CN110878337A - 一种红斑丹毒丝菌的检测方法及其引物和探针 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测领域,公开了一种检测红斑丹毒丝菌的引物和探针,所述引物和探针的序列为:F‑引物:5’‑CCGAATTTGCTTACCGCTTGAAGGTTAAAGCAGGC‑3’,R‑引物:5’‑GTCCAAATTGAATAGTTTTCTATATACATAAGATC‑3’;探针:5’‑AGGTCTAGCGCAGATCGAGGGTAAGTACAATAATCTCCAAAAGATAA‑3’;所述探针上标记有荧光基团、淬灭基团和THF,所述荧光基团与所述淬灭基团均标记在T碱基上,所述荧光基团与所述淬灭基团的间距为1~5nt;所述荧光基团与所述淬灭基团之间设有所述THF,所述THF距所述探针5’端≥30nt,所述THF距所述探针3’端≥15nt。本发明还公开了采用上述引物和探针的红斑丹毒丝菌的检测方法。本发明所述检测方法的特异性强、灵敏度高、稳定性好,还具有简便、快速的特点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域,具体涉及一种红斑丹毒丝菌的检测方法及其引物和探针。
背景技术
猪丹毒(Swine erysipelas)又称猪丹毒丝菌病或猪丹毒杆菌病,是猪感染红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的急性、热性传染病,常导致猪的急性死亡,给养殖业造成了严重的损失。而且,该疾病是一种条件性人畜共患病,红斑丹毒丝菌可通过伤口感染接触到病猪的人员,因此对饲养员和屠宰员也都可能造成危害。
由于丹毒丝菌属细菌的抵抗力和生长繁殖能力很强,常大量存在于圈舍的稻草中,在尸体中也能存活数月,不易被彻底消灭,因此猪丹毒属于防控难度较大的疾病类型。而农业部的行业标准《猪丹毒诊断技术》(NY/T 566-2002)中关于猪丹毒的检测方法只有病原分离和血清培养凝集试验,这两种方法对生物安全环境的要求比较高,普通实验室无法办法满足要求而且费时费力。同时,该检测方法费时费力,不适用于实际检测的需要,也不适用于大规模流行病学的调查。
因此,建立一种简便、快速、准确的红斑丹毒丝菌快速等温检测方法是十分有必要的。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此,本发明提出一种检测红斑丹毒丝菌的引物和探针,以及基于所述引物和探针的RAA(重组酶介导核酸扩增)检测方法。本发明所述检测方法的特异性强、灵敏度高、稳定性好,还具有简便、快速的特点。
一种检测红斑丹毒丝菌的引物,所述引物的序列为:
F-引物:5’-CCGAATTTGCTTACCGCTTGAAGGTTAAAGCAGGC-3’,
R-引物:5’-GTCCAAATTGAATAGTTTTCTATATACATAAGATC-3’。
一种检测红斑丹毒丝菌的探针,所述探针的序列为:
探针:5’-AGGTCTAGCGCAGATCGAGGGTAAGTACAATAATCTCCAAAAGATAA-3’;
所述探针上标记有荧光基团、淬灭基团和THF,所述荧光基团与所述淬灭基团均标记在T碱基上,所述荧光基团与所述淬灭基团的间距为1~5nt;所述荧光基团与所述淬灭基团之间设有所述THF,所述THF距所述探针5’端≥30nt,所述THF距所述探针3’端≥15nt。
其中所述THF为四氢呋喃,所述THF的数量为一个。
本发明根据红斑丹毒丝菌CPS基因的高度保守区域设计特异性引物和探针,共设计了多组不同的引物和探针组合,经过筛选和分析,从而确定上述引物和探针的检测效果最佳。
优选的,所述荧光报告基团包括FAM(羧基荧光素)、TET(四氯-6-羧基荧光素)、HEX(六氯-6-甲基荧光素)、CY3(3H-吲哚菁)或JOE(2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素)。
优选的,所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse。
优选的,所述探针的3’末端还标记有修饰基团。
更优选的,所述修饰基因包括胺基、磷酸基团、生物素-TEG、巯基或C3-spacer。所述修饰基团对探针3’末端起封闭和阻断作用,阻止探针3’末端发生进一步的延伸。
一种用于检测红斑丹毒丝菌的试剂盒,所述试剂盒包括上述的引物和探针。
优选的,所述试剂盒还包括阳性标准品和阴性标准品。所述阳性标准品为插入红斑丹毒丝菌的CPS基因序列的质粒,所述阴性标准品为超纯水或纯净水。其中超纯水由双蒸水经高温杀菌制得。
一种非诊断目的的红斑丹毒丝菌的检测方法,包括以下步骤:
(1)提取样品DNA;
(2)以所述样品DNA为模板,利用上述引物和探针进行实时荧光重组酶介导核酸扩增检测;
(3)收集荧光信号,得出样品检测结果。
本发明采用RAA(重组酶介导的等温核酸扩增)技术结合上述的引物和探针进行红斑丹毒丝菌的检测,样品检测结果可通过荧光分析仪进行读取。
RAA技术与RPA(重组酶聚合酶等温扩增)技术为类似的体外等温扩增技术,但RAA技术是基于RPA技术的改良,其扩增时温度为37-42℃,属于更接近等温的体外等温扩增技术,具备一定的优势。
优选的,所述样品DNA的OD260/280(280nm用于表示蛋白质吸光度,260nm用于表示DNA的吸光度,因此OD260/280体现样品DNA的纯度)为1.8~2.0。由于RAA技术对模板的要求较低,样品DNA的提取可采用人工提取或试剂盒提取,具体提取方法不作限制。为保证检测的准确性,当所提取样品DNA的OD260/280不为1.8~2.0时,需重新提取样品DNA。
优选的,所述RAA检测的反应体系中:F-引物的浓度为10μmol/L,R-引物的浓度为10μmol/L,探针的浓度10μmol/L。
优选的,所述RAA检测的反应体系中:F-引物的用量为2μL,R-引物的用量为2μL,探针的用量为0.6μL。
优选的,所述RAA检测的反应程序为:39℃40s,1个循环;39℃30s,30~40个循环。
由于RAA检测时扩增的反应温度低(37~42℃),不需要在高温下进行,可在缺少PCR仪器的条件下完成检测,也不易受到空间的限制,因此具有更广阔的应用范围。
相对于现有技术,本发明的有益效果如下:
(1)本发明通过采用实时荧光RAA检测技术,可在恒温条件下完成实时荧光RAA检测,降低了对设备的要求;
(2)本发明所述检测方法的特异性强,灵敏度高;
(3)本发明所述检测方法操作简便,且检测效率高,通常情况下RAA检测仅需15~20分钟即可完成,实现了红斑丹毒丝菌的快速检测,尤其适用于动物卫生监督、海关检疫部门或医院等场所。
附图说明
图1为实施例3中特异性试验的结果;
图2为实施例4中灵敏度试验的结果;
图3为实施例5中样品的检测结果;
图4为实施例6中第1次稳定性试验的结果;
图5为实施例6中第2次稳定性试验的结果。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案,现列举以下实施例进行说明。需要指出的是,以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
实施例1
根据GenBank中公布的红斑丹毒丝菌的CPS基因序列,使用分子生物学软件Oligo7.0设计特异性引物和探针。
其中引物的序列为:
F-引物:5’-CCGAATTTGCTTACCGCTTGAAGGTTAAAGCAGGC-3’,
R-引物:5’-GTCCAAATTGAATAGTTTTCTATATACATAAGATC-3’。
其中探针的序列为:
探针:5’-AGGTCTAGCGCAGATCGAGGGTAAGTACAA(FAM-dT)A(THF)A(BHQ1-dT)CTCCAAAAGATAA-C3 spacer-3’;
其中THF位点距探针5’端32个核苷酸,距探针3’端15个核苷酸;其中FAM-dT表示标记有荧光基团FAM的胸腺嘧啶脱氧核苷酸,BHQ1-dT表示标记有淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。其中荧光基团与淬灭基团的间距为3nt。
上述引物和探针委托生工生物(上海)股份有限公司合成。
实施例2
一种非诊断目的的红斑丹毒丝菌的检测方法,包括以下步骤:
(1)提取样品DNA;
(2)以样品DNA为模板,利用实施例1中的引物和探针进行RAA检测;
(3)收集荧光信号,得出样品检测结果。
采用DNA提取试剂盒进行样品DNA的提取,其中DNA提取试剂盒为美国OMEGA公司的E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit产品。
采用购自杭州众测生物科技有限公司的RAA核酸扩增试剂(荧光型)进行RAA检测。
RAA检测的反应体系:
上述Buffer均来自杭州众测生物科技有限公司的RAA核酸扩增试剂(荧光型)。
RAA检测的反应程序如表1所示:
表1
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 是否收集荧光 |
预热 | 39℃ | 40s | 1 | 否 |
扩增 | 39℃ | 30s | 40 | 是 |
采用ViiA 7Real Time PCR System(生厂厂家:美国Applied Biosystems公司)对荧光信号进行检测,根据扩增曲线直接读取检测结果。
实施例3
特异性试验
采用实施例2中检测方法对以下材料进行检测,验证该检测方法的特异性。
生物材料:猪肺疫CA株、猪丹毒GC42株、猪链球菌II型灭活疫苗、大肠杆菌O157:H7株、金黄色葡萄球菌ATCC25923株、猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗III型、单核细胞增生李斯特菌ATCC株、猪源支气管败血波氏杆菌833株。
其中猪肺疫CA株购买自山东华宏生物工程有限公司,猪丹毒GC42株和猪链球菌II型灭活疫苗购买自广东永顺生物制药股份有限公司,大肠杆菌O157:H7株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株购买自广东环凯微生物科技有限公司,猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗III型购买自武汉科前动物生物制品有限责任公司,单核细胞增生李斯特菌ATCC株购买自通派(上海)生物科技有限公司,猪源支气管败血波氏杆菌833株购买自西班牙海博莱生物大药厂。
阴性对照组:纯净水。
如图1所示,只有Er(猪丹毒GC42株)随着循环数的增加,荧光信号得到明显增强,出现显著的扩增曲线;而Ecoil(大肠埃希氏菌O157:H7株)、S.aureus(金黄色葡萄球菌ATCC25923株)、App(传染性胸膜肺炎灭活疫苗III型)、L.monocytogenes(单核细胞增生李斯特菌ATCC株)、Bb(猪源支气管败血波氏杆菌833株)、Pcv2(猪链球菌II型灭活疫苗)、Pm(猪肺疫CA株)和N(阴性对照组)均未出现扩增曲线。由此可见,本发明所建立的检测方法具备良好的特异性。
实施例4
灵敏度试验
委托上海旭冠生物科技有限公司合成克隆质粒,该克隆质粒中插入红斑丹毒丝菌的CPS基因序列,得到大小为2962bp的质粒。取2μg该质粒用100μL的纯净水充分溶解,经换算,其初始拷贝数为2.55×1010。以10倍梯度对该质粒样品进行稀释,直至稀释为2.55×101,将不同稀释梯度的质粒样品作为灵敏度试验的阳性标准品。
对经梯度稀释后的阳性标准品分别使用实施例2中检测方法进行检测,验证该检测方法的灵敏度。
如图2所示,除101(拷贝数为2.55×101)和N(阴性对照组)没有检测到荧光信号的显著变化外,其余阳性标准品均出现明显的扩增曲线,循环数均在6-20之间,能检测到的最小拷贝数约2.55×102(对应图2中的102曲线)。由于当最低拷贝数约2.55×102时,此时的循环数仍不大于20。因此在一些情况下,为追求更高的检测效率,可对RAA检测的反应程序进行调整,将扩增的循环数调整至30以下,使得检测时间小于15分钟。
实施例5
样品检测
通过实施例2的检测方法对不同超市采购的猪样品进行检测,其中猪样品共25份:淋巴结、脾脏、肝脏、大小肠和肌肉组织各5份。取实施例4中稀释至拷贝数为2.55×105的阳性标准品为阳性对照组,取纯净水作为阴性对照组。
如图3所示,除P(阳性对照组)出现明显的扩增曲线外,25份猪样品和N(阴性对照组)均未检测到荧光型号的变化,得出该25份猪样品均未受到红斑丹毒丝菌的污染。
为了验证此次检测的准确性,将该25份猪样品在实验室中经细菌分离培养、细菌生化鉴定及毒性试验,最终确认该25份样品中不含有红斑丹毒丝菌。
实施例6
稳定性试验
取实施例4中稀释至2.55×105的红斑丹毒丝菌质粒的阳性标准品为模板,使用实施例2的检测方法进行两次稳定性试验,试验间隔为15天,单次试验重复数为16个。
每次试验开展前使用紫外分光光度计测量阳性标准品的初始DNA浓度,其中第1次为2.3ng/μL、第2次为2.2ng/μL,即两次试验的初始DNA浓度基本相同。
如图3-4所示,红斑丹毒丝菌质粒在第1次和第2次稳定性试验中的检测结果保持一致,具有高度的相关性和重现性,证实本发明所建立的检测方法具有良好的稳定性。
实施例7
一种用于检测红斑丹毒丝菌的试剂盒,包括实施例1中的引物和探针,实施例4中拷贝数为2.55×105的阳性标准品和阴性标准品(纯净水)。
Claims (10)
1.一种检测红斑丹毒丝菌的引物,其特征在于,所述引物的序列为:
F-引物:5’-CCGAATTTGCTTACCGCTTGAAGGTTAAAGCAGGC-3’,
R-引物:5’-GTCCAAATTGAATAGTTTTCTATATACATAAGATC-3’。
2.一种检测红斑丹毒丝菌的探针,其特征在于,所述探针的序列为:
探针:5’-AGGTCTAGCGCAGATCGAGGGTAAGTACAATAATCTCCAAAAGATAA-3’;
所述探针上标记有荧光基团、淬灭基团和THF,所述荧光基团与所述淬灭基团均标记在T碱基上,所述荧光基团与所述淬灭基团的间距为1~5nt;所述荧光基团与所述淬灭基团之间设有所述THF,所述THF距所述探针5’端≥30nt,所述THF距所述探针3’端≥15nt。
3.根据权利要求2所述的探针,其特征在于,所述荧光基团包括FAM、TET、HEX、CY3或JOE,所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse。
4.根据权利要求2所述的探针,其特征在于,所述探针的3’末端还标记有修饰基团。
5.根据权利要求4所述的探针,其特征在于,所述修饰基因包括胺基、磷酸基团、生物素-TEG、巯基或C3-spacer。
6.一种用于检测红斑丹毒丝菌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和权利要求2至5中任一项所述的探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阳性标准品和阴性标准品。
8.一种非诊断目的的红斑丹毒丝菌的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)提取样品DNA;
(2)以所述样品DNA为模板,利用权利要求1所述的引物和权利要求2至5中任一项所述的探针进行实时荧光重组酶介导核酸扩增检测;
(3)收集荧光信号,得出样品检测结果。
9.根据权利要求8所述的检测方法,其特征在于,所述样品DNA的OD260/280为1.8~2.0。
10.根据权利要求8所述的检测方法,其特征在于,所述RAA检测的反应程序为:39℃40s,1个循环;39℃30s,30~40个循环。
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