增反应引物设计的位置和方向示意图；
图2为检测试纸条的结构示意图；
图3为检测试纸条检测结果示意图；
图4为检测结核分枝杆菌的MCDA引物温度动态曲线图；
图5为实施例2中利用实施浊度仪检测的实验结果图(6条曲线从左到右依次代表CH1～CH6)；
图6为实施例2中利用试纸条检测的实验结果图；
图7为实施例2中利用电泳发检测的实验结果图；
图8为实施例3中利用实施浊度仪检测的实验结果图(其中a中的6条曲线从左到右依次代表CH1～CH7，b中的3条曲线从左到右依次代表CH1～CH3)；
图9为实施例3中利用试纸条检测的实验结果图；
图10为实施例3中利用电泳发检测的实验结果图；
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
具体实施方式
本发明实施例涉及一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列，针对结核分枝杆菌的特异性基因MPB64设计并进行优化后得到，具有SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列。
其中，SEQ ID No.7所示引物序列的5’端连接有荧光素，部分SEQ ID No.3所示引物序列的5’端连接有生物素。引物序列的具体核苷酸序列如表1所示：
表1：
Figure BDA0001756617730000051
可选的，SEQ ID No.7所示引物序列的5’端连接的荧光素选自FAM，并不限于此。
可选的，将5’端连接有生物素的SEQ ID No.3所示引物序列命名为CP1*，其中CP1与CP1*的摩尔比优选为1：1。
可选的，本发明实施例上述核酸序列根据结核分枝杆菌的特异性基因MPB64设计并进行优化后得到。具体的，本发明实施例根据结核分枝杆菌的特异性基因MPB64(GenBank:CP011510.1)设计多交叉置换扩增反应引物，MPB64基因只存在于结核分枝杆菌复合群中，包括结核分枝杆菌，牛分枝杆菌，非洲分枝杆菌及田鼠分枝杆菌等，如此可以将结核分枝杆菌复合群感染与其他分枝杆菌感染区分开来。利用引物设计软件PRIMERPREMIER 5.0和Primer Explorer V4设计多交叉置换扩增反应引物。并将获得的特异性引物在NCBI数据库中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的一套多交叉置换扩增反应引物。引物设计的位置和方向见图1。
本发明实施例第二方面还提出一种用于结核分枝杆菌复合群检测的试剂盒，特别是一种采用多交叉置换扩增反应结合胶体金试纸条的试剂盒，从而可更加快速、简便检测结核分枝杆菌复合群。MCDA扩增产物可以通过实时浊度计，琼脂糖凝胶电泳及可视化颜色改变进行检测。实时浊度计法及琼脂糖凝胶电泳法需要依赖机器设备来完成，而根据颜色改变来判读结果，更为简单、便宜并且不易造成后续污染。本发明实施例则是采用了更加简单、快速、准确、易操作的胶体金免疫层析法。将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上，胶体金标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上，当待检样本加到试纸条一端的样本垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，当移动至固定的抗原或抗体的区域时，待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，可通过肉眼观察到显色结果。
具体的，本发明实施例的试剂盒包含核酸扩增试剂，核酸扩增试剂中含有SEQ IDNo.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列。其中，SEQ ID No.7所示引物序列的5’端连接有荧光素，部分SEQ ID No.3所示引物序列的5’端连接有生物素。
进一步可选的，本发明实施例的试剂盒中的核酸扩增试剂中还含有dCTP、dTTP、dUTP、dATP、dGTP以及南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶。
本发明实施例在PCR扩增体系里加入南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶(AUDG)和dUTP，从而在PCR反应中，以dUTP替代dTTP掺入DNA中形成含dU碱基的PCR扩增产物，此扩增产物DNA中U基的糖苷键被UDG作用后断裂后，使DNA链在失去U基后极不稳定，超过50℃就被降解并且使UDG失活，从而可消化降低PCR反应中扩增产物的残留污染，降低假阳性的结果。
进一步可选的，本发明实施例的试剂盒还包括检测试纸条。检测试纸条的结构示意图如图2所示。由图2可知，检测试纸条包括一背板1，背板1上依次设置有样品垫4、共轭垫3、硝酸纤维素膜2和吸水垫5，在硝酸纤维素膜2上依次设置检测区7及对照区6。其中，共轭垫3包被有胶体金颗粒，检测区7包被有抗荧光素抗体，对照区6包被有生物素偶联的牛血清蛋白。其中，箭头A显示样品流动方向。
优选的，当引物序列的荧光素标记选自FAM时，检测区7包被的抗荧光素抗体则选自FAM抗体。
优选的，胶体金颗粒可选自链霉素纳米金(SA-GNP)。
进一步可选的，本发明实施例的试剂盒中还包括样本缓冲液。样本缓冲液用于稀释所提取的结核分枝杆菌的基因组DNA。进一步可选的，本发明实施例的试剂盒的具体组成如表2所示：
表2
Figure BDA0001756617730000071
本发明实施例第三方面还提出一种结核分枝杆菌复合群的检测方法，本发明实施例的检测方法使用SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列检测结核分枝杆菌的特异性基因MPB64并对检测结果进行信息分析。
可选的，检测方法至少包括以下步骤：
(1)提取结核分枝杆菌的基因组DNA；
(2)将提取得到的基因组DNA作为模板进行多交叉置换扩增反应；
(3)采用胶体金检测试纸条进行检测。
其中，步骤(2)中多交叉置换扩增反应体系为：
SEQ ID No.3和生物素标记的SEQ ID No.3的浓度均为1.2μM，SEQ ID No.5的浓度为2.4μM；SEQ ID No.1和SEQ ID No.2的浓度均为0.4μM，SEQ ID No.7～SEQ ID No.10的浓度均为1.2μM，SEQ ID No.4和SEQ ID No.6的浓度均为0.8μM；dATP、dCTP、dGTP的浓度均为1.4mM，dUTP的浓度为0.7mM，dTTP的浓度为0.7mM；
1μL(8U)Bst 2.0DNA聚合酶，0.1μL(0.1U)of AUDG，0.8M甜菜碱，12.5μL的10×NEB缓冲液，1μL的模板，补加去离子水至25μl。
进一步可选的，步骤(2)中交叉置换扩增反应的最佳反应温度为67℃。
其中，步骤(3)中的具体的检测过程为：阳性扩增产物同时含有FAM和Biotin，当检测物首先到达检测区，含有FAM的产物会被FAM抗体结合，Biotin与SA-GNP结合并在检测线上滞留下来，形成一条淡红色的线(检测线T)，表示阳性结果。样本继续移动，对照区包被的生物素与SA-GNP结合并在检测线上滞留下来，形成一条淡红色的线(对照线C)，对照线的出现证明试纸条检测功能正常。具体示意图如图3所示。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1：结核分枝杆菌复合群的检测
1、实验材料和仪器：
本实施例中所使用和涉及的试剂：AUDG、dUTP、dATP、dCTP and dGTP购于美国NEB公司。胶体金试纸条和样本缓冲液购于北京海泰正元科技有限公司。蛋白酶K、TE缓冲液、溶菌酶均购于索莱宝科技有限公司。溴代十六烷基三甲胺(CTAB)和十二烷基硫酸钠(SDS)购于美国AMRESCO公司。
本实施例中使用和涉及的主要仪器：Loopamp实时浊度仪LA-320C(EikenChemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司。电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Dox XR,美国Bio-Rad产品。
2、实验过程：
2.1提取结核分枝杆菌的基因组DNA；
2.2配制多交叉置换扩增反应体系：
交叉引物CP1和CP1*的浓度为1.2μM，CP2的浓度为2.4μM；置换引物F1和F2的浓度为0.4μM，扩增引物R1、R2、D1和D2的浓度为1.2μM，扩增引物C1和C2的浓度为0.8μM；
dATP、dCTP、dGTP的浓度分别为1.4mM，0.7mM的dUTP，0.7mM dTTP，1μL(8U)Bst2.0DNA聚合酶(NEB)，0.1μL(0.1U)of AUDG，0.8M甜菜碱(Sigma-Aldrich)，2.5μL的10×NEB缓冲液，1μL的模板，补加去离子水至25μL。
在上述反应体系条件下，加入结核分枝杆菌检测MCDA引物和DNA模板，模板浓度为10pg/μL，反应在不同温度条件下进行(61～70℃)，利用实施浊度仪进行结果检测，得到不同的动态曲线，具体如图4所示。
经验证67℃作为MTB-MCDA检测的最佳反应温度。
实施例2：MTB-MCDA-LFD技术的检测下限
利用CTAB法对培养后的结核分枝杆菌进行DNA提取，然后利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，结核分枝杆菌(H37Rv)基因组DNA用TE缓冲液连续稀释(10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg)，各浓度基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。
在实施例1的反应体系条件下，运用连续稀释的结核分会杆菌(10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg)基因组DNA进行多交叉置换扩增反应。利用实施浊度仪进行结果检测，得到实验结果如图5所示(6条曲线从左到右依次代表CH1～CH6)。采用本发明的试纸条进行检测，得到实验结果如图6所示，采用电泳法进行检测，得到的实验结果如图7所示。
结果显示：MTB-MCDA-LFD的检测下限是100fg/μL，当反应体系中基因组模板量降低至100fg以下时，多交叉置换扩增反应不出现阳性扩增。
实施例3：AUDG降低残余污染技术评价：
在标准反应体系中加入0.1μL浓度为1U的AUTG，反应在恒温67℃条件下进行，室温孵育5分钟后再进行多交叉置换扩增，将扩增产物梯度稀释到1×10-13～1×10-20g/μL作为DNA模板再进行多交叉置换扩增，胶体金试纸条检测，根据颜色变化判断结果是否为阳性。
利用实施浊度仪进行结果检测，得到实验结果如图8所示。采用本发明的试纸条进行检测，得到实验结果如图9所示，采用电泳法进行检测，得到的实验结果如图10所示。
结果显示：在没有AUDG的反应体系中，扩增产物稀释到1×10-19出现假阳性，相当于0.02μL直径的气溶胶污染(图8a、图9a、图10a)，在加入0.1μL浓度为1U的AUTG后，扩增产物稀释到1×10-15出现假阳性(图8b、图9b、图10b)。AUDG防止了非模板DNA的扩增，从而降低了假阳性，使结果更可靠。
实施例4：灵敏度评价：
选取20株结核分枝杆菌和1株牛分枝杆菌的卡介苗(BCG)(菌株信息见表3)进行特异性评价，利用水煮法(100℃，15分钟)提取细菌的DNA。将反应体系反应全部在67℃条件下进行，胶体金试纸条检测，根据试纸条上显色变化判断结果是否为阳性。
结果显示：20株结核分枝杆菌和1株卡介苗全部呈现阳性结果。该实验结果与实施浊度仪检测法、电泳法的检测结果一致。
实施例5：特异性评价：
选取10株非结核分枝杆菌进行特异性评价，菌株详细信息如表3所示。利用水煮法(100℃，15分钟)提取细菌的DNA。将反应体系反应全部在67℃条件下进行，胶体金试纸条检测，根据试纸条上显色变化判断结果是否为阳性。
表3：菌株信息
Figure BDA0001756617730000111
BCG：卡介苗；NTRL：国家结核病参比实验室。
实验结果显示：10株非结核分枝杆菌全部呈现阴性结果。该实验结果与实施浊度仪检测法、电泳法的检测结果一致。
实施例6：
选取20份临床痰标本(2mL)，然后将每份痰标本均分为2份，一份经过N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-4％NaOH处理，静置15分钟后加入磷酸盐缓冲液3000×g离心15分钟，弃上清，所得的沉淀全部转移到1.5mL EP管中，加入100μL TE缓冲液，100℃加热15分钟，1.2×10000rpm离心2分钟，吸取1μL样本DNA加入到多交叉置换扩增反应反应管中，反应温度为67℃，胶体金试纸条检测，根据试纸条上显色变化判断结果是否为阳性。
一份用于GeneXpert MTB/RIF方法检测，将GeneXpert试剂盒配套的处理液加入含有标本的离心管中，震荡后静置15分钟，将处理后样品由加样孔缓慢加入到反应盒内。然后上机，反应2小时后读取结果并分析。实验结果如表4所示。
表4：与GeneXpert MTB/RIF比较MTB-MCDA-LFD的检测效能
方法 灵敏度 特异度 卡方值 P值
MTB-MCDA-LFD 95.3％ 85.7％ 0 1.00
GeneXpert MTB/RIF 100％ 85.7％
结果显示：以WHO推荐的GeneXpert MTB/RIF方法为标准，MTB-MCDA-LFD检测的灵敏度为95.3％，特异度为100％。
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围为准。
序列表
<110> 中国疾病预防控制中心
内蒙古华星康为生物科技有限公司
<120> 用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列、试剂盒及检测方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agttgaaagg caccgatacc 20
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcaccacgg cctgcgta 18
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cttctggtcg gggtagtaac tggcgtgcca gattcaaatg t 41
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cttctggtcg gggtagtaac t 21
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
acatcgtcca ctccacgcga gtatcgcgga ctggtatgt 39
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
acatcgtcca ctccacgcga 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgatgttga tgttgtaggc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctacgaatt gaatatcacc 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctgggcgatg taattttcca 20
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gacaagttcc tcagcgcg 18

Claims (6)

1.一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列具有SEQID No.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列。
2.根据权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，SEQ ID No.7所示引物序列的5’端连接有荧光素，50％的SEQ ID No.3所示引物序列的5’端连接有生物素。
3.一种用于结核分枝杆菌复合群检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，
SEQ ID No.7所示引物序列的5’端连接有荧光素，50％的SEQ ID No.3所示引物序列的5’端连接有生物素。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂中还含有dCTP、dTTP、dUTP、dATP、dGTP以及南极热敏尿嘧啶脱氧核酸糖基化酶。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括检测试纸条，所述检测试纸条包括一背板，所述背板上依次设置有样品垫、共轭垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，在所述硝酸纤维素膜上依次设置检测区及对照区，所述共轭垫包被有胶体金颗粒，所述检测区包被有抗荧光素抗体，所述对照区包被有生物素偶联的牛血清蛋白。
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