CN109913558A - 一种用于检测贝类寄生派琴虫的rpa引物和探针及试剂盒 - Google Patents
一种用于检测贝类寄生派琴虫的rpa引物和探针及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于检测贝类寄生派琴虫的RPA引物和探针，所述引物的序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探针Probe的序列如SEQ ID NO.3所示，在下游引物R1的5’端加入生物素标记，在探针Probe的5’端添加FAM标记，3’端添加C3Spacer标记，且在探针中间加入dSpacer或THF修饰。本发明还公开了包括上述引物和探针的试剂盒，以及上述引物和探针在检测贝类寄生派琴虫方面的应用和采用RPA法检测贝类寄生派琴虫方面的方法。本发明引物和探针以及试剂盒和方法检测时间短，灵敏度高，特异性强，且操作环境要求低，适用面广。
Description
技术领域
本发明属于水产动物寄生虫快速诊断技术领域，具体涉及一种用于检测贝类寄生派琴虫的RPA引物和探针及试剂盒。
背景技术
派琴虫(Perkinsus spp.)是一种病原性寄生虫，可以寄生于多种海水贝类，且分布范围广泛，其危害性极强，可引起贝壳闭合失控，套膜收缩，性腺发育抑制，生长缓慢，甚至导致贝类的大规模死亡。世界动物卫生组织(OIE)将其中危害性最严重的的两种派琴虫(P.marinus和P.olseni)规定为水产贝类动物疫病爆发时必须检测上报的病原寄生虫。
派琴虫的生活史简单，其传播无需中间宿主，贝类通过摄食、排泄等行为即可完成派琴虫的互相感染和传播。派琴虫的感染性极强，其生活史的各个阶段均可以感染贝类。众所周知，贝类以开放式海域养殖为主，一旦发生病害，无法像封闭式养殖(如池塘养殖)那样保证药物浓度，因而药物治疗很难奏效。因此，贝类派琴虫病必须贯彻以防为主、治疗为辅的防治策略。建立一种特异性强、灵敏度高、快速、操作简便、适用于现场快速诊断的检测方法对我国派琴虫防控工作显得尤其重要和迫切。
重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，简称RPA)是近年来兴起的一种可在室温下进行的核酸快速检测技术，最快几分钟内便可获得检测结果，具有和PCR一样的灵敏度和特异性。该技术对硬件设备的要求很低，具有特异性强、灵敏度高、快速、操作简便、适用于现场快速诊断等特点，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。自从RPA技术问世以来，这项技术已经成功应用到了细菌、真菌、病毒、寄生虫、食品安全、生物安全、转基因水稻和癌症等的研究，而且近5年来RPA相关研究数呈明显上升趋势。这些成功的RPA应用案例充分说明了该技术的可行性、快速性、准确性，也鼓励着各个领域对RPA技术进行有益地探索和推广。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测贝类寄生派琴虫的RPA引物和探针以及包括该引物和探针的试剂盒。
本发明的目的还在于提供上述引物和探针以及试剂盒在检测贝类寄生派琴虫方面的应用。
本发明的第三个目的在于提供一种采用RPA法检测贝类寄生派琴虫方面的方法。
本发明的上述第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种用于检测贝类寄生派琴虫的RPA引物和探针，所述引物的序列如下：
上游引物F1：5’-CGATGAAGGACGCAACGAAGTG-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物R1：5’-CAAGCGGGATACAAAGCATTAGATT-3’(SEQ ID NO.2)；
探针Probe：
5’-CAGAATTCCGTGAACCAGTAGAAATCTCAACGCATACTGCACAAAGGGGA-3’(SEQ IDNO.3)；
在下游引物R1的5’端加入生物素标记，在探针Probe的5’端添加FAM标记，3’端添加C3Spacer标记，且在探针中间距离探针5’端34bp处加入dSpacer或THF修饰。
进一步的，上述引物和探针的序列如下：
上游引物F1：5’-CGATGAAGGACGCAACGAAGTG-3’；
下游引物R1：5’-biotin-CAAGCGGGATACAAAGCATTAGATT-3’
探针Probe：
FAM-CAGAATTCCGTGAACCAGTAGAAATCTCAACGCA-(dSpacer或THF)-TACTGCACAAAGGGGA-/C3-Spacer/。
本发明还提供含有上述引物和探针的试剂盒。
优选的，该试剂盒还可以包括rehydration buffer、灭菌超纯水、MgAc以及反应管等。
本发明的上述第二个目的是通过以下技术方案来实现的：上述引物和探针以及上述的试剂盒在检测贝类寄生派琴虫方面的应用。
进一步的，所述应用不包括疾病的治疗和诊断方法。
本发明的上述第三个目的是通过以下技术方案来实现的：一种采用RPA法检测贝类寄生派琴虫方面的方法，包括以下步骤：
(1)设计上述引物和探针；
(2)提取DNA：提取不同贝类鳃组织的DNA；
(3)RPA恒温扩增：用上述的引物和探针进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；
(4)试纸条检验：将扩增产物采用试纸条检测，若检测线和对照线处同时出现红色条带即为阳性结果，若只有检测线出现红色条带即视为阴性。
优选的，步骤(3)中RPA扩增时，RPA反应液为50μL，包括Rehydration buffer29.5μL、上述上下游引物分别2.1μL、探针0.6μL、灭菌超纯水12.2μL、DNA样品1μL、MgAc2.5μL；RPA扩增反应于室温下反应20～25min。
优选的，步骤(4)中将扩增产物采用试纸条(可以是试剂盒Hybridtech 1 strips，(Milenia Biotec,Germany)中的试纸条，下同)检测，若检测线和对照线处同时出现红色条带即为阳性结果，即检测出派琴虫，若只有检测线出现红色条带即视为阴性，即未检出派琴虫。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明方法大大缩短了检测时间，全过程仅需要30-40min，常规PCR检测需要数小时，而雷氏液体巯基醋酸盐培养法是派琴虫检测的金标准检测需要3-7天，而且雷氏液体巯基醋酸盐培养法检测不出浓度低于1000个派琴虫/克组织的感染样品；
(2)本发明方法灵敏度高、特异性强，本发明应用的诊断方法能检测的派琴虫最低浓度为26copies/μL，普通PCR为100copies/μL，本发明方法及试剂盒能特异检测出中国海域分布的派琴虫种类，但不能检测出其它非派琴虫种类病原；
(3)本发明方法操作环境要求低，适用于野外现场诊断，能在常温下进行扩增反应，也无需贵重的硬件设备，操作简单，检测结果可视化，推广应用潜力大。
附图说明
图1是实施例3中RPA试纸条诊断方法的灵敏度检测，其中C:对照线；T：检测线；NT：无菌水；
图2是实施例4中RPA试纸条诊断方法的特异性检测；其中PB：北海派琴虫，PO：奥尔森派琴虫，PC：切萨皮克派琴虫，VH：哈维弧菌，SA：无乳链球菌，OV：牡蛎疱疹病毒，AV：鲍疱疹病毒，C:对照线；T：检测线；NT：无菌水。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的应用方法。下述实施例和附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂原料为常规市购或商业途径获得的生试剂原料，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。
实施例1引物和探针设计
引物设计：以目前发现的7种派琴虫的核糖体DNA内转录间隔区序列为设计模板，设计筛选出一对能扩增所有派琴虫的引物组，引物序列为：
上游引物F1：5’-CGATGAAGGACGCAACGAAGTG-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物R1：5’-CAAGCGGGATACAAAGCATTAGATT-3’(SEQ ID NO.2)。
在扩增的目的序列中设计探针，探针Probe序列为：5’-CAGAATTCCGTGAACCAGTAGAAATCTCAACGCATACTGCACAAAGGGGA-3’(SEQ ID NO.3)。
为了能用试纸条直接检测结果，在引物R1的5’端加入生物素标记，探针的5’端添加FAM标记，中间加入dSpacer或THF，3’端添加C3Spacer标记。
荧光标记后的序列如下：
R1’：5’-biotin-CAAGCGGGATACAAAGCATTAGATT-3’；
Probe’：
FAM-CAGAATTCCGTGAACCAGTAGAAATCTCAACGCA-(THF)-TACTGCACAAAGGGGA-/C3-Spacer/。
可以用这些引物和探针制成试剂盒。
实施例2
本实施例提供采用RPA法检测贝类寄生派琴虫方面的方法，包括以下步骤：
(1)引物设计见实施例1。
(2)DNA提取：提取不同贝类鳃组织的DNA，用于派琴虫的检测工作。
(3)重组酶聚合酶恒温扩增：以贝类鳃组织的DNA为模板，应用F1，R1’为上下游引物，Probe’为探针进行恒温扩增，扩增体系为50μL，先将Rehydration buffer29.5μL，上下游引物(10μM)各2.1μL，探针0.6μL，灭菌超纯水12.2μL，DNA样品1μL，共47.5μL的体系预先混匀后，转移到反应管中，然后将2.5μL MgAc(280mM)溶液加到对应的管盖里，充分混合后置于室温反应20-25min。
(4)试纸条检验：常温反应完成后，取10μL扩增产物置于装有80-100μL缓冲液(Tris-buffered saline(三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水)；缩写TBS)的EP管中，轻轻混匀后垂直插入试纸条，在室温孵育5～10min。若检测线和对照线处同时出现红色条带即为阳性结果，若只有检测线出现红色条带即视为阴性。
实施例3
本发明诊断方法的灵敏度实验
(1)使用OIE推荐的帕金虫通用引物PerkITS-85(5′-CCGCTTTGTTTGGM TCCC-3′)和PerkITS-750(5′-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3′)扩增北海派琴虫(Perkinsus beihaiensis)的ITS序列，制备这段目的序列的重组质粒，提取北海派琴虫质粒DNA。
(2)将北海派琴虫质粒DNA浓度(copies/μL)稀释为2.6×105、2.6×104、2.6×103、2.6×102、2.6×101、2.6×5、2.6×1，作为灵敏度分析的DNA标准品。
(3)以不同浓度的北海派琴虫质粒DNA为模板，应用F1，R1’为上下游引物，Probe’为探针进行恒温扩增，扩增体系为50μL，先将Rehydration buffer29.5μL，上下游引物(10μM)各2.1μL，探针0.6μL，灭菌超纯水12.2μL，DNA样品1μL，共47.5μL的体系预先混匀后，转移到反应管中，然后将2.5μL MgAc(醋酸镁)(280mM)溶液加到对应的管盖里，充分混合后置于室温反应20-25min。
(3)常温反应完成后，取10μL扩增产物置于装有80-100μL缓冲液(Tris-bufferedsaline，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水，缩写TBS)的EP管中，轻轻混匀后垂直插入试纸条，在室温孵育5～10min。若检测线和对照线处同时出现红色条带即为阳性结果，若只有检测线出现红色条带即视为阴性。
灵敏度结果如图1所示，结果表明，本发明的诊断方法可检测派琴虫的最低浓度为26copies/μL。
实施例4
本发明诊断方法的特异性实验
(1)提取北海派琴虫、奥尔森派琴虫、切萨皮克派琴虫、哈维弧菌、无乳链球菌、牡蛎疱疹病毒、鲍疱疹病毒的DNA，置于冰箱中备用。
(2)以上述DNA为模板，应用F1，R1’为上下游引物，Probe’为探针进行恒温扩增，扩增体系为50μL，先将Rehydration buffer29.5μL，上下游引物(10μM)各2.1μL，探针0.6μL，灭菌超纯水12.2μL，DNA样品1μL，共47.5μL的体系预先混匀后，转移到反应管中，然后将2.5μL MgAc(280mM)溶液加到对应的管盖里，充分混合后置于室温反应20-25min。
(3)常温反应完成后，取10μL扩增产物置于装有80-100μL缓冲液(Tris-bufferedsaline，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水，缩写TBS)的EP管中，轻轻混匀后垂直插入试纸条，在室温孵育5～10min。若检测线和对照线处同时出现红色条带即为阳性结果，若只有检测线出现红色条带即视为阴性。
特异性结果如图2所示，结果表明，本发明的诊断方法能特异性检测到派琴虫种类，而不能检测到其他病原。
实施例5
本发明诊断方法与荧光定量PCR(qPCR)的比较实验
(1)使用OIE推荐的帕金虫通用引物PerkITS-85(5′-CCGCTTTGTTTGGMTCCC-3′)和PerkITS-750(5′-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3′)扩增北海派琴虫(Perkinsus beihaiensis)的ITS序列，制备这段目的序列的重组质粒，提取北海派琴虫质粒DNA。
(2)设计一对引物Q2-F(5′-TCGATGAAGGACGCAACGAA-3′)和Q2-R(5′-CTCATTTCTGCGGGGCTACA-3′)，用于qPCR实验评估样品派琴虫感染情况。
(3)采集60个香港巨牡蛎样品，取其鳃部后提取其DNA基因组，应用qPCR检测方法评估这些样品的派琴虫感染率。qPCR进行40循环扩增，若在此过程中循环阈值大于零则认为感染了派琴虫，否则认为未感染。
(4)以上述样品对应的DNA为模板，应用F1，R1’为上下游引物，Probe’为探针进行恒温扩增，扩增体系为50μL，先将Rehydration buffer29.5μL，上下游引物(10μM)各2.1μL，探针0.6μL，灭菌超纯水12.2μL，DNA样品1μL，共47.5μL的体系预先混匀后，转移到反应管中，然后将2.5μL MgAc(280mM)溶液加到对应的管盖里，充分混合后置于室温反应20-25min。
(5)常温反应完成后，取10μL扩增产物置于预先装有80-100μL缓冲液(Tris-buffered saline，三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水，缩写TBS)的EP管中，轻轻混匀后垂直插入试纸条，在室温孵育5～10min。若检测线和对照线处同时出现红色条带即为阳性结果，若只有检测线出现红色条带即视为阴性。
特异性结果如下表1所示，本发明的诊断方法与qPCR无显著差异，准确率高达90％以上，说明其检测效率与qPCR一样高，但是比qPCR速度更快、操作环境要求更低。
表1 RPA试纸条诊断方法与qPCR诊断方法的比较实验
因此，本发明方法在检测贝类寄生派琴虫方面灵敏度高、特异性强，本发明应用的诊断方法能检测的派琴虫最低浓度为26copies/μL，普通PCR为100copies/μL，本发明方法能特异检测出中国海域分布的派琴虫种类，但不能检测出其它非派琴虫种类病原。因此，采用本发明中的引物及试剂盒和方法大大缩短了检测时间，全过程仅需要30～40min。并且，本发明方法操作环境要求低，适用于野外现场诊断，能在常温下进行扩增反应，也无需贵重的硬件设备，操作简单，检测结果可视化，推广应用潜力大。
本发明不局限于上述特定的实施方案范围内，上述实施方案仅仅是为了能够对本发明的使用过程进行详细地说明，而且有相等功能的生产方法和技术细节也属于本发明内容的一部分。事实上，本领域技术人员根据前文的描述，就能够根据各自需要找到不同的调整方案，这些调整都应在本文所附的权利要求书的范围内。
序列表
<110> 中国水产科学研究院南海水产研究所
<120> 一种用于检测贝类寄生派琴虫的RPA引物和探针及试剂盒
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 派琴虫(Perkinsus )
<400> 1
cgatgaagga cgcaacgaag tg 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 派琴虫(Perkinsus )
<400> 2
caagcgggat acaaagcatt agatt 25
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 派琴虫(Perkinsus )
<400> 3
cagaattccg tgaaccagta gaaatctcaa cgcatactgc acaaagggga 50
Claims (6)
1.一种用于检测贝类寄生派琴虫的RPA引物和探针，其特征是：所述引物的序列如下：
上游引物F1：5’-CGATGAAGGACGCAACGAAGTG-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物R1：5’-CAAGCGGGATACAAAGCATTAGATT-3’(SEQ ID NO.2)；
探针Probe：
5’-CAGAATTCCGTGAACCAGTAGAAATCTCAACGCATACTGCACAAAGGGGA-3’(SEQ ID NO.3)；
在下游引物R1的5’端加入生物素标记，在探针Probe的5’端添加FAM标记，3’端添加C3Spacer标记，且在探针中间距离探针5’端34bp处加入dSpacer或THF修饰。
2.根据权利要求1所述的用于检测贝类寄生派琴虫的RPA引物和探针，其特征是所述引物和探针的序列如下：
上游引物F1：5’-CGATGAAGGACGCAACGAAGTG-3’；
下游引物R1：5’-biotin-CAAGCGGGATACAAAGCATTAGATT-3’
探针Probe：
FAM-CAGAATTCCGTGAACCAGTAGAAATCTCAACGCA-(dSpacer或THF)-TACTGCACAAAGGGGA-/C3-Spacer/。
3.含有权利要求1或2所述引物和探针的试剂盒。
4.权利要求1或2所述引物和探针以及权利要求3所述的试剂盒在快速检测贝类寄生派琴虫方面的应用。
5.一种采用RPA法检测贝类寄生派琴虫方面的方法，其特征是包括以下步骤：
(1)设计权利要求1或权利要求2中所述的引物和探针；
(2)提取DNA：提取不同贝类鳃组织的DNA；
(3)RPA恒温扩增：用权利要求1或2中所述的引物和探针进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；
(4)试纸条检验：将扩增产物采用试纸条检测，若检测线和对照线处同时出现红色条带即为阳性结果，若只有检测线出现红色条带即视为阴性。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是：步骤(3)中RPA扩增时，RPA反应液为50μL，包括Rehydration buffer29.5μL、权利要求1或2中上下游引物分别2.1μL、探针0.6μL、灭菌超纯水12.2μL、DNA样品1μL、MgAc2.5μL；RPA扩增反应于室温下反应20～25min。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN114107573A (zh) * | 2022-01-27 | 2022-03-01 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 鲍疱疹病毒HaHV-1通用型RPA核酸等温扩增引物、试剂盒及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101724689A (zh) * | 2008-10-22 | 2010-06-09 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于派琴虫检测的实时荧光pcr引物和探针 |
| CN102363812A (zh) * | 2011-11-16 | 2012-02-29 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂及检测方法 |
| CN103014164A (zh) * | 2012-12-18 | 2013-04-03 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒 |
| WO2015006755A2 (en) * | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Castellanos Alejandro | Recombinase polymerase amplification (rpa) method for leishmania spp. and trypanosoma cruzi |
| CN107653325A (zh) * | 2017-08-29 | 2018-02-02 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针及快速检测试剂盒 |
-
2019
- 2019-03-15 CN CN201910197256.9A patent/CN109913558A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101724689A (zh) * | 2008-10-22 | 2010-06-09 | 中国检验检疫科学研究院 | 用于派琴虫检测的实时荧光pcr引物和探针 |
| CN102363812A (zh) * | 2011-11-16 | 2012-02-29 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 奥尔森派琴虫可视化环介导等温扩增检测试剂及检测方法 |
| CN103014164A (zh) * | 2012-12-18 | 2013-04-03 | 广西壮族自治区兽医研究所 | 贝类包拉米虫和派琴虫的二重荧光定量rt-pcr检测试剂盒 |
| WO2015006755A2 (en) * | 2013-07-12 | 2015-01-15 | Castellanos Alejandro | Recombinase polymerase amplification (rpa) method for leishmania spp. and trypanosoma cruzi |
| CN107653325A (zh) * | 2017-08-29 | 2018-02-02 | 中国农业科学院兰州兽医研究所 | 用于检测捻转血矛线虫核酸的引物对和探针及快速检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J. D. GAUTHIER等: "TAQMAN® MGB REAL-TIME PCR APPROACH TO QUANTIFICATION OF PERKINSUS MARINUS AND PERKINSUS SPP. IN OYSTERS", 《J. OF SHELLFISH RESEARCH》, vol. 25, no. 2, 1 August 2006 (2006-08-01) * |
| 郑文斌等: "重组酶聚合酶扩增技术及其在寄生虫检测中的应用", 《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》, vol. 33, no. 5, 3 November 2015 (2015-11-03), pages 382 - 386 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114107573A (zh) * | 2022-01-27 | 2022-03-01 | 中国水产科学研究院黄海水产研究所 | 鲍疱疹病毒HaHV-1通用型RPA核酸等温扩增引物、试剂盒及其应用 |
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