CN110358850B - 一种检测副乳房链球菌血清型的引物组和试剂盒 - Google Patents

一种检测副乳房链球菌血清型的引物组和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测副乳房链球菌血清型的引物组和试剂盒，属于鱼类疾病检测技术领域，所述引物组包括Parauberis1引物对和Parauberis2引物对。采用本发明提供的引物组能够准确、特异、快速及灵敏地对鱼源副乳房链球菌的血清型进行区分。

Description

一种检测副乳房链球菌血清型的引物组和试剂盒
技术领域
本发明属于鱼类疾病检测技术领域，尤其涉及一种检测副乳房链球菌血清型的引物组和试剂盒。
背景技术
副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)是一种重要的水产动物致病菌，该菌于1996年第一次在西班牙养殖大菱鲆中被鉴定为鱼类病原菌，之后该病在欧洲蔓延。在北美，该菌被报道可引起野生条纹鲈的感染。近年来，该病原菌是亚洲韩国和日本养殖牙鲆病害爆发的主要原因，感染病鱼表现出眼球突起、充血，肌肉出血，腹部膨大等症状。引起急性大面积死亡，造成重大的经济损失，同时在以色列最新报道了由该菌引起的养殖淡水观赏鱼的败血症。根据菌株的荚膜多糖抗原的差异以及其是否存在，副乳房链球菌可分为5种血清表型。目前，针对该病原菌的血清流行病学方面的研究引起了广泛的关注，因此提供一种精确、快速的检测方法显得尤为重要。
目前最常用的血清型检测和鉴定方法是血清凝集试验，但该方法所需周期较长，且大多数的研究所和实验室并无用于血清分型的抗血清，所以用传统的方法鉴别鱼源副乳房链球菌的血清型变的困难。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测副乳房链球菌血清型的引物组和试剂盒，采用本发明提供的引物组能够准确、特异、快速及灵敏地对鱼源副乳房链球菌的血清型进行区分。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种检测副乳房链球菌血清型的引物组，所述引物组包括Parauberis1引物对和Parauberis2引物对；
所述Parauberis1引物对包括Parauberis-F1和Parauberis-R1；
所述Parauberis-F1具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述Parauberis-R1具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；
所述Parauberis2引物对包括Parauberis-F2和Parauberis-R2；
所述Parauberis-F2具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述Parauberis-R2具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
优选的，所述副乳房链球菌血清型包括Ia、Ib/Ic、II血清型。
优选的，将待检测样品经引物组PCR扩增后，得到扩增产物，当所述扩增产物的分子量同时存在763bp、428bp和183bp时，待检测样品的副乳房链球菌血清型为Ia血清型。
优选的，将待检测样品经引物组PCR扩增后，得到扩增产物，当所述扩增产物的分子量为428bp时，待检测样品的副乳房链球菌血清型为Ib/Ic血清型。
优选的，将待检测样品经引物组PCR扩增后，得到扩增产物，当所述扩增产物的分子量为183bp时，待检测样品的副乳房链球菌血清型为II血清型。
本发明还提供了一种检测副乳房链球菌血清型的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物组和检测试剂；
所述检测试剂包括dNTPS、Taq DNA聚合酶和10×Taq polymerase buffer。
本发明提供了一种检测副乳房链球菌血清型的引物组和试剂盒，所述引物组包括Parauberis1引物对和Parauberis2引物对；所述Parauberis1引物对包括Parauberis-F1和Parauberis-R1；所述Parauberis-F1具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述Parauberis-R1具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述Parauberis2引物对包括Parauberis-F2和Parauberis-R2；所述Parauberis-F2具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述Parauberis-R2具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。采用本发明提供的引物组能够准确、特异和快速地对鱼源副乳房链球菌的血清型进行区分。
附图说明
图1为实施例1电泳结果；
图2为实施例2电泳结果；
图3为实施例3电泳结果；
图4为实施例4电泳结果；
图5为实施例5电泳结果。
具体实施方式
本发明提供了一种检测副乳房链球菌血清型的引物组，所述引物组包括Parauberis1引物对和Parauberis2引物对；所述Parauberis1引物对包括Parauberis-F1和Parauberis-R1；所述Parauberis-F1具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述Parauberis-R1具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；所述Parauberis2引物对包括Parauberis-F2和Parauberis-R2；所述Parauberis-F2具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，所述Parauberis-R2具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。
在本发明中，所述Parauberis1引物对包括Parauberis-F1和Parauberis-R1；所述Parauberis-F1具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，具体序列如下所示：
5’-AAATCTCATTGCTACATTAGATGGT-3’；
所述Parauberis-R1具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，具体如下所示：
5’-CTGCTTCTGCTTCAGTAAATCCCAT-3’。
在本发明中，所述Parauberis2引物对包括Parauberis-F2和Parauberis-R2；所述Parauberis-F2具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，具体如下所示：
5’-TTTGGCTATGGTGGTTATTGCTTAC-3’；
所述Parauberis-R2具有SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，具体如下所示：
5’-TTCAGGATTATATTCACTTGATCCG-3’。
在本发明中，所述引物组的设计思路为：以鱼源副乳房链球菌荚膜基因簇的一个保守基因为对象，血清Ia型和血清Ib/Ic型的该基因上游的第81-125位碱基序列完全相同，而血清II型的则与之不同；该基因中游的第481-560位、第641-720位碱基序列，血清Ia型、血清Ib/Ic型和II型三者完全相同；下游的第819-843位碱基序列，血清Ia型和血清II型完全相同，而血清Ib/Ic型的则与之不同。根据上述设计得到引物组。本发明的创新之处：现有的针对病原菌血清型的检测技术一般是以血清型特异性基因为对象设计引物进行检测，本发明则是以血清型保守基因设计引物，用两对引物便可检测三种血清型。
在本发明中，所述副乳房链球菌血清型优选包括Ia、Ib/Ic、II血清型。
在本发明中，利用引物组检测副乳房链球菌血清型的方法，优选包括：
提取待检测样品的基因组DNA，用所述引物组进行PCR扩增；
将得到的扩增产物依次进行凝胶电泳和荧光成像，当所述扩增产物的分子量同时存在763bp、428bp和183bp时，待检测样品的副乳房链球菌血清型为Ia血清型；
当所述扩增产物的分子量为428bp时，待检测样品的副乳房链球菌血清型为Ib/Ic血清型；
当所述扩增产物的分子量为183bp时，待检测样品的副乳房链球菌血清型为II血清型。
在本发明中，所述PCR扩增使用的体系每50μL优选包括：基因组DNA 2μL，10μM正、反向引物(两对)各2μL，10mM dNTPS 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，10×Taq polymerasebuffer 5μL和dd H2O 33.5μL。在本发明中，所述PCR扩增的程序包括：98℃3min；98℃10s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃7min。
本发明还提供了一种检测副乳房链球菌血清型的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的引物组和检测试剂，所述检测试剂优选包括：dNTPs、Taq DNA聚合酶和10×Taq polymerase buffer。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
鱼源副乳房链球菌血清型Ia、Ib/Ic以及II的分型鉴别
实验研究对象为鱼源副乳房链球菌3种不同血清型Ia、Ib/Ic以及II各一个菌株，另外，牛源副乳房链球菌和其他常见鱼类病原菌的菌株用于检测该检测方法的特异性。
检测体系中同时加入上述两对引物，PCR扩增使用的体系每50μL优选包括：基因组DNA 2μL，10μM正、反向引物(两对)各2μL，10mM dNTPS 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，10×Taqpolymerase buffer 5μL和dd H2O 33.5μL。在本发明中，所述PCR扩增的程序包括：98℃3min；98℃10s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃7min。
引物对的组合方式有三种：以Parauberis-F2/Parauberis-R2作为一对上下游引物，鱼源副乳房链球菌血清型Ia和II菌株可扩增出预期为183bp大小的条带，而血清型Ib/Ic菌株在该处无条带；以Parauberis-F1/Parauberis-R1作为一对上下游引物，鱼源副乳房链球菌血清型Ia和Ib/Ic菌株可扩增出预期为428bp大小的条带，而血清型II菌株在该处无条带；以Parauberis-F1/Parauberis-R2作为一对上下游引物，鱼源副乳房链球菌血清型Ia菌株可扩增出预期为763bp大小的条带，而血清型Ib/Ic以及II菌株在该处均无条带。特异性方面，牛源副乳房链球菌和其他鱼类病原菌的菌株无任何条带。故此法可以特异地用于对鱼源副乳房链球菌血清型Ia、Ib/Ic以及II菌株的分型鉴别。结果如图1所示。
实施例2
6株血清Ia型鱼源副乳房链球菌的特异性检测
检测体系中加入的两对引物有三种组合方式，分别为Parauberis-F2/Parauberis-R2、Parauberis-F1/Parauberis-R1及Parauberis-F1/Parauberis-R2，实验用的6株血清Ia型鱼源副乳房链球菌株均扩增出了预期的条带，共有三处，长度分别为：183bp、428bp以及763bp，该结果与实施例1中Ia型的一致，因而可以用于对鱼源副乳房链球菌血清Ia型菌株的特异性检测。结果如图2所示。
实施例3
7株血清Ib/Ic型鱼源副乳房链球菌的特异性检测
如上述实施例1的检测体系中，实验用的7株血清Ib/Ic型鱼源副乳房链球菌株均可扩增出预期428bp大小的条带，如图3所示。该结果与实施例1中Ib/Ic型的检测结果一致，因而可以用于对鱼源副乳房链球菌血清型Ib/Ic菌株的特异性检测。
实施例4
3株血清II型鱼源副乳房链球菌的特异性检测
同上述实施例1检测体系，实验用的3株血清II型鱼源副乳房链球菌株均可扩增出预期183bp大小的条带，如图4所示。该结果与实施例1中II型的检测结果一致，因而可以用于对鱼源副乳房链球菌血清II型菌株的特异性检测。
实施例5
鱼源副乳房链球菌血清型Ia、Ib/Ic以及II的PCR检测灵敏性
检测体系中同时加入上述两对引物，PCR扩增使用的体系每25μL优选包括：基因组DNA2μL，10μM正、反向引物(两对)各1μL，10mM dNTPS 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.25μL，10×Taq polymerase buffer2.5μL和dd H2O 15.75μL。在本发明中，所述PCR扩增的程序包括：98℃3min；98℃10s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃7min。
相同PCR检测体系条件下，血清型Ia的DNA浓度最低检测限在0.1～1ng/uL，即仅需0.2～2ng的基因组DNA便可实现对血清型Ia的鉴别；血清型Ib/Ic以及II的DNA浓度最低检测限都在0.1ng/uL以下，即仅需0.2ng左右的基因组DNA便可实现对血清型Ib/Ic以及II的鉴别。结果如图5所示。这表明即使在少量基因组DNA的情况下，仍可完成血清型的分类鉴别。
综合以上，该检测方法能准确、特异、快速及灵敏地对鱼源副乳房链球菌的血清型进行区分鉴定。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种检测副乳房链球菌血清型的引物组和试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaatctcatt gctacattag atggt 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgcttctgc ttcagtaaat cccat 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tttggctatg gtggttattg cttac 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttcaggatta tattcacttg atccg 25

Claims (6)

1.一种检测副乳房链球菌血清型的引物组，其特征在于，所述引物组为Parauberis1引物对和Parauberis2引物对；
所述Parauberis1引物对为Parauberis-F1和Parauberis-R1；
所述Parauberis-F1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述Parauberis-R1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的；
所述Parauberis2引物对为Parauberis-F2和Parauberis-R2；
所述Parauberis-F2的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述Parauberis-R2的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述副乳房链球菌血清型包括Ia、Ib/Ic、II血清型。
3.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，将待检测样品经引物组PCR扩增后，得到扩增产物，当所述扩增产物的分子量同时存在763bp、428bp和183bp时，待检测样品的副乳房链球菌血清型为Ia血清型。
4.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，将待检测样品经引物组PCR扩增后，得到扩增产物，当所述扩增产物的分子量为428bp时，待检测样品的副乳房链球菌血清型为Ib/Ic血清型。
5.根据权利要求1或2所述的引物组，其特征在于，将待检测样品经引物组PCR扩增后，得到扩增产物，当所述扩增产物的分子量为183bp时，待检测样品的副乳房链球菌血清型为II血清型。
6.一种检测副乳房链球菌血清型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～5任一项所述的引物组和检测试剂；
所述检测试剂包括dNTPS、Taq DNA聚合酶和10×Taq polymerase buffer。
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