CN103602721A - 一种检测布鲁氏菌的lamp引物及包含该引物的试剂盒 - Google Patents

一种检测布鲁氏菌的lamp引物及包含该引物的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测布鲁氏菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒。本发明所述的LAMP引物包括内引物FIP和BIP，外引物F3和B3，以及2对环引物（LF1和LB1，或者LF2和LB2）；所述试剂盒包括所述LAMP引物、Bst DNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液等。本发明利用环介导等温扩增反应（LAMP），由Bst ploymerase和所述LAMP引物对靶基因BCSP31进行特异性扩增，可以快速、准确、方便地检测出人血样或者牛奶中的布鲁氏菌。本发明所述的检测方法灵敏度较高，检测下限可达到35fg，反应时间短，不需要昂贵的仪器来实现，可操作性强；并且产物检测方便，通过肉眼观察或染色法就能实现，具有很高的实用价值。

Description

一种检测布鲁氏菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒
技术领域
本发明涉及一种快速检测布鲁氏菌的方法以及LAMP引物及包含该引物的试剂盒，属于微生物检测技术领域。 
背景技术
布鲁氏菌（Brucella spp.）是一种革兰氏阴性菌，无鞭毛，无芽孢，光滑有荚膜。常在细胞内寄生。内毒素是其重要的致病物质。布鲁氏菌可通过完整皮肤和粘膜进入宿主，具有较强的侵袭力。根据表型，抗原性及宿主的不同，布鲁氏菌被分为6各种，分别是Brucella abortus(牛种布鲁氏菌),Brucella melitensis(羊种布鲁氏菌),Brucella ovis(绵羊附睾种布鲁氏菌),Brucella canis(犬种布鲁氏菌),Brucella suis(猪种布鲁氏菌)and Brucella neotomae(沙林鼠种布鲁氏菌)；感染人类的主要是牛种布鲁氏菌，羊种布鲁氏菌和猪种布鲁氏菌。长久以来，布鲁氏菌一直被列为潜在的生物武器。 
布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌引起的一种重要的人兽共患传染病，在许多国家引起了严重的公共健康问题和农业经济问题。该病可以导致许多家畜和野生动物流产和不育；人类感染布鲁氏菌的临床症状表现为发热(波浪热)、寒战、头痛、全身疼痛、疲劳、脑神经功能障碍症状、关节炎等非特异性症状。 
由于布鲁氏菌病的临床症状是非特异性的，并且变化无常，因此必须借助实验室诊断技术对布鲁氏菌病进行最后的确诊。细菌学检测是必要的，但是细菌在培养基中生长较慢，并对实验室工作人员有危险；血清学诊断虽然比较简单，但是特异性比较低，因为布鲁氏菌的脂多糖与其他病原菌的脂多糖（如小肠结肠炎耶氏菌）存在结构相似性，因此容易产生交叉反应；基于DNA的PCR检测方法敏感，准确，快速，可以替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。因此，迫切需要开发出一种可以快速、特异、简单、安全地检测布鲁氏菌病的方法。 
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中无法快速、准确的检测布鲁氏菌的不足，提供一种可以快速、特异、简单、安全地检测布鲁氏菌的方法； 
进一步的，本发明提供了一种能够快速检测布鲁氏菌的LAMP引物以及包含该引物的试剂盒。 
为解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的： 
一种用于检测布鲁氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向内引物FIP、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向内引物BIP、核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向外引物F3以及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向 外引物B3。 
所述LAMP引物还包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：6所示的环引物LF1和LB1，或者核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的环引物LF2和LB2。 
一种用于检测布鲁氏菌的试剂盒，包括：权利要求1或2所述的LAMP引物、Bst DNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水; 
其中，所述含dNTPs的反应缓冲液包含40mM pH8.8的Tris-HCl、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4、0.2%吐温20、1.6M甜菜碱以及2.8mM dNTPs 
所述试剂盒包括40pM/μL引物FIP100μL，40pM/μL引物BIP100μL，5pM/μL引物F3100μL，5pM/μL引物B3100μL，20pM/μL引物LF1或LF2100μL，20pM/μL引物LB1或LB2100μL，8U/μL的Bst DNA聚合酶100μL，含dNTPs的反应缓冲液1.5mL，去离子水1mL。 
一种利用权利要求3所述的试剂盒检测布鲁氏菌的方法，包括如下步骤： 
S01：制备模板DNA； 
S02：以S01中所得的DNA作为模板，采用权利要求1或2所述的LAMP引物，于60℃～65℃进行LAMP扩增反应，反应时间为55min～90min；所述LAMP扩增反应的体系为25μL，各组分的含量如下： 
Figure BDA00003520314400041
或者 
Figure BDA00003520314400042
S03:扩增结果判定。 
所述步骤S02中，利用Real-time turbidimeter浊度仪进行LAMP扩增反应；通过浊度仪连接的LA-320程序显示的浊度上升时间鉴定 所述步骤S02中特异性扩增产物的存在。 
本领域技术人员也可以根据实际需要按比例调节所述步骤S02中的反应体系，亦可以实现本发明。 
所述步骤S02中，所述LAMP扩增反应的温度为63℃，时间为90min。 
在所述步骤S02结束后，可以将反应产物于80℃恒温灭活5min或95℃恒温灭活5min。 
所述布鲁氏菌为人体血液或者牛奶中的布鲁氏菌。 
一种利用所述的试剂盒进行检测布鲁氏菌的应用。 
BCSP31基因在所有布鲁氏菌种和生物型中是保守的，它编码了大小为3l ku具有免疫原性的可溶性细胞表面蛋白质。该基因于1988年被克隆测序和体外表达；1992年Baily等扩增BCSP31基因的一段大小为223bp的片段，结果表明该序列在牛种布鲁氏菌和羊种布鲁氏菌中是保守的；1996年Da Costa等证实BCSP31基因能鉴别所有的布鲁氏菌种和生物型，他们还检测了其他98种对照细菌，结果均为阴性；王胜昌等（2003）以BCSP31为靶基因建立套式PCR反应，不同型的布鲁氏菌都能出现预期的扩增带；结果表明BCSP31序列具有高度的布鲁氏菌特异性，可用于鉴别布鲁氏菌。 
环介导等温扩增技术(LAMP，loop-mediated isotherma lamplification)是一种全新的核酸扩增方法。该法在等温条件下(60～65℃)就能完成扩增反应，它可以在1h以内在恒温条件下特异地扩增 DNA到109个拷贝，在保持PCR技术优点的基础上，进一步增强了反应的特异性和缩短了检测时间。LAMP技术利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。由于它针对靶基因的6个区域设计4种特意的引物，因而对靶基因序列有高度的特异性；如果再增加一对环引物，则可以使反应加速，提高扩增效率。LAMP扩增结果判定的方法包括：（1）荧光染色法：向LAMP反应产物中加入SYBR GreenⅠ等燃料，进行呈色反应，通过观察LAMP反应体系的颜色变化来判定扩增结果。若发生了扩增反应，SYBR GreenⅠ会掺入双链DNA中，反应体系的颜色会从橙色变为绿色；若反应体系的颜色保持不变，则没有发生扩增反应。（2）琼脂糖凝胶电泳法：根据LAMP的扩增原理，LAMP反应的最终产物含有不同长度（目的片段长度的自然数倍）的花椰菜状的反向重复序列，所以其产物在琼脂糖凝胶上呈现特征性梯状条带，而非单一条带。（3）焦磷酸镁浊度检测：DNA大量合成时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子与溶液中的镁离子结合产生焦磷酸镁白色沉淀，出现肉眼可见的浑浊，浊度大小与DNA的含量成正比，可以通过肉眼观察反应前后的浑浊情况来判断是否发生了LAMP反应，也可以用分光光度计检测其在400nm处的吸光度，实现实时定量检测。 
如果LAMP反应的靶序列在除引物区外带有限制性酶切位点，则 可以利用该酶切位点进行LAMP反应特异性扩增产物的鉴定。本发明所述的靶序列在除引物区外带有限制性酶切位点BstH2Ⅰ，用该酶对所述LAMP扩增产物进行酶切，所得到的酶切片段的大小的计算如下所示： 
所述LAMP反应的机理如附图11所示。 
LAMP扩增产物的线性示意图如附图12所示。 
本发明所述的LAMP反应的目的基因如图13所示。 
由以上各图可推知： 
B+的长度=B1c的长度+B2的长度+B2和B1之间的长度+B1的长度=22+18+35+22=97bp 
B-的长度=22+18+35+22=97bp 
F+的长度=F1c的长度+F1c和F2c之间的长度+F2c的长度+F1的长度=22+22+19+22=85bp 
F-的长度=22+22+19+22=85bp 
+的长度=-的长度=B1和F1c之间的距离=2bp 
BstH2Ⅰ的酶切位点位于F1c和B1之间，酶切产物预期片段的大小推导结果如图14所示。 
酶切后的片段大小为： 
97+2+22+20+16=141bp 
2+19+22+2+97+2+22+19+2=187bp 
20+22+2+97+2+22+20=185bp 
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点： 
（1）本发明所述的一种检测布鲁氏菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒，所述LAMP引物以BCSP31基因为靶基因进行扩增；该基因序列具有高度的布鲁氏菌特异性，因而可以实现布鲁氏菌的特异性检测。 
（2）本发明所述的一种检测布鲁氏菌的LAMP引物及包含该引物的试剂盒，在检测布鲁氏菌时更加快速和高效，因为LAMP扩增反应不需要对模板DNA进行热变性，避免了温度循环造成的时间损失，核酸扩增在1h内即可完成；添加环引物后20-30min内就可以检测到扩增产物，1h内可扩增出109个靶序列拷贝，且产物可以达到0.5mg/mL。 
（3）本发明所述的LAMP法检测布鲁氏菌，针对靶序列的6个区域设计了4种特异性引物，6个区域中任何一处与引物不匹配均不能进行核酸扩增，因而具有高特异性；同时LAMP扩增法具有高灵敏 度，所需模板拷贝量少，灵敏度较较高，检测下限约为35fg。 
（4）本发明所述的LAMP反应可操作性强，只需要一个简单的恒温器即可完成此操作；并且产物检测方便，通过肉眼观察或染色法就能实现。 
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中， 
图1是本发明所述实施例4中实验例（1）不加环引物的LAMP反应开始时间（min），均在45min之后开始反应； 
图2是本发明所述实施例2中LAMP反应特异性分析的实时浊度法反应结果，横坐标代表反应时间（min），纵坐标代表浊度；CH1-8分别对应：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌、酵母菌、黄曲霉； 
图3是本发明所述实施例2中实时浊度法反应结果，横坐标代表样品编号，纵坐标代表浊度；1-8分别对应：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌、酵母菌、黄曲霉； 
图4是本发明所述实施例3中向LAMP扩增产物肉眼观察结果，编号1-8对应的稀释梯度分别为3.5ng/μL、350pg/μL、35pg/μL、3.5pg/μL、350fg/μL、35fg/μL、3.5fg/μL和350ag/μL； 
图5是本发明所述实施例4中实验例（2）、（3）和（4）加入环引物的LAMP实时浊度法反应结果，横坐标代表反应时间（min）， 纵坐标代表浊度；CH1为标准布鲁氏菌株对照DNA、CH5为实验例（2）的扩增结果、CH6为实验例（3）的扩增结果、CH7为实验例（4）的扩增结果、CH8为阴性对照（水）；所述反应均在45min之前开始反应； 
图6是本发明所述实施例4中实验例（2）、（3）和（4）的实时浊度法反应结果，横坐标代表样品编号，纵坐标代表浊度；1为标准布鲁氏菌株对照DNA、5为实验例（2）的扩增结果、6为实验例（3）的扩增结果、7为为实验例（4）的扩增结果、8为阴性对照（水）； 
图7是本发明所述实施例4中实验例（5）的LAMP实时浊度法反应结果，横坐标代表反应时间（min），纵坐标代表浊度；CH1和CH2为阴性对照，CH3为标准布鲁氏菌株对照DNA，CH7为本实验例的扩增结果； 
图8是本发明所述实施例4中实验例（5）的实时浊度法反应结果，横坐标代表样品编号，纵坐标代表浊度；1和2为阴性对照（水和大肠杆菌）、3为标准布鲁氏菌株对照DNA、7为实验例（5）的扩增结果； 
图9本发明所述实施例4实验例（1）扩增产物的1%琼脂糖凝胶电泳图，所用Marker为100-1100bp，泳道1为实验例（1）的扩增产物； 
图10本发明所述实施例4实验例（1）扩增产物酶切后所得酶切产物的2%琼脂糖凝胶电泳图，所用Marker为100-600bp，泳道1为实验例（1）扩增产物的酶切产物； 
图11所述LAMP反应的机理图； 
附图12所述LAMP扩增产物的线性示意图； 
图13为所述的LAMP反应的目的基因； 
图14为所述的LAMP反应酶切产物预期片段的大小推导结果。 
具体实施方式
实施例1用于检测布鲁氏菌的LAMP引物的设计与合成 
选择羊种布鲁氏菌BCSP31基因作为目的基因，通过在线工具http://primerexplorer.jp/e/，使用Primer Explorer V4设计、筛选并合成一套参数符合LAMP引物设计要求的引物。所述引物包括2条外引物（F3、B3），2条内引物（FIP、BIP）和2对环引物（LF1、LB1和LF2、LB2），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。各引物的序列见表1： 
表1：检测布鲁氏菌的LAMP引物 
实施例2利用LAMP引物检测布鲁氏菌的特异性分析 
用建立的LAMP方法扩增大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、苏云金芽孢杆菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌、酵母菌、黄曲霉等，验证方法的特异性。分析LA-320程序的出峰时间及峰值，如图2和图3所示。从图2可以看出，CH1-8均没有反应发生；图3中红色代表布鲁氏菌阳性，绿色代表布鲁氏菌阴性；1-8反应过程中浊度均为变化，均显示绿色，所以扩增结果均为阴性。结果表明，本发明所述的LAMP引物对BCSP31基因具有很高的特异性。 
实施例3利用LAMP引物检测布鲁氏菌的灵敏度分析 
将从已经确诊的病羊(来自内蒙古突泉县动物防疫站)血中提纯的DNA模板经NANODROP2000紫外可见分光光计测定浓度后，进行10倍系列稀释，使得浓度梯度依次为3.5ng/μL、350pg/μL、35pg/μL、3.5pg/μL、350fg/μL、35fg/μL、3.5fg/μL和350ag/μL。取2.0μL作为LAMP反应模板，每个梯度进行三个重复。反应结束后，直接肉眼观察反应管内颜色变化进行结果判定。发生LAMP扩增时，结果称白色沉淀，而未发生LAMP反应的则溶液澄清。通过观察发现，当DNA模板浓度低至35fg/μL，反应管内依然有白色沉淀产生，所以判定本方法的检测下限约为35fg，灵敏度较高。 
用外引物（F3、B3）扩增并纯化的羊种布鲁氏菌DNA作为目的片段连接到PMD18-T载体，作为标准布鲁氏菌株对照DNA。 
实施例4试剂盒对布鲁氏菌的检测 
实验例（1）利用所述试剂盒检测人血样中的布鲁氏菌（不含环 引物） 
S01：制备模板DNA； 
将人血样放于沸水中5min，然后12000rpm离心5min，离心后取上清50μL作为LAMP扩增反应的模板； 
S02：以S01中所得的DNA作为模板，采用所述LAMP引物，于60℃的恒温水浴锅中进行LAMP扩增反应，反应时间为90min； 
LAMP反应体系如下： 
Figure BDA00003520314400131
S03：向反应管内加入一定量的SYBR GreenⅠ染料，通过观察溶液的颜色变化判定扩增结果，如果变绿则存在扩增产物，如果颜色保持不变则不存在扩增反应。 
为了进一步确认LAMP扩增产物的存在，将实验例（1）得到的扩增产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果扩增产物呈现特征性的梯形条带，如附图9泳道1所示，证明存在阳性反应。 
为了确认LAMP反应特异性扩增产物的存在，对实验例（1）所得到的扩增产物进行酶切，然后将酶切产物通过2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果在100bp和200bp之间出现了2个大小在140bp和180bp位置的条带，如附图10泳道1所示，2个条带的位置与通过LAMP计算酶切片段的方法所得的理论酶切片段141bp、187bp和185bp相一致，所以本实验例存在布鲁氏菌阳性反应。 
所述扩增产物的酶切反应过程如下：（1）通过Prime5软件查找合适的限制性内切酶，根据酶切位点选用BstH2Ⅰ（ViVantis，购自北京欣科中晶科技有限公司），位点是RGCGC^Y，在本实例中位点即为GGCGC^T；（2）根据BstH2Ⅰ的特点，选择50μL酶切反应体系，在65℃下温浴2h进行酶切反应，所述反应体系为： 
Figure BDA00003520314400141
实验例（2）利用所述试剂盒检测人血样中的布鲁氏菌（包含环引物LF1和LB1） 
S01：制备模板DNA； 
将人血样放于沸水中5min，然后12000rpm离心5min，离心后取上清50μL作为LAMP扩增反应的模板。 
S02：以S01中所得的DNA作为模板，采用所述LAMP引物，连 接Real-time turbidimeter浊度仪，于65℃进行LAMP扩增反应，反应时间为90min； 
LAMP反应体系如下： 
Figure BDA00003520314400151
通过浊度仪连接的LA-320程序显示的浊度上升时间鉴定所述步骤S02中特异性扩增产物的存在； 
S03：扩增结果判定，详见图5和图6。 
实验例（3）利用所述试剂盒检测人血样中的布鲁氏菌（包含环引物LF1和LB1） 
S01：制备模板DNA； 
将人血样放于沸水中5min，然后12000rpm离心5min，离心后取上清50μL作为LAMP扩增反应的模板。 
S02：以S01中所得的DNA作为模板，采用所述LAMP引物，连接Real-time turbidimeter浊度仪，于63℃进行LAMP扩增反应，反应时间为90min； 
LAMP反应体系如下： 
Figure BDA00003520314400161
通过浊度仪连接的LA-320程序显示的浊度上升时间鉴定所述步骤S02中特异性扩增产物的存在； 
S03：扩增结果判定，详见图5和图6。 
实验例（4）利用所述试剂盒检测人血样中的布鲁氏菌（包含环引物LF2和LB2） 
S01：制备模板DNA； 
将人血样放于沸水中5min，然后12000rpm离心5min，离心后 取上清50μL作为LAMP扩增反应的模板。 
S02：以S01中所得的DNA作为模板，采用所述LAMP引物，连接Real-time turbidimeter浊度仪，于63℃进行LAMP扩增反应，反应时间为90min； 
LAMP反应体系如下： 
通过浊度仪连接的LA-320程序显示的浊度上升时间鉴定所述步骤S02中特异性扩增产物的存在； 
S03：扩增结果判定，详见图5和图6。 
综上，从图5可以看出，阳性对照CH1发生了反应，实验例（2）、（3）、（4）所对应的CH5-7均发生了反应，阴性对照CH8没有发生反应；图6中红色代表布鲁氏菌阳性，绿色代表布鲁氏菌阴性；1、5-7 反应过程中浊度均有变化，显示红色，所以扩增结果为阳性；8为阴性对照，浊度没有任何变化，扩增结果为阴性。 
实验例（5）利用所述试剂盒检测牛奶中的布鲁氏菌（包含环引物LF2和LB2） 
S01：提取牛奶样品中的DNA，具体步骤如下： 
1）取400μL冻存奶样溶解后的上层液体，加入2mL的离心管中，加入100μLNET buffer（Nacl50mM、EDTA125mM、Tris50mM），然后加入终浓度为3.5%100μL20%的SDS，混匀。在95-100℃孵育10min后，迅速放置于-20℃冷却10min； 
2）在样品中加入Rnase A酶至终浓度为75ug/μL，50℃作用1-2h。然后加入proteinase K至终浓度为325ug/μL，50℃作用1-2h。注意反复颠倒混匀； 
3）在上一步处理的样品液中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），颠倒摇匀2-3次，4℃下7500转离心8-10min。然后转移上清液于另一离心管中； 
4）重复3操作过程直到基本无其他杂质存在，加入2.5体积的预冷无水乙醇，同时加入1/10体积的3M的乙醇钠溶液，-20℃沉淀15-20min，12000转离心10min，弃去液体，沉淀物即为总DNA； 
5）用1mL70%（v/v）乙醇漂洗总DNA，12000转离心2-3min。弃去漂洗液，尽可能除去残留的液体；重复漂洗2-3次； 
S02：以S01中所得的DNA作为模板，采用所述LAMP引物，连 接Real-time turbidimeter浊度仪，于65℃进行LAMP扩增反应，反应时间为55min； 
LAMP反应体系如下： 
Figure BDA00003520314400191
S03：扩增结果判定，详见图7和图8。由图7可以看出阴性对照CH1和CH2均没有发生扩增反应，阳性对照CH3和本实验例CH7均发生了扩增反应；图8中中红色代表布鲁氏菌阳性，绿色代表布鲁氏菌阴性；1和2显示绿色，为阴性；阳性对照3和本实验例7显示红色，为阳性，发生了扩增反应。 
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有 的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。 
Figure IDA00003520315200011
Figure IDA00003520315200021

Claims (10)

1.一种用于检测布鲁氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向内引物FIP、核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向内引物BIP、核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的正向外引物F3以及核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向外引物B3。 
2.根据权利要求1所述的用于检测布鲁氏菌的LAMP引物，其特征在于，所述LAMP引物还包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的环引物LF1和LB1，或者核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的环引物LF2和LB2。 
3.一种用于检测布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1或2所述的LAMP引物、Bst DNA聚合酶、含dNTPs的反应缓冲液和去离子水; 
其中，所述含dNTPs的反应缓冲液包含40mM pH8.8的Tris-HCl、20mM KCl、20mM(NH4)2SO4、16mM MgSO4、0.2%吐温20、1.6M甜菜碱以及2.8mM dNTPs。 
4.根据权利要求3所述的用于检测布鲁氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括40pM/μL引物FIP100μL，40pM/μL引物BIP100μL，5pM/μL引物F3100μL，5pM/μL引物B3100μL，20pM/μL引物LF1或LF2100μL，20pM/μL引物LB1或LB2100μL，8U/μL的Bst DNA 聚合酶100μL，含dNTPs的反应缓冲液1.5mL，去离子水1mL。 
5.一种检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括如下步骤： 
S01：制备模板DNA； 
S02：以S01中所得的DNA作为模板，采用权利要求1或2所述的LAMP引物，于60℃～65℃进行LAMP扩增反应，反应时间为55min～90min；所述LAMP扩增反应的体系为25μL，各组分的含量如下： 
Figure FDA00003520314300021
或者 
Figure FDA00003520314300022
S03:扩增结果判定。 
6.根据权利要求5所述的检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，所述步骤S02中，利用Real-time turbidimeter浊度仪进行LAMP扩增反应；通过浊度仪连接的LA-320程序显示的浊度上升时间鉴定所述步骤S02中特异性扩增产物的存在。 
7.根据权利要求5或6所述的检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，所述步骤S02中，所述LAMP扩增反应的温度为63℃，时间为90min。 
8.根据权利要求5-7任一所述的检测布鲁氏菌的方法，其特征在于，所述布鲁氏菌为人体血液或者牛奶中的布鲁氏菌。 
9.一种利用权利要求3或4所述的试剂盒在检测布鲁氏菌中的应用。 
10.一种利用权利要求1或2所述的LAMP引物在检测布鲁氏菌中的应用。 
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