CN104561267A - 检测罗非鱼无乳链球菌的环介导等温扩增反应引物 - Google Patents

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樊海平
吴斌
曾占壮
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Abstract

本发明涉及一种检测罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增的引物，所述引物根据罗非鱼无乳链球菌表面免疫相关基因的保守序列设计，其分别为<i>sip</i>-F3、<i>sip</i>-B3、<i>sip</i>-FIP和<i>sip</i>-BIP。具体序列见SEQ？ID？NO.1、SEQ？ID？NO.2、SEQ？ID？NO.3、SEQ？ID？NO.4。根据所设计的引物能建立一种检测罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增方法。该方法不与水生动物常见的几种病原菌及常见的链球菌属的病原菌发生交叉反应。本发明的检测方法不需要昂贵仪器设备，时间短，操作简单，灵敏度高。

Description

检测罗非鱼无乳链球菌的环介导等温扩增反应引物
技术领域
本发明属于水生动物细菌学领域，具体涉及一种检测罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增反应引物。
背景技术
随着罗非鱼的大量养殖，罗非鱼链球菌病发病率越来越高，其发病面积之广、危害程度之重已成为罗非鱼养殖业发展的重要障碍，造成了养殖户重大的经济损失。在农业部2008年新修订的《一、二、三类动物疫病病种名录》中，鱼类链球菌病被列为三类动物疫病，其主要的病原菌是无乳链球菌和海豚链球菌。目前，国内还没有研发出特效的药物来防控罗非鱼链球菌病。因此，建立一种罗非鱼无乳链球菌快速检测体系，对罗非鱼养殖的快速发展能起到积极的作用。
无乳链球菌（S. agalactiae）又称为B群链球菌（group B Streptococcus,GBS）。无乳链球菌的血清学分类是依据其菌株的荚膜多糖的特异性而展开的。目前已经鉴定出 10种不同的荚膜类型 ( Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VII 和IX)，其中Ia，Ib和III型为目前已确定的水生动物源血清型。另外，有文献报导通过动物实验已证实表面免疫相关蛋白基因（surface immunogenic protein,sip）存在于血清型Ia、Ib、II、III、V和VI中，表明sip基因存在于水生动物源的三种血清型中。因此，sip具有高度的序列保守性，可成为罗非鱼无乳链球菌检测的重要候选基因。
环介导等温扩增技术是一种新颖的恒温核酸扩增方法，该技术具有特异性高，操作简单，肉眼可判断结果的特点，适用于基层水产科研机构及水产养殖场的使用，具有重要实践应用价值。目前，该方法已被广泛应用于病原微生物及寄生虫的检测。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增检测的引物。
为了实现上述发明目的，本发明是采用如下技术方案实施的：
一种检测罗非鱼无乳链球菌环介导等温扩增反应引物，其由1对外引物和一对内引物组成，所述的外引物由引物sip-F3和sip-B3组成，所述的内引物由引物sip-FIP和sip-BIP组成；
其中所述的外引物的序列如下：
sip-F3：5’–AGTTTCTGTTGCAGACC– 3’
sip-B3：5’–CTGAAGTAATCGACTTCACAG– 3’；
其中所述的内引物的序列如下：
sip-FIP：
5’–CGAAACAATCGTTGTTGCTGCTTAAAGTTTCTCTCAATACAATTTCGG– 3’
sip-BIP：
5’–GCGCCAGCTTTGAAATCAAAAGAGCTGGTGATACCTGTTCAT– 3’。
一种如上所述的环介导等温扩增反应引物的应用：在制备罗非鱼无乳链球菌快速诊断试剂中的应用。
本发明是根据无乳链球菌基因组中sip基因序列特征，设计特异性的LAMP检测引物，根据所设计的LAMP引物，建立了检测无乳链球菌环介导等温扩增方法。
本发明的有益效果在于：
1）以本发明所设计的LAMP引物建立的检测无乳链球菌环介导等温扩增方法，不与水生动物常见的几种病原菌及常见的链球菌属的病原菌发生非特异性反应，不需要昂贵仪器设备，时间短，操作简单，灵敏度高，具有显著的经济效益；
2）以本发明引物所建立的LAMP检测方法能在60分钟内检测出30个菌落数/mL的无乳链球菌；同时，在本发明的LAMP反应体系中，加入了一种绿色荧光染料SYBP Green I，该染料在反应液配置时加入，反应结束后，无需开盖，直接根据颜色变化进行结果判定，能有效的降低污染的可能性。
具体实施方法
本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。
实施例1
1、LAMP实验引物设计
根据GenBank公布的无乳链球菌sip基因序列与本实验室从我省发病渔场中分离的无乳链球菌相比较，选择sip基因前段保守序列，用Primer Explorer IV软件分析设计引物，分别为sip-F3、sip-B3、sip-FIP和sip-BIP，具体序列见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2 、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。
 2．菌株
包括2株罗非鱼无乳链球菌株（患病罗非鱼分离菌），8株其它链球菌属菌株（海豚链球菌、停乳链球菌、2株II型猪链球菌、牛链球菌、马肠链球菌、酿脓链球菌、嗜热链球菌等）及6株水体常见菌株（嗜水气单胞菌、枯草芽孢杆菌、2株豚鼠气单胞菌、2株大肠杆菌）。
 3．细菌DNA提取
无乳链球菌接种脑心浸液培养基(BHI)，28℃过夜培养，采用细菌DNA提取试剂盒（购买于泰京生物技术公司）提取DNA，-20℃保存备用。
 4．LAMP反应体系
LAMP反应体系为 25μL。其中F3与B3(50μmolL-1 )各0.1 μL、FIP与BIP(50μmolL-1 )各0.4μL、1.0 μL Bst DNA 聚合酶(8 UL-1 )、2.5 μL 10×Bst buffer、3.0 μL Mg2+(25 μmolL-1)、3.0 μL dNTPs (10 μmolL-1 )、2.5μL甜菜碱（8 M）、10.0μL灭菌蒸馏水、1μL SYBR Green I（稀释100倍）、1.0μLDNA模板。混匀后将反应液放入恒温水浴锅，61℃反应60 min。观察颜色变化。
 5．LAMP特异性实验
提取8株链球菌属和6株水体常见病原菌的DNA，反应产物。
 6．LAMP灵敏度实验
无乳链球菌接种脑心浸液固体培养基(BHI)纯培养后，用灭菌的生理盐水洗脱，洗脱液进行10倍倍比稀释，各取每个稀释度的菌液l mL，用试剂盒提取DNA后进行LAMP扩增。
实验结果
1．LAMP特异性实验
LAMP扩增产物荧光显色结果，2株无乳链球菌的反应组颜色变为绿色，其它14株非无乳链球菌保持橙色未变，证明本方法具有良好的特异性。
2．LAMP灵敏度实验
经平板计数，原始无乳链球菌菌液浓度为 3.0×108 CFU·mL-1。10倍倍比稀释菌液并提取DNA进行LAMP检测。电泳检测结果显示，当菌液稀释到3.0×10  CFU·mL-1时仍可见梯状扩增产物，LAMP法检测灵敏度达30CFU·mL-1。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
  SEQUENCE LISTING
 
<110>  福建省淡水水产研究所
 
<120>   检测罗非鱼无乳链球菌的环介导等温扩增反应引物
 
<130>  4
 
<160>  4    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  17
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
agtttctgtt gcagacc                                                    17
 
 
<210>  2
<211>  21
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2
ctgaagtaat cgacttcaca g                                               21
 
 
<210>  3
<211>  48
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3
cgaaacaatc gttgttgctg cttaaagttt ctctcaatac aatttcgg                  48
 
 
<210>  4
<211>  42
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4
gcgccagctt tgaaatcaaa agagctggtg atacctgttc at                        42
 
 

Claims (2)

1.一种检测罗非鱼无乳链球菌的环介导等温扩增反应引物，其特征在于：由一对外引物和一对内引物组成，所述的外引物由引物sip-F3和sip-B3组成，所述的内引物由引物sip-FIP和sip-BIP组成；
sip-F3：5’–AGTTTCTGTTGCAGACC–3’，
sip-B3：5’–CTGAAGTAATCGACTTCACAG–3’，
sip-FIP：
5’-CGAAACAATCGTTGTTGCTGCTTAAAGTTTCTCTCAATACAATTTCGG–3’，
sip-BIP：
5’–GCGCCAGCTTTGAAATCAAAAGAGCTGGTGATACCTGTTCAT–3’。
2.一种如权利要求1所述的检测罗非鱼无乳链球菌的环介导等温扩增反应引物的应用，其特征在于：在制备罗非鱼无乳链球菌快速诊断试剂中的应用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104726567A (zh) * 2015-03-04 2015-06-24 广西壮族自治区水产科学研究院 一种无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN106893770A (zh) * 2016-12-26 2017-06-27 何凤屏 一种用于检测b族链球菌rna的试剂盒及方法
CN111485028A (zh) * 2019-01-29 2020-08-04 广东美格基因科技有限公司 用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量pcr方法及相应试剂盒
CN116411099A (zh) * 2023-02-17 2023-07-11 东莞市动物疫病预防控制中心 ddPCR检测罗非鱼无乳链球菌的引物、探针和方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102888458A (zh) * 2012-09-27 2013-01-23 广西工学院 一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102888458A (zh) * 2012-09-27 2013-01-23 广西工学院 一种罗非鱼源无乳链球菌的高灵敏度快速检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
黄锦炉等: "无乳链球菌三重PCR快速检测方法的建立与应用", 《海洋与湖沼》, vol. 43, no. 2, 31 March 2012 (2012-03-31) *
黎炯等: "罗非鱼无乳链球菌Sip基因的克隆、表达及免疫原性分析", 《水生生物学报》, vol. 36, no. 4, 31 July 2012 (2012-07-31), pages 626 - 633 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104726567A (zh) * 2015-03-04 2015-06-24 广西壮族自治区水产科学研究院 一种无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN106893770A (zh) * 2016-12-26 2017-06-27 何凤屏 一种用于检测b族链球菌rna的试剂盒及方法
CN111485028A (zh) * 2019-01-29 2020-08-04 广东美格基因科技有限公司 用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量pcr方法及相应试剂盒
CN116411099A (zh) * 2023-02-17 2023-07-11 东莞市动物疫病预防控制中心 ddPCR检测罗非鱼无乳链球菌的引物、探针和方法

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