CN102876809B

CN102876809B - 一种草鱼呼肠孤病毒rt-pcr检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN102876809B
Application number: CN201210398483.6A
Authority: CN
Inventors: 张辉; 曾令兵; 周勇; 范玉顶; 徐进
Original assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2012-10-18
Filing date: 2012-10-18
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2032-10-18
Also published as: CN102876809A

Abstract

本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法，一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分：5×AMV缓冲液，无镁Taq酶10×PCR缓冲液，MgCl2，dNTPs，引物GCRVF和GCRVR，AMV酶，Taq酶。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，可在3小时内准确检测出样品中的GCRV，能检测GCRV感染的草鱼组织，也能检测GCRV感染的细胞，非常适用于GCRV的快速检测。

Description

一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于鱼类病毒检测技术领域，具体涉及一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，还涉及一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法。

背景技术

草鱼出血病是传染性、致病性都很强的一种严重病毒性疾病，主要危害草鱼鱼种。1972年首次在湖北滠口发现，并命名为草鱼出血病。1978年首次通过电镜观察证实该病原为病毒。1983年首次分离出爆发性草鱼出血病病原，并根据其形态学、理化特性等研究鉴定该病毒为呼肠孤病毒。1991年国际病毒分类委员会第五次会议将该病毒正式命名为草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV),并纳入呼肠孤病毒科(Reoviridae)水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)。草鱼呼肠孤病毒是我国分离鉴定的第一株鱼类病毒，现在已有资料证实该病毒是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株，目前国内已报道了20多个分离株。

对草鱼呼肠孤病毒的检测的方法很多，电镜观察是最直接的方法，细胞培养分离病毒、空斑试验、病毒核酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)等经典方法较为复杂，目前国内外检测草鱼呼肠孤病毒最常用的还是免疫学检测方法及RT-PCR方法等。免疫学方法在敏感性和特异性上有待提高，并且存在空窗期、交叉反应、血清型差异等问题。在现有的关于RT-PCR检测GCRV的公开文献中，都是采用传统的两步法RT-PCR技术，即将反转录和PCR反应分管分步进行。RT-PCR检测病原在近年来越来越趋向于采用一步法进行反应。与两步法相比，简化了操作程序、降低了样品交叉污染的可能性，对反应的干扰因素少，能获得良好的重现性，又降低了成本，为开发同时检测多种病原的多重RT-PCR创造了有利条件。

发明内容

本发明的一个目的是在于提供了一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，通过分析比对GenBank中已有的草鱼呼肠孤病毒基因序列（AF260512、AF284502、GQ896335、HQ231199、JN967630），针对病毒核酸第2片段序列设计并筛选了一对兼并引物，从而实现一步法检测GCRV病毒的目的，所用的试剂均为国产试剂，大大降低了实验成本，从分子水平对草鱼呼肠孤病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法，本方法可在3小时内准确检测出样品中的GCRV，能检测GCRV感染的草鱼组织，也能检测GCRV感染的细胞（例如CIK细胞），非常适用于GCRV的快速检测。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分：

该试剂盒包括以下成分：5×AMV buffer，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)，MgCl₂，dNTPs，引物GCRVF和GCRVR，AMV酶，Taq酶。

GCRVF:5’-GGBTCCACDGYMACVTCCAC-3’；

GCRVR:5’-WDRTCRCCKKGRGGCATGTA-3’。

一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法，其步骤是：

1、病毒RNA的获取：

采用

或LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA。

2、RT-PCR扩增：

采用25μl反应体系：在PCR管中加入预处理的核酸模板5μL，5×AMV buffer1μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)2μL，MgCl₂(25mM)0.5-3μL，dNTPs(25mM)0.5μL，引物(20μM)各0.5μL，AMV酶0.5μL，Taq酶0.5μL，补加灭菌水至25μL。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45℃30min，95℃3min，再按95℃20s-52℃20s-72℃40s作35个循环，最后72℃延伸5min，4℃下保温。同时设置阳性对照和阴性空白对照。

3、检测结果判定：

取扩增产物，用1.5%（w/v,以下相同）的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示在650bp大小处有条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。

一种利用草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒检测草鱼呼肠孤病毒的方法（最佳条件），其步骤是：

1、病毒RNA的获取:

采用

或

LS试剂或柱吸附洗脱法等提取样本总RNA，模板RNA在95℃5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。

2、RT-PCR扩增:

采用25μl反应体系：在PCR管中加入预处理的核酸模板5μL，5×AMV buffer1μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)2μL，MgCl₂(25mM)1μL，dNTPs(25mM)0.5μL，引物(20μM)各0.5μL，AMV酶0.5μL，Taq酶0.5μL，补加灭菌水至25μL。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45℃30min，95℃3min，再按95℃20s-52℃20s-72℃40s作35个循环，最后72℃延伸5min，4℃下保温。同时设置阳性对照和阴性空白对照。

3、检测结果判定：

取扩增产物，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示在650bp大小处有条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明公开了一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，能够检测出目前分离的所有的GCRV病毒株。

2、特异性好，能有效检测出GCRV病毒；

3、全部采用国产试剂，大大降低了检测成本；

4、一步法提高了检测效率，缩短了检测时间。

附图说明

图1为一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测方法的特异性的示意图

从左至右的泳道依次为水的空白对照、GCRV-873、GCRV-HZ08株和104株感染CIK细胞的总RNA、SVCV感染EPC细胞的总RNA、CRV感染CCO细胞的总RNA、DL1,000Marker。

图2为一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测草鱼组织的结果示意图

从左至右的泳道依次为DL5,000Marker、8个疑似草鱼组织的总RNA、GCRV-104株感染CIK细胞的总RNA、水的空白对照。

具体实施方式

下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。本发明全部试剂均为上海生工公司产品。

实施例1：

一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，包括以下成分：

该试剂盒它包括以下成分：5×AMV buffer，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)，MgCl₂，dNTPs，引物GCRVF和GCRVR，AMV酶，Taq酶。

实施例2：

草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒所用缓冲液的优化

一、取待检样品提取病毒RNA:

培养草鱼肾脏细胞（CIK细胞）至汇合单层，吸出培养液，以感染复数为0.1的剂量，接种1mL经4000r/min离心5min除去细胞碎片的草鱼呼肠孤病毒细胞毒材料GCRV-104（CCTCC NO:V201217），添加10μL的Polybrene（终浓度10μg/ml），置于28℃培养箱中吸附1h，使病毒吸附细胞，吸附过程中每20min轻轻晃动培养瓶一次，使病毒液与细胞单层充分均匀接触，吸附1h后，吸弃病毒液，加入5mL2%胎牛血清（V/V）的培养液，置28℃培养，直至细胞出现明显的致细胞病变效应，收集细胞病变材料，于-80℃至室温（20-25℃）反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μl，用

LS（Invitrogen）试剂按照说明书提取RNA，最后溶于50μl灭菌水，-80℃保存备用。

二、RT-PCR扩增的反应体系:

采用25μl反应体系：在PCR管中加入预处理的核酸模板（预处理方法：将获得的模板RNA在95℃5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度，以下同）5μL，5×AMV buffer，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)，MgCl₂(25mM)2μL，dNTPs(25mM)0.5μL，引物(20μM)各0.5μL，AMV酶0.5μL，Taq酶0.5μL，补加灭菌水至25μL。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45℃30min，95℃3min，再按95℃20s-52℃20s-72℃40s作35个循环，最后72℃延伸5min，4℃下保温。同时设置空白对照。

其中5×AMV buffer和Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)采用不同的组合：

1)5×AMV buffer 0μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)2.5μL

2)5×AMV buffer 1μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)2μL

3)5×AMV buffer 2μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)1.5μL

4)5×AMV buffer 3μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)1μL

5)5×AMV buffer 4μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)0.5μL

6)5×AMV buffer 5μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)0μL

三、检测结果判定:

取8μl扩增产物，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示5×AMV buffer1μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)2μL时结果最好。

实施例3：

草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒不同浓度的Mg²⁺的优化:

一、取待检样品提取病毒RNA:

待GCRV-104感染的CIK细胞出现90%病变后收获（制备方法同实施例2），于-80℃至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μl，用LS试剂按照说明书提取RNA，最后溶于50μl灭菌水，-80℃保存备用。

二、RT-PCR扩增的反应体系:

采用25μl反应体系：在PCR管中加入预处理的核酸模板5μL，5×AMV buffer1μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)2μL，MgCl₂(25mM)，dNTPs(25mM)0.5μL，引物(20μM)各0.5μL，AMV酶0.5μL，Taq酶0.5μL，补加灭菌水至25μL。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45℃30min，95℃3min，再按95℃20s-52℃20s-72℃40s作35个循环，最后72℃延伸5min，4℃下保温。同时设置空白对照。

其中MgCl₂(25mM)添加量分别为0μL、0.5μL、1μL、1.5μL和2μL。

三、检测结果判定:

取8μl扩增产物，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示MgCl₂(25mM)添加量为1μL时结果最好。

实施例4：

草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测方法的特异性

一、取待检样品提取病毒RNA:

接种SVCV（张朋，刘荭，陈孝煊，等.鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定[J]，中国预防兽医学报，2011，33（4）：305-308.）的EPC细胞、接种CRV（曾令兵、徐进、李艳秋，等.斑点叉尾鮰出血病病原呼肠孤病毒的分离与鉴定[J]，病毒学报，2009，25（6）：460-466.）的CCO细胞、接种GCRV-HZ08株、GCRV-873株和GCRV-104株的CIK细胞出现90%病变后收获（上述病毒的制备方法同GCRV-104），于-80℃至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μl，用LS试剂按照说明书提取RNA，最后溶于50μl灭菌水，-80℃保存备用。目前GCRV至少有30个分离株，分为3个基因型，GCRV-104、GCRV-HZ08、GCRV-873是各型的代表。

二、RT-PCR扩增的反应体系:

采用25μl反应体系：在PCR管中加入预处理的核酸模板5μL，5×AMV buffer1μL，Taq酶10×PCR buffer(Mg²⁺free)2μL，MgCl₂(25mM)1μL，dNTPs(25mM)0.5μL，引物(20μM)各0.5μL，AMV酶0.5μL，Taq酶0.5μL，补加灭菌水至25μL。放入PCR仪进行RT-PCR反应，先45℃30min，95℃3min，再按95℃20s-52℃20s-72℃40s作35个循环，最后72℃延伸5min，4℃下保温。同时设置空白对照。

三、检测结果判定:

取8μl扩增产物，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示能够检测出GCRV-104、GCRV-HZ08和GCRV-873，而SVCV、CRV和空白对照均无法检出（图1），表明利用本发明的试剂盒，能够检测出目前分离的所有的GCRV病毒株，并具有特异性。

实施例5：

一、取待检样品提取病毒RNA:

取100mg疑似感染草鱼呼肠孤病毒的草鱼组织加入1ml试剂用玻璃匀浆器于室温研磨，按照说明书提取RNA，最后溶于50μl灭菌水，-80℃保存备用。

以下为本发明中判断疑似草鱼感染了呼肠孤病毒的依据：

仔细检查草鱼有无异常表征，如发现其：尾鳍末端变黑、不食、反应迟钝、独游、易失平衡的；口腔、上下颌、头顶部、眼眶周围、鳃盖及鳍条基部充血、鳃丝呈点状出血；病鱼出血严重时，鳃呈“白鳃”症状；或鱼体暗黑，小的鱼种在阳光或灯光透视下，皮下肌肉充血。可作疑似草鱼出血病对待，并进一步诊断。

经初步判断为疑似草鱼出血病的患病鱼，抽样进行解剖检查，根据下述病变，可初步判断为草鱼出血病：

a)剥开皮肤，肌肉充血和点状出血，呈鲜红色；

b)肠壁充血或出血，全肠或局部呈鲜红色，肠壁弹性较好，肠内无食物，粘液较少；

c)肠系膜、周围脂肪、鳔、胆囊、肝、肾有出血点或血丝；

d)个别情况下，鳔及胆囊呈紫红色；

e)当肌肉出血严重时，肝、脾、肾的颜色变淡。

二、RT-PCR扩增的反应体系:

三、检测结果判定:

取8μl扩增产物，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示对照成立，8个鱼样均呈阳性（图2），与细胞培养方法检测的结果一致。

SEQUENCE LISTING

<110> 一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒及检测方法

<120> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<130> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 草鱼呼肠孤病毒

<400> 1

ggbtccacdg ymacvtccac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 草鱼呼肠孤病毒

<400> 2

wdrtcrcckk grggcatgta 20

Claims

1.一种草鱼呼肠孤病毒RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分：

5×AMV缓冲液，无镁Taq酶10×PCR缓冲液，MgCl₂，dNTPs，引物GCRVF和GCRVR，AMV酶，Taq酶；

GCRVF:5’-GGBTCCACDGYMACVTCCAC-3’；

GCRVR:5’-WDRTCRCCKKGRGGCATGTA-3’。