CN105602945B - 一种同时检测海水鱼类三种致病菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法；其技术要点：所述引物组包括引物对Ns‑mce、引物对Vh‑tox和引物对Si‑its，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～6所示；所述检测试剂盒包括上述检测引物组；所述检测方法运用上述检测试剂盒进行检测，先对样品进行前处理，并提取基因组DNA作为样品组DNA，再采用PCR方法对样品进行检测；旨在建立一套三重PCR检测方法，可用于对各时期的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌进行跟踪检测，避免病原菌传播流行，加强水产品中致病菌的快速检验检疫；属于水产养殖动物病原菌检测领域。

Description

一种同时检测海水鱼类三种致病菌的检测引物组、检测试剂 盒和检测方法

技术领域

本发明属于水产养殖动物病原菌检测领域，具体涉及一种鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法。

背景技术

鰤鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)和海豚链球菌(Streptococcus iniae)是三种常见的海水养殖鱼类病原菌，其中鰤鱼诺卡氏菌和海豚链球菌属于革兰氏阳性菌，而哈维弧菌属于革兰氏性阴菌。这三种菌在海洋环境及水产养殖环境中广泛分布，可通过饵料、水环境等进行传播，它们在生物学特性和致病性上有一定区别，但都可导致多种水产养殖动物大量死亡，给水产养殖业造成严重的经济损失。

鰤鱼诺卡氏菌在在25～40℃均能生长，最适温度为25～28℃，生长的盐度范围为0～4.5％，广泛分布于空气、土壤、海水、淡水、腐烂的植被及动物的排泄物中，以腐生为主。当养殖鱼类体质虚弱、免疫力低下时，通过消化道、鳃或创伤而感染。该病最危险的特点是潜伏期长，自然发病率15％～60％，诺卡氏菌生长缓慢，但受感染的鱼在发病初期通常未出现外部症状或症状不明显，故给该病的早期检测、诊断及治疗带来了极大困难。

哈维弧菌主要存在于自由水体、浮游动植物体表、海底沉积物中，是石斑鱼、东方鲀、鮸鱼、鲈鱼、大黄鱼和卵形鲳鲹等多种鱼类的重要病原菌。此外，哈维弧菌还能感染人类，引起继发性败血症。被感染的鱼类因种类、体质、部位等不同而表现出复杂多样的症状，且引起较高的死亡率，给水产养殖业造成了严重的经济损失，在养殖生产中亟需快速准确、操作简便的针对哈维弧菌的检测技术。

海豚链球菌是危害世界养殖业的重要病原菌之一，可感染包括淡水河海水在内的多种野生或养殖鱼类，近年来，陆续有关于海豚链球菌引起哺乳动物甚至人类的疾病报道。链球菌感染鱼的主要临床症状为眼球突出，角膜混浊，游动异常，并伴有脑膜炎、组织出血及肝胆症状等解剖病变，但一些鱼类感染海豚链球菌却不表现出症状。在疾病爆发后的幸存鱼体内也可分离到该病原，这些幸存鱼很可能成为未来疾病爆发的携带者。因此，病原的早期检测与及时采取有效的防控措施尤为重要。

基于现有的技术检测水产动物致病菌大多采用病样细菌分离、培养及鉴定等方法，其操作过程复杂、耗时，且检测的灵敏度较低，结果不确定常延误病情的诊断。在应对突发的疾病发生事件时则不能满足诊断及时、灵敏度和特异性高、检测结果准确以及样品数量较大的要求。针对鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的快速检测方面，国内外学者已构建针对单一致病菌的细菌培养鉴定和PCR等检测方法，然而在海水水生动物养殖过程中，进行相关疾病的预防和控制时，其样本量大，时间紧，需要对多种致病菌进行同时快速检测，而采用单一的致病菌PCR检测方法或一般的细菌分离方法则不能满足上述要求。三重PCR是在普通PCR的基础上，在同一反应体系中加入三对引物，同时特异性扩增出三种目的基因片段。在本发明中，在同一反应管内鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的基因片段，将大大节省时间和试剂，节约经费，为检测提供更多更准确的信息。

多重PCR以其快速、高效、灵敏和特性的特点，在病原微生物检测中具有重要作用，也符合卫生、质检等快速检测的需要，是一种准确、科学、可靠的检测方法。有鉴于此，开发一种同时检测鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的多重PCR势在必行，对于加强水产养殖过程中病原的监测和预警、水产品中致病菌的快速检验检疫等具有重要意义。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的是提供一种能同时检测鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测引物组，试剂盒及其方法，该试剂盒精确度高、检测方便。

为解决上述技术问题，本发明提供的前一技术方案是这样的：

一种鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测引物组，其特征在于，包括引物对Ns-mce、引物对Vh-tox和引物对Si-its；其中，所述引物对Ns-mce包括核苷酸序列如SEQID NO.1所示的Ns-mceF和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Ns-mceR；所述引物对Vh-tox包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的Vh-toxF和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的Vh-toxR；所述引物对Si-its包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的Si-itsF和核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的Si-itsF。

本发明提供的另一个技术方案，是提供含有上述的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测引物组的试剂盒。

进一步的，上述的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，还包括蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70％的乙醇、TE缓冲液、CTAB的NaCl溶液、阳性对照品和PCR DsMix。

进一步的，上述的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，所述酚-氯仿-异戊醇混合溶液中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。

进一步的，上述的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，所述CTAB的NaCl溶液为将CTAB溶于0.5mol/L的NaCl溶液中，CTAB和所述NaCl溶液的质量体积比为1:20。

进一步的，上述的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，所述阳性对照品包括鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的DNA模板。

进一步的，上述鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，所述检测引物组中的引物浓度均为10μM。

本发明的最后一个技术方案是提供所述检测试剂盒进行检测的方法，包括如下步骤：

1)取待检测样品50～100mg并加入500-550μL的TE缓冲液，用玻璃匀浆器充分匀浆后，于12000r/min离心10min；

2)步骤1)离心后去除沉淀，取上清备用；

3)向步骤2)上清溶液中加入30μL质量浓度为10％SDS和15μL 20mg/mL的蛋白酶K，并于37℃温育1h；

4)向步骤3)温育后的溶液中加入100μL 5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再加入80μLCTAB的NaCl溶液，65℃温育20min；

5)向步骤4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀，12000g/min离心4-5min；

6)将步骤5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6-0.8倍体积的异丙醇，12000g/min离心4-5min；

7)步骤6)离心后去上清，沉淀用1mL的体积浓度为70％的乙醇洗涤后，12000g/min离心4-5min；

8)步骤7)离心后去上清，沉淀常温干燥5-10min，重溶于30-50μL TE缓冲液，即为样品DNA模板；

9)样品组三重PCR反应体系包括：12.5μL 2×PCR DsMix、1.0μL引物Ns-mceF、1.0μL引物Ns-mceR、0.7μL引物Vh-toxF、0.7μL引物Vh-toxR、1.8μL引物Si-itsF、1.8μL引物Si-itsR、3.0μL步骤8)得到的样品DNA模板和2.5μL无菌水；

10)阳性对照组三重PCR反应体系包括：12.5μL 2×PCR DsMix、1.0μL引物Ns-mceF、1.0μL引物Ns-mceR、0.7μL引物Vh-toxF、0.7μL引物Vh-toxR、1.8μL引物Si-itsF、1.8μL引物Si-itsR、3.0μL阳性对照品和2.5μL无菌水；

11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/min离心10s，置于PCR仪中，分别于94℃预变性4min，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，进行PCR反应；

12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照孔和参比孔；所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5μL与6×Loading Buffer 1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5μL与6×Loading Buffer 1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述参比孔取5μL DL2000DNAMarker加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；以120V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和所述参比孔进行电泳25min后，于凝胶成像系统下观察结果；若样品孔电泳条带出现与阳性对照孔相同大小的条带，则说明待测样品中含有相对应的细菌。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明引物组具有高特异性，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在与否，从而能够确定样品是否含有鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌，能够实现对鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌进行检测。

2、采用本发明检测试剂盒可以同时对三种病原菌进行检测，即进行一次实验就可以得到三种病原菌的检测结果，并且在5个小时左右完成检测。相比传统检测方法，不仅节约了成本和时间，也减少了劳动力的支出。

3、本发明的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌三重PCR检测方法，不但使得海水鱼类养殖水体病原检测更加快速，而且可用于海水鱼类养殖过程中各时期跟踪检测中，可以对病害的爆发进行及时预警，避免病原菌传播流行，降低海水养殖鱼类疾病爆发的风险，提高科学管理效率，具有很高的实用价值，有利于增加养殖效益。4、本发明的检测操作简单，不需要使用复杂仪器，也不需要特殊试剂，只需常规PCR仪即可，对检测人员的技术素质要求较低，只需进行简单培训即可。

5、本发明应用范围广泛。本发明不仅可以检测海水鱼类体内和养殖水体中的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌，也可针对其他环境或患病动物进行快速检测。

6、本发明检测试剂盒制备成本低廉，制备工艺简单，容易实现工业化大生产，具有广阔的市场前景。

附图说明

图1为实施例2中三重PCR扩增产物及单一PCR扩增产物检测结果电泳图。

图2为实施例5中养殖水体样品检测结果电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

实施例1细菌基因组DNA的提取

分别取鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌(中国水产科学研究院南海水产研究所渔业生物病害研究室自存)，采用如下步骤进行DNA提取：

(1)用500-550μL的TE缓冲液重悬细菌；

(2)向步骤(1)重悬后的溶液中加入30μL质量浓度为10％SDS和15μL的蛋白酶K(20mg/mL)，混合均匀并于37℃温育1h；

(3)向步骤(2)温育后的溶液中加入100μL 5mol/L的NaCl溶液，充分混匀后再加入80μL CTAB的NaCl溶液溶液(将CTAB溶于0.5mol/L的NaCl溶液中，CTAB和所述NaCl溶液的质量体积比为1:20)，于65℃温育20min；

(4)向步骤(3)温育后的溶液中加入与步骤(3)温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇(酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1)的混合溶液混匀，12000g/min离心4-5min；

(5)将步骤(4)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6-0.8倍体积的异丙醇，12000g/min离心4-5min；

(6)步骤(5)离心后去上清，沉淀用1mL的体积浓度为70％乙醇洗涤后，12000g/min离心4-5min；

(7)步骤(6)离心后去上清，沉淀常温干燥5-10min，重溶于30-50μL TE缓冲液，备用。

实施例2鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌三重PCR检测引物组的设计和有效性检测

1、分别选取鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的特异性基因，采用PrimerPremier 5.0软件分析设计出相应的引物对，各引物对能分别各自专一性鉴别上述细菌的特异性，引物序列如下所示：

2、有效性检测：

(1)合成上述设计的引物组，用引物组的引物分别对实施例1提取的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的DNA进行单一PCR验证，其中单一PCR反应体系如下：

(2)同时对鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌进行三重PCR验证，采用如下三重PCR反应体系：

(3)采用如下PCR反应程序，对上述PCR反应体系进行PCR反应：

1)94℃预变性4min。

2)94℃变性30s。

58℃退火30s。

72℃延伸1min。

共计35个循环。

3)72℃延伸10min。

上述PCR反应结束后，分别取各组PCR反应产物5μL与6×Loading Buffer 1μL混合，分别加入到质量浓度为1％的琼脂糖凝胶点样孔中，同时在样品孔旁添加对照组，对照组琼脂糖凝胶点样孔中加入5μL DL2000DNA Marker作对照，以120V电压进行电泳，约25min后于凝胶成像系统下观察结果。

3、检测结果：

检测结果如图1所示，图1中泳道M为Marker DL2000；泳道1为鰤鱼诺卡氏菌单一PCR的扩增结果，目的扩增片段长度为964bp；泳道2为鰤鱼诺卡氏菌单一PCR的阴性对照；泳道3为哈维弧菌单一PCR的扩增结果，目的扩增片段长度为528bp；泳道4为哈维弧菌单一PCR的阴性对照；泳道5为海豚链球菌单一PCR的扩增结果，目的扩增片段长度为205bp；泳道6为海豚链球菌单一PCR的阴性对照；泳道7为三种病原菌三重PCR的扩增结果，从上到下依次为鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌；泳道8为三种病原菌三重PCR的的阴性对照；从图1可以看出单一PCR检测相应的单一条带及三重PCR检测相应的3条单一条带，分别与鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的扩增片段长度分别为964、528和205bp相吻合，即说明本发明的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌检测用引物组可以准确、特异性地检测出鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌。

实施例4检测试剂盒

本实施例的检测试剂盒可用于三重PCR快速诊断样品中是否含有鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌，该检测试剂盒由鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测用引物组、蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70％的乙醇、TE缓冲液、CTAB的NaCl溶液、阳性对照品和PCR DsMix组成，其中：

(1)鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌检测用引物组：1管内装鰤鱼诺卡氏菌引物Ns-mceF及Ns-mceR，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；2管内装哈维弧菌引物Vh-toxF及Vh-toxR，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；3管内装海豚链球菌引物Si-itsF及Si-itsR，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；以上引物浓度分别为10μM。

(2)蛋白酶K(20mg/mL)，置于容器，1管；

(3)质量浓度为10％SDS，置于容器，1管；

(4)酚-氯仿-异戊醇混合溶液(体积比25:24:1)，置于容器，1管；

(5)异丙醇，置于容器，1管；

(6)制备体积浓度为70％乙醇，置于容器，1管；

(7)制备TE缓冲液(10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA，pH8.0)，置于容器，1管；

(8)制备CTAB的NaCl溶液(5g CTAB溶于100mL 0.5M NaCl溶液中)，置于容器，1管；

(9)制备阳性对照品：提取鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的基因组DNA，等体积混合，置于容器，1管；

(10)2×PCR DsMix，置于容器，1管；

(11)一块泡沫板，将上述12个小管分别对应放置于泡沫板的孔内，装于盒中即制备得到本实施例的检测试剂盒。

本实施例中各试剂管制备后均经过抽样质检，对其质量进行监控。

实施例5利用实施例4制得的试剂盒进行检测的方法

1、本实施例采用实施例4制备所得试剂盒，采用三重PCR对海水鱼类养殖水体样品是否含有鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌进行快速检测，其具体步骤如下：

(1)取待检测水体样品50ml于12000r/min离心10min；

(2)步骤1)离心后去上清，加入500-550μL的TE缓冲液重悬沉淀，备用；

(3)向步骤(2)重悬后的溶液中加入30μL质量浓度为10％SDS和15μL的蛋白酶K(20mg/mL)，并于37℃温育1h；

(4)向步骤(3)温育后的溶液中加入100μL 5mol/L NaCl,充分混匀后再加入80μLCTAB的NaCl溶液，65℃温育20min；

(5)向步骤(4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀，12000g/min离心4min；

(6)将步骤(5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6倍体积的异丙醇，12000g/min离心4min；

(7)步骤(6)离心后去上清，沉淀用1mL的体积浓度70％乙醇洗涤后，12000g/min离心4min；

(8)步骤(7)离心后去上清，沉淀常温干燥10min，重溶于30-50μL TE缓冲液，即为样品DNA模板；

(9)样品组三重PCR反应体系包括：12.5μL 2×PCR DsMix、1.0μL引物Ns-mceF、1.0μL引物Ns-mceR、0.7μL引物Vh-toxF、0.7μL引物Vh-toxR、1.8μL引物Si-itsF、1.8μL引物Si-itsR、3.0μL步骤8)得到的样品DNA模板和2.5μL无菌水；

(10)阳性对照组三重PCR反应体系包括：12.5μL 2×PCR DsMix、1.0μL引物Ns-mceF、1.0μL引物Ns-mceR、0.7μL引物Vh-toxF、0.7μL引物Vh-toxR、1.8μL引物Si-itsF、1.8μL引物Si-itsR、3.0μL阳性对照品和2.5μL无菌水；

(11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/min离心10s，置于PCR仪中，分别94℃预变性4min，(94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min)35个循环，72℃延伸10min，进行PCR反应；

(12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照孔和参比孔；所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5μL与6×Loading Buffer 1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5μL与6×Loading Buffer1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述参比孔取5μL DL2000DNAMarker加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；以120V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和所述参比孔进行电泳约25min后，于凝胶成像系统下观察结果；若样品电泳条带出现与阳性对照相同大小的条带(鰤鱼诺卡氏菌964bp、哈维弧菌528bp、海豚链球菌205bp)，则说明待测样品含有相对应的细菌。

2、检测结果：

检测结果如图2所示，图2中泳道M为Marker DL2000；泳道1为三种病原菌三重PCR阳性对照；泳道2为含有三种病原菌养殖水体样品的三重PCR扩增结果；泳道3为三种病原菌三重PCR阴性对照；泳道4为不含有三种病原菌养殖水体样品的三重PCR扩增结果；从图2可以看出含有三种病原菌养殖水体样品检测出相应的3条条带，并且与阳性对照条带大小相同，不含有三种病原菌养殖水体样品并未检测出条带，即说明本发明的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌检测用引物组可以准确、特异性地检测出养殖水体是否含有鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌。

上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.一种鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测引物组，其特征在于，包括引物对Ns-mce、引物对Vh-tox和引物对Si-its；其中，所述引物对Ns-mce包括核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的Ns-mceF和核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Ns-mceR；所述引物对Vh-tox包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的Vh-toxF和核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的Vh-toxR；所述引物对Si-its包括核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的Si-itsF和核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示的Si-itsF。

2.一种鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述检测引物组。

3.根据权利要求2所述的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，其特征在于，还包括蛋白酶K、SDS溶液、酚-氯仿-异戊醇混合溶液、异丙醇、体积浓度为70％的乙醇、TE缓冲液、CTAB的NaCl溶液、阳性对照品和PCR DsMix。

4.根据权利要求3所述的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述酚-氯仿-异戊醇混合溶液中酚、氯仿和异戊醇的体积比为25:24:1。

5.根据权利要求3所述的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述CTAB的NaCl溶液为将CTAB溶于0.5mol/L的NaCl溶液中，CTAB和所述NaCl溶液的质量体积比为1:20。

6.根据权利要求3所述的鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品包括鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的DNA模板。

7.根据权利要求2所述鰤鱼诺卡氏菌、哈维弧菌和海豚链球菌的检测试剂盒，其特征在于，所述检测引物组中的引物浓度均为10μM。

8.采用权利要求3～7任一所述检测试剂盒进行检测的方法，该方法适用于非诊断目的，其特征在于，包括如下步骤：

1)取待检测样品50～100mg并加入500-550μL的TE缓冲液，用玻璃匀浆器充分匀浆后，于12000r/min离心10min；

2)步骤1)离心后去除沉淀，取上清备用；

3)向步骤2)上清溶液中加入30μL质量浓度为10％SDS和15μL 20mg/mL的蛋白酶K，并于37℃温育1h；

4)向步骤3)温育后的溶液中加入100μL 5mol/L的NaCl溶液,充分混匀后再加入80μLCTAB的NaCl溶液，65℃温育20min；

5)向步骤4)温育后的溶液中加入与温育后的溶液等体积的酚-氯仿-异戊醇混合溶液混匀，12000g/min离心4-5min；

6)将步骤5)离心后的上清转入一只新管中，加入上清液0.6-0.8倍体积的异丙醇，12000g/min离心4-5min；

7)步骤6)离心后去上清，沉淀用1mL的体积浓度为70％的乙醇洗涤后，12000g/min离心4-5min；

8)步骤7)离心后去上清，沉淀常温干燥5-10min，重溶于30-50μL TE缓冲液，即为样品DNA模板；

9)样品组三重PCR反应体系包括：12.5μL 2×PCR DsMix、1.0μL引物Ns-mceF、1.0μL引物Ns-mceR、0.7μL引物Vh-toxF、0.7μL引物Vh-toxR、1.8μL引物Si-itsF、1.8μL引物Si-itsR、3.0μL步骤8)得到的样品DNA模板和2.5μL无菌水；

10)阳性对照组三重PCR反应体系包括：12.5μL 2×PCR DsMix、1.0μL引物Ns-mceF、1.0μL引物Ns-mceR、0.7μL引物Vh-toxF、0.7μL引物Vh-toxR、1.8μL引物Si-itsF、1.8μL引物Si-itsR、3.0μL阳性对照品和2.5μL无菌水；

11)将步骤9)制得的样品组和步骤10)制得的阳性对照组分别混匀后12000g/min离心10s，置于PCR仪中，分别于94℃预变性4min，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，进行PCR反应；

12)对步骤11)PCR反应结果进行电泳检测，分别设置样品孔、阳性对照孔和参比孔；所述样品孔取步骤11)样品组PCR反应产物5μL与6×Loading Buffer 1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述阳性对照孔取步骤11)阳性对照组PCR反应产物5μL与6×LoadingBuffer1μL混合，加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；所述参比孔取5μL DL2000 DNA Marker加入到1％琼脂糖凝胶点样孔中；以120V电压分别对所述样品孔、所述阳性对照孔和所述参比孔进行电泳25min后，于凝胶成像系统下观察结果；若样品孔电泳条带出现与阳性对照孔相同大小的条带，则说明待测样品中含有相对应的细菌。