CN106319054A - 检测布鲁氏菌的引物及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测布鲁氏菌的引物及检测方法。本发明的引物组合I，由序列1至4所示的4条单链DNA分子组成；引物组合II，由序列5至8所示的4条单链DNA分子组成；引物组合III，由序列9至12所示的4条单链DNA分子组成。本发明还保护所述引物组合I或引物组合II或引物组合III的应用。本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌的方法、一种检测待测样本中是否含有布鲁氏菌的方法。本发明提供的引物及检测方法可以有效避免检测过程中引物二聚体的产生，避免了假阳性的结果，对有效检测布鲁氏菌及布病的防控提供了技术支持。

Description

检测布鲁氏菌的引物及检测方法
技术领域
本发明涉及一种检测布鲁氏菌的引物及检测方法。
背景技术
布鲁氏菌(Brucella)属于兼性胞内寄生的革兰氏阴性球杆菌，大小在0.5-1.5μm左右，无鞭毛，不形成芽孢，需氧，在严格厌氧条件下不能生长。布鲁氏菌侵染机体导致人畜共患疾病(布病)，人患布病症状多为反复发热、关节痛，继而丧失劳动力。动物患布病则表现为睾丸炎、流产。因而布病是一种既严重威胁人类健康，又给畜牧业造成重大损失的疾病。
不同种类的布鲁氏菌对人体侵袭能力不同，羊种对人类有显著的侵染性，而牛种、犬种等对人的毒力则大大降低。布鲁氏菌主要通过带菌的牲畜、肉蛋奶产品、环境等传播。因此，建立布鲁氏菌快速有效的检测方法对于布病的防控是十分必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测布鲁氏菌的引物及检测方法。
本发明保护引物组合I或引物组合II或引物组合III；
所述引物组合I由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1和引物BIP-1组成；
所述引物F3-1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物B3-1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物FIP-1为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物BIP-1为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物组合II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2和引物BIP-2组成；
所述引物F3-2为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物B3-2为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述引物FIP-2为如下(b5)或(b6)：
(b5)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(b6)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物BIP-2为如下(b7)或(b8)：
(b7)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(b8)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物组合III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-3和引物BIP-3组成；
所述引物F3-3为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(c2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物B3-3为如下(c3)或(c4)：
(c3)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(c4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物FIP-3为如下(c5)或(c6)：
(c5)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(c6)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物BIP-3为如下(c7)或(c8)：
(c7)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(c8)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子。
所述引物组合I或引物组合II或引物组合III的用途为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：
(d1)鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌；
(d2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌的试剂盒；
(d3)检测待测样本中是否含有布鲁氏菌；
(d4)制备用于检测待测样本中是否含有布鲁氏菌的试剂盒。
本发明还保护所述引物组合I或引物组合II或引物组合III的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：
(d1)鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌；
(d2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌的试剂盒；
(d3)检测待测样本中是否含有布鲁氏菌；
(d4)制备用于检测待测样本中是否含有布鲁氏菌的试剂盒。
本发明还保护含有所述引物组合I或引物组合II或引物组合III的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(e1)或(e2)：
(e1)鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌；
(e2)检测待测样本中是否含有布鲁氏菌。
本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌的方法，包括如下步骤：提取待测细菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用特异引物组合进行LAMP扩增，如果采用特异引物组合可以实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测细菌为或候选为布鲁氏菌，如果采用特异引物组合不能实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测细菌为或候选为非布鲁氏菌；所述特异引物组合具体可为所述引物组合I或所述引物组合II或所述引物组合III。
本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌的方法，包括如下步骤：检测待测细菌的基因组DNA中是否含有特异引物组合的靶序列，如果所述基因组DNA中含有特异引物组合的靶序列、待测细菌为或候选为布鲁氏菌，如果所述基因组DNA中不含有特异引物组合的靶序列、待测细菌为或候选为非布鲁氏菌；所述特异引物组合具体可为所述引物组合I或所述引物组合II或所述引物组合III。
本发明还保护一种检测待测样本中是否含有布鲁氏菌的方法，包括如下步骤：提取待测样本的总DNA，以总DNA为模板，采用特异引物组合进行LAMP扩增，如果采用特异引物组合可以实现以所述总DNA为模板的阳性扩增、待测样本中含有或疑似含有布鲁氏菌，如果采用特异引物组合不能实现以所述总DNA为模板的阳性扩增、待测样本不含有布鲁氏菌；所述特异引物组合具体可为所述引物组合I或所述引物组合II或所述引物组合III。
本发明还保护一种检测待测样本中是否含有布鲁氏菌的方法，包括如下步骤：检测待测样本的总DNA中是否含有特异引物组合的靶序列，如果所述总DNA中含有特异引物组合的靶序列、待测样本含有或疑似含有布鲁氏菌，如果所述总DNA中不含有特异引物组合的靶序列、待测样本不含有布鲁氏菌；所述特异引物组合具体可为所述引物组合I或所述引物组合II或所述引物组合III。
以上任一所述引物组合的各条引物均以引物溶液形式加入至LAMP反应体系中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为10μM。
以上任一所述采用引物组合进行LAMP扩增的反应体系具体可为：10μL Mix酶，8μL模板DNA，3.2μL引物FIP，3.2μL引物BIP，0.4μL引物F3，0.4μL引物B3。
以上任一所述模板DNA均以DNA溶液形式加入至LAMP反应体系中，各模板DNA在DNA溶液中的初始浓度均为5ng/μL。
以上任一所述LAMP扩增的反应程序可为：62-65℃(具体可为62℃或65℃)恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号。
以上任一所述布鲁氏菌具体可为牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌或犬种布鲁氏菌。
所述牛种布鲁氏菌具体可为牛种布鲁氏菌S19；所述羊种布鲁氏菌具体可为羊种布鲁氏菌M5；所述犬种布鲁氏菌具体可为犬种布鲁氏菌RM6/66。
本发明设计合成了用于检测布鲁氏菌的引物并建立了检测方法，本发明提供的引物及检测方法可以有效避免检测过程中引物二聚体的产生，避免了假阳性的结果，对有效检测布鲁氏菌及布病的防控提供了技术支持。
附图说明
图1为实施例1引物再优化的步骤3的LAMP扩增结果。
图2为实施例1引物再优化的步骤5的LAMP扩增结果。
图3为实施例1引物再优化的步骤6的LAMP扩增结果。
图4为实施例2中模板量及引物浓度优化的LAMP扩增结果。
图5为实施例2中反应温度优化的LAMP扩增结果。
图6为实施例3的LAMP扩增结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。以下实施例中，各条引物均以引物溶液形式加入至LAMP反应体系中，各条引物在引物溶液中的初始浓度均为10μM；各模板DNA均以DNA溶液形式加入至LAMP反应体系中，各模板DNA在DNA溶液中的初始浓度均为5ng/μL。
牛种布鲁氏菌S19(简称牛种布鲁氏菌)、羊种布鲁氏菌M5(简称羊布鲁氏菌)、犬种布鲁氏菌RM6/66(简称犬种布鲁氏菌)和大肠杆菌：参考文献：陈思，王秀然，钱晶，等.牛、羊、猪、犬布鲁氏菌病多重PCR方法的建立[J].中国畜牧兽医，2014，41(02)：29-34.；公众可以从中央民族大学获得。
白色葡萄球菌：中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，编号：10897。
实施例1、引物设计及优化
一、引物设计
进行大量序列分析、比对获得了用于检测布鲁氏菌的12套引物组合(如表1所示)。每套引物组合包括外引物(F3和B3)和内引物(FIP和BIP)。
表1 12套引物组合列表
二、引物优化
1、分别提取牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌的基因组DNA。
2、采用步骤1得到的各基因组DNA为模板，分别采用表1的12套引物组合进行LAMP扩增。
LAMP扩增的反应体系：15μL Mix酶，5μL模板DNA，2.4μL引物FIP，2.4μL引物BIP，0.3μL引物F3，0.3μL引物B3。
LAMP扩增的反应程序：65℃恒温60min。
扩增结果如表2所示。
表2 LAMP扩增结果
通过上述实验，筛选出0mp2-001、0mp2a-43、0mp2a-14、0mp25-10、0mp25-34这5套引物组合，它们对于牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌具有普适性，可以将牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌基因组DNA全部扩增。
三、引物再优化
1、提取羊种布鲁氏菌的基因组DNA。
2、采用步骤1得到的基因组DNA为模板，分别采用引物组合0mp2a-43和引物组合0mp2a-14进行LAMP扩增。
LAMP扩增的反应体系：15μL Mix酶，5μL模板DNA，2.4μL引物FIP，2.4μL引物BIP，0.3μL引物F3，0.3μL引物B3。
LAMP扩增的反应程序：65℃恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号，每30s设为一个循环。
3、用等体积超纯水代替羊种布鲁氏菌的基因组DNA进行步骤2的LAMP扩增。
结果如图1所示。图1中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度，1为采用引物组合0mp2a-43扩增羊种布鲁氏菌的基因组DNA得到的扩增曲线，2为采用引物组合0mp2a-14扩增羊种布鲁氏菌的基因组DNA得到的扩增曲线，3为采用引物组合0mp2a-43扩增超纯水得到的扩增曲线，采用引物组合0mp2a-14扩增超纯水未得到扩增曲线。结果表明，采用引物组合0mp2a-43扩增超纯水出现扩增曲线，可能的原因是形成了引物二聚体，而引物组合0mp2a-14扩增超纯水未得到扩增曲线，未形成引物二聚体。因此，可以判定引物组合0mp2a-14的效果要好于引物组合0mp2a-43。
4、采用步骤1得到的基因组DNA为模板，分别采用引物组合0mp2-001、引物组合0mp2a-14、引物组合0mp25-10和引物组合0mp25-34进行LAMP扩增。
LAMP扩增的反应体系：15μL Mix酶，5μL模板DNA，2.4μL引物FIP，2.4μL引物BIP，0.3μL引物F3，0.3μL引物B3。
LAMP扩增的反应程序：65℃恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号，每60s设为一个循环。
5、用等体积超纯水代替羊种布鲁氏菌的基因组DNA进行步骤4的LAMP扩增。
结果如图2所示。图2中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度，1为采用引物组合0mp2-001扩增羊种布鲁氏菌的基因组DNA得到的扩增曲线，2为采用引物组合0mp25-10扩增羊种布鲁氏菌的基因组DNA得到的扩增曲线，3为采用引物组合0mp25-34扩增羊种布鲁氏菌的基因组DNA得到的扩增曲线，4为采用引物组合0mp2a-14扩增羊种布鲁氏菌的基因组DNA得到的扩增曲线，5为采用引物组合0mp25-34扩增超纯水得到的扩增曲线，采用引物组合0mp2-001、引物组合0mp25-10和引物组合0mp2a-14扩增超纯水均未得到扩增曲线。结果表明，采用引物组合0mp25-34进行扩增时会产生引物二聚体。
6、向步骤4和步骤5得到的扩增产物加入5μL SYBE Green I(100×)进行可视化检验。加入SYBR Green I后，若仍呈现橘红色，说明没有扩增产物，若出现黄绿色，则说明有扩增产物出现。
结果如图3所示。图3中，1为采用引物组合0mp25-34扩增羊种布鲁氏菌的基因组DNA得到的扩增产物，2为采用引物组合0mp2a-14扩增羊种布鲁氏菌的基因组DNA得到的扩增产物，3为采用引物组合0mp25-34扩增超纯水得到的扩增产物，4为采用引物组合0mp2a-14扩增超纯水得到的扩增产物，5为采用引物组合0mp2-001扩增羊种布鲁氏菌的基因组DNA得到的扩增产物，6为采用引物组合0mp25-10扩增羊种布鲁氏菌的基因组DNA得到的扩增产物，7为采用引物组合0mp2-001扩增超纯水得到的扩增产物，8为采用引物组合0mp25-10扩增超纯水得到的扩增产物，结果表明，采用引物组合0mp25-34进行扩增时会产生引物二聚体，产生假阳性结果，而引物组合0mp2-001、引物组合0mp2a-14和引物组合0mp25-10，能够有效避免假阳性。
根据上述结果，从12套引物组合中优化筛选出三套用于检测布鲁氏菌的引物组合，分别为引物组合0mp2-001、引物组合0mp2a-14和引物组合0mp25-10，这三个引物组合可以检测牛种、羊种和犬种三种布鲁氏菌，同时可以有效避免假阳性。
引物组合0mp2-001(引物组合I)各条引物序列如下所示(5’→3’)：
F3-1(序列表的序列1)：ACCAGAACTACGGTCAGTGG；
B3-1(序列表的序列2)：GTCTTCAGCAACGGTGTCT；
FIP-1(序列表的序列3)：GCGCAGCCTGCAGATTGAAGGTCTGGGGTGGTGCAAAG；
BIP-1(序列表的序列4)：GGCAAGACCGCAGTTACCGCTTGGTGTAGGAAACTTCCGG。
引物组合0mp2a-14(引物组合II)各条引物序列如下所示(5’→3’)：
F3-2(序列表的序列5)：GGCACCGATCTGCAGTTTG；
B3-2(序列表的序列6)：CCGTCGATCGTGTAATCGTT；
FIP-2(序列表的序列7)：TGACATCACCGAGGTAACCGGT-TATCACGCTTGGTGGTTTCA；
BIP-2(序列表的序列8)：CCTACCGCACCGGCAAGATC-GTTCGAGAGCGATCACAGC。
引物组合0mp25-10(引物组合III)各条引物序列如下所示(5’→3’)：
F3-3(序列表的序列9)：CAAGACCAGCACCGTTGG；
B3-3(序列表的序列10)：GGTTCAGGTCGTAGCCGA；
FIP-3(序列表的序列11)：GGTCCTGCTGGAAGTTCCAGC-AGCATCAAGCCTGACGATTG；
BIP-3(序列表的序列12)：CGGTGTTGAAGGTGATGCAGGT-TTCAAAGCCCTGCTTGACTT。
实施例2、反应体系优化
一、模板量及引物浓度优化
I、提取羊种布鲁氏菌的基因组DNA。
2、采用步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物组合0mp2-001进行LAMP扩增。共分为如下三个反应体系：
反应体系1：10μL Mix酶，2μL模板DNA，6.4μL引物FIP-1，6.4μL引物BIP-1，0.8μL引物F3-1，0.8μL引物B3-1。
反应体系2：10μL Mix酶，5μL模板DNA，6.4μL引物FIP-1，6.4μL引物BIP-1，0.8μL引物F3-1，0.8μL引物B3-1。
反应体系3：10μL Mix酶，8μL模板DNA，3.2μL引物FIP-1，3.2μL引物BIP-1，0.4μL引物F3-1，0.4μL引物B3-1
LAMP扩增的反应程序：65℃恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号，每30s设为一个循环。
3、采用超纯水为模板，采用引物组合0mp2-001进行LAMP扩增。共分为如下三个反应体系：
反应体系4(反应体系1的对照体系)：10μL Mix酶，2μL超纯水，6.4μL引物FIP-1，6.4μL引物BIP-1，0.8μL引物F3-1，0.8μL引物B3-1。
反应体系5(反应体系2的对照体系)：10μL Mix酶，5μL超纯水，6.4μL引物FIP-1，6.4μL引物BIP-1，0.8μL引物F3-1，0.8μL引物B3-1。
反应体系6(反应体系3的对照体系)：10μL Mix酶，8μL超纯水，3.2μL引物FIP-1，3.2μL引物BIP-1，0.4μL引物F3-1，0.4μL引物B3-1。
LAMP扩增的反应程序：65℃恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号，每30s设为一个循环。
结果如图4所示。图4中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度，1为反应体系1的扩增曲线，2为反应体系2的扩增曲线，3为反应体系3的扩增曲线，4为反应体系4的扩增曲线，反应体系5和反应体系6未得到扩增曲线。结果表明，反应体系1得到扩增曲线，但其对照反应体系4也产生了引物二聚体，反应体系2和反应体系3都得到了扩增曲线且相应对照体系(反应体系5和反应体系6)没有产生引物二聚体。反应体系3比反应体系2出峰早，因此反应体系3为最优反应体系。
二、反应温度优化
1、提取羊种布鲁氏菌的基因组DNA。
2、采用步骤1得到的基因组DNA为模板，采用引物组合0mp2-001进行LAMP扩增。
LAMP扩增反应体系：10μL Mix酶，8μL模板DNA，3.2μL引物FIP-1，3.2μL引物BIP-1，0.4μL引物F3-1，0.4μL引物B3-1。
LAMP扩增的反应程序：恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号，每60s设为一个循环。
设置如下反应温度：
反应温度I：62℃；
反应温度II：63℃；
反应温度III：64℃；
反应温度IV：65℃。
结果如图5所示。图5中，横坐标为循环数，纵坐标为荧光信号强度，1、2对应反应温度为62℃时的得到的扩增曲线，3、4对应反应温度为63℃时的得到的扩增曲线，5、6对应反应温度为64℃时的得到的扩增曲线，7、8对应反应温度为65℃时的得到的扩增曲线。结果表明，62℃和64℃出峰较早，但总体影响不大，在30min内都有扩增。因此反应温度可控制在62-65℃。
实施例3、检测方法验证
1、分别提取牛种布鲁氏菌、羊种布鲁氏菌和犬种布鲁氏菌的基因组DNA。
2、采用步骤1得到的各基因组DNA为模板，分别采用引物组合0mp2-001、引物组合0mp2a-14和引物组合0mp25-10进行LAMP扩增。
当采用引物组合0mp2-001时，LAMP扩增反应体系：10μL Mix酶，8μL模板DNA，3.2μL引物FIP-1，3.2μL引物BIP-1，0.4μL引物F3-1，0.4μL引物B3-1。设置采用等体积的超纯水作为模板的阴性对照。
当采用引物组合0mp2a-14时，LAMP扩增反应体系：10μL Mix酶，8μL模板DNA，3.2μL引物FIP-2，3.2μL引物BIP-2，0.4μL引物F3-2，0.4μL引物B3-2。设置采用等体积的超纯水作为模板的阴性对照。
当采用引物组合、时，LAMP扩增反应体系：10μL Mix酶，8μL模板DNA，3.2μL引物FIP-3，3.2μL引物BIP-3，0.4μL引物F3-3，0.4μL引物B3-3。设置采用等体积的超纯水作为模板的阴性对照。
LAMP扩增的反应程序：62℃恒温60min。
3、向步骤2得到的扩增产物加入5μL SYBE Green I(100×)进行可视化检验。加入SYBR Green I后，若仍呈现橘红色，说明没有扩增产物，若出现黄绿色，则说明有扩增产物出现。
如图6所示。图6为采用中引物组合0mp2-001进行扩增的结果图，其中，1为阴性对照的扩增产物，2为羊种布鲁氏菌的扩增产物，3为牛种布鲁氏菌的扩增产物，4为犬种布鲁氏菌的扩增产物。除阴性对照外，各实验组管内液体呈黄绿色并发荧光，均呈阳性反应。采用引物组合0mp2a-14和引物组合0mp25-10进行扩增的结果与引物组合0mp2-001相同。
实施例4、灵敏度
1、提取羊种布鲁氏菌的基因组DNA。
2、用无菌水10倍梯度稀释步骤1的基因组DNA，得到各稀释液。
3、分别取步骤2得到的各稀释液作为模板，分别采用引物组合0mp2-001、引物组合0mp2a-14和引物组合0mp25-10进行LAMP扩增。
由于采用的稀释度不同，形成如下不同的反应体系：
反应体系1中，基因组DNA的初始含量为：4ng；
反应体系2中，基因组DNA的初始含量为：400pg；
反应体系3中，基因组DNA的初始含量为：40pg；
反应体系4中，基因组DNA的初始含量为：4pg；
反应体系5中，基因组DNA的初始含量为：400fg。
反应体系6中，基因组DNA的初始含量为：40fg。
当采用引物组合0mp2-001时，LAMP扩增反应体系：10μL Mix酶，8μL模板DNA，3.2μL引物FIP-1，3.2μL引物BIP-1，0.4μL引物F3-1，0.4μL引物B3-1。设置采用等体积的超纯水作为模板的阴性对照。
当采用引物组合0mp2a-14时，LAMP扩增反应体系：10μL Mix酶，8μL模板DNA，3.2μL引物FIP-2，3.2μL引物BIP-2，0.4μL引物F3-2，0.4μL引物B3-2。设置采用等体积的超纯水作为模板的阴性对照。
当采用引物组合0mp25-10时，LAMP扩增反应体系：10μL Mix酶，8μL模板DNA，3.2μL引物FIP-3，3.2μL引物BIP-3，0.4μL引物F3-3，0.4μL引物B3-3。设置采用等体积的超纯水作为模板的阴性对照。
LAMP扩增的反应程序：65℃恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号，每60s设为一个循环。
结果表明，采用三种引物组合中的任意一种，当基因组DNA的含量为40fg-4ng时，均可以得到扩增曲线，最低能检测到40fg的布鲁氏菌。
实施例5、特异性
待测样本分别为：羊种布鲁氏菌、大肠杆菌和白色葡萄球菌。
1、提取各待测样本的基因组DNA。
2、以步骤1的基因组DNA为模板，分别采用引物组合0mp2-001、引物组合0mp2a-14和引物组合0mp25-10进行LAMP扩增。
当采用引物组合0mp2-001时，LAMP扩增反应体系：10μL Mix酶，8μL模板DNA，3.2μL引物FIP-1，3.2μL引物BIP-1，0.4μL引物F3-1，0.4μL引物B3-1。设置采用等体积的超纯水作为模板的阴性对照。
当采用引物组合0mp2a-14时，LAMP扩增反应体系：10μL Mix酶，8μL模板DNA，3.2μL引物FIP-2，3.2μL引物BIP-2，0.4μL引物F3-2，0.4μL引物B3-2。设置采用等体积的超纯水作为模板的阴性对照。
当采用引物组合0mp25-10时，LAMP扩增反应体系：10μL Mix酶，8μL模板DNA，3.2μL引物FIP-3，3.2μL引物BIP-3，0.4μL引物F3-3，0.4μL引物B3-3。设置采用等体积的超纯水作为模板的阴性对照。
LAMP扩增的反应程序：65℃恒温60min。反应过程中，采用荧光PCR仪检测荧光信号，每60s设为一个循环。
结果表明，采用三种引物组合中的任意一种，均只有羊种布鲁氏菌基因组DNA能够得到扩增曲线，其他待测样本均未得到扩增曲线，检测方法具有很高的特异性。

Claims (8)

1.引物组合I或引物组合II或引物组合III；
所述引物组合I由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1和引物BIP-1组成；
所述引物F3-1为如下(a1)或(a2)：
(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；
(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的DNA分子；
所述引物B3-1为如下(a3)或(a4)：
(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；
(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子；
所述引物FIP-1为如下(a5)或(a6)：
(a5)序列表的序列3所示的单链DNA分子；
(a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的DNA分子；
所述引物BIP-1为如下(a7)或(a8)：
(a7)序列表的序列4所示的单链DNA分子；
(a8)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的DNA分子；
所述引物组合II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2和引物BIP-2组成；
所述引物F3-2为如下(b1)或(b2)：
(b1)序列表的序列5所示的单链DNA分子；
(b2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列5具有相同功能的DNA分子；
所述引物B3-2为如下(b3)或(b4)：
(b3)序列表的序列6所示的单链DNA分子；
(b4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列6具有相同功能的DNA分子；
所述引物FIP-2为如下(b5)或(b6)：
(b5)序列表的序列7所示的单链DNA分子；
(b6)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列7具有相同功能的DNA分子；
所述引物BIP-2为如下(b7)或(b8)：
(b7)序列表的序列8所示的单链DNA分子；
(b8)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列8具有相同功能的DNA分子；
所述引物组合III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-3和引物BIP-3组成；
所述引物F3-3为如下(c1)或(c2)：
(c1)序列表的序列9所示的单链DNA分子；
(c2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列9具有相同功能的DNA分子；
所述引物B3-3为如下(c3)或(c4)：
(c3)序列表的序列10所示的单链DNA分子；
(c4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列10具有相同功能的DNA分子；
所述引物FIP-3为如下(c5)或(c6)：
(c5)序列表的序列11所示的单链DNA分子；
(c6)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列11具有相同功能的DNA分子；
所述引物BIP-3为如下(c7)或(c8)：
(c7)序列表的序列12所示的单链DNA分子；
(c8)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列12具有相同功能的DNA分子。
2.权利要求1所述引物组合I或引物组合II或引物组合III的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)：
(d1)鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌；
(d2)制备用于鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌的试剂盒；
(d3)检测待测样本中是否含有布鲁氏菌；
(d4)制备用于检测待测样本中是否含有布鲁氏菌的试剂盒。
3.含有权利要求1所述引物组合I或引物组合II或引物组合III的试剂盒；所述试剂盒的用途为如下(e1)或(e2)：
(e1)鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌；
(e2)检测待测样本中是否含有布鲁氏菌。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将各条引物单独包装的步骤。
5.一种鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌的方法，包括如下步骤：提取待测细菌的基因组DNA，以基因组DNA为模板，采用特异引物组合进行LAMP扩增，如果采用特异引物组合可以实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测细菌为或候选为布鲁氏菌，如果采用特异引物组合不能实现以所述基因组DNA为模板的阳性扩增、待测细菌为或候选为非布鲁氏菌；所述特异引物组合为权利要求1所述的引物组合I或引物组合II或引物组合III。
6.一种鉴定或辅助鉴定待测细菌是否为布鲁氏菌的方法，包括如下步骤：检测待测细菌的基因组DNA中是否含有特异引物组合的靶序列，如果所述基因组DNA中含有特异引物组合的靶序列、待测细菌为或候选为布鲁氏菌，如果所述基因组DNA中不含有特异引物组合的靶序列、待测细菌为或候选为非布鲁氏菌；所述特异引物组合为权利要求1所述的引物组合I或引物组合II或引物组合III。
7.一种检测待测样本中是否含有布鲁氏菌的方法，包括如下步骤：提取待测样本的总DNA，以总DNA为模板，采用特异引物组合进行LAMP扩增，如果采用特异引物组合可以实现以所述总DNA为模板的阳性扩增、待测样本中含有或疑似含有布鲁氏菌，如果采用特异引物组合不能实现以所述总DNA为模板的阳性扩增、待测样本不含有布鲁氏菌；所述特异引物组合为权利要求1所述的引物组合I或引物组合II或引物组合III。
8.一种检测待测样本中是否含有布鲁氏菌的方法，包括如下步骤：检测待测样本的总DNA中是否含有特异引物组合的靶序列，如果所述总DNA中含有特异引物组合的靶序列、待测样本含有或疑似含有布鲁氏菌，如果所述总DNA中不含有特异引物组合的靶序列、待测样本不含有布鲁氏菌；所述特异引物组合为权利要求1所述的引物组合I或引物组合II或引物组合III。
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