CN111394483B - 一种同时检测三种鱼源链球菌的试剂盒和检测方法 - Google Patents

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Abstract

同时检测三种链球菌的引物组合，组成为：SEQ ID MO:1、2的检测无乳链球菌的上下游引物，SEQ ID MO:3、4的检测停乳链球菌链球菌的上下游引物，SEQ ID MO:5、6的检测海豚链球菌的上下游引物。一种试剂盒，由DNA提取试剂和PCR反应试剂组成，DNA提取试剂由TE缓冲液、蛋白酶K、氯仿、异丙醇、乙醇、双蒸水组成；PC反应试剂含有反应缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、所述6种引物、去离子水。同时检测所述三种链球菌的方法，用所述提取试剂提取样品中的DNA，用所述反应试剂对所述DNA作PCR扩增，所述扩增产物作凝胶电泳。本发明能同时检测所述三种链球菌，检测简便、快速、灵敏度高、特异性强，适用于水生动物大规模分子流行病学调查分析及水产品的质量安全检测需求。

Description

一种同时检测三种鱼源链球菌的试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及靶DNA片断的检测技术，具体涉及一种同时检测无乳链球菌、海豚链球菌及停乳链球菌的快速检测试剂盒及检测方法。
技术背景
鱼类链球菌病是由链球菌属细菌感染引起的传染病，致病菌种类主要包括海豚链球菌(Streptococcus iniae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)和停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)。链球菌感染宿主范围广、致死率高、发病持续时间长，给水产养殖业造成了巨大经济损失。无乳链球菌是罗非鱼最主要的致病菌之一，该菌也可引起多种水产动物如虹鳟、斑点叉尾鮰、牙鲆、大菱鲆、真鲷和齐口裂腹鱼等的败血症和脑膜炎。海豚链球菌最初分离自患病的淡水海豚，其后发现该菌可感染罗非鱼、虹鳟、大菱鲆、红拟石首鱼、牙鲆、斑点叉尾鮰和鲑鱼等几十种淡海水鱼类，引起养殖鱼类流行性脑膜炎，是水生动物暴发性疾病的重要原菌之一。停乳链球菌引起鱼类疾病的报道出现较晚，2004年日本的Nomoto等首次报道了停乳链球菌感染导致杜氏鰤和五条鰤死亡。近年来的研究表明，停乳链球菌感染的种类及流行范围正在逐渐扩张，梭鱼、布氏鲳鲹、鲻鱼、军曹鱼，马来西亚的白星笛鲷、布氏鲳鲹、尼罗罗非鱼、杂交红罗非鱼，我国的卵形鲳鲹及鲟鱼(俄罗斯鲟、西伯利亚鲟、史氏鲟、达氏鲟等)等均有感染发病的报道。此外，这三种致病性链球菌均可感染人和多种动物。无乳链球菌常导致新生儿肺炎、脑膜炎、败血症及奶牛乳腺炎；停乳链球菌是牛、猪、羊等家养动物乳房炎、多关节炎、败血症的常见病原菌；人类感染海豚链球菌后可出现包括败血症、中毒性休克综合症和皮肤发炎等症状。因此，实现对三种致病链球菌的快速精准检测，有助于实现鱼类链球菌病的及时监控和快速诊断，保证水产品的质量安全，提升公共卫生水平。
传统的生理生化鉴定，是病原鉴定的重要方法，但是该方法步骤繁琐、周期较长、灵敏度低。目前已报道的针对无乳链球菌、海豚链球菌等单一致病菌的PCR检验方法，一次只能检测一种链球菌，检测三种链球菌则需多次实验，工作量大，检测时间长，总体效率低。而在普通单重PCR基础上发展起来的多重PCR(multiplex polymerase chain reaction,MPCR)可以在一个PCR体系中同时扩增出多个目的DNA片段，以解决单一引物检测能力不足的问题，提高检测效率，节约检测成本。目前，有关所述三种链球菌的检测试剂盒和检测技术虽已有专利申请(申请号：201410425186.5，名称：“同时检测三种链球菌的三重实时荧光PCR方法及试剂盒”)披露，但该申请的试剂盒和检测技术对仪器设备要求较高，试剂耗材昂贵。而本发明建立的多重PCR检测方法基于普通PCR反应及检测平台，适用于普通实验室的现有条件，检测成本大幅降低。此外，本发明PCR扩增获得的目的DNA片段，亦可用于分子流行病学调查中菌株的基因分型研究。
发明内容
本发明要解决现有技术检测所述三种鱼源链球菌耗时长，效率低，准确率不高，以及对仪器设备要求高，试剂耗材昂贵等问题，为此提供本发明的一种同时检测所述三种链球菌的试剂盒及检测方法，该方法可实现对无乳链球菌、海豚链球菌及停乳链球菌的快速检测和准确鉴别。
本发明包括一种可同时快速检测无乳链球菌、海豚链球菌及停乳链球菌三种链球菌的试剂盒以及用该试剂盒同时检测所述三种链球菌的方法。
本发明一种同时检测所述三种链球菌的试剂盒，由DNA提取试剂和PCR反应试剂组成，其特殊之处是所述DNA提取试剂和PCR反应试剂分别为：
(1)DNA提取试剂成分为5-15mM Tris、0.5-1.5mM EDTA的pH 8.0的TE缓冲液；蛋白酶K，浓度15-20mg/mL；100％的氯仿；100％的异丙醇；乙醇，浓度70％；双蒸水；
(2)PCR反应试剂分装于若干PCR反应管，每个PCR反应管中含有10×PCR反应缓冲液2.5μL，浓度为10μM的dNTPs 0.5μL，浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶0.3μL，浓度为10μM的特异性寡核苷酸引物Sa.tkt-F 0.25μL，10μM的特异性寡核苷酸引物Sa.tkt-R 0.25μL，10μM的特异性寡核苷酸引物Sd.AtoB-F 0.25μL，10μM的特异性寡核苷酸引物Sd.AtoB-R 0.25μL,10μM的特异性寡核苷酸引物Si.RecA-F 0.75μL,10μM的特异性寡核苷酸引物Si.RecA-R0.75μL，灭菌去离子水18.2μL，所述引物及其核苷酸序列为：
检测无乳链球菌的上下游引物—
引物Sa.tkt-F:5’-GTGCTGGCATAGATACGACG-3’,
引物Sa.tkt-R:5’-CGCTTCACGGTGGGACT-3’,
检测停乳链球菌的上下游引物—
引物Sd.AtoB-F:5’-TAGGACAAAATGTGGCAAGAC-3’,
引物Sd.AtoB-R:5’-GTCCAGTTCCCATCAGTTCAG-3’,
检测海豚链球菌的上下游引物—
引物Si.RecA-F:5’-TAAGGGTGCTGTTATGCGTCT-3’,
引物Si.RecA-R:5’-CAGGCGTTGTTTCAGGGTTA-3’。
本发明用所述的试剂盒同时检测无乳链球菌、海豚链球菌和停乳链球菌的方法，步骤为：(1)用所述提取试剂提取样品中的DNA；(2)用所述反应试剂对所述DNA作PCR扩增；(3)所述扩增产物作凝胶电泳；其特殊之处是所述PCR扩增过程为95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min；循环35次，最后72℃延伸5～10min；所述凝胶电泳后观察到495bp、566bp、699bp扩增产物。
本发明中所设计的分别针对无乳链球菌、海豚链球菌及无乳链球菌的多重PCR特异性检测引物，系根据GenBank上已公布的链球菌的看家基因序列，结合相关文献报道，选择在本属内相对保守而种间同源性较低的基因：无乳链球菌tkt基因，海豚链球菌RecA基因，停乳链球菌AtoB基因，分别为各自的引物设计区。各引物均通过Blast对比分析及特异性试验验证，能够很好的区分与检测目标种属相近、生存环境相同的细菌。同时，上述靶基因亦是三种链球菌MLST分型研究的目标基因之一，因此，本发明多重PCR引物扩增获得的目的片段，还可用于分子流行病学调查中菌株的基因分型研究。
本发明的有益效果在于：
本发明建立的多重PCR检测方法是一种基于普通PCR平台的检测方法，对检测平台和检测人员的要求低，检测通量高，试剂耗材成本低，该检测方法简便、快速、灵敏度高、特异性强。适用于水生动物链球菌的快速检测及大规模分子流行病学调查分析、水产品的质量安全及检验检疫等多种检测需求。
本发明的方法在于快速、简便地检测所述三种链球菌，不以人或动物疾病的诊断和治疗为目的。
附图说明
图1为无乳链球菌特异性检测结果；
其中，M-DNA marker 1000；1-无乳链球菌；2-海豚链球菌；3-停乳链球菌；4-温和气单胞菌ATCC43979；5-豚鼠气单胞菌ATCC15468；6-嗜水气单胞菌TPS；7-维隆气单胞菌MRM0908；8-溶藻弧菌VAN100117；9-副溶血弧菌VPZJ；10-哈维氏弧菌VHHA；11-拟态弧菌VM18531K；12-鲁氏耶尔氏菌LY0903；13-弗氏柠檬酸杆菌JXMR0908L1；14-鮰爱德华氏菌hsy19618K；15-类志贺邻单胞菌hsy18920S；16-脑膜败血伊丽莎白菌HBW190701B；17-格氏乳球菌ET060821；18-乳酸乳球菌sg-5；19-粪肠球菌M18523-5。
图2为海豚链球菌特异性检测结果；
其中，M-DNA marker 1000；1-海豚链球菌；2-无乳链球菌；3-停乳链球菌；4-温和气单胞菌ATCC 43979；5-豚鼠气单胞菌ATCC15468；6-嗜水气单胞菌TPS；7-维隆气单胞菌MRM0908；8-溶藻弧菌VAN100117；9-副溶血弧菌VPZJ；10-哈维氏弧菌VHHA；11-拟态弧菌VM18531K；12-鲁氏耶尔氏菌LY0903；13-弗氏柠檬酸杆菌JXMR0908L1；14-鮰爱德华氏菌hsy19618K；15-类志贺邻单胞菌hsy18920S；16-脑膜败血伊丽莎白菌HBW190701B；17-格氏乳球菌ET060821；18-乳酸乳球菌sg-5；19-粪肠球菌M18523-5。
图3为停乳链球菌特异性检测结果；
其中，M-DNA marker 1000；1-停乳链球菌；2-无乳链球菌；3-海豚链球菌；4-温和气单胞菌ATCC 43979；5-豚鼠气单胞菌ATCC15468；6-嗜水气单胞菌TPS；7-维隆气单胞菌MRM0908；8-溶藻弧菌VAN100117；9-副溶血弧菌VPZJ；10-哈维氏弧菌VHHA；11-拟态弧菌VM18531K；12-鲁氏耶尔氏菌LY0903；13-弗氏柠檬酸杆菌JXMR0908L1；14-鮰爱德华氏菌hsy19618K；15-类志贺邻单胞菌hsy18920S；16-脑膜败血伊丽莎白菌HBW190701B；17-格氏乳球菌ET060821；18-乳酸乳球菌sg-5；19-粪肠球菌M18523-5。
图4为多重PCR条件优化检测结果；
其中，M-DNA marker 1000；1-无乳链球菌；2-海豚链球菌；3-停乳链球菌；4-无乳链球菌+海豚链球菌；5-无乳链球菌+停乳链球菌；6-海豚链球菌+停乳链球菌；7-无乳链球菌+海豚链球菌+停乳链球菌，8-无乳链球菌+海豚链球菌+停乳链球菌+16种对照菌株的混合模板；9-16种对照菌株的混合模板。
图5为本发明多重PCR检测试剂盒敏感性检测结果；
其中，M-DNA marker 1000；1～7样品中无乳链球菌的浓度分别为3×109cfu/mL、3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL；8～14样品中海豚链球菌的浓度分别为3×109cfu/mL、3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL；15～21样品中停乳链球菌的浓度分别为3×109cfu/mL、3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL。
图6为临床样本的检测结果：
其中，M-DNA marker 1000；1-罗非鱼2018-01；2-罗非鱼2018-02；3-俄罗斯鲟2018-ZJ1；4-罗非鱼2018-03；5-罗非鱼2018-04；6-罗非鱼2018-05；7-罗非鱼2018-06；8-罗非鱼2019-01；9-罗非鱼2019-02；10-罗非鱼2019-03；11-罗非鱼2019-04；12-俄罗斯鲟2018-ZJ2；13-俄罗斯鲟2019-ZJ1；14-俄罗斯鲟2019-ZJ2；15-俄罗斯鲟2019-ZJ3；16-俄罗斯鲟2019-ZJ4。
具体实施方式
DNA模板制备
1、组织样本DNA的提取：称取病样0.1g，充分研磨后加入500μL所述组成为5mMTris和0.5mM EDTA的pH 8.0的TE缓冲液，并加入20μL蛋白酶K溶液，混匀后于56℃放置1h；加入100μL氯仿混匀，12000rpm离心15min，取上层液移至另一离心管，加入400μL异丙醇，室温沉淀10min，12000rpm离心10min，取沉淀物，用70％乙醇洗涤2次；
2、菌液样本DNA的提取：取1mL细菌培养液离心，弃上清，沉淀物中加入500μL所述组成为5mM Tris和0.5mM EDTA的pH 8.0的TE缓冲液，并加入20μL蛋白酶K溶液，混匀后于56℃放置1h；加入100μL氯仿混匀，12000rpm离心15min，取上层液移至另一离心管，加入400μL异丙醇，室温沉淀10min，12000rpm离心10min，取沉淀物，用70％乙醇洗涤2次；
步骤1的沉淀物和步骤2的沉淀物分别室温干燥，干燥后样品溶于双蒸水，得样品基因组DNA溶液。以下实施例中的DNA模板参照此步骤制备。
实施例1多重PCR检测
1、单基因PCR反应体系和反应条件的建立
分别提取所述三种链球菌及对照菌株的基因组DNA，作为PCR扩增的模板，检测各引物的特异性，并对PCR扩增条件进行优化。
特异性验证的所述对照菌株16种，均为常见水生动物病原菌，有：温和气单胞菌ATCC43979；豚鼠气单胞菌ATCC15468；嗜水气单胞菌TPS；维隆气单胞菌MRM0908；溶藻弧菌VAN100117；副溶血弧菌VPZJ；哈维氏弧菌VHHA；拟态弧菌VM18531K；鲁氏耶尔氏菌LY0903；弗氏柠檬酸杆菌JXMR0908L1；鮰爱德华氏菌hsy19618K；类志贺邻单胞菌hsy18920S；脑膜败血伊丽莎白菌HBW190701B；格氏乳球菌ET060821；乳酸乳球菌sg-5；粪肠球菌M18523-5。
用本发明所述三对引物，Sa.tkt-F和Sa.tkt-R，Si.RecA-F和Si.RecA-R，Sd.AtoB-F和Sd.AtoB-R，每对引物对所述19个菌株的DNA模板分别进行PCR反应与检测，通过多次试验发现，本发明所述三对引物，特异性强、扩增效率高，可以在优化后的反应体系和条件下更好地扩增出对应的基因片段。
1)无乳链球菌单基因特异性PCR反应体系、条件和检测
PCR反应体系：
PCR反应条件：95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸40s；循环35次，最后72℃延伸5～10min；
结果检测：取5μL PCR扩增产物在含5μg/ml嗅化乙啶(EB)的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，5V/cm，30min后于凝胶成像仪上观察结果。如图1所示，只有无乳链球菌扩增到了495bp的目的片段，所述16种对照病原菌及海豚链球菌、停乳链球菌均无特异性条带扩增，说明该引物具有较好的特异性，能够将非目标菌有效区分开。
2)海豚链球菌单基因特异性PCR反应体系、条件和检测
PCR反应体系：
PCR反应条件：95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸50s；循环35次，最后72℃延伸5～10min；
结果检测：取5μL PCR扩增产物在含5μg/ml嗅化乙啶(EB)的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，5V/cm，30min后于凝胶成像仪上观察结果。如图2所示，只有海豚链球菌扩增到了566bp的目的片段，所述16种对照病原菌及无乳链球菌、停乳链球菌均无特异性条带扩增，说明该引物具有较好的特异性，能够将非目标菌有效区分开。
3)停乳链球菌单基因特异性PCR反应体系、条件和检测
PCR反应体系：
PCR反应条件：95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min；循环35次，最后72℃延伸5～10min；
结果检测：取5μL PCR扩增产物在含5μg/ml嗅化乙啶(EB)的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，5V/cm，30min后于凝胶成像仪上观察结果。如图3所示，只有无乳链球菌扩增到了699bp的目的片段，所述16种对照病原菌及无乳链球菌、海豚链球菌均无特异性条带扩增，说明该引物具有较好的特异性，能够将非目标菌有效区分开。
2、多重PCR反应体系和条件的优化
在单基因特异性PCR反应的基础上，使用经上述试验验证成功的引物组，进一步优化所述三对引物的浓度比例及退火温度等反应条件，建立多重PCR检测方法。试验结果表明，检测无乳链球菌、海豚链球菌及停乳链球菌的引物浓度最佳比例为1︰3︰1，退火温度为60℃，引物相互之间的影响最小，扩增效率较高，且无非特异性条带扩增。
分别制备以下样品：样品1含有无乳链球菌；样品2含有海豚链球菌；样品3含有停乳链球菌；样品4含有无乳链球菌和海豚链球菌；样品5含有海豚链球菌和停乳链球菌；样品6含有无乳链球菌和停乳链球菌；样品7含有无乳链球菌、海豚链球菌和停乳链球菌；样品8含有无乳链球菌、海豚链球菌、停乳链球菌和所述16种对照病原菌。样品9含所述16种所述对照病原菌。分别提取上述9个样品的DNA，各作为多重PCR反应的模板。
多重PCR反应体系：
多重PCR反应条件：95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min；循环35次，最后72℃延伸10min；
结果检测：取5μL PCR扩增产物在含5μg/ml嗅化乙啶(EB)的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，5V/cm，30min后于凝胶成像仪上观察结果。如图4所示，图中第1泳道出现495bp扩增条带，表明该样品含有无乳链球菌；第2泳道出现566bp扩增条带，表明该样品含有海豚链球菌；第3泳道出现699bp扩增条带，表明该样品含有停乳链球菌；第4泳道出现495bp和566bp的扩增条带，表明该样品含有无乳链球菌和海豚链球菌；第5泳道出现495bp和699bp的扩增条带，表明该该样品含有无乳链球菌和停乳链球菌；第6泳道出现566bp和699bp的扩增条带，表明该样品含有海豚链球菌和停乳链球菌；第7泳道出现495bp、566bp和699bp的扩增条带，表明该样品含有无乳链球菌、海豚链球菌和停乳链球菌；第8泳道出现495bp、566bp和699bp的扩增条带，表明该样品含有无乳链球菌、海豚链球菌和停乳链球菌，且本发明多重PCR检测方法对3种目标链球菌的扩增不受其他常见水生动物病原的干扰；第9泳道未出现任何特异性目的条带，表明本发明多重PCR检测方法对样品9中所述16种对照病原菌DNA均无扩增，特异性好。本发明多重PCR检测方法可同时对无乳链球菌、海豚链球菌和停乳链球菌进行检测，所述三种链球菌均扩增出现特异性目的条带(无乳链球菌495bp、海豚链球菌566bp、停乳链球菌699bp)，无杂带产生，且扩增效率相当，不受其他常见水生动物病原的干扰。
实施例2试剂盒的组建
本发明同时检测三种鱼源链球菌的试剂盒由DNA提取试剂和PCR反应试剂组成。
1、DNA提取试剂成分为5-15mM Tris、0.5-1.5mM EDTA的pH 8.0的TE缓冲液；蛋白酶K，浓度15-20mg/mL；100％的氯仿；100％的异丙醇；乙醇，浓度70％；双蒸水；
2、PCR反应试剂分装于若干PCR反应管，每个反应管中含有10×PCR反应缓冲液2.5μL，浓度为10μM的dNTPs 0.5μL，浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶0.3μL，浓度为10μM的特异性寡核苷酸引物Sa.tkt-F 0.25μL，10μM的特异性寡核苷酸引物Sa.tkt-R 0.25μL，10μM的特异性寡核苷酸引物Sd.AtoB-F 0.25μL，10μM的特异性寡核苷酸引物Sd.AtoB-R 0.25μL,10μM的特异性寡核苷酸引物Si.RecA-F 0.75μL,10μM的特异性寡核苷酸引物Si.RecA-R 0.75μL，灭菌去离子水18.2μL。
实施例3多重PCR检测试剂盒的敏感性评估
将无乳链球菌、海豚链球菌及停乳链球菌的菌液浓度均调整至3×109cfu/mL，提取DNA。各基因组DNA分别进行10倍梯度稀释，每个检测样品中DNA模板对应的菌液浓度依次为3×109cfu/mL、3×108cfu/mL、3×107cfu/mL、3×106cfu/mL、3×105cfu/mL、3×104cfu/mL、3×103cfu/mL。使用本发明试剂盒以实施例1建立的多重PCR检测方法对所述三种链球菌不同稀释度的模板进行敏感性检测。结果如图5所示，表明本发明多重PCR方法检测三种链球菌的敏感性强，均为3×105cfu/mL。
实施例4临床样品的检测
1、样本的采集
待检样本16份，为2018-2019年采集自浙江省某鲟鱼养殖场的鲟鱼样本和海南省多家养殖场的罗非鱼样本。
2、DNA模板制备
无菌条件下，解剖鱼体，取肾组织约0.1g，按照本发明所述组织样本DNA的提取步骤提取样本的DNA。实际操作也可以取鱼的脾或肝组织。
3、多重PCR扩增
采用实施案例2所述试剂盒，在每个PCR反应管中各加入1μL待检样本的DNA作为模板，多重PCR反应条件参见实施例1，具体为：95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min；循环35次，最后72℃延伸10min。
4、结果检测
取5μL PCR扩增产物在含5μg/ml嗅化乙啶(EB)的1.5％琼脂糖凝胶上电泳，5V/cm，30min后于凝胶成像仪上观察结果。如图6所示，样本1扩增到了495bp的特异性条带，说明该样本有无乳链球菌的感染；样本2扩增到566bp的特异性条带，说明该样本有海豚链球菌的感染；样本2扩增到了699bp的特异性条带，说明该样本有停乳链球菌的感染；其他13个样本均未扩增到上述3种特异性目的条带，说明这些样本没有本发明所述三种链球菌的感染。
补充说明：待检样本的DNA模板，亦可由采集样本分离菌株的增菌液来制备，参见具体实施方式所述DNA模板制备。
序列表
<110> 浙江省淡水水产研究所
<120> 一种同时检测三种鱼源链球菌的试剂盒和检测方法
<130> 3
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtgctggcat agatacgacg 20
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcttcacgg tgggact 17
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taggacaaaa tgtggcaaga c 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtccagttcc catcagttca g 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taagggtgct gttatgcgtc t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caggcgttgt ttcagggtta 20

Claims (3)

1.一种同时检测无乳链球菌、海豚链球菌及停乳链球菌的引物组合，其成分及其核苷酸序列如下：
检测无乳链球菌的上下游引物—
引物Sa.tkt-F:5’-GTGCTGGCATAGATACGACG-3’,
引物Sa.tkt-R:5’-CGCTTCACGGTGGGACT-3’,
检测停乳链球菌的上下游引物—
引物Sd.AtoB-F:5’-TAGGACAAAATGTGGCAAGAC-3’,
引物Sd.AtoB-R:5’-GTCCAGTTCCCATCAGTTCAG-3’,
检测海豚链球菌的上下游引物—
引物Si.RecA-F:5’-TAAGGGTGCTGTTATGCGTCT-3’,
引物Si.RecA-R:5’-CAGGCGTTGTTTCAGGGTTA-3’。
2.一种同时检测权利要求1所述三种链球菌的试剂盒，由DNA提取试剂和PCR反应试剂组成，其特征是所述DNA提取试剂和PCR反应试剂分别为：
(1)DNA提取试剂成分为5-15mM Tris、0.5-1.5mM EDTA的pH 8.0的TE缓冲液；蛋白酶K，浓度15-20mg/mL；100％的氯仿；100％的异丙醇；浓度70％的乙醇；双蒸水；
(2)PCR反应试剂分装于若干PCR反应管，每个PCR反应管中含有10×PCR反应缓冲液2.5μL，浓度为10μM的dNTPs 0.5μL，浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶0.3μL，浓度为10μM的特异性寡核苷酸引物Sa.tkt-F：5’-GTGCTGGCATAGATACGACG-3’0.25μL，10μM的特异性寡核苷酸引物Sa.tkt-R：5’-CGCTTCACGGTGGGACT-3’0.25μL，10μM的特异性寡核苷酸引物Sd.AtoB-F：5’-TAGGACAAAATGTGGCAAGAC-3’0.25μL，10μM的特异性寡核苷酸引物Sd.AtoB-R：5’-GTCCAGTTCCCATCAGTTCAG-3’0.25μL,10μM的特异性寡核苷酸引物Si.RecA-F：5’-TAAGGGTGCTGTTATGCGTCT-3’0.75μL,10μM的特异性寡核苷酸引物Si.RecA-R：5’-CAGGCGTTGTTTCAGGGTTA-3’0.75μL，灭菌去离子水18.2μL。
3.用权利要求2所述的试剂盒制备同时检测所述三种链球菌产品的方法，步骤为：(1)用所述提取试剂提取样品中的DNA；(2)用所述反应试剂对所述DNA作PCR扩增；(3)所述扩增产物作凝胶电泳；其特征是所述PCR扩增过程为95℃预变性3min；94℃变性30s，60℃复性30s，72℃延伸1min；
循环35次，最后72℃延伸5～10min；所述凝胶电泳后观察到495bp、566bp、699bp扩增产物。
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