CN104946747A - 一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用 - Google Patents

一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104946747A
CN104946747A CN201510289724.7A CN201510289724A CN104946747A CN 104946747 A CN104946747 A CN 104946747A CN 201510289724 A CN201510289724 A CN 201510289724A CN 104946747 A CN104946747 A CN 104946747A
Authority
CN
China
Prior art keywords
microsporidium
primer
portunus trituberculatus
early warning
nested primer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510289724.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104946747B (zh
Inventor
周俊芳
房文红
王浩
王元
周红霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Original Assignee
East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences filed Critical East China Sea Fishery Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority to CN201510289724.7A priority Critical patent/CN104946747B/zh
Publication of CN104946747A publication Critical patent/CN104946747A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104946747B publication Critical patent/CN104946747B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6893—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for protozoa

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用，所述套式引物包括一对外引物MI1F/MI545R和一对内引物MI230F/MI426R，具体序列如下：MI1F：TGGCGACCAGTTCTAAG；MI545R：AAGCCGAACAATCCACA；MI230F：CARATAGATAGGGGCAGTAGC；MI426R：ATCGGTCACTGCTAGAACTAC。本发明检测灵敏度很高且特异性好，比通用引物有大幅提高，适用于从微孢子虫微量或潜伏感染的蟹的肌肉组织等样品中早期检测三疣梭子蟹微孢子虫，可在我国三疣梭子蟹微孢子虫的分子检测和疾病预警中应用，具有良好的应用前景。

Description

一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用
技术领域
本发明属于三疣梭子蟹疾病防治领域，特别涉及一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用。
背景技术
三疣梭子蟹是我国重要的渔业生产对象，也是重要的高经济价值水产养殖品种，然而近年来“牙膏病”的流行对三疣梭子蟹养殖业造成了巨大威胁。本实验室通过病理学和分子生物学等方法证明了其病原为一种微孢子虫。三疣梭子蟹微孢子虫病虽然发病较为缓慢，但是传染性很强。该病初期感染特征较为隐蔽，在培育中后期才表现典型症状，病蟹丧失经济价值，经济损失很大。因此，建立三疣梭子蟹微孢子虫的早期诊断技术，对于养殖三疣梭子蟹“牙膏病”的防治和预警均具有重要的现实意义。
目前我国三疣梭子蟹育苗在很大程度上仍然依赖海捕的野生三疣梭子蟹。由于微孢子虫的传播方式是垂直传播和水平传播共存，如果野生亲蟹携带微孢子虫，则不仅导致出苗率下降，还极易垂直传播给子代，导致子代育成率下降，或终身带毒，生长速度下降，发生“牙膏样”病变的则经济价值丧失，因此，野生亲蟹微孢子虫微量感染的早期诊断尤其重要。分子PCR诊断技术由于快速、简便、样品组织需要量小，因而，适于三疣梭子蟹尤其是亲蟹和蟹苗微孢子虫微量感染的快速诊断。但是，还未见到关于我国野生三疣梭子蟹微孢子虫流行种的鉴定和序列分析的报道，也没有针对我国养殖与野生微孢子虫流行种特异的分子检测技术。
由于微孢子虫是细胞内寄生生物，还具有坚硬的几丁质外壳，不仅影响DNA的提取效率，而且容易出现较短的片段，因此，国内外基于通用引物(扩增长片段)的微孢子虫的检出率比细菌、病毒等病原的检出率要低许多，定量PCR技术虽然灵敏度有一定提高，但是检测成本大幅提高，而且对仪器要求较高。套式PCR技术通过设计内、外两对嵌套引物进行两轮扩增，痕量的模板DNA被富集、扩增到可以检测的量，放大效率极高，且因为两对引物扩增的目的基因是嵌套的，扩增的特异性大大增强，达到高灵敏度、高特异性扩增目的基因的目的。该法与单对引物的普通PCR相比效率高出很多，与荧光定量PCR相比又相对简单易行且成本低廉。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用，该套式引物检测灵敏度很高且特异性好，比通用引物有大幅提高，适用于从微孢子虫微量或潜伏感染的蟹的肌肉组织等样品中早期检测三疣梭子蟹微孢子虫，可在三疣梭子蟹微孢子虫的分子检测和疾病预警中应用，具有良好的应用前景。
本发明的一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物，所述套式引物包括一对外引物MI1F/MI545R和一对内引物MI230F/MI426R，具体序列如下：
MI1F：TGGCGACCAGTTCTAAG；
MI545R：AAGCCGAACAATCCACA；
MI230F：CARATAGATAGGGGCAGTAGC；
MI426R：ATCGGTCACTGCTAGAACTAC。
所述外引物MI1F/MI545R的扩增片段长度为545bp。
所述内引物MI230F/MI426R的扩增片段长度为197bp。
本发明的一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物的应用，所述套式引物应用于我国三疣梭子蟹微孢子虫的分子检测和疾病预警。
经过普通与超微病理分析以及基于通用引物的广泛的流行病学调查表明，感染我国养殖和野生三疣梭子蟹的微孢子虫为同一个种，具有完全相同的SSU rRNA基因序列，但是该序列与已知的最为接近的微孢子虫序列也存在较多的碱基差异。据此，本发明设计了一套基于我国三疣梭子蟹微孢子虫种特异序列的、养殖与野生蟹均适用的、较短的套式引物。
有益效果
本发明检测灵敏度很高且特异性好，比通用引物有大幅提高，适用于从微孢子虫微量或潜伏感染的蟹的肌肉组织等样品中早期检测三疣梭子蟹微孢子虫，可在我国三疣梭子蟹微孢子虫的分子检测和疾病预警中应用，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的套式引物对野生三疣梭子蟹肌肉中微孢子虫的扩增结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
分别应用微孢子虫通用引物(V1F/1492R)和套式引物(MI1F/MI545R和MI230F/MI426R)对76份野生三疣梭子蟹样品肌肉DNA模板进行PCR扩增试验。
通用引物(V1F/1492R)扩增体系和条件：扩增体系共25μL，由1μL组织DNA模板、1μL正向引物V1F(10μM)、1μL反向引物1492R(10μM)、12.5μL 2×Green Master Mix(promega)和9.5μL无DNA酶水组成。扩增条件为：94℃5min，然后94℃45s，45℃35s，72℃90s循环32次，最后72℃延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪观察结果。
套式引物外引物(MI1F/MI545R)扩增体系和条件：扩增体系共25μL，由1μL组织DNA模板、0.5μL正向外引物MI1F(10μM)、0.5μL反向外引物MI545R(10μM)、12.5μL 2×Green Master Mix(promega)和10.5μL无DNA酶水组成。扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃45s，47℃35s，72℃，40s循环25次，最后72℃延伸5min。PCR产物一部分用作内引物模板，一部分经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪观察结果。
套式引物内引物(MI230F/MI426R)扩增体系和条件：扩增体系共25μL，由1μL外引物扩增的PCR产物、0.3μL正向内引物MI230F(10μM)、0.3μL反向内引物MI426R(10μM)、12.5μL 2×Green Master Mix(promega)和10.9μL无DNA酶水组成。扩增条件为：95℃预变性5min，然后95℃35s，50℃30s，72℃20s循环20次，最后72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪观察结果。
图1为其中20份样品的套式引物扩增结果。从电泳图可以看出，套式引物扩增的条带明亮而单一，无杂带，特异性好。阳性结果经测序验证均为三疣梭子蟹微孢子虫。通用引物和外引物以及套式引物对所有野生三疣梭子蟹样品的检测结果比较见表1。
检测结果说明：1、野生三疣梭子蟹中微孢子虫含量极低，但是感染率较高，显示了建立特异而高度灵敏的微孢子虫检测技术的必要性；2、套式引物(MI1F/MI545R和MI230F/MI426R)的特异性好且检测灵敏度比通用引物大幅提高，适用于我国养殖和野生三疣梭子蟹微孢子虫微量感染或潜伏感染的早期监测和预警。
表1 不同引物对76份野生三疣梭子蟹样品中微孢子虫的扩增结果

Claims (4)

1.一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物，其特征在于：所述套式引物包括一对外引物MI1F/MI545R和一对内引物MI230F/MI426R，具体序列如下：
MI1F：TGGCGACCAGTTCTAAG；
MI545R：AAGCCGAACAATCCACA；
MI230F：CARATAGATAGGGGCAGTAGC；
MI426R：ATCGGTCACTGCTAGAACTAC。
2.根据权利要求1所述的一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物，其特征在于：所述外引物MI1F/MI545R的扩增片段长度为545bp。
3.根据权利要求1所述的一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物，其特征在于：所述内引物MI230F/MI426R的扩增片段长度为197bp。
4.一种如权利要求1所述的用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物的应用，其特征在于：所述套式引物应用于我国三疣梭子蟹微孢子虫的分子检测和疾病预警。
CN201510289724.7A 2015-05-29 2015-05-29 一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用 Active CN104946747B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510289724.7A CN104946747B (zh) 2015-05-29 2015-05-29 一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510289724.7A CN104946747B (zh) 2015-05-29 2015-05-29 一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104946747A true CN104946747A (zh) 2015-09-30
CN104946747B CN104946747B (zh) 2018-05-01

Family

ID=54161809

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510289724.7A Active CN104946747B (zh) 2015-05-29 2015-05-29 一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104946747B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755518A (zh) * 2017-02-15 2017-05-31 中国水产科学研究院东海水产研究所 一种梭子蟹肌孢虫实时定量pcr检测试剂盒
CN108611426A (zh) * 2018-04-25 2018-10-02 中国科学院水生生物研究所 用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量pcr引物对、检测试剂盒及应用
CN111269999A (zh) * 2020-02-09 2020-06-12 西南大学 一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104498599A (zh) * 2014-12-11 2015-04-08 华南农业大学 一组微孢子虫分子通用检测引物及其试剂盒
CN105154576A (zh) * 2015-10-26 2015-12-16 西南大学 快速检测家蚕微孢子虫的引物对及其试剂盒和检测方法
CN105177165A (zh) * 2015-10-26 2015-12-23 江苏省淡水水产研究所 中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针及试剂盒

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104498599A (zh) * 2014-12-11 2015-04-08 华南农业大学 一组微孢子虫分子通用检测引物及其试剂盒
CN105154576A (zh) * 2015-10-26 2015-12-16 西南大学 快速检测家蚕微孢子虫的引物对及其试剂盒和检测方法
CN105177165A (zh) * 2015-10-26 2015-12-23 江苏省淡水水产研究所 中华绒螯蟹微孢子虫的原位杂交检测探针及试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
F. NILSEN: "SMALL SUBUNIT RIBOSOMAL DNA PHYLOGENY OF MICROSPORIDIA WITH PARTICULAR REFERENCE TO GENERA THAT INFECT FISH", 《J. PARASITOL》 *
王元: "脊尾白虾与三疣梭子蟹微孢虫病的病原和病理", 《上海海洋大学硕士学位论文》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106755518A (zh) * 2017-02-15 2017-05-31 中国水产科学研究院东海水产研究所 一种梭子蟹肌孢虫实时定量pcr检测试剂盒
CN108611426A (zh) * 2018-04-25 2018-10-02 中国科学院水生生物研究所 用于检测绒螯蟹肝胞虫的实时荧光定量pcr引物对、检测试剂盒及应用
CN111269999A (zh) * 2020-02-09 2020-06-12 西南大学 一种同时检测四种人微孢子虫的通用引物、试剂盒、试纸条及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN104946747B (zh) 2018-05-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107299155A (zh) 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针
CN104372104B (zh) 一种樟疫霉菌的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
CN103498000B (zh) 一种多重pcr法检测水稻检疫性病原菌的引物组及试剂盒和方法
CN109486976A (zh) 一种对虾肝肠微孢子虫病的高灵敏度的靶基因、引物对、试剂盒和检测方法
CN108251548A (zh) 禽致病性大肠杆菌等的多重pcr检测引物组、方法及试剂盒
CN107385111A (zh) 一种鹅星状病毒的实时荧光定量pcr检测引物及其试剂盒
CN104313175A (zh) 一种致病疫霉的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
CN104928288B (zh) 一种用于我国养殖对虾虾肝肠胞虫感染早期预警的套式引物及其应用
CN105648055A (zh) 一种禽源沙门氏菌多重pcr检测试剂盒及其非诊断性检测方法
Li et al. Modulation of gut microbiota, short-chain fatty acid production, and inflammatory cytokine expression in the cecum of porcine deltacoronavirus-infected chicks
CN104946747A (zh) 一种用于我国养殖与野生三疣梭子蟹微孢子虫感染早期预警的套式引物及其应用
CN104372099A (zh) 一种恶疫霉菌的lamp检测引物组合物及其lamp检测试剂盒和lamp检测方法
Yazdi et al. Quantitative PCR for detection and quantification of Veronaea botryosa in fish and environmental samples
CN102876809B (zh) 一种草鱼呼肠孤病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法
CN105087831A (zh) 牡蛎疱疹病毒i型检测引物、方法与应用
CN106754911A (zh) 用于鉴定牛支原体、牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒的引物组及其应用
CN104099407B (zh) 动物源细菌的酰胺醇类药物耐药基因四重pcr检测试剂盒
CN102876811A (zh) 一种鲤春病毒血症病毒rt-lamp检测试剂盒及检测方法
CN109811073A (zh) 双重pcr早期快速检测无乳链球菌和海豚链球菌的引物及其应用
Wang et al. Development of a new concentration method for Hepatitis A virus detection (ISO 15216–2: 2019) in Manila clams (Ruditapes philippinarum)
CN104195254A (zh) 基于环介导等温扩增技术检测木贼镰孢菌的方法和引物组合物
CN103602760B (zh) 病毒样颗粒内标实时荧光rt-pcr检测新城疫病毒的方法
CN1861802A (zh) 一种多重pcr反应试剂盒及其检测方法
CN104313163B (zh) 一种猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清2型、3型和6型三重pcr检测方法、试剂盒及其应用
CN105039331A (zh) 一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant