CN110885892A - 一种多杀性巴氏杆菌的检测方法及其引物和探针 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测领域，公开了一种检测多杀性巴氏杆菌的引物和探针，所述引物和探针的序列为：F‑引物：5’‑CGCTCTACCGTTAATGGCTTCAATAATGGCCATAA‑3’，R‑引物：5’‑GGACGTTATTTATTACTCAGCTTATTGTTATTTGC‑3’，探针：5’‑CATAAGAAACGTAACTCAACATGGAAATATTGATAATCAGACTGACAAGGA‑3’；所述探针上标记有荧光基团、淬灭基团和THF，所述荧光基团与所述淬灭基团均标记在T碱基上，所述荧光基团与所述淬灭基团的间距为1～5nt；所述荧光基团与所述淬灭基团之间设有所述THF，所述THF距所述探针5’端≥30nt，所述THF距所述探针3’端≥15nt。本发明所述检测方法的特异性强、灵敏度高、稳定性好，还具有简便、快速的特点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种多杀性巴氏杆菌的检测方法及其引物和探针。
背景技术
猪肺疫(Swine pasteurellosis)又称猪巴氏杆菌病，是猪感染多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)引起的一种急性热性传染病，一年四季均可发病，但多发于春初或秋末等气候骤变时期。猪肺疫在中国爆发具有小范围、高频次爆发的特点。感染多杀性巴氏杆菌的病猪死亡率较高，未死亡的也多转为慢性，是一种造成较大危害的疾病。
《供港澳活猪检疫管理办法》中规定，供港澳活猪的检疫项目包括有猪瘟、猪丹毒、猪肺疫、猪水疱病、口蹄疫、狂犬病、日本脑炎和其他动物传染病、寄生虫病，目前对于口蹄疫和猪瘟已有较为完善的分子生物学检测方法，而对于猪肺疫仍沿用传统的检测方法，如细菌分离、免疫学试验等，费时费力，不适用于实际检测的需求，也不适用于大规模流行病学的调查。
因此，建立一种简便、快速、准确的多杀性巴氏杆菌快速等温检测方法是十分有必要的。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测多杀性巴氏杆菌的引物和探针，以及基于所述引物和探针的RAA(重组酶介导核酸扩增)检测方法。本发明所述检测方法的特异性强、灵敏度高、稳定性好，还具有简便、快速的特点。
一种检测多杀性巴氏杆菌的引物，所述引物的序列为：
F-引物：5’-CGCTCTACCGTTAATGGCTTCAATAATGGCCATAA-3’，
R-引物：5’-GGACGTTATTTATTACTCAGCTTATTGTTATTTGC-3’。
一种检测多杀性巴氏杆菌的探针，所述探针的序列为：
探针：5’-CATAAGAAACGTAACTCAACATGGAAATATTGATAATCAGACTGACAAGGA-3’；
所述探针上标记有荧光基团、淬灭基团和THF，所述荧光基团与所述淬灭基团均标记在T碱基上，所述荧光基团与所述淬灭基团的间距为1～5nt；所述荧光基团与所述淬灭基团之间设有所述THF，所述THF距所述探针5’端≥30nt，所述THF距所述探针3’端≥15nt。
其中所述THF为四氢呋喃，所述THF的数量为一个。
本发明根据多杀性巴氏杆菌KMT基因的高度保守区域设计特异性引物和探针，设计了多组不同的引物和探针组合，并经过筛选和分析，从而确定上述引物和探针的检测效果最佳。
优选的，所述荧光报告基团包括FAM(羧基荧光素)、TET(四氯-6-羧基荧光素)、HEX(六氯-6-甲基荧光素)、CY3(3H-吲哚菁)或JOE(2，7-二甲基-4，5-二氯-6-羧基荧光素)。
优选的，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse。
优选的，所述探针的3’末端还标记有修饰基团。
更优选的，所述修饰基因包括胺基、磷酸基团、生物素-TEG、巯基或C3-spacer。所述修饰基团对探针3’末端起封闭和阻断作用，阻止探针3’末端发生进一步的延伸。
一种用于检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物和探针。
优选的，所述试剂盒还包括阳性标准品和阴性标准品。所述阳性标准品为插入多杀性巴氏杆菌的KMT基因序列的质粒，所述阴性标准品为超纯水或纯净水。其中超纯水由双蒸水经高温杀菌制得。
一种非诊断目的的多杀性巴氏杆菌的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)以所述样品DNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光重组酶介导核酸扩增检测；
(3)收集荧光信号，得出样品检测结果。
本发明采用RAA(重组酶介导的等温核酸扩增)技术结合上述的引物和探针进行多杀性巴氏杆菌的检测，样品检测结果可通过荧光分析仪进行读取。
RAA技术与RPA(重组酶聚合酶等温扩增)技术为类似的体外等温扩增技术，但RAA技术是基于RPA技术的改良，其扩增时温度为37～42℃，属于更接近等温的体外等温扩增技术，因此具备一定的优势。
优选的，所述样品DNA的OD260/280为1.8～2.0。由于RAA技术对模板的要求较低，样品DNA的提取可采用人工提取或试剂盒提取，具体提取方法不作限制。为保证检测的准确性，当所提取样品DNA的OD260/280不为1.8～2.0时，需重新提取样品DNA。
优选的，所述RAA检测的反应体系中：F-引物的浓度为10μmol/L，R-引物的浓度为10μmol/L，探针的浓度10μmol/L。
优选的，所述RAA检测的反应体系中：F-引物的用量为2μL，R-引物的用量为2μL，探针的用量为0.6μL。
优选的，所述RAA检测的反应程序为：39℃40s，1个循环；39℃30s，30～40个循环。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
(1)本发明通过采用实时荧光RAA检测技术，可在恒温条件下完成实时荧光RAA检测，降低了对设备的要求；
(2)本发明所述检测方法的特异性强，灵敏度高；
(3)本发明所述检测方法操作简便，且检测效率高，通常情况下仅需15～20分钟即可完成，实现了多杀性巴氏杆菌的快速检测，尤其适用于动物卫生监督、海关检疫部门或医院等场所。
附图说明
图1为实施例3中特异性试验的结果；
图2为实施例4中灵敏度试验的结果；
图3为实施例5中样品的检测结果；
图4为实施例6中第1次稳定性试验的结果；
图5为实施例6中第2次稳定性试验的结果。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
实施例1
根据GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌的KMT基因序列，使用分子生物学软件Oligo7.0设计特异性引物和探针。
其中引物的序列为：
F-引物：5’-CGCTCTACCGTTAATGGCTTCAATAATGGCCATAA-3’，
R-引物：5’-GGACGTTATTTATTACTCAGCTTATTGTTATTTGC-3’。
其中探针的序列为：
探针：5’-CATAAGAAACGTAACTCAACATGGAAATATTGA(FAM-dT)A(THF)A(BHQ1-dT)CAGACTGACAAGGA-C3 spacer-3’；
其中THF位点距探针5’端35个核苷酸，距探针3’端16个核苷酸；其中FAM-dT表示标记有荧光基团FAM的胸腺嘧啶脱氧核苷酸，BHQ1-dT表示标记有淬灭基团BHQ1的胸腺嘧啶脱氧核苷酸。其中荧光基团与淬灭基团的间距为3nt。
上述引物和探针委托生工生物(上海)股份有限公司合成。
实施例2
一种非诊断目的的多杀性巴氏杆菌的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)以样品DNA为模板，利用实施例1中的引物和探针进行实时荧光RAA检测；
(3)收集荧光信号，得出样品检测结果。
采用DNA提取试剂盒进行样品DNA的提取，其中DNA提取试剂盒为美国OMEGA公司的E.Z.N.A.TM Tissue DNA Kit产品。
采用购自杭州众测生物科技有限公司的RAA核酸扩增试剂(荧光型)进行实时荧光RAA检测。
RAA检测的反应体系：
上述Buffer均来自杭州众测生物科技有限公司的RAA核酸扩增试剂(荧光型)。
RAA检测的反应程序如表1所示：
表1
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 | 是否收集荧光 |
| 预热 | 39℃ | 40s | 1 | 否 |
| 扩增 | 39℃ | 30s | 40 | 是 |
采用ViiA 7Real Time PCR System(厂家:美国Applied Biosystems公司)对荧光信号进行检测，根据扩增曲线直接读取检测结果。
实施例3
特异性试验
采用实施例2中检测方法对以下材料进行检测，验证该检测方法的特异性。
生物材料：猪肺疫CA株、猪丹毒GC42株、猪链球菌II型灭活疫苗、大肠杆菌O157:H7株、金黄色葡萄球菌ATCC25923株、猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗III型、单核细胞增生李斯特菌ATCC株、猪源支气管败血波氏杆菌833株。
其中猪肺疫CA株购买自山东华宏生物工程有限公司，猪丹毒GC42株和猪链球菌II型灭活疫苗购买自广东永顺生物制药股份有限公司，大肠杆菌O157:H7株和金黄色葡萄球菌ATCC25923株购买自广东环凯微生物科技有限公司，猪传染性胸膜肺炎灭活疫苗III型购买自武汉科前动物生物制品有限责任公司，单核细胞增生李斯特菌ATCC株购买自通派(上海)生物科技有限公司，猪源支气管败血波氏杆菌833株购买自西班牙海博莱生物大药厂。
阴性对照组：纯净水。
如图1所示，只有Pm(猪肺疫CA株)随着循环数的增加，荧光信号得到明显增强，出现显著的扩增曲线；而Ecoil(大肠埃希氏菌O157:H7株)、S.aureus(金黄色葡萄球菌ATCC25923株)、App(传染性胸膜肺炎灭活疫苗III型)、L.monocytogenes(单核细胞增生李斯特菌ATCC株)、Bb(猪源支气管败血波氏杆菌833株)、Pcv2(猪链球菌II型灭活疫苗)、Er(猪丹毒GC42株)和N(阴性对照组)均未出现扩增曲线。由此可见，本发明所建立的检测方法具备良好的特异性。
实施例4
灵敏度试验
委托上海旭冠生物科技有限公司合成克隆质粒，该克隆质粒中插入多杀性巴氏杆菌的KMT基因序列，得到大小为2962bp的质粒。取2μg该质粒用100μL的纯净水充分溶解，经换算，其初始拷贝数为2.55×1010。以10倍梯度对该质粒样品进行稀释，直至稀释为2.55×101，将不同稀释梯度的质粒样品作为灵敏度试验的阳性标准品。
对经梯度稀释后的阳性标准品分别使用实施例2中检测方法进行检测，验证该检测方法的灵敏度。
如图2所示，除101(拷贝数为2.55×101)和N(阴性对照组)没有检测到荧光信号的显著变化外，其余阳性标准品均出现明显的扩增曲线，循环数均在6-18之间，能检测到的最小拷贝数约2.55×102(对应图2中的102曲线)。由于当最低拷贝数约2.55×102时，此时的循环数仍不大于18。因此在一些情况下，为追求更高的检测效率，可对RAA检测的反应程序进行调整，将扩增的循环数调整至30以下，使得检测时间小于15分钟。
实施例5
样品检测
通过实施例2的检测方法对不同超市采购的猪样品进行检测，其中猪样品共25份：淋巴结、脾脏、肝脏、大小肠和肌肉组织各5份。取实施例4中稀释至拷贝数为2.55×105的阳性标准品为阳性对照组，取纯净水作为阴性对照组。
如图3所示，除P(阳性对照组)出现明显的扩增曲线外，25份猪样品和N(阴性对照组)均未检测到荧光型号的变化，得出该25份猪样品均未受到多杀性巴氏杆菌的污染。
为了验证此次检测的准确性，将该25份猪样品在实验室中经细菌分离培养、细菌生化鉴定及毒性试验，最终确认该25份样品中不含有多杀性巴氏杆菌。
实施例6
稳定性试验
取实施例4中稀释至2.55×105的多杀性巴氏杆菌质粒的阳性标准品为模板，使用实施例2的检测方法进行两次稳定性试验，试验间隔为15天，单次试验重复数为16个。
每次试验开展前使用紫外分光光度计测量阳性标准品的初始DNA浓度，其中第1次为2.2ng/μL、第2次为2.1ng/μL，即两次试验的初始DNA浓度基本相同。
如图3-4所示，多杀性巴氏杆菌质粒在第1次和第2次稳定性试验中的检测结果保持一致，具有高度的相关性和重现性，证实本发明所建立的检测方法具有良好的稳定性。
实施例7
一种用于检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒，包括实施例1中的引物和探针，实施例4中拷贝数为2.55×105的阳性标准品和阴性标准品(纯净水)。
Claims (10)
1.一种检测多杀性巴氏杆菌的引物，其特征在于，所述引物的序列为：
F-引物：5’-CGCTCTACCGTTAATGGCTTCAATAATGGCCATAA-3’，
R-引物：5’-GGACGTTATTTATTACTCAGCTTATTGTTATTTGC-3’。
2.一种检测多杀性巴氏杆菌的探针，其特征在于，所述探针的序列为：
探针：5’-CATAAGAAACGTAACTCAACATGGAAATATTGATAATCAGACTGACAAG GA-3’；
所述探针上标记有荧光基团、淬灭基团和THF，所述荧光基团与所述淬灭基团均标记在T碱基上，所述荧光基团与所述淬灭基团的间距为1～5nt；所述荧光基团与所述淬灭基团之间设有所述THF，所述THF距所述探针5’端≥30nt，所述THF距所述探针3’端≥15nt。
3.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、TET、HEX、CY3或JOE，所述淬灭基团包括BHQ1、BHQ2、TAMRA、DABCYL、MGB或Eclipse。
4.根据权利要求2所述的探针，其特征在于，所述探针的3’末端还标记有修饰基团。
5.根据权利要求4所述的探针，其特征在于，所述修饰基因包括胺基、磷酸基团、生物素-TEG、巯基或C3-spacer。
6.一种用于检测多杀性巴氏杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和权利要求2至5中任一项所述的探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性标准品和阴性标准品。
8.一种非诊断目的的多杀性巴氏杆菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取样品DNA；
(2)以所述样品DNA为模板，利用权利要求1所述的引物和权利要求2至5中任一项所述的探针进行实时荧光重组酶介导核酸扩增检测；
(3)收集荧光信号，得出样品检测结果。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述样品DNA的OD260/280为1.8～2.0。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述RAA检测的反应程序为：39℃40s，1个循环；39℃30s，30～40个循环。
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