CN112239794B - 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用 - Google Patents
检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的引物对、探针、试剂盒，所述试剂盒包含上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.3，或上游引物SEQ ID NO.2和下游引物SEQ ID NO.4。本发明检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的试剂盒，以RPA方法对SARS‑CoV‑2病毒进行核酸检测，灵敏度可达250copies/mL，检测准确性100％，并能在30min内完成对新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的检测，非常适用于现场快速筛查，具有非常好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探 针、试剂盒及其应用。
背景技术
冠状病毒属(Coronavirus)病毒是具外套膜(envelope)的单股正链RNA病毒，直径约 80～120nm，其遗传物质是所有RNA病毒中最大的，是许多家畜、宠物包括人类疾病的重要 病原，可引起多种急慢性疾病。第九次国际病毒学分类委员会报告将冠状病毒科分为三个属， 即α、β和γ属。其中α属冠状病毒的人冠状病毒229E、人冠状病毒NL63以及β属冠状病毒的人冠状病毒HKU1、人冠状病毒OC43、严重急性呼吸综合征(severe acute respiratorysyndromes，SARS)相关病毒等5种病毒可引起人不同程度疾病。
核酸检测是现阶段用于确诊新型冠状病毒肺炎的主要手段之一。目前对新型冠状病毒的 核酸检测手段主要是RT-PCR法，此方法以其较高的特异性及敏感性在新型冠状病毒检测方 面发挥着重大作用。但是RT-PCR方法由于其变温的特点需要相关的昂贵复杂仪器设备，且 需要有专业的实验室和技术人员，因此无法应用于基层和现场的检测。而且，RT-PCR方法根 据不同的试剂盒，整个检测时间需要1.5-3小时，受检测速度的限制，会导致大量疑似病例的样本积压，不能快速得到结果。
发明内容
本发明要解决目前缺乏快速、准确检测SARS-CoV-2试剂盒的技术问题，提供一种基于 RPA技术检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒，该试剂盒操作简单、耗 时短，能快速、准确、特异地对SARS-CoV-2进行检测。
为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
在本发明的一个方面，提供了一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对，所述 引物对选自：上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.3，或上游引物SEQ IDNO.2和 下游引物SEQ ID NO.4。
在本发明的另一方面，还提供了一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的探针，所述 探针为SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。
优选的，所述探针在其核苷酸序列的第29位碱基修饰荧光报告基团、第31位碱基替换 为四氢呋喃残基和第33位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。
所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；所述荧光淬 灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
在本发明的另一方面，还提供了一种检测新型冠状病毒的SARS-CoV-2的试剂盒，所述 试剂盒包含上述的引物对。
优选的，所述试剂盒包含上游引物SEQ ID NO.1、下游引物SEQ ID NO.3、和探针SEQ ID NO.5。
优选的，所述试剂盒包含上游引物SEQ ID NO.2、下游引物SEQ ID NO.4、和探针SEQ ID NO.6。
所述引物的浓度为0.4-1μM，所述探针的浓度为0.2-0.6μM。优选的，所述引物的浓度为 0.6μM，所述探针的浓度为0.4μM。
在本发明的另一方面，还提供了上述试剂盒在制备检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的产 品中的应用。
本发明检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒，灵敏度高、特异性强，最短只需10min 即可实现对新型冠状病毒的恒温检测，克服了现有RT-PCR检测新型冠状病毒SARS-CoV-2 RNA检测时间长，需要反转录，操作繁琐的缺点，适合基层和现场检测，对新型冠状病毒的 快速诊断具有非常重要的意义，具有很大的应用前景。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明实施例1的N、S基因引物探针组在28℃、37℃扩增产物电泳图；
图2是本发明实施例1的N、S基因引物探针组在37℃扩增不同时间的产物电泳图；
图3是本发明实施例3的N基因引物探针组的引物浓度优化图；
图4是本发明实施例4的N基因引物探针组的探针浓度优化图；
图5是本发明实施例5的N基因引物探针组的灵敏度检测结果图；
图6是本发明实施例5的S基因引物探针组的灵敏度检测结果图；
图7是本发明实施例6的N基因引物探针组的特异性检测结果图；
图8是本发明实施例6的S基因引物探针组的特异性检测结果图。
具体实施方式
实施例1检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物和探针设计及RPA检测方法
1.引物和探针的设计
通过对已公布的新型冠状病毒SARS-CoV-2的全序列共包含10个基因进行综合分析比 较，选取N、S基因序列进行引物探针设计。通过筛选，优选出下述表1所列的2组引物探针组，其中，第一组是针对N基因序列设计的SEQ ID NO.1所示上游引物、SEQ ID NO.3 所示下游引物、和SEQ ID NO.5所示探针；第二组是针对S基因序列设计的SEQ ID NO.2 所示上游引物、SEQ ID NO.4所示下游引物、和SEQ ID NO.6所示探针。
表1检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物和探针序列
优选地，探针SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的第29位碱基修饰荧光报 告基团、第31位碱基替换为四氢呋喃残基和第33位碱基修饰荧光淬灭基团的物质。探针修饰的荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；优选为FAM或 HEX。荧光淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL；优选为BHQ1 或BHQ2。
2.检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的RPA检测方法(非荧光法)
1)提前30分钟将TABAS03KIT试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
2)引物加水溶解，终浓度为10μM。
3)每个干粉反应管加入29.4μL A buffer，3μL上游引物、3μL下游引物、7.1μLRNase free H2O，上下颠倒反应管8-10次，充分混合。
4)在反应管中加入5μL RNA模板和2.5μL B buffer，上下颠倒8-10次混匀，之后将反应 液瞬时离心至管子底部，然后立即将反应管放入扩增设备中(如金属浴、PCR仪、恒温扩增仪、实时定量PCR仪等)。
5)反应温度28-37℃，反应时间10-30min。
6)琼脂糖凝胶电泳检测产物，结果如图1-2所示，从图1可以看出，28℃、37℃都有扩 增，但37℃扩增效率更高。图2是N、S基因引物探针组在37℃扩增不同时间的产物电泳图， 从图2可以看出，N、S基因扩增10min就可以获得扩增产物，N基因在30min时扩增产物最多，S基因在20min时扩增产物最多。
实施例2检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的rt-RPA检测方法
1)提前30分钟将TAEXO02KIT试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
2)引物、探针加水溶解，终浓度为10μM。
3)每个干粉反应管加入29.4μL A buffer，3μL上游引物、3μL下游引物、2μL探针、5.1μL RNase free H2O，上下颠倒反应管8-10次，充分混合。
4)在反应管中加入5μL RNA模板和2.5μL B buffer，上下颠倒8-10次混匀，之后将反应 液瞬时离心至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中(如恒温扩增仪、实时定量 PCR仪等)。
5)恒温37℃；每30s采集一次荧光信号(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧 光值；反应时间30min。
6)有扩增曲线为阳性，没有荧光增长为阴性。
实施例3引物浓度的优化
用103copie/μL质粒标准品进行引物浓度的优化，具体实施方式为：
1)提前30分钟将TAEXO02KIT试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
2)引物、探针加水溶解，终浓度为10μM。
3)设置四个实验管，每个干粉反应管加入29.4μL A buffer、2μL探针，0.4μM组中加入2μL 上游引物、2μL下游引物，0.6μM组中加入3μL上游引物、3μL下游引物，1.0μM组中加入5μL 上游引物、5μL下游引物，NC组为阴性对照，用适量RNase free H2O将体系补足至42.5μL， 上下颠倒反应管8-10次，充分混合。
4)在反应管中加入5μL RNA模板和2.5μL B buffer，上下颠倒8-10次混匀，之后将反应 液瞬时离心至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中(如恒温扩增仪、实时定量 PCR仪等)。
5)恒温37℃；每30s采集一次荧光信号(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧 光值；反应时间30min。
结果如图3所示，图3是N基因引物探针组的引物浓度优化图，从图3可以看出，上游引物和下游引物浓度为0.6μM时，扩增效率更高。S基因引物探针组结果类似。
实施例4探针浓度的优化
用103copie/μL质粒标准品进行探针浓度的优化，具体实施方式为：
1)提前30分钟将TAEXO02KIT试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
2)引物、探针加水溶解，终浓度为10μM。
3)设置四个实验管，每个干粉反应管加入29.4μL A buffer、3μL上游引物、3μL下游引 物，0.2μM组中加入1μL探针，0.4μM组中加入2μL探针，0.6μM组中加入3μL探针，NC 组为阴性对照，用适量RNase free H2O将体系补足至42.5μL，上下颠倒反应管8-10次，充分混合。
4)在反应管中加入5μL RNA模板和2.5μL B buffer，上下颠倒8-10次混匀，之后将反应 液瞬时离心至管子底部，然后立即将反应管放入荧光检测设备中(如恒温扩增仪、实时定量 PCR仪等)。
5)恒温37℃；每30s采集一次荧光信号(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧 光值；反应时间30min。
结果如图4所示，图4是N基因引物探针组的探针浓度优化图，从图4可以看出，探针浓度为0.4μM时，扩增效率更高。S基因引物探针组结果类似。
实施例5检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的灵敏度实验
用250copies/mL、500copies/mL、1000copies/mL和2500copies/mL质粒标准品进行检测 灵敏度实验，具体实施方式为：
1)提前30分钟将TAEXO02KIT试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
2)引物、探针加水溶解，终浓度为10μM。
3)每个干粉反应管加入29.4μL A buffer，3μL上游引物、3μL下游引物、2μL探针、5.1μL RNase free H2O，上下颠倒反应管8-10次，充分混合。
4)在各个反应管分别加入5μL不同浓度的RNA模板和2.5μL B buffer，阴性对照中加入 5μL RNase free H2O，上下颠倒8-10次混匀，之后将反应液瞬时离心至管子底部，然后立即 将反应管放入荧光检测设备中(如恒温扩增仪、实时定量PCR仪等)。
5)恒温37℃；每30s采集一次荧光信号(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧 光值；反应时间30min。
检测结果如图5和图6所示，其中图5表示N基因的引物探针组的灵敏度检测结果，图 6表示S基因引物探针组的灵敏度检测结果。结果显示最快5分钟明显有扩增，10分钟内所 有标准工作品均有扩增，最低灵敏度可以达到250copies/mL，表明本发明灵敏度高，检测时 间短。
实施例6检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的特异性实验
特异性实验中样本选择为常见的呼吸道病毒及细菌和人类冠状病毒，具体为：冠状病毒 HKU1，OC43，NL63和229E、人鼻病毒、合胞病毒及新型冠状病毒SARS-CoV-2。其中冠状病毒HKU1，OC43，NL63和229E、人鼻病毒、合胞病毒以及新型冠状病毒SARS-CoV-2 样本核酸由中国疾病预防控制中心提供。具体实验中采用的样本为含新型冠状病毒目的基因 片段的标准阳性质粒，其它为分别含冠状病毒HKU1，OC43，NL63和229E、人鼻病毒、合 胞病毒特征基因片段的标准物质，实验步骤如下：
1)提前30分钟将TAEXO02KIT试剂盒所需组分取出，室温融化，震荡混匀。
2)引物、探针加水溶解，终浓度为10μM。
3)每个干粉反应管加入29.4μL A buffer，3μL上游引物、3μL下游引物、2μL探针、5.1μL RNase free H2O，上下颠倒反应管8-10次，充分混合。
4)在各个反应管分别加入5μL不同浓度的RNA模板和2.5μL B buffer，阴性对照中加入 5μL RNase free H2O，上下颠倒8-10次混匀，之后将反应液瞬时离心至管子底部，然后立即 将反应管放入荧光检测设备中(如恒温扩增仪、实时定量PCR仪等)。
5)恒温37℃；每30s采集一次荧光信号(信号采集通道的选择与荧光探针设计一致)荧 光值；反应时间30min。
检测结果如图7和图8所示，其中图7表示N基因的引物探针组的特异性检测结果，图 8表示S基因引物探针组的特异性检测结果。结果显示出现扩增曲线的为含新型冠状病毒目 的基因片段的标准阳性质粒，其余特异性参考品均无扩增曲线，表明该检测方法的特异性良 好。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理 解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离 本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序 列 表
<110> 上海伯豪医学检验所有限公司
<120> 检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物对、探针、试剂盒及其应用
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 4
taatacctat tggcaaatct accaatggtt ct 32
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 5
ggccgacgtt gttttgatcg cgccccactg cgttctccat tctggt 46
<210> 6
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 6
tattctaagc acacgcctat taatttagtg cgtgatctcc ctcagg 46
Claims (3)
1.一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含引物对和探针，所述引物对和探针选自：上游引物SEQ ID NO.1、下游引物SEQ ID NO.3和探针SEQID NO.5；或上游引物SEQ ID NO.2、下游引物SEQ ID NO.4和探针SEQ ID NO.6；所述探针在其核苷酸序列的第29位碱基修饰荧光报告基团、第31位碱基替换为四氢呋喃残基和第33位碱基修饰荧光淬灭基团的物质，所述引物的浓度为0.6μM，所述探针的浓度为0.4μM。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团包括FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy3或Cy5；所述荧光淬灭基团包括TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2、BHQ3或DABCYL。
3.权利要求1或2所述试剂盒在制备检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的产品中的应用。
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