CN111485028A

CN111485028A - 用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量pcr方法及相应试剂盒

Info

Publication number: CN111485028A
Application number: CN201910085502.1A
Authority: CN
Inventors: 唐伟; 束文圣; 杨荣; 束浩然; 黄斌; 蒋华
Original assignee: Guangdong Magigene Technology Co ltd
Current assignee: Guangdong Magigene Technology Co ltd
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2019-01-29
Publication date: 2020-08-04

Abstract

本发明公开了一种用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分罗非鱼无乳链球菌与其它种属的菌种，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测罗非鱼无乳链球菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR方法及相应试剂盒

技术领域

本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对罗非鱼无乳链球菌进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。

背景技术

链球菌病的主要病原为海豚链球菌(Streptococcus/Sterptococcus shiloi)，海豚链球菌最早是由Pier和Madin(1976从亚马逊淡水海豚(Inia geoffrensis)损伤的皮下组织中分离鉴定获取的。在分类学上，海豚链球菌隶属于细菌域(Bacteria),厚壁菌门(Firmicutes)芽孢杆菌纲(Bacilli)乳杆菌目(Lactobacillales)链球菌科(Streptococcaceae)链球菌属(Streptococcus)。菌体卵圆形，有夹膜，β溶血阳性，大小0.7μm×1.4μm，革兰氏阳性，二链或连锁状的球菌，过氧化氢酶阳性，兼性好氧，在TSA、BHI和血琼脂上生长。无芽孢，无运动力。在温度10～45℃，最适温度为20～34℃，pH3.5～10.0，最适pH值7.6。

中国是最大的罗非鱼养殖国，其年产量占世界总产量的40％以上，无乳链球菌是罗非鱼养殖最主要的疾病之一，每年给世界罗非鱼养殖业造成巨大的经济损失。从2001年开始，无乳链球菌对在我国开始大规模流行，95％以上的罗非鱼养殖场均有不同程度的发病情况，累积死亡率高达30％～80％。

罗非鱼患链球菌病后，主要影响脑组织，组织切片显示脑组织的蛛网膜下出血和簿壁单核细胞浸润。链状的球菌见于蛛网膜间，并且位于脑组织的脓肿中。巨大细胞的直径为100μm，散布的细胞嗜酸颗粒呈线状排列，平行与出血区域。罗非鱼的主要病症是出血和形成脓肿的脑膜炎。

对罗非鱼无乳链球菌病流行病学和感染机制进行研究，是有效预防该病发生与流行的重要方法。传统病原检测一般先从组织内进行细菌分离培养再鉴定，但此方法存在操作繁琐、检测周期长以及检测结果不稳定等问题。普通PCR检测法虽然结果准确，但检测时间长、操作复杂、无法定量，在一定程度上限制了普通PCR检测方法在生产中的推广应用；环介导等温扩增法，虽然检测时间快、操作简单，但假阳性高，一直受到专业人士的诟病。

本发明通过对无乳链球菌的全基因组序列比对分析，找到了三个保守序列16SrRNA、cfb和SIP，通过设计高特异性的引物探针，对无乳链球菌进行定性或定量检测，对无乳链球菌病原的诊断和防控具有重要意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR方法。

具体地，上述方法包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

S3、利用荧光定量PCR检测罗非鱼无乳链球菌特异性基因16SrRNA、SIP和CFB基因；

S4、读取扩增Ct值；当所述罗非鱼无乳链球菌特异性基因中至少1个基因的Ct值小于35时，罗非鱼无乳链球菌的检测结果为阳性；当所述罗非鱼无乳链球菌特异性基因16SrRNA、SIP和CFB基因的Ct值均大于35时，罗非鱼无乳链球菌的检测结果为阴性。

作为一种优选技术方案，所述罗非鱼无乳链球菌特异性基因16SrRNA的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示；

SEQ ID NO:1(5'-CGGTTGGAGCATGTGGTTTA-3')；

SEQ ID NO:2(5'-CTAGGCCGGTCAGAAGGATGT-3')。

TaqMan探针序列如SEQ ID NO:3所示；

SEQ ID NO:3(5'-FAM-TCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAG-BHQ1-3')；

所述罗非鱼无乳链球菌特异性基因SIP的检测引物如SEQ ID NO:4～5所示；

SEQ ID NO:4(5'-CGCTATTATCAGTCGCAAGTGTTC-3')；

SEQ ID NO:5(5'-AAATCAGCCTTTACCTCTGAAACAGTA-3')。

TaqMan探针序列如SEQ ID NO:6所示；

SEQ ID NO:6：5'-FAM-GCACAAGAAACAGATACGACGTGGACAGC-BHQ1-3'。

所述罗非鱼无乳链球菌特异性基因CFB的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示；

SEQ ID NO:7(5'-CGGTTAATGAGGCTATTACTAGTGTTGA-3')；

SEQ ID NO:8(5'-TCAATCACATCTGTTAAGGCTTCTACA-3')。

TaqMan探针序列如SEQ ID NO:9所示；

SEQ ID NO:9(5'-FAM-TTAAAGACTTCATTGCGTGCCAACCCTG-BHQ1-3')；

作为本发明的优化方法，所述荧光定量PCR检测的反应体系为25μl，包括2×TaqPCR Mix 12.5μl，total 10uM Primers Mix 1μl，TaqMan探针0.5μl，DNA input 2μl，H₂O 9μl。

进一步的，所述荧光定量PCR检测的反应条件为95℃预变性2min30s，94℃变性15s，60℃退火30s，采集荧光信号，40个循环。

本发明另一目的是提供一种用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的罗非鱼无乳链球菌特异性基因16SrRNA、SIP和CFB基因的检测引物和TaqMan探针。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明通过前期对罗非鱼无乳链球菌和其他种属的菌种和病毒的大量研究数据中，挖掘出能够区分罗非鱼无乳链球菌和其他种属的菌种的孤儿基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出其他菌种阳性样品和环境样品中是否含有罗非鱼无乳链球菌，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。

(2)本发明中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。

(3)本发明检测方法与市面上其他的检测方法相比，本发明的检测策略，能够直观的判断罗非鱼无乳链球菌的感染和其他菌种感染，结果更加严谨和准确。

(4)本发明能够实现阳性样本从10¹倍稀释到10⁵倍稀释的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。

(5)本发明检测方法能够应用于养殖水体样本或鳜鱼样品等多方面来源样品筛查和检测，精准地判断出该养殖样品中是否含有罗非鱼无乳链球菌，操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于多种养殖样品和养殖环境样品的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在样本检测和养殖生产中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。

附图说明

图1是16SrRNA基因检测引物标准曲线。

图2的SIP基因检测引物标准曲线。

图3是CFB基因检测引物标准曲线。

图4是实施例1中16SrRNA基因扩增曲线。

图5是实施例1中SIP基因扩增曲线。

图6是实施例1中CFB基因扩增曲线。

图7是实施例2中16SrRNA基因扩增曲线。

图8是实施例2中SIP基因扩增曲线。

图9是实施例2中CFB基因扩增曲线。

图10是实施例3中特异性实验三种基因的扩增曲线。

图11是实施例4中不同稀释倍数下16SrRNA基因的扩增曲线。

图12是实施例4中不同稀释倍数下SIP基因的扩增曲线。

图13是实施例4中不同稀释倍数下CFB基因的扩增曲线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。

表1

在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。

在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出罗非鱼无乳链球菌感染的样本和其他种属菌类感染的样本，从而准确检测并判断出罗非鱼无乳链球菌。

在一些实施方案中，通过对10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍以及10⁵倍稀释的样本进行提取和检测，能够精确检测出不同样本浓度下的罗非鱼无乳链球菌。并且能够保证样本稀释10⁵倍仍然能够准确检出，而更高浓度的微生物样品可以通过稀释至检测区间，同样可以准确检出。

在一些实施方案中，采集包括纯水、健康罗非鱼样本、多份云浮云城罗非鱼样品、多份茂名电白罗非鱼样品以及多份养殖海水样品，通过对特异性基因的检测，能够快速和准确的检验出样品中是否含有罗非鱼无乳链球菌，方便快捷。

本领域技术人员应能理解，本方法中检测的基因和设计的特异性引物，同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。

本发明所描述的用于检测罗非鱼无乳链球菌荧光定量PCR的方法及试剂盒可以广泛应用于罗非鱼样本检测、养殖水体检测等多个检验检疫范畴，能够为罗非鱼养殖、繁殖等提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。

实施例1检测引物扩增标准曲线及质粒灵敏度实验

1.微生物培养

使用LB培养基作为罗非鱼无乳链球菌质粒的培养基，pH7.0～7.4的平板中生长良好。在平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。

2.基因组DNA提取

按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。

3.扩增产物标准品质粒制作

使用源自罗非鱼无乳链球菌提取的DNA，分别以16SrRNA、SIP和CFB基因的引物进行扩增，扩增产物经过加A处理后，使用T4连接酶连入T载体，并且通过转导感受态细胞后，质粒得到大规模扩增。3个基因的引物序列和TaqMan探针序列如SEQ ID NO:1～9所示，具体见表2。

表2

4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置

分别涂板扩增16SrRNA、SIP和CFB基因对应的引物扩增产物的标准品克隆菌，收集单克隆的菌斑，并通过LB培养摇菌过夜扩增，最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株，按照QIAGEN Plasmid Midi Kit说明书指示进行质粒DNA的提取。提取后检测质粒DNA的浓度，并通过10倍稀释的方法，配置7个浓度梯度的标准品，浓度梯度分别为1fg/μL，1×10¹fg/μL，1×10²fg/μL，1×10³fg/μL，1×10⁴fg/μL，1×10⁵fg/μL，1×10⁶fg/μL。

5.检测引物标准曲线绘制

按照TaKaRa Taq PCR Mix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的qPCR扩增，并且绘制对应的扩增曲线，得到每对引物的扩增效率。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表3所示，绘制的标准曲线如图1～3所示。

表3

6.结果分析

检测引物扩增标准曲线结果显示，16SrRNA、SIP和CFB基因对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度R²>0.990，证明引物设计和反应体系是最优状态。分析3个基因的扩增曲线，其中1×10¹fg/μL～1×10⁶fg/μL这6个浓度下测得的CT值均小于35个循环，均达到最优状态的要求，3对引物在该反应条件下能够满足检测要求，说明本方法质粒灵敏度高，且通过3个技术重复实验测得的CT值之间的变异系数小于5.0％，证明本方法重复性高。检测结果如表4～6及图4～6所示。图4～图6为三个基因不同质粒浓度下的扩增曲线，扩增曲线从左到右的浓度依次为1×10⁶fg/μL，1×10⁵fg/μL，1×10⁴fg/μL，1×10³fg/μL，1×10²fg/μL，1×10¹fg/μL，1×10⁰fg/μL。

表4

表5

表6

实施例2质粒重复性实验

1.微生物培养

同实施例1。

2.基因组DNA提取

同实施例1。

3.3个目标基因的qPCR检测

按照TaKaRa Taq PCR Mix说明书指示进行样品的qPCR扩增，并且得到每对引物对应的Ct值读数。本实验的qPCR的反应设置2个浓度分别为1×10⁶fg/μL和1×10⁵fg/μL，每个浓度下分别设置4个生物学重复和5个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表7所示。

表7

4.结果分析

本实施例分析了3个基因的扩增曲线的相关性系数和可信度，以及2个浓度下的扩增效率，测定的CT值均小于35个循环，均达到最优状态的要求，3对引物在该反应条件下能够满足检测要求。每个浓度条件设定4组，每组重复性测定5次，测定结果显示，变异系数均小于5.0％，证明本方法的质粒重复性好，稳定性高。检测结果如表8～10及如图7～9所示，图7～图9为三个基因不同质粒浓度下的重复性实验的扩增曲线，扩增曲线从左到右的浓度依次为1×10⁶fg/μL和1×10⁵fg/μL。

表8

表9

表10

实施例3阳性及阴性样品检测情况

1.微生物培养

同实施例1。

2.基因组DNA提取

同实施例1。

3.3个目标基因的qPCR检测

按照TaKaRa Taq PCR Mix说明书指示进行样品的qPCR扩增，并且得到每对引物对应的Ct值读数。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件同实施例2。

4.结果分析

如表11和图10所示，3对引物的qPCR扩增结果显示，罗非鱼无乳链球菌呈现16SrRNA、SIP和CFB基因的全部阳性结果，而其他属均显示阴性结果。因此，对于罗非鱼无乳链球菌和其他菌属，进行16SrRNA、SIP和CFB基因的检测，能够较好的区分罗非鱼无乳链球菌和其他菌属。综上所述，16SrRNA、SIP和CFB基因的对应引物，能够满足罗非鱼无乳链球菌的检测判断。图1中，扩增曲线从左到右依次为SIP基因、CFB基因以及16SrRNA基因。

表11

实施例4阳性样品的灵敏度

1.样本收集和处理

分别收集健康罗非鱼样本和罗非鱼无乳链球菌阳性样品，其中罗非鱼无乳链球菌阳性样品按照10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍以及10⁵倍进行梯度稀释，按照Qiagen的QIAamp DNAMini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。

2.基因组DNA提取

同实施例1。

3.3个目标基因的qPCR检测

同实施例1。

4.结果分析

如表12和图11～13所示，3对引物的qPCR扩增结果显示，从10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍以及10⁵倍样本的范围内，罗非鱼无乳链球菌阳性样品呈现16SrRNA、SIP和CFB基因的阳性结果。因此，通过进行16SrRNA、SIP和CFB基因的检测，能够较好的达到从10¹倍至10⁵倍的稀释样本范围内的罗非鱼无乳链球菌的检出。同时，从样本稀释10¹倍至10⁵倍的范围内，可以通过16SrRNA、SIP和CFB基因的检测，较好的完成样本中罗非鱼无乳链球菌的检测，检测范围可以跨度至样本稀释10¹倍至10⁵倍，样本中更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内，能够达到预期的检测要求。

图11～13中，图11～图13为三个基因不同阳性样本浓度下的扩增曲线，扩增曲线从左到右的稀释倍数依次为：10¹倍、10²倍、10³倍、10⁴倍以及10⁵倍。

表12

实施例5环境样品的检测

1.环境样品收集和基因组DNA的提取

分别收集纯水样本、健康罗非鱼样本、多份云浮云城罗非鱼样品、多份茂名电白罗非鱼样品以及多份养殖海水样品，按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。

2.3个目标基因的qPCR检测

同实施例2。

3.结果分析

如表13所示，3对引物的qPCR扩增结果显示，除了纯水样本、健康罗非鱼样本、一个云浮云城样品、两个茂名电白样品以及养殖海水样品外，其他样品均检出16SrRNA、SIP和CFB基因，证明相应的样品来源中含有罗非鱼无乳链球菌。最终判断为罗非鱼无乳链球菌阳性的准则为，16SrRNA、SIP和CFB基因中的1个及以上检测得到Ct值小于35个循环。如果16SrRNA、SIP和CFB基因均检测得到Ct值大于35个循环，则判断为罗非鱼无乳链球菌阴性未检出。

表13

以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东美格基因科技有限公司

<120> 用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR方法及相应试剂盒

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 16SrRNA正向引物(Artificial Sequence)

<400> 1

cggttggagc atgtggttta 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 16SrRNA反向引物(Artificial Sequence)

<400> 2

ctaggccggt cagaaggatg t 21

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 16SrRNA探针(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccag 27

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> SIP正向引物(Artificial Sequence)

<400> 4

cgctattatc agtcgcaagt gttc 24

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> SIP反向引物(Artificial Sequence)

<400> 5

aaatcagcct ttacctctga aacagta 27

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> SIP探针(Artificial Sequence)

<400> 6

gcacaagaaa cagatacgac gtggacagc 29

<210> 7

<211> 28

<212> DNA

<213> cfb正向引物(Artificial Sequence)

<400> 7

cggttaatga ggctattact agtgttga 28

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> cfb反向引物(Artificial Sequence)

<400> 8

tcaatcacat ctgttaaggc ttctaca 27

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> cfb探针(Artificial Sequence)

<400> 9

ttaaagactt cattgcgtgc caaccctg 28

Claims

1.用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、收集样品；

S2、提取基因组DNA；

2.根据权利要求1所述的用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述步骤S2中还包括设计16SrRNA、SIP和CFB基因的检测引物和TaqMan探针的步骤。

3.根据权利要求2所述的用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述罗非鱼无乳链球菌特异性基因16SrRNA的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示，TaqMan探针序列如SEQ ID NO:3所示。

4.根据权利要求1所述的用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述罗非鱼无乳链球菌特异性基因SIP的检测引物如SEQ ID NO:4～5所示，TaqMan探针序列如SEQ ID NO:6所示。

5.根据权利要求1所述的用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述罗非鱼无乳链球菌特异性基因CFB的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示，TaqMan探针序列如SEQ ID NO:9所示。

6.根据权利要求1所述的用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的反应体系为25μl，包括2×Taq PCR Mix 12.5μl，total 10uMPrimers Mix 1μl，TaqMan探针0.5μl，DNA input 2μl，H₂O 9μl。

7.根据权利要求1所述的用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR检测的反应条件为95℃预变性2min30s，94℃变性15s，60℃退火30s，采集荧光信号，40个循环。

8.一种用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含所述的罗非鱼无乳链球菌特异性基因16SrRNA、SIP和CFB基因的检测引物和TaqMan探针。