CN110470839A - 一种检测铜绿色假单胞菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测铜绿色假单胞菌的方法，包括以下步骤：（1）制备检测线包被铜绿色假单胞菌抗体、质控线包被羊抗鼠IgG抗体的试纸条；（2）在试纸条检测区域下方放置磁铁；（3）检测铜绿色假单胞菌含量。该发明中所使用的金磁纳米颗粒（Fe3O4@AuNPs）既用于在样品预处理步骤中富集铜绿色假单胞菌，又在随后的免疫层析检测中用于构建信号探针，减少了操作步骤，降低了成本。本发明的试纸条具有检测限低、特异性好、成本低廉、检测时间短等优势，能够满足现场快速检测的需求，适用于液体样品中致病菌及各种有毒有害物质的检测，极具实用价值。

Description

一种检测铜绿色假单胞菌的方法
技术领域
本发明属于分析检测领域，具体涉及一种检测铜绿色假单胞菌的方法。
背景技术
铜绿色假单胞菌，是威胁人类健康的主要病原菌之一。由于其广泛存在于广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，由其引发的疾病往往人群数量多，分布广，给食品安全和人们健康带来巨大的威胁。因此，食品中铜绿色假单胞菌的检测具有非常重要的意义。
目前常用的检测食源性致病菌的方法主要有平板计数法、聚合酶链锁反应法、环介导等温扩增法、酶联免疫吸附测定法、免疫磁性纳米颗粒分离法、荧光免疫分析法、颜色传感器等。这些检测方法通常需要对样品进行分离、纯化培养、富集，步骤繁多、实验周期长，致使整个检测过程费时费力，不能满足现场快速高通量检验的需要。
免疫层析是近年来兴起的一种新型快速检测技术。凭借其简单易用、低成本、检测快速等优势，免疫层析技术迅速得到了人们的接受和认可。随着检测技术的进步，免疫层析已经从最初的定性检测，发展到现在的半定量、定量检测。多个检测指标也可以集成在单个试纸条内，只需一次即可完成多个目标物的检测。然而，传统的基于胶体金的免疫层析技术存在灵敏度低的缺陷，极大限制了其应用的广度和商业化的可能性。因此，采用新策略克服免疫层析技术灵敏度低的瓶颈问题，对于拓展其应用范围，提高其实用性就变得尤为必要。
发明内容
为了解决这一阻碍免疫层析技术应用的瓶颈，本发明中，我们通过将经典采用的胶体金置换为磁性纳米颗粒，采用外加磁场降低其在硝基纤维膜上的移动速率的方式克服了免疫层析技术灵敏度低的缺陷。该策略把磁性纳米颗粒的高选择性、可富集性及流速可控性与免疫层析技术高通量、快速、简捷的优势相结合，大幅提高了检测灵敏度。
本发明涉及的方法的基本原理如下：不同于经典胶体金免疫层析法，本发明提出的基于“磁聚焦”策略的双模式免疫层析法使用标记拉曼信标分子的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒代替了胶体金纳米颗粒，并在试纸条检测区域下方放置一块小磁铁。
方法1中：将修饰铜绿色假单胞菌抗体的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒喷在结合垫上。将铜绿色假单胞菌抗体和羊抗鼠IgG固定在硝基纤维膜的特定区域分别形成检测线和质控线。当将样品溶液滴加到样品垫上时，样品在毛细作用下在试纸条上流动，当移动到结合垫时，基于抗原抗体间的免疫反应，修饰抗体的Fe3O4@AuNPs将与样品中含有的铜绿色假单胞菌结合，形成Fe3O4@AuNPs-抗体-目标菌复合物。样品继续在硝基纤维膜上继续流动，当复合物流动至检测线区域时，由于磁场的作用，有磁性的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒会使得流速明显减缓，这样固定在硝基纤维膜上的抗体即可有更长的时间与Fe3O4@AuNPs-抗体-目标菌复合物结合形成“三明治”夹心结构。而没有结合铜绿色假单胞菌的复合物则继续向前移动，在质控线处与二抗结合。
方法2：本发明中，我们在免疫层析进行前，首先采用免疫磁性纳米颗粒富集样品溶液中的目标菌，从而达到增强最终检测灵敏度的目的。在免疫层析过程进行前，首先采用修饰铜绿色假单胞菌抗体的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒与样品溶液混合，富集样品中的铜绿色假单胞菌。随后在外加磁场条件下，将结合铜绿色假单胞菌的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒与上清液分离，并重新溶解在PBS溶液中并将溶液用于免疫层析检测。将溶解Fe3O4@AuNPs-抗体-铜绿色假单胞菌复合物的PBS溶液滴加到样品垫上时，样品在毛细作用下在试纸条上流动，当复合物流动至检测线区域时，由于磁场的作用，有磁性的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒会使得流速明显减缓，这样固定在硝基纤维膜上的抗体即可有更长的时间与Fe3O4@AuNPs-抗体-目标菌复合物结合形成“三明治”夹心结构。而没有结合铜绿色假单胞菌的复合物则继续向前移动，在质控线处与二抗结合。
由于反应时间的延长，相应地，与未施加磁场的免疫层析方法相比，就会有更多的目标物被固定在检测区域的抗体所捕获。因此，最终的检测结果明显更好，即检测限更低、灵敏度更高。如果样品中的铜绿色假单胞菌浓度较高，那么在检测线出聚集的“三明治”夹心结构复合物就越多，会显示出Fe3O4@AuNPs纳米颗粒的颜色。相反，如果样品中的铜绿色假单胞菌浓度较低，那么在检测线出聚集的“三明治”夹心结构复合物就越少，则不会显示出Fe3O4@AuNPs纳米颗粒的颜色。层析过程结束后，采用配备785nm激光的拉曼光谱仪采集检测线和质控线的SERS光谱，基于SERS光谱定量测定样品中的铜绿色假单胞菌含量。
本发明通过样品富集预处理和引入“磁聚焦”策略，大幅提升了免疫层析方法的灵敏度，方法1的检测限低至10cfu/mL，灵敏度可达到传统胶体金方法的10000倍。方法2的检测限低至1cfu/mL，灵敏度可达到传统胶体金方法的100000倍。且因该方法是基于金磁纳米颗粒的磁性，其检测结果几乎不受样品颜色的影响。因为磁性纳米颗粒磁性很难发生改变，其检测结果也可长时间保存。本发明为食品体系中有害组分的快速现场检测指明了新方向。
优选地，在本方法中所述的磁铁的磁场强度为30mT-300mT。所采用的金磁纳米颗粒（Fe3O4@AuNPs）直径在30-200nm的范围内。
有益效果
基于样品富集预处理和“磁聚焦”策略，大幅提升了免疫层析试纸条的灵敏度，解决了其灵敏度低的瓶颈问题。该发明中所使用的金磁纳米颗粒（Fe3O4@AuNPs）既用于在样品预处理步骤中富集铜绿色假单胞菌，又在随后的免疫层析检测中用于构建信号探针，减少了操作步骤，降低了成本。该试纸条基于在检测区域聚集的修饰拉曼信标分子的Fe3O4@AuNPs所产生的表面增强拉曼光谱（SERS）信号，可定量测定样品中的铜绿色假单胞菌含量。本发明的试纸条具有检测限低（1 cfu/mL）、特异性好、成本低廉、检测时间短等优势，能够满足现场快速检测的需求，适用于液体样品中致病菌及各种有毒有害物质的检测，极具实用价值。
附图说明
图1 用于新型免疫层析检测的模具；
图2铜绿色假单胞菌浓度范围为30-105 cfu/mL时基于采集的SERS光谱建立的标准曲线；
图3铜绿色假单胞菌浓度范围为10-105 cfu/mL时，(a) 新型免疫层析检测试纸条SERS光谱检测结果；(b) 基于SERS光谱结果建立的标准曲线。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
一种检测铜绿色假单胞菌的方法，包括以下步骤：
（1）金磁纳米颗粒的制备及修饰：
Fe3O4纳米颗粒的制备：准确称取11.2 mM 氯化铁溶液和5.6 mM 氯化亚铁溶液，将它们加入到180mL去离子水中，充分搅拌直至完全溶解。然后在氮气保护下加热到50℃，将该混合溶液与12.5 mL 0.1M NH3·H2O溶液混合并剧烈搅拌30 min。在外加磁场作用下，采用无水乙醇和去离子水交替冲洗至中性，并重新溶解在水溶液中，存于4℃备用；
Fe3O4@AuNPs纳米颗粒的制备：超声条件下，将20 mL合成的Fe3O4溶液与15 mL 1%的氯金酸溶液混合20 min。接着，将15 mL 20 mM的柠檬酸三钠溶液逐滴加入到上述混合溶液中，超声，直至溶液颜色变为深红色。最后，将制得的磁性纳米金颗粒通过外加磁场从溶液中分离出来，分别用无水乙醇和超纯水各清洗三遍，并重新溶解在水溶液中，保存于4℃下备用；
Fe3O4@AuNPs的修饰：首先，将10μL浓度为1mmol/L的4-MBA溶液添加到制备的10 mLFe3O4@AuNPs纳米粒子溶液中，室温下避光反应3 h，10000 rpm离心15 min以除去多余的4-MBA分子。然后将修饰有4-MBA的Fe3O4@AuNPs纳米粒子重悬在等体积的PBS溶液（10 mM）中。抗体修饰步骤如下：将10μg抗体及1μL 0.5M的碳酸纳溶液加入到1mL②中制备的Fe3O4@AuNPs纳米粒子溶液中，轻摇混匀后，室温（25℃）下振荡反应2 h。然后将122 μL 5%（w/v）的酪蛋白溶液（溶解在10mM中PBS溶液中）添加到上述溶液中用于封闭Fe3O4@AuNPs纳米粒子表面的残余结合位点，摇床振荡过夜。最后，将修饰抗体的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒溶液5000g离心10分钟，弃去上清液，并将得到的纳米粒子洗涤后重新分散在100μL 5%（w/v）的酪蛋白溶液中。
（2）结合垫的处理：将3μL Fe3O4@AuNPs纳米颗粒溶液分别喷于结合垫上，37℃烘干，得到处理后的标记物结合垫；
（3）硝基纤维膜的处理：将0.3μg铜绿色假单胞菌多克隆抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将0.3μg羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；
（4）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水条,组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测铜绿色假单胞菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用；
（5）外加磁场的施加：将其应用于样品中铜绿色假单胞菌的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为100mT的小磁铁（图1）；
（6）标准曲线的建立：向不含铜绿色假单胞菌的饮用水溶液中添加菌液，使其浓度分别为30 cfu/mL，102 cfu/mL，103 cfu/mL，104 cfu/mL和105 cfu/mL。吸取100 μL经过预处理的溶液缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。溶液在试纸条上层析结束后，加入30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子。最后，采用拉曼光谱仪照射检测区域，采集SERS谱图。He-Ne激光波长：785 nm；激光功率：20 mW；扫描时间：10 s；每个样品扫描区域：7个；采集范围：600-1800cm-1；扫描次数：10次。取七个区域的所有采集到的拉曼光谱在拉曼位移为1567cm-1处的平均值，用于对铜绿色假单胞菌含量进行定量，建立标准曲线（图1）。
（7）样品的检测：吸取100μL含有致病菌的样品溶液缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。样品溶液在试纸条上层析结束后，加入30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子。最后，采用拉曼光谱仪照射检测区域，采集SERS谱图。He-Ne激光波长：785 nm；激光功率：20 mW；扫描时间：10 s；每个样品扫描区域：7个；采集范围：600-1800cm-1；扫描次数：10次。取七个区域的所有采集到的拉曼光谱在拉曼位移为1567cm-1处的平均值，最终得到的T/C值为0.57，基于已建立的标曲，推导出样品中铜绿色假单胞菌含量为1380 cfu/mL。
实施例2
一种检测铜绿色假单胞菌方法，包括以下步骤：
（1）金磁纳米颗粒的制备及修饰：
Fe3O4纳米颗粒的制备：准确称取11.2 mM 氯化铁溶液和5.6 mM 氯化亚铁溶液，将它们加入到180mL去离子水中，充分搅拌直至完全溶解。然后在氮气保护下加热到50℃，将该混合溶液与12.5 mL 0.1M NH3·H2O溶液混合并剧烈搅拌30 min。在外加磁场作用下，采用无水乙醇和去离子水交替冲洗至中性，并重新溶解在水溶液中，存于4℃备用；
Fe3O4@AuNPs纳米颗粒的制备：超声条件下，将20 mL合成的Fe3O4溶液与15 mL 1%的氯金酸溶液混合20 min。接着，将15 mL 20 mM的柠檬酸三钠溶液逐滴加入到上述混合溶液中，超声，直至溶液颜色变为深红色。最后，将制得的磁性纳米金颗粒通过外加磁场从溶液中分离出来，分别用无水乙醇和超纯水各清洗三遍，并重新溶解在水溶液中，保存于4℃下备用；
Fe3O4@AuNPs的修饰：首先，将10μL浓度为1mmol/L的4-MBA溶液添加到制备的10 mLFe3O4@AuNPs纳米粒子溶液中，室温下避光反应3 h，10000 rpm离心15 min以除去多余的4-MBA分子。然后将修饰有4-MBA的Fe3O4@AuNPs纳米粒子重悬在等体积的PBS溶液（10 mM）中。抗体修饰步骤如下：将10μg抗体及1μL 0.5M的碳酸纳溶液加入到1mL②中制备的Fe3O4@AuNPs纳米粒子溶液中，轻摇混匀后，室温（25℃）下振荡反应2 h。然后将122 μL 5%（w/v）的酪蛋白溶液（溶解在10mM中PBS溶液中）添加到上述溶液中用于封闭Fe3O4@AuNPs纳米粒子表面的残余结合位点，摇床振荡过夜。最后，将修饰抗体的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒溶液5000g离心10分钟，弃去上清液，并将得到的纳米粒子洗涤后重新分散在100μL 5%（w/v）的酪蛋白溶液中。
（2）硝基纤维膜的处理：将0.3μg铜绿色假单胞菌多克隆抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将0.3μg羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；
（3）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水条，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测铜绿色假单胞菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用；
（4）外加磁场的施加：将其应用于样品中铜绿色假单胞菌的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为100mT的小磁铁；
（5）标准曲线的建立：向不含铜绿色假单胞菌的饮用水溶液中添加菌液，使其浓度分别为10 cfu/mL，102 cfu/mL，103 cfu/mL，104 cfu/mL和105 cfu/mL。将10μL修饰铜绿色假单胞菌抗体和4-MBA的Fe3O4@Au纳米颗粒溶液加入到样品溶液中，充分反应30分钟，富集饮用水中存在的铜绿色假单胞菌，然后在外加磁场条件下，分离出结合铜绿色假单胞菌的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在100μL含有0.5%（w/v）酪蛋白的 PBS溶液中。吸取100 μL经过预处理的PBS溶液缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10 min。PBS溶液在试纸条上层析结束后，加入30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子。最后，采用拉曼光谱仪照射检测区域，采集SERS谱图（图3a）。He-Ne激光波长：785 nm；激光功率：20 mW；扫描时间：10 s；每个样品扫描区域：7个；采集范围：600-1800cm-1；扫描次数：10次。取七个区域的所有采集到的拉曼光谱在拉曼位移为1567cm-1处的平均值，用于对铜绿色假单胞菌含量进行定量，建立标准曲线（图3b）。
（6）样品的检测：吸取100 μL样品溶液缓慢滴加到样品垫上，使其在室温下流动10min。样品溶液在试纸条上层析结束后，加入30μL去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子。最后，采用拉曼光谱仪照射检测区域，采集SERS谱图。He-Ne激光波长：785 nm；激光功率：20 mW；扫描时间：10 s；每个样品扫描区域：7个；采集范围：600-1800cm-1；扫描次数：10次。取七个区域的所有采集到的拉曼光谱在拉曼位移为1567cm-1处的平均值，基于已建立的标曲，用于对样品中的铜绿色假单胞菌含量进行定量。
其他条件不变，去除实施例2中的第（4）外加磁场的施加：将其应用于样品中铜绿色假单胞菌的检测过程中，试纸条检测区域下方放置一块磁场强度为100mT的小磁铁。
检测的结果（表1）：
如表1所示，施加磁场的新型免疫层析试纸条检测灵敏度明显优于未施加磁场试纸条。此外，施加磁场的新型免疫层析试纸条的检测结果与传统的平板计数法检测所得结果无显著差异，展示出该新型检测方法的实用性。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种检测铜绿色假单胞菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备检测线包被铜绿色假单胞菌抗体、质控线包被羊抗鼠IgG抗体的试纸条；
（2）在试纸条检测区域下方放置磁铁；
（3）金磁纳米颗粒的制备：在Fe3O4@AuNPs表面修饰铜绿色假单胞菌抗体和拉曼信标分子；
（4）检测铜绿色假单胞菌含量。
2.根据权利要求1所述的一种检测铜绿色假单胞菌的方法，其特征在于，所述的磁铁的磁场强度在30mT-300mT。
3.根据权利要求1所述的一种检测铜绿色假单胞菌的方法，其特征在于，所述的试纸条包括衬板、样品垫、纳米颗粒标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、金磁纳米颗粒标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸由后到前依次粘贴吸附在所述衬板上，所述硝酸纤维素膜上划有一根检测线和一根质控线；所述检测线包被铜绿色假单胞菌抗体；所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体。
4.根据权利要求3所述的一种检测铜绿色假单胞菌的方法，其特征在于，试纸条的制备方法包括以下步骤：
（1）金磁纳米颗粒的制备：合成磁性纳米颗粒Fe3O4，在其表面包被一层金壳，得到Fe3O4@AuNPs纳米颗粒，在Fe3O4@AuNPs表面修饰铜绿色假单胞菌抗体和拉曼信标分子；
（2）样品富集预处理：将修饰铜绿色假单胞菌抗体和拉曼信标分子的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒溶液加入到样品溶液中充分反应，富集样品中存在的铜绿色假单胞菌，然后在外加磁场条件下，分离出结合铜绿色假单胞菌的免疫磁性纳米颗粒，重新溶解在PBS溶液中；
（3）硝基纤维膜的处理：将铜绿色假单胞菌抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；
（4）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测铜绿色假单胞菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。
5.根据权利要求1所述的一种检测铜绿色假单胞菌的方法，其特征在于，试纸条还包括金磁纳米颗粒标记物结合垫有修饰铜绿色假单胞菌抗体和拉曼信标分子的金磁纳米颗粒Fe3O4@AuNPs。
6.根据权利要求1所述的一种检测铜绿色假单胞菌的方法，其特征在于，金磁纳米颗粒Fe3O4@ AuNPs直径为30-200nm。
7.根据权利要求6所述的一种检测铜绿色假单胞菌的方法，其特征在于，所述的试纸条包括衬板、样品垫、纳米颗粒标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述样品垫、金磁纳米颗粒标记物结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸由后到前依次粘贴吸附在所述衬板上，所述硝酸纤维素膜上划有一根检测线和一根质控线；所述检测线包被铜绿色假单胞菌抗体；所述质控线包被羊抗鼠IgG抗体；所述金磁纳米颗粒标记物结合垫有修饰铜绿色假单胞菌抗体和拉曼信标分子的金磁纳米颗粒Fe3O4@AuNPs。
8.根据权利要求6或7所述的一种检测铜绿色假单胞菌的方法，其特征在于，试纸条的制备方法包括以下步骤：
（1）金磁纳米颗粒的制备：合成磁性纳米颗粒Fe3O4，在其表面包被一层金壳，得到Fe3O4@AuNPs纳米颗粒，在Fe3O4@AuNPs表面修饰铜绿色假单胞菌抗体和拉曼信标分子；
（2）结合垫的处理：将修饰铜绿色假单胞菌抗体和拉曼信标分子的Fe3O4@AuNPs纳米颗粒溶液喷于结合垫上，得到处理后的标记物结合垫；
（3）硝基纤维膜的处理：将铜绿色假单胞菌抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测线，将羊抗鼠IgG抗体溶液喷涂在硝基纤维膜上形成检测质控线，烘干，即得到处理后的硝基纤维膜；
（4）试纸条的组装：在衬板上依次搭接并粘贴处理后的样品垫、结合垫和硝酸纤维素膜，再在酸纤维素膜的一侧搭接吸水纸，组装后裁剪为60mm长，3.8mm宽的试纸条，即得到所述定量检测铜绿色假单胞菌的免疫层析试纸条，将制得的试纸条与干燥剂一起装入避光袋密封保存待用。
9.根据权利要求1-8之一所述的一种检测铜绿色假单胞菌的方法，其特征在于，铜绿色假单胞菌为单克隆抗体或多克隆抗体，Fe3O4@AuNPs表面修饰的拉曼信标分子可为4-巯基苯甲酸、对氨基苯硫酚、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)。
10.根据权利要求1-9之一所述的一种检测铜绿色假单胞菌的方法，其特征在于，样品溶液在试纸条上层析，结束后，加入去离子水冲洗检测区域以洗去未反应的信号探针分子，采用配备785nm激光的拉曼光谱仪采集检测线和质控线的SERS光谱，基于SERS光谱定量测定样品中的铜绿色假单胞菌含量。
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