CN109486972A - 一种用于检测铜绿假单胞菌的cpa引物组、cpa核酸试纸条试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种用于检测铜绿假单胞菌的CPA引物组、CPA核酸试纸条试剂盒及其应用，属于生物技术领域。该CPA引物组的序列如SEQ ID NO：16～20所示；该CPA引物组不需要通过温度循环变化来扩增，在62℃的单一温度扩增30～60min就能将靶基因大量扩增，操作简单，反应时间短。本发明还提供一种包括上述CPA引物组和核酸检测试纸条的试剂盒。本发明的恒温反应所得产物用一次性核酸检测试纸条检测后直接判读结果；出现检测线和质控线两条红色条带判读为阳性结果；试剂盒操作简单、成本低廉、反应结果易于观察、特异性好、灵敏度高，尤其适用于户外以及基层医疗单位的检验分析，易于推广应用。

Description

一种用于检测铜绿假单胞菌的CPA引物组、CPA核酸试纸条试 剂盒及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种用于检测铜绿假单胞菌的CPA引物组、CPA核酸试纸条试剂盒及其应用。
背景技术
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)又称绿脓杆菌，本菌是一种常见的人兽共患的条件致病菌，属于假单胞菌属的一种革兰氏阴性菌，广泛存在于水、植物、土壤等潮湿的自然环境中，同时也是医院内最常见的病原菌之一，正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有本菌存在，患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及烧伤患者和免疫受损患者易感染本菌，甚至导致死亡。另一方面，现在几乎从所有动物中分离到了致病性PA，在这些发病的各种动物中，以鸡的分离率最高，可见其对养殖业的危害。
传统的细菌分离和鉴定所需时间过长，不能满足快速诊断的要求；PCR、荧光定量PCR等分子生物学检测方法对仪器设备要求较高，不利于基层单位使用；现有PA的LAMP检测方法虽对仪器设备要求不高，但却极易存在假阳率高、弱阳性结果判别不够准确，且容易受气溶胶污染。
交叉引物恒温扩增(Cross Priming Amplification，CPA)技术是由杭州优思达生物公司研发，近年来发展比较迅速的一种快速检测方法，是中国首个具有自主知识产权的体外核酸扩增技术。根据体系中交叉引物数量的不同，这种技术可以分为单交叉扩增(Single crossing CPA)和双交叉扩增(Double crossing CPA)两种。本发明属于单交叉扩增，扩增体系主要包括交叉引物、剥离引物、探针，以及具有链置换功能的DNA聚合酶等。CPA技术具有特异性高、敏感性强的特征，同时不需昂贵仪器，操作过程更加简便快速，在55～65℃恒温对核酸进行指数级扩增；整个反应只需30～60min，扩增产物用一次性核酸检测试纸条检测，且闭管操作，使结果判定直观、客观，且可有效避免气溶胶污染，已被推广用于感染性疾病的诊断和病原体的检测。目前，国内外尚未见采用CPA 技术检测PA的报道。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种用于检测铜绿假单胞菌的CPA引物组；
本发明的另一目的在于提供一种用于检测铜绿假单胞菌的CPA核酸试纸条试剂盒。
本发明的再一目的在于提供上述CPA引物组或CPA核酸试纸条试剂盒的应用。
本发明丰富了PA的检测方法，且具有高灵敏度、高特异性、可视化、操作简单。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种用于检测铜绿假单胞菌的CPA引物组，包含如下引物：
引物 引物序列(5'-3')
F3 CGGTTTTCAACAGGTCGTGA
B3 GCCACTCCAAAGAAACCGAA
B2 TGACCGCTACCGAAGACG
B1 CGAAGCCTATCGCAAGGCTGA
CPF TGACCGCTACCGAAGACGTTGCGGCTGGCTTTTTCC
其中，引物B1的5'端标记FAM，引物B2的5'端标记Biotin。
所述的用于检测铜绿假单胞菌的CPA引物组在制备用于CPA检测铜绿假单胞菌试剂盒、扩增反应试剂中的应用。
一种用于检测铜绿假单胞菌的CPA核酸试纸条试剂盒，包括上述CPA引物组和核酸检测试纸条。
所述的核酸检测试纸条为通用型一次性核酸检测试纸条；
所述的用于检测铜绿假单胞菌的CPA核酸试纸条试剂盒，包含上述CPA引物组和全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置；
所述的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为杭州优思达生物技术有限公司产品，该检测装置将通用型一次性核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到；
所述的用于检测铜绿假单胞菌的CPA核酸试纸条试剂盒，还包括：Betaine 溶液、Mg2+溶液、dNTPs混合物溶液、Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)、反应缓冲液；
更优选的，所述的试剂盒包含10×反应缓冲液(10×ThermoPol Buffer)、浓度为5mol·L-1的Betaine溶液、浓度为10mmol·L-1的dNTPs混合物溶液、浓度为100mmol·L-1的MgSO4溶液、浓度为8U·μL-1的Bst DNA polymerase、浓度为10μmol·L-1的引物CPF、浓度为10μmol·L-1的引物B1、浓度为10μmol·L-1的引物B2、浓度为10μmol·L-1的引物B3、浓度为10μmol·L-1的引物F3；
所述的用于检测铜绿假单胞菌的CPA核酸试纸条试剂盒在鉴定和/或检测铜绿假单胞菌中的应用。
一种鉴定和/或非诊断性检测铜绿假单胞菌的方法，包括下步骤：
(1)配置CPA反应体系，见下表：
组分 用量(μL) 终浓度
10×ThermoPol Buffer 2.5 1×/μL
5mol·L<sup>-1</sup>Betaine 2.0 0.4mol·L<sup>-1</sup>
10mmol·L<sup>-1</sup>dNTPs 1.75 0.7mmol·L<sup>-1</sup>
100mmol·L<sup>-1</sup>Mg<sup>2+</sup> 1.0 4.0mmol·L<sup>-1</sup>
8U·μL<sup>-1</sup>Bst DNA polymerase 1.0 0.32U·μL<sup>-1</sup>
10μmol·L<sup>-1</sup>CPF 2.5 1.0μmol·L<sup>-1</sup>
10μmol·L<sup>-1</sup>B1 2.0 0.8μmol·L<sup>-1</sup>
10μmol·L<sup>-1</sup>B2 2.0 0.8μmol·L<sup>-1</sup>
10μmol·L<sup>-1</sup>B3 1.5 0.6μmol·L<sup>-1</sup>
10μmol·L<sup>-1</sup>F3 1.5 0.6μmol·L<sup>-1</sup>
模板 1.0 /
ddH<sub>2</sub>O 补足至25μL /
所述的模板为待检测样品DNA或待检测样品菌悬液；
(2)反应：将步骤(1)的CPA反应体系62℃恒温反应30～60min(优选为45min)，得到的产物用核酸检测试纸条检测，5～10min后观察结果；
(3)结果判读，直接肉眼观察
1)阳性(+)：
试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区(C线)，一条位于检测区(T 线)；
2)阴性(-)：
试纸条质控区(C线)出现一条红色条带，检测区(T线)没有条带；
3)无效：
试纸条质控区(C线)和检测区(T线)均未出现条带。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明以5条精确设计的引物及探针严格识别靶核苷酸序列上的5个独立区域，从而避免反应混合物中存在非靶序列的影响，特异性高。
(2)本发明的扩增模板最低为118拷贝，比常规PCR灵敏100倍。
(3)本发明的CPA引物组不需要通过温度循环变化来扩增，在62℃的单一温度扩增30～60min就能将靶基因大量扩增，操作简单，反应时间短。
(4)本发明所需的设倍简单，不需要PCR仪，也不需要凝胶成像系统，只需一台普通水浴锅或金属浴，即使在基层实验室和医疗机构也可使用。
(5)本发明的扩增产物通过一次性核酸检测试纸条检测，使结果判定直观、客观，且可有效避免气溶胶污染。
(6)本发明的恒温反应所得产物用一次性核酸检测试纸条检测后直接判读结果；出现检测线和质控线两条红色条带判读为阳性结果；试剂盒操作简单、成本低廉、反应结果易于观察、特异性好，尤其适用于户外以及基层医疗单位的检验分析，易于推广应用。
附图说明
图1是实施例1中引物组4的CPA产物通过琼脂糖凝胶电泳的结果；其中， M为DNAmarker；P为CPA阳性反应；N为阴性对照。
图2是实施例1中引物组4的引物及探针在基因组中具体位置。
图3是实施例1中不同浓度引物及比例对CPA效果的影响；其中，M为 DNA Marker；1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23泳道分别为引物浓度组合1～12；2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24泳道分别为引物浓度组合1～12的阴性对照。
图4是实施例1中不同Betaine(甜菜碱)浓度对CPA效果的影响；其中，泳道M为DNAMarker；1为1.4mol·L-1的甜菜碱；3为1.2mol·L-1的甜菜碱；5 为1.0mol·L-1的甜菜碱；7为0.8mol·L-1的甜菜碱；9为0.6mol·L-1的甜菜碱； 11为0.4mol·L-1的甜菜碱；13为0.2mol·L-1的甜菜碱；15为0mol·L-1的甜菜碱； 2、4、6、8、10、12、14、16别为1、3、5、7、9、11、13、15的阴性对照。
图5是实施例1中不同MgSO4浓度对CPA效果的影响；其中，M为DNA Marker；1为8mmol·L-1的MgSO4；3为7mmol·L-1的MgSO4；5为6mmol·L-1的MgSO4；7为5mmol·L-1的MgSO4；9为4mmol·L-1的MgSO4；11为3mmol·L-1的MgSO4；13为2mmol·L-1的MgSO4；15为1mmol·L-1的MgSO4；2、4、6、 8、10、12、14、16别为1、3、5、7、9、11、13、15的阴性对照。
图6是实施例1中不同dNTPs浓度对CPA效果的影响；其中，M为DNA Marker；1为0.3mmol·L-1的dNTPs混合液；3为0.4mmol·L-1的dNTPs混合液； 5为0.5mmol·L-1的dNTPs混合液；7为0.6mmol·L-1的dNTPs混合液；9为0.7 mmol·L-1的dNTPs混合液；11为0.8mmol·L-1的dNTPs混合液；13为0.9mmol·L-1的dNTPs混合液；15为1mmol·L-1的dNTPs混合液；2、4、6、8、10、12、14、 16别为1、3、5、7、9、11、13、15的阴性对照。
图7是实施例1中不同用量Bst DNA聚合酶对CPA效果的影响；其中，M 为DNAMarker；1为0.2μL的Bst DNA聚合酶；3为0.4μL的Bst DNA聚合酶； 5为0.6μL的Bst DNA聚合酶；7为0.8μL的Bst DNA聚合酶；9为1.0μL的 Bst DNA聚合酶；11为1.2μL的Bst DNA聚合酶；13为1.4μL的Bst DNA聚合酶；15为0μL的Bst DNA聚合酶；2、4、6、8、10、12、14、16别为1、3、5、7、9、11、13、15的阴性对照。
图8是实施例1中不同温度对CPA效果的影响；其中，M为DNA Marker； 1为54℃；3为55℃；5为56℃；7为57℃；9为58℃；11为59℃；13为60℃； 15为61℃；17为62℃；19为63℃；21为64℃；23为65℃；2、4、6、8、10、 12、14、16、18、20、22、24分别为1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、 21、23的阴性对照。
图9是实施例1中不同反应时间对CPA效果的影响；其中，M为DNA Marker；1为扩增90min时的阴性对照；2为15min的反应时间；3为30min的反应时间；4为45min的反应时间；5为60min的反应时间；6为75min的反应时间；7为90min的反应时间；
图10是实施例2中PA的CPA引物的特异性检测通过琼脂糖凝胶电泳的结果；其中，M为DNA marker；1为阴性对照；2为PA的CPA引物对PA菌体 DNA反应后通过琼脂糖凝胶电泳的结果；3为PA的CPA引物对PA oprI阳性质粒DNA反应后通过琼脂糖凝胶电泳的结果；4为PA的CPA引物对PA菌悬液反应后通过琼脂糖凝胶电泳的结果；5为PA的CPA引物对SE菌株反应后通过琼脂糖凝胶电泳的结果；6为PA的CPA引物对E.coli菌株反应后通过琼脂糖凝胶电泳的结果；7为PA的CPA引物对SA菌株反应后通过琼脂糖凝胶电泳的结果；8为PA的CPA引物对MG反应后通过琼脂糖凝胶电泳的结果；9为PA的 CPA引物对ALV毒株反应后通过琼脂糖凝胶电泳的结果。
图11是实施例2中不同浓度的PA的阳性质粒DNA模板的CPA产物通过琼脂糖凝胶电泳的结果；其中，1～12分别为1.18×1011～1.18拷贝/管的阳性质粒的CPA产物通过琼脂糖凝胶电泳的结果；13为阴性对照；M为DNA marker。
图12是实施例2中不同浓度的PA的阳性质粒DNA模板的常规PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳的结果；其中，1～12分别为1.18×1011～1.18拷贝/管的阳性质粒的常规PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳的结果；13为阴性对照；M为DNA marker。
图13是实施例2中不同浓度的PA的菌悬液的CPA产物通过琼脂糖凝胶电泳的结果；其中，1～12分别为4.4×104～4.4×10-7CFU·mL-1的菌悬液的CPA产物通过琼脂糖凝胶电泳的结果；13为阴性对照；M为DNA marker。
图14是实施例2中不同浓度的PA的菌悬液的常规PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳的结果；其中，1～12分别为4.4×104～4.4×10-7CFU·mL-1的菌悬液的常规PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳的结果；13为阴性对照；M为DNA marker。
图15是实施例3中PA的CPA产物用一次性核酸检测试纸条检测的结果；
图16是实施例3中PA的CPA引物的特异性检测用一次性核酸检测试纸条检测的结果；其中，1为阴性对照；2为PA的CPA引物对PA菌体DNA反应后用一次性核酸检测试纸条检测的结果；3为PA的CPA引物对PA oprI阳性质粒 DNA反应后用一次性核酸检测试纸条检测的结果；4为PA的CPA引物对PA菌悬液反应后用一次性核酸检测试纸条检测的结果；5为PA的CPA引物对SE菌株反应后用一次性核酸检测试纸条检测的结果；6为PA的CPA引物对E.coli菌株反应后用一次性核酸检测试纸条检测的结果；7为PA的CPA引物对SA菌株反应后用一次性核酸检测试纸条检测的结果；8为PA的CPA引物对MG反应后用一次性核酸检测试纸条检测的结果；9为PA的CPA引物对ALV毒株反应后用一次性核酸检测试纸条检测的结果。
图17是实施例3中不同浓度的PA的阳性质粒DNA模板的CPA产物用一次性核酸检测试纸条检测的结果；其中，1～12分别为1.18×1011～1.18拷贝/管的阳性质粒的CPA产物用一次性核酸检测试纸条检测的结果；13为阴性对照。
图18是实施例3中不同浓度的PA的菌悬液浓度的CPA产物用一次性核酸检测试纸条检测的结果；其中，1～12分别为4.4×104～4.4×10-7CFU·mL-1的菌悬液的CPA产物用一次性核酸检测试纸条检测的结果；13为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
实施例中所涉及的材料、试剂和仪器：
(1)铜绿假单胞菌为铜绿假单胞菌ATCC27853、大肠杆菌为大肠杆菌 ATCC25922、沙门氏菌为沙门氏菌CMCC50335、金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌CMCC26003，均购自环凯微生物科技有限公司；鸡毒支原体为鸡毒支原体 CVCC353、禽白血病病毒为禽白血病病毒CVCC AV228，均购自中国兽医药品监察所；Bst DNA polymerase、Reaction Buffer、dNTP混合液及 MgSO4为NEB公司产品；Betaine为Sigma产品；一次性核酸检测试纸条为杭州优思达生物技术有限公司产品；SQ Tissue组织DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒DNA Gel Extraction Kit为OMEGA公司产品。
(2)仪器：
ZHJH-C1214C超净工作台 苏州净化设备有限公司
DK-8D型电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司
GDS8000PC凝胶成像及分析系统 UVP公司
ND-1000分光光度计 NanoDrop公司
T3000 Thermocycler PCR仪 Whatman Biometra公司
微量可调移液器 德国Eppendorf公司
Power PacTM基础电泳仪 BIO-RAD公司
普通离心机 德国Eppendorf公司
实施例1
一、CPA引物设计
根据NCBI数据库中已知的铜绿假单胞菌的外膜蛋白基因oprI基因序列 (GenBank登录号X58714.1)，针对其中特异且保守区域，用在线软件PrimerExpolrer(http://primerexplorer.jp/e/)、Primer Premier 5.0及Oligo7软件设计了5组CPA反应的引物及探针。其中包括两条外引物F3(正向外引物)和B3 (反向外引物)，一条交叉扩增引物CPF由两条短引物B2和F2组成，还有两条检测探针B1(5'端标记FAM)和B2(5'端标记Biotin)。
引物探针名称及序列见表1。F3与B3同时也做为克隆引物和普通PCR引物使用。送交生工生物工程(上海)股份有限公司合成，稀释为10μmol·L-1备用。
表1 CPA引物和探针序列
二、CPA反应
1、阳性质粒DNA的提取及定量
将铜绿假单胞菌ATCC27853复苏培养后，挑取单菌落到5mL LB肉汤中， 37℃培养16～24h后，取1mL菌液按照DNA试剂盒说明书提取菌体DNA，用引物F3、B3扩增目的基因片段，常规PCR扩增体系及反应条件如下：rTaq酶 10μL、10μmol·L-1的上下游引物各1μL、DNA模板1μL、去离子水补足至20μL。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸45s， 30个循环；72℃后延伸8min。反应产物经2％琼脂糖凝胶电泳，然后胶回收纯化目的片段，并克隆到pMD-18T载体上，16℃连接过夜，连接产物转化到DH5α感受态细胞中，涂布在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板培养基上，倒置37℃培养12～16h，形成单菌落。无菌操作挑选3个白色菌落扩大培养，使用菌液PCR 法验证，阳性者送去生工生物工程(上海)股份有限公司测序，确认T载体中插入片段的长度大小及准确性，并按质粒抽提试剂盒制备PA阳性质粒DNA。利用分光光度计检测DNA质量及纯度，计算拷贝数，-20℃保存备用。
2、CPA反应体系的建立及条件优化
1)反应体系参考Xu等建立的CPA体系(Xu,G.,et al.,Cross primingamplification:mechanism and optimization for isothermal DNA amplification.SciRep,2012.2:p.246.)，用无菌ddH2O水作为阴性对照，以提取的1.18×1011拷贝·μL-1质粒DNA作为阳性模板，在60℃下恒温扩增60min。扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳进行检测。若阴、阳性结果成立，则该基础反应体系可用于后续优化：按照表2对不同浓度引物组合进行优化，其他试剂工作浓度不变，每个组合均设阴性对照。选取最优浓度引物组合，采用控制变量法，对扩增体系中的Betaine浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Bst DNA聚合酶浓度、扩增温度和扩增时间进行优化，确定最佳反应体系和条件。
根据实验结果发现引物组1、2、3、5的阴、阳性反应结果不成立，其阴、阳性也能扩增出梯形条带，说明引物本身能发生非特异性扩增；或者阴阳性均不能扩增出梯形条带，表面引物无法对目的基因进行扩增，无法实现检测，被淘汰掉。而只有引物组4能满足CPA反应体系阴、阳性结果成立的基本条件(图1)，因此下文中所进行的优化和一系列研究都以引物组4为基础，其扩增目的基因片段为214bp，引物及探针在基因组中具体位置见图2。
反应体系优化实验结果表明，最佳引物浓度为浓度组合8(图3)，最优 Betaine浓度为0.4mol·L-1(图4)；最优Mg2+浓度为4mmol·L-1(图5)；最优 dNTPs浓度为0.8mmol·L-1(图6)；最优Bst DNA聚合酶为1μL/体系(图7)；最佳反应温度为62℃(图8)；最佳反应时间45min(图9)。最终确定的优化的检测体系如表3所示。
表2不同引物浓度组合
表3交叉引物恒温扩增的反应体系及条件
实施例2
一、CPA反应特异性分析
按照DNA提取试剂盒说明书提取沙门氏菌(SE)、大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球菌(SA)、鸡毒支原体(MG)、禽白血病病毒(ALV)的核酸，用建立的CPA检测方法用以上核酸作为模板进行扩增，来验证该CPA引物的特异性。结果如图10所示，通过琼脂糖凝胶电泳及核酸试纸条检测显示，PA的CPA引物只能特异性的检测出PA，对其他病原微生物无反应。
二、CPA反应灵敏度分析
(1)阳性质粒DNA灵敏度检测
将制备的阳性质粒DNA进行10倍倍比稀释，对每个稀释梯度进行CPA方法和常规PCR(引物F3、B3)进行检测，检测结果显示：当质粒DNA浓度在 1.18×102～1.18×1011拷贝·μL-1时均有大量扩增；在1.18～1.18×101拷贝·μL-1时，没有出现扩增产物(图11)，即建立的CPA检测方法最低检测限为1.18×102拷贝。常规PCR扩增结果显示，仅在1.18×104～1.18×1011拷贝·μL-1时有扩增目的条带(图12)，故常规PCR的检测限为1.18×104拷贝，可见建立的PA-CPA比常规PCR灵敏100倍。
(2)菌悬液灵敏度检测
将LB琼脂培养基上的PA单菌落接种到1mL的LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养8h后，将其进行10倍倍比稀释，并取各稀释梯度的菌液分别涂布于LB琼脂培养基，一个梯度做3个重复，37℃培养16～24h后，进行细菌计数。计数时以细菌量在30～300个范围内的稀释梯度为准。得到原始菌液浓度为4.4×104CFU·mL-1。对该菌液进行10倍倍比稀释，对每个稀释梯度进行CPA 方法和常规PCR(引物F3、B3)进行检测。
检测结果显示：当菌液浓度在4.4×101～4.4×104CFU·mL-1时，均有大量扩增；在4.4～4.4×10-7CFU·mL-1时，没有出现扩增产物(图13)，即建立的CPA 检测方法最低检测限的菌液浓度为4.4×101CFU·mL-1，因为每个体系加入了1μL 菌液，故其最低检测限为0.044CFU。常规PCR扩增结果显示，仅在4.4×103～ 4.4×104CFU·mL-1时，扩增有目的条带(图14)，故常规PCR的检测限的菌液浓度为4.4×103CFU·mL-1，因为每个体系加入了1μL菌液，故其最低检测限为4.4CFU，可见建立的PA-CPA比常规PCR灵敏100倍。
实施例3
可视化试纸条检测
将“实施例1、实施例2”中的CPA扩增产物放入一次性核酸检测装置中， 5～10min后肉眼判读结果。
(1)结果判读，直接肉眼观察
1)阳性(+)：
试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区(C线)，一条位于检测区(T 线)；
2)阴性(-)：
试纸条质控区(C线)出现一条红色条带，检测区(T线)没有条带；
3)无效：
试纸条质控区(C线)和检测区(T线)均未出现条带。
(2)PA-CPA基础反应结果(图15)、特异性检测结果(图16)、灵敏度检测结果(图17、图18)均与琼脂糖凝胶电泳结果一致。可见，本发明提供的检测铜绿假单胞菌的CPA核酸试纸条试剂盒特异性强、灵敏度高、操作简单、快速，结果判读直观，易于检测，无需电泳。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南农业大学
<120> 一种用于检测铜绿假单胞菌的CPA引物组、CPA核酸试纸条试剂盒及其应用
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合1-F3
<400> 1
agccactcca aagaaaggg 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合1-B3
<400> 2
gcacgctggt tagcctcg 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合1-B2
<400> 3
cggtctgctg agctttctga g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合1-B1
<400> 4
cgaagcctat cgcaaggctg a 21
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合1-CPF
<400> 5
cggtctgctg agctttctga ggctcgtctg accgctaccg 40
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合2-F3
<400> 6
actagcactt gggatcctt 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合2-B3
<400> 7
ggcacggatc catctctgg 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合2-B2
<400> 8
cagcatgtca aggccagg 18
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合2-B1
<400> 9
cgaattaaac cacatgctc 19
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合2-CPF
<400> 10
cagcatgtca aggccagggc agctaacgcg ataagtcg 38
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合3-F3
<400> 11
actagccgtt ccagatcctt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合3-B3
<400> 12
ggcatacaat ccatctctgg 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合3-B2
<400> 13
cagcatgtca aggccagg 18
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合3-B1
<400> 14
cgaattaaac cacatgctc 19
<210> 15
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合3-CPF
<400> 15
cagcatgtca aggccagggc agctaacgcg ataagtcg 38
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合4-F3
<400> 16
cggttttcaa caggtcgtga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合4-B3
<400> 17
gccactccaa agaaaccgaa 20
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合4-B2
<400> 18
tgaccgctac cgaagacg 18
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合4-B1
<400> 19
cgaagcctat cgcaaggctg a 21
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合4-CPF
<400> 20
tgaccgctac cgaagacgtt gcggctggct ttttcc 36
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合5-F3
<400> 21
gaaggatccc ataactagaa ct 22
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合5-B3
<400> 22
ttctttacgc aacttgagag g 21
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合5-B2
<400> 23
gtgcaaaagt aagaataatc acaga 25
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合5-B1
<400> 24
atgggtgcag atgtttat 18
<210> 25
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 组合5-CPF
<400> 25
gtgcaaaagt aagaataatc acagactata gcgaatttat tatgc 45

Claims (10)

1.一种用于检测铜绿假单胞菌的CPA引物组，其特征在于：包含如下引物：
F3：5'-CGGTTTTCAACAGGTCGTGA-3'；
B3：5'-GCCACTCCAAAGAAACCGAA-3'；
B2：5'-TGACCGCTACCGAAGACG-3'；
B1：5'-CGAAGCCTATCGCAAGGCTGA-3'；
CPF：5'-TGACCGCTACCGAAGACGTTGCGGCTGGCTTTTTCC-3'；
其中，引物B1的5'端标记FAM，引物B2的5'端标记Biotin。
2.权利要求1所述的用于检测铜绿假单胞菌的CPA引物组在制备用于CPA检测铜绿假单胞菌试剂盒、扩增反应试剂中的应用。
3.一种用于检测铜绿假单胞菌的CPA核酸试纸条试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的CPA引物组和核酸检测试纸条。
4.一种用于检测铜绿假单胞菌的CPA核酸试纸条试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的CPA引物组和全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置；
所述的全封闭式靶核酸扩增物快速检测装置为将核酸检测试纸条置入一个掌上塑料检测装置内得到。
5.根据权利要求3或4所述的用于检测铜绿假单胞菌的CPA核酸试纸条试剂盒，其特征在于：
所述的核酸检测试纸条为通用型一次性核酸检测试纸条。
6.根据权利要求3或4所述的用于检测铜绿假单胞菌的CPA核酸试纸条试剂盒，其特征在于：
还包括：Betaine溶液、Mg2+溶液、dNTPs混合物溶液、Bst DNA polymerase、反应缓冲液。
7.根据权利要求6所述的用于检测铜绿假单胞菌的CPA核酸试纸条试剂盒，其特征在于：包含10×反应缓冲液、浓度为5mol·L-1的Betaine溶液、浓度为10mmol·L-1的dNTPs混合物溶液、浓度为100mmol·L-1的MgSO4溶液、浓度为8U·μL-1的Bst DNA polymerase、浓度为10μmol·L-1的引物CPF、浓度为10μmol·L-1的引物B1、浓度为10μmol·L-1的引物B2、浓度为10μmol·L-1的引物B3、浓度为10μmol·L-1的引物F3。
8.权利要求3～7任一项所述的用于检测铜绿假单胞菌的CPA核酸试纸条试剂盒在鉴定和/或检测铜绿假单胞菌中的应用。
9.一种鉴定和/或非诊断性检测铜绿假单胞菌的方法，其特征在于：包括下步骤：
(1)配置CPA反应体系：
所述的模板为待检测样品DNA或待检测样品菌悬液；
(2)反应：将步骤(1)的CPA反应体系62℃恒温反应30～60min，得到的产物用核酸检测试纸条检测，5～10min后观察结果；
(3)结果判读，直接肉眼观察：
1)阳性(+)：
试纸条出现两条红色条带，一条位于质控区，一条位于检测区；
2)阴性(-)：
试纸条质控区出现一条红色条带，检测区没有条带；
3)无效：
试纸条质控区和检测区均未出现条带。
10.根据权利要求9所述的鉴定和/或非诊断性检测铜绿假单胞菌的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的恒温反应的条件为62℃恒温反应45min。
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