CN111154903A - 一种用于布鲁氏菌rpa扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用 - Google Patents

一种用于布鲁氏菌rpa扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用，属于分子生物学检测技术领域；所述引物组包括上游引物和下游引物。利用本发明的引物组对布鲁氏菌进行RPA扩增，结合SYBR Green I可对布鲁氏菌进行现场可视化检测，本发明不依赖PCR仪等热循环仪器，利用RPA技术对布鲁氏菌核酸进行扩增，扩增结束后使用395nm波长的紫外灯进行照射，观察反应体系是否呈现荧光判定检测结果，本发明的引物组具有特异性强、敏感性好，所发明的试剂盒操作简单、检测快速、结果可视化等优点，为布鲁氏菌的现场可视化检测提供新的方法。

Description

一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及 应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用。
背景技术
布鲁氏菌(Brucella)又称布氏杆菌，是一种革兰氏阴性的不运动细菌，可以在牛、羊、猪等多种家畜体内存活。
目前我国对布鲁氏菌的检测主要以细菌学、血清学检测方法为主，这些方法存在着费时费力，假阳性等缺点。随着分子生物学技术的发展，PCR方法逐步用于布鲁氏菌的鉴定。但PCR技术本身存在依赖PCR仪、易污染、灵敏度和特异性有待于进一步提高等问题，而且扩增产物需要经过进一步琼脂糖凝胶电泳或荧光定量检测等设备才能得到检测结果，不能实现布鲁氏菌的可视化检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用，本发明的方法具有特异性强、灵敏度高、能够可视化检测的优点。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组；所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明提供了一种包括上述方案所述引物组的试剂盒。
优选的，所述试剂盒还包括醋酸镁水溶液、RPA反应缓冲液、RPABasic冻干粉、50×SYBR Green I和无菌水。
优选的，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品包括布鲁氏菌的基因组DNA；所述阴性对照品包括无菌水。
本发明提供了上述方案所述引物组或者所述试剂盒在非诊断目的的布鲁氏菌RPA扩增中的应用，所述应用包括以下步骤：
1)提取待检测样品的基因组DNA；
2)以待检测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组进行RPA扩增反应，得到RPA扩增产物；
3)将所述RPA扩增产物和50×SYBR Green I混合，离心，用395nm波长的紫外灯照射，观察扩增产物的产生荧光情况，若扩增产物呈现荧光，则样品中含有布鲁氏菌，若扩增产物不呈现荧光，则样品中不含布鲁氏菌。
优选的，步骤2)中还包括分别以布鲁氏菌的基因组DNA和无菌水为模板进行RPA扩增；所述以布鲁氏菌的基因组DNA为模板的RPA扩增结果作为阳性对照，以无菌水为模板的RPA扩增结果作为阴性对照。
优选的，步骤2)中所述RPA扩增反应的反应体系以50μL计包括：2μL模板、12.4μL无菌水、29.5μL RPA反应缓冲液、上下游引物各1.8μL，2.5μL醋酸镁水溶液和4mg RPABasic冻干粉；
所述醋酸镁水溶液中醋酸镁的浓度为280mM；所述上游引物和下游引物的浓度分别为10μM；所述模板的浓度为0.1μg/μL。
优选的，步骤2)中所述RPA扩增反应的程序为：37～42℃扩增10～20min。
优选的，以RPA扩增的扩增体系为50μL计，步骤3)中所述50×SYBR Green I的用量为1～2μL。
本发明的有益效果：本发明提供了一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组；所述引物组包括上游引物和下游引物。利用本发明的引物组对布鲁氏菌进行RPA扩增，结合SYBRGreen I可对布鲁氏菌进行现场可视化检测，本发明不依赖PCR仪等热循环仪器，利用RPA技术对布鲁氏菌核酸进行扩增，扩增结束后，不需要进行琼脂糖凝胶电泳分析，只使用395nm波长的紫外灯进行照射，观察反应体系扩增产物是否呈现荧光，就可以判定检测结果，本发明的引物组具有特异性强、敏感性好，所发明的试剂盒操作简单、检测快速、结果可视化等优点，为布鲁氏菌的现场可视化检测提供新方法。
附图说明
图1为实施例1和对比例1～5的不同引物组RPA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中1为对比例1的引物扩增产物、2为对比例2的引物扩增产物、3为对比例3的引物扩增产物、4为实施例1的引物扩增产物、5为对比例4的引物扩增产物、6为对比例5的引物扩增产物、M为Marker；
图2为实施例2中以布鲁氏菌基因组DNA为模板，不同扩增反应温度的RPA扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中1为37℃扩增产物、2为38℃扩增产物、3为39℃扩增产物、4为40℃扩增产物、5为41℃扩增产物、6为42℃扩增产物、M为Marker；
图3为实施例3中不同引物浓度和不同RPA扩增反应时间的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中图3中的A为不同引物浓度的RPA体系扩增10min对应扩增情况，图3中的B为不同引物浓度的RPA体系扩增15min对应扩增情况，图3中的C为不同引物浓度的RPA体系扩增20min对应扩增情况；
图4为实施例4中不同菌种的RPA反应特异性分析的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中1为布鲁氏菌基因组扩增产物，2为大肠杆菌基因组扩增产物，3为沙门氏菌基因组扩增产物，4为小肠结肠炎耶氏菌基因组扩增产物，5为副溶血弧菌基因组扩增产物，6为福氏志贺氏菌基因组扩增产物，7为无菌水；
图5为实施例5中RPA反应灵敏度分析的扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中1～9为:布鲁氏菌基因组浓度141.358ng/μL～1.41358×10-6ng/μL；
图6为实施例6中RPA反应重复性分析扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，其中1～3为布鲁氏菌基因组扩增产物；
图7为实施例6中人工加标血清样品灵敏度检测结果，其中1～9:布鲁氏菌菌体浓度2.14×109CFU/mL～2.14×101CFU/mL；
图8为实施例6中人工加标血清样品检测重复性分析结果，其中图8中A的1～10:10个加标样，图8中B的11:阴性对照；
图9为实施例6中人工加标牛肉样品灵敏度检测结果，其中1～9:布鲁氏菌菌体浓度2.14×109CFU/g～2.14×101CFU/g；
图10为实施例6中人工加标牛肉样品检测重复性分析结果，其中图10中A的1～10:10个加标样，图10中B的11:阴性对照；
图11为实施例6中人工加标牛奶样品灵敏度检测结果，其中1～9:布鲁氏菌菌体浓度2.14×109CFU/mL～2.14×101CFU/mL；
图12为实施例6中人工加标牛奶样品检测重复性分析结果，其中图12中A的1～10:10个加标样，图12中B的11:阴性对照。
具体实施方式
本发明提供了一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组；所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：CCTTTCAGGTCTGCGACCGATTTGATGTTT；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：ATATCAATGCGATCAAGTCGGGCGCTCTGG；所述上游引物和下游引物由长春库美生物科技有限公司合成。
本发明中，所述引物组针对布鲁氏菌属的外膜蛋白31(Brucella cell surfaceprotein 31ku，BCSP31)基因设计得到，该基因高度保守一致，存在于所有不同种布鲁氏菌的基因组中；所述外膜蛋白31基因序列参考的是GenBank登录号:M20404.1的序列。
本发明中，所述BCSP31基因保守区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：ATGAAATTCGGAAGCAAAATCCGTCGCTTGGCTGTTGCGGCGGTGGCGGGCGCGATTGCGTTGGGAGCGAGCTTTGCGGTTGCACAGGCCCCGACATTTTTCCGTATCGGCACTGGCGGCACAGCCGGAACCTATTATCCGATTGGTGGTCTGATCGCGAACGCGATTTCCGGCGCAGGCGAAAAGGGCGTGCCGGGTCTCGTCGCGACGGCCGTTTCGT CGAATGGCTCGGTTGCCAATATCAATGCGATCAAGTCGGGCGCTCTGGAGTCCGGCTTTACGCAGTCAGACGTTGCCTATTGGGCCTATAACGGCACCGGCCTTTATGATGGCAAGGGCAAGGTGGAAGATTTGCGCCTTCTGGCGACGCTTTACCCGGAAACGATCCATATCGTTGCGCGTAAGGATGCAAACATCAAATCGGTCGCAGACCTGAAAGGCAAGCGCGTTTCGCTGGATGAGCCGGGTTC TGGCACCATC GTCGATGCGCGTATCGTTCTTGAAGCCTACGGCCTCACGGAAGACGATATCAAGGCTGAACACCTGAAGCCGGGACCGGCAGGCGAGAGGCTGAAAGATGGTGCGCTGGACGCCTATTTCTTTGTGGGCGGCTATCCGACGGGCGCAATCTCGGAACTGGCCATCTCGAACGGTATTTCGCTCGTTCCGATCTCCGGGCCGGAAGCGGACAAGATTCTGGAGAAATATTC CTTCTTCTCGAAGGATGTGGTTCCTGCCGGAGCCTATAAGGACGTGGCGGAAACACCGACCCTTGCCGTTGCCGCACAGTGGGTGACGAGCGCCAAGCAGCCGGACGACCTCATCTATAACATCACCAAGGTTCTCTGGAACGAGGATACACGCAAGGCACTCGATGCGGGCCATGCGAAGGGCAAGCTCATCAAGCTCGATAGTGCGACGAGCAGCCTCGGTATTCCGCTGCATCCCGGCGCAGAACGCTTTTACAAGGAAGCGGGCGTGCTGAAATAA。
本发明提供了一种包括上述方案所述引物组的试剂盒；所述试剂盒包括优选的
Figure BDA0002397482270000051
Basic Kits，由醋酸镁溶液(MgOAc)、RPA反应缓冲液、RPA Basic冻干粉组成，购自英国TwistDx Inc公司；还优选的包括50×SYBR Green I、无菌水、阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品优选的包括布鲁氏菌的基因组DNA；所述阴性对照品优选的包括无菌水。
本发明提供了上述方案所述引物组或者所述试剂盒在非诊断目的的布鲁氏菌RPA扩增中的应用，所述应用包括以下步骤：
1)提取待检测样品的基因组DNA；
2)以待检测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组进行RPA扩增反应，得到RPA扩增产物；
3)将所述RPA扩增产物与50×SYBR Green I混合，混匀并瞬时离心，用395nm波长的紫外灯照射，观察扩增产物的产生荧光情况，若扩增产物呈现荧光，则样品中含有布鲁氏菌，若扩增产物不呈现荧光，则样品中不含布鲁氏菌。
本发明所述应用能够实现布鲁氏菌的可视化检测。
本发明首先提取待检测样品的基因组DNA；本发明对所述提取待检测样品的基因组DNA的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
得到待检测样品的基因组DNA后，本发明以待检测样品的基因组DNA为模板，利用上述方案所述引物组进行RPA扩增反应，得到RPA扩增产物。
本发明优选的还包括分别以布鲁氏菌的基因组DNA和无菌水为模板进行RPA扩增；所述以布鲁氏菌基因组DNA为模板的RPA扩增结果作为阳性对照，以无菌水为模板的RPA扩增结果作为阴性对照。
本发明中，所述RPA扩增反应的反应体系以50μL计包括：2μL模板、12.4μL无菌水、29.5μL RPA反应缓冲液、上下游引物各1.8μL、2.5μL醋酸镁水溶液，混合均匀后充分溶解约4mg的RPABasic冻干粉；所述醋酸镁水溶液中醋酸镁的浓度优选为280mM；所述上游引物和下游引物的浓度分别优选为10μM；所述模板的浓度优选为0.1μg/μL；以RPA扩增的扩增体系为50μL计，所述50×SYBR Green I的用量优选为1～2μL。
本发明中，所述RPA扩增反应的程序为：37～42℃扩增10～20min；所述扩增的温度优选为38～40℃，时间优选为15～18min。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、本发明所用的布鲁氏菌为猪种布鲁氏菌(Brucella suis)疫苗株S2由吉林大学人兽共患病研究所保存。布鲁氏菌属中其它种布鲁氏菌的检测实验结果与猪种布鲁氏菌S2株检测实验结果相同。使用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，并参照试剂盒说明书，提取布鲁氏菌基因组DNA。
2、以布鲁氏菌基因组DNA为模板，利用本发明的上游引物BCSP31-4F和下游引物BCSP31-4R，所述BCSP31-4F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：CCTTTCAGGTCTGCGACCGATTTGATGTTT；所述BCSP31-4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：ATATCAATGCGATCAAGTCGGGCGCTCTGG。按照Twist DX
Figure BDA0002397482270000061
Basic Kit说明书操作步骤进行RPA扩增；RPA扩增体系参见表1，扩增程序为39℃、20min。金属浴恒温扩增结束后使用普通DNA产物纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)进行纯化，通过1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，扩增结果如图1中的泳道4所示，扩增片段大小为202bp。
表1实施例1的RPA反应体系
Figure BDA0002397482270000071
对比例1
利用的引物为BCSP31-1F和BCSP31-1R，所述BCSP31-1F的核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示，具体为：TGCCTTTCAGGTCTGCGACCGATTTGATGT；所述BCSP31-1R的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，具体为：CCGGCTTTACGCAGTCAGACGTTGCCTATT。其余同实施例1。扩增结果如图1中的泳道1所示，扩增片段大小为171bp。
对比例2
利用的引物为BCSP31-2F和BCSP31-2R，所述BCSP31-2F的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，具体为：AAATCTTCCACCTTGCCCTTGCCATCATAA；所述BCSP31-2R的核苷酸序列如SEQID NO.7所示，具体为：CAATGCGATCAAGTCGGGCGCTCTGGAGTC。其余同实施例1。扩增结果如图1中的泳道2所示，扩增片段大小为111bp。
对比例3
利用的引物为BCSP31-3F和BCSP31-3R，所述BCSP31-3F的核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，具体为：TGCCTTTCAGGTCTGCGACCGATTTGATGT；所述BCSP31-3R的核苷酸序列如SEQID NO.9所示，具体为：AGGGCAAGGTGGAAGATTTGCGCCTTCTGG。其余同实施例1。扩增结果如图1中的泳道3所示，扩增片段大小为108bp。
对比例4
利用的引物为BCSP31-5F和BCSP31-5R，所述BCSP31-5F的核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示，具体为：GCGCAAATCTTCCACCTTGCCCTTGCCATC；所述BCSP31-5R的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，具体为：CAATGCGATCAAGTCGGGCGCTCTGGAGTC。其余同实施例1。扩增结果如图1中的泳道5所示，扩增片段大小为115bp。
对比例5
利用的引物为BCSP31-6F和BCSP31-6R，所述BCSP31-6F的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示，具体为：ATCGTTTCCGGGTAAAGCGTCGCCAGAAGG；所述BCSP31-6R的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：CTCGGTTGCCAATATCAATGCGATCAAGTC。其余同实施例1。扩增结果如图1中的泳道6所示，扩增片段大小为159bp。
图1为实施例1、对比例1～5的不同引物组的RPA扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中1为对比例1的引物扩增产物、2为对比例2的引物扩增产物、3为对比例3的引物扩增产物、4为实施例1的引物扩增产物、5为对比例4的引物扩增产物、6为对比例5的引物扩增产物、M为Marker。由图1来看，本发明的引物组RPA扩增效果最好。
实施例2
使用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，并参照试剂盒说明书，提取布鲁氏菌基因组。根据重组酶活性温度范围在37～42℃，使用BCSP31-4F和BCSP31-4R引物，设置不同反应温度进行RPA扩增，其中1为37℃条件下扩增产物、2为38℃条件下扩增产物、3为39℃条件下扩增产物、4为40℃条件下扩增产物、5为41℃条件下扩增产物、6为42℃条件下扩增产物、M为Marker，使用金属浴恒温扩增20min筛选出最佳扩增反应温度。反应体系参照实施例1。扩增结束后使用普通DNA产物纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)进行纯化，通过1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，扩增结果如图2所示，可见当扩增反应温度为40℃时，条带最为清晰。
实施例3
使用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，并参照试剂盒说明书，提取布鲁氏菌和大肠杆菌基因组。使用BCSP31-4F和BCSP31-4R引物，反应温度为40℃下，设置三组实验，分别采用终浓度为0.2μM、0.36μM、0.72μM引物的RPA体系扩增10min、15min、20min，同时每组实验以大肠杆菌作阴性对照。
扩增结束后使用普通DNA产物纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)进行纯化，通过1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，或者向反应产物中加入1μL-2μL的50×SYBR GreenI，混匀并瞬时离心，用395nm波长的紫外灯照射，观察反应管内扩增产物颜色情况。结果如图3所示，其中图3中的A为RPA体系扩增10min对应扩增情况，图3中的B为RPA体系扩增15min对应扩增情况，图3中的C为RPA体系扩增20min对应扩增情况。可见，随着引物浓度的增加，时间的延长，阴性对照扩增(N)背景信号也逐渐增强。为了保证阳性扩增(P)产物具有较强的荧光信号而阴性扩增产物的荧光信号尽可能的降低，选择引物终浓度为0.36μM，扩增时间为15min。
实施例4
使用细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，并参照试剂盒说明书，提取猪种布鲁氏菌(Brucella suis)S2、大肠杆菌模式株(Escherichia coli)、沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、小肠结肠炎耶氏菌(Yersinia enterocolitica)、副溶血弧菌(VibrioParahemolyticus)、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)基因组。所有菌株均为吉林大学人兽共患病研究所保存。分别以不同细菌基因组为模板，利用布鲁氏菌引物BCSP31-4F和BCSP31-4R，进行RPA扩增反应。反应程序为：40℃、15min，RPA反应体系参见表2。
表2实施例4的RPA反应体系
Figure BDA0002397482270000101
RPA结果判定方法参见实施例3，电泳结果和可视化结果参见图4，其中1为布鲁氏菌基因组扩增产物，2为大肠杆菌基因组扩增产物，3为沙门氏菌基因组扩增产物，4为小肠结肠炎耶氏菌基因组扩增产物，5为副溶血弧菌基因组扩增产物，6为福氏志贺氏菌基因组扩增产物，7为无菌水。图4中，1号管呈现荧光，为阳性，2～7未呈现荧光，为阴性。因此，本发明布鲁氏菌可视化快速检测方法的特异性好，不与其它细菌产生交叉扩增反应。同时说明加入SYBR Green I后，可视化结果与电泳结果一致。
实施例5
本发明提取布鲁氏菌基因组后使用DNA定量分析仪测定其浓度为141.358ng/μL，10倍倍比稀释后进行RPA扩增反应。反应条件为：40℃扩增15min，RPA反应体系参照实施例4，RPA结果判定方法参见实施例3，电泳结果和可视化结果参见图5，其中1～9为:布鲁氏菌基因组浓度141.358ng/μL～1.41358×10-6ng/μL，可见，可视化图与电泳图结果一致，可见灵敏度为1.41358×10-3ng/μL，即1.41358pg/μL。
实施例6
本发明提取布鲁氏菌基因组作为模板，利用布鲁氏菌引物BCSP31-4F和BCSP31-4R，进行三次重复性RPA扩增反应。反应程序为：40℃、15min，RPA反应体系参见表2。RPA反应体系参照实施例4，RPA结果判定方法参见实施例3，电泳结果和可视化结果参见图6，其中1～3为:布鲁氏菌基因组，M为Marker，可见可视化图与电泳图结果一致，可见本发明重复性良好。
实施例7
人工对血清样品、牛肉样品、牛奶样品进行加标检测。
人工加标血清样品：对布鲁氏菌S2菌液通过平板计数，得出菌液浓度，将菌液与血清混合，使血清中布鲁氏菌终浓度为2.14×109CFU/mL，12000转/分钟离心1min收集菌体，无菌生理盐水洗涤两遍，最后加入100μL生理盐水重悬菌体，沸水煮30min，离心取上清基因组，然后将其进行10倍倍比稀释作模板，用于分析血清样品中布鲁氏菌检测灵敏度。另外将200μL浓度为2.14×109CFU/mL布鲁氏菌S2菌液与800μL血清混合，制备10个人工加标血清样品，同样煮沸法提取基因组作模板，用于分析血清样品中布鲁氏菌检测重复性，同时设置阴性对照。使用本发明对所制备样品进行扩增检测，并使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测。
人工加标牛肉样品：对布鲁氏菌S2菌液通过平板计数，得出菌液浓度，将牛肉尽可能粉碎制成牛肉渣，将菌体与肉渣充分混合，使肉渣中布鲁氏菌终浓度为2.14×109CFU/g，用无菌生理盐水重悬肉渣，过滤肉渣，滤液通过12000转/分钟离心1min收集菌体，无菌生理盐水洗涤两遍，最后加入100μL生理盐水重悬菌体，沸水煮30min，离心取上清基因组，然后将其进行10倍倍比稀释作模板，用于分析牛肉样品中布鲁氏菌检测灵敏度。另外离心收集200μL浓度为2.14×109CFU/mL布鲁氏菌S2菌体与1g肉渣混合，制备10个人工加标牛肉样品，同样煮沸法提取基因组作模板，用于分析牛肉样品中布鲁氏菌检测重复性，同时设置阴性对照。使用本发明对所制备样品进行扩增检测，并使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测。
人工加标牛奶样品：对布鲁氏菌S2菌液通过平板计数，得出菌液浓度，将菌液与牛奶混合，使牛奶中布鲁氏菌终浓度为2.14×109CFU/mL，12000转/分钟离心1min收集菌体，无菌生理盐水洗涤两遍，最后加入100μL生理盐水重悬菌体，沸水煮30min，离心取上清基因组，然后将其进行10倍倍比稀释作模板，用于分析牛奶样品中布鲁氏菌检测灵敏度。另外将200μL浓度为2.14×109CFU/mL布鲁氏菌S2菌液与800μL牛奶混合，制备10个人工加标血清样品，同样煮沸法提取基因组作模板，用于分析牛奶样品中布鲁氏菌检测重复性，同时设置阴性对照。使用本发明对所制备样品进行扩增检测，并使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对扩增结果进行检测。
反应条件为：40℃扩增15min，RPA反应体系参照实施例4。本发明对人工加标血清样品中布鲁氏菌检测结果如图7(1～9:布鲁氏菌菌体浓度2.14×109CFU/mL～2.14×101CFU/mL)，可见血清样品布鲁氏菌最低检测浓度为2.14×104CFU/mL；人工加标血清样品布鲁氏菌检测重复性结果如图8(图8中A的1～10:10个加标样，图8中B的11:阴性对照)；本发明对人工加标牛肉样品中布鲁氏菌检测结果如图9(1～9:布鲁氏菌菌体浓度2.14×109CFU/g～2.14×101CFU/g)，可见牛肉样品中布鲁氏菌最低检测浓度为2.14×104CFU/g，人工加标牛肉样品布鲁氏菌检测重复性结果如图10(图10中A的1～10:10个加标样，图10中B的11:阴性对照)，本发明对人工加标牛奶样品中布鲁氏菌检测结果如图11(1～9:布鲁氏菌菌体浓度2.14×109CFU/mL～2.14×101CFU/mL)，可见牛奶样品中布鲁氏菌最低检测浓度为2.14×104CFU/mL，人工加标牛奶样品布鲁氏菌检测重复性结果如图12(图12中A的1～10:10个加标样，图12中B的11:阴性对照)，并且电泳图与可视化图呈现一致结果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组、可视化检测试剂盒及应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctttcaggt ctgcgaccga tttgatgttt 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atatcaatgc gatcaagtcg ggcgctctgg 30
<210> 3
<211> 990
<212> DNA
<213> 布鲁氏菌(Brucella )
<400> 3
atgaaattcg gaagcaaaat ccgtcgcttg gctgttgcgg cggtggcggg cgcgattgcg 60
ttgggagcga gctttgcggt tgcacaggcc ccgacatttt tccgtatcgg cactggcggc 120
acagccggaa cctattatcc gattggtggt ctgatcgcga acgcgatttc cggcgcaggc 180
gaaaagggcg tgccgggtct cgtcgcgacg gccgtttcgt cgaatggctc ggttgccaat 240
atcaatgcga tcaagtcggg cgctctggag tccggcttta cgcagtcaga cgttgcctat 300
tgggcctata acggcaccgg cctttatgat ggcaagggca aggtggaaga tttgcgcctt 360
ctggcgacgc tttacccgga aacgatccat atcgttgcgc gtaaggatgc aaacatcaaa 420
tcggtcgcag acctgaaagg caagcgcgtt tcgctggatg agccgggttc tggcaccatc 480
gtcgatgcgc gtatcgttct tgaagcctac ggcctcacgg aagacgatat caaggctgaa 540
cacctgaagc cgggaccggc aggcgagagg ctgaaagatg gtgcgctgga cgcctatttc 600
tttgtgggcg gctatccgac gggcgcaatc tcggaactgg ccatctcgaa cggtatttcg 660
ctcgttccga tctccgggcc ggaagcggac aagattctgg agaaatattc cttcttctcg 720
aaggatgtgg ttcctgccgg agcctataag gacgtggcgg aaacaccgac ccttgccgtt 780
gccgcacagt gggtgacgag cgccaagcag ccggacgacc tcatctataa catcaccaag 840
gttctctgga acgaggatac acgcaaggca ctcgatgcgg gccatgcgaa gggcaagctc 900
atcaagctcg atagtgcgac gagcagcctc ggtattccgc tgcatcccgg cgcagaacgc 960
ttttacaagg aagcgggcgt gctgaaataa 990
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tgcctttcag gtctgcgacc gatttgatgt 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggctttac gcagtcagac gttgcctatt 30
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaatcttcca ccttgccctt gccatcataa 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
caatgcgatc aagtcgggcg ctctggagtc 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tgcctttcag gtctgcgacc gatttgatgt 30
<210> 9
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agggcaaggt ggaagatttg cgccttctgg 30
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcgcaaatct tccaccttgc ccttgccatc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
caatgcgatc aagtcgggcg ctctggagtc 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atcgtttccg ggtaaagcgt cgccagaagg 30
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctcggttgcc aatatcaatg cgatcaagtc 30

Claims (9)

1.一种用于布鲁氏菌RPA扩增的引物组；所述引物组包括上游引物和下游引物；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种包括权利要求1所述引物组的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括醋酸镁溶液、RPA反应缓冲液、RPABasic冻干粉、50×SYBR GreenI和无菌水。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品；所述阳性对照品包括布鲁氏菌的基因组DNA；所述阴性对照品包括无菌水。
5.权利要求1所述引物组或者权利要求2～4任意一项所述试剂盒在非诊断目的的布鲁氏菌RPA扩增中的应用，所述应用包括以下步骤：
1)提取待检测样品的基因组DNA；
2)以待检测样品的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物组进行RPA扩增反应，得到RPA扩增产物；
3)将所述RPA扩增产物和50×SYBR Green I混合，离心，用395nm波长的紫外灯照射，观察反应体系扩增产物产生荧光情况，若反应体系扩增产物呈现荧光，则样品中含有布鲁氏菌，若反应体系扩增产物不呈现荧光，则样品中不含布鲁氏菌。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中还包括分别以布鲁氏菌的基因组DNA和无菌水为模板进行RPA扩增；所述以布鲁氏菌的基因组DNA为模板的RPA扩增结果作为阳性对照，以无菌水为模板的RPA扩增结果作为阴性对照。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述RPA扩增反应的反应体系以50μL计包括：2μL模板、12.4μL无菌水、29.5μL RPA反应缓冲液、上下游引物各1.8μL，2.5μL醋酸镁水溶液和4mg RPABasic冻干粉；
所述醋酸镁溶液中醋酸镁的浓度为280mM；所述上游引物和下游引物的浓度分别为10μM；所述模板的浓度为0.1μg/μL。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述RPA扩增反应的程序为：37～42℃扩增10～20min。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，以RPA扩增的扩增体系总体积为50μL计，步骤3)中所述50×SYBR Green I的用量为1～2μL。
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