CN102363815A - 运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法 - Google Patents

运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法，设计了五个引物组序列包括以下五个引物：5’GCGGAAGTCGCGGCCCG；5’TCGCACCGTCAAAGGAACC；5’AGGCCGGTATTATTGATGC；TTTCTCTGGATGGTATGC；5’AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC，其中引物序列3的5’端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5’端有生物素荧光基团标记。针对沙门菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术快速低成本的沙门菌检测方法。

Description

运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法
技术领域
本发明涉及细菌检验技术，具体地说是运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法。
背景技术
沙门菌属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌。已发现的近一千种(或菌株)。按其抗原成分，可分为甲、乙、丙、丁、戊等基本菌组。除引起人类的疾病外，大多数仅能目引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，但有时也可污染人类的食物而引起食物中毒，可引起极为严重的食品中毒事件，并可以导致多种疾病发生，严重威胁着人们的健康。快速、准确的检测沙门菌是有效预防和控制肠杆菌感染的前提条件。随着分子生物学的发展，实际工作中的细菌鉴定方法已经从传统的简单生化实验水平上向分子生物学的方法如PCR、探针杂交等技术发展。近期开发出来的交叉引物核酸恒温扩增技术是一种更为高效的分子检测方法，已经被很多国家认同，并大力发展。
发明内容
针对沙门菌，本发明克服了现有技术中的缺点，提供一种快速、便捷、低成本的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂及其扩增方法和检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，包括以下五个引物 ：
SEQ ID NO.1：5’ GCGGAAGTCGCGGCCCG
SEQ ID NO.2：5’ TCGCACCGTCAAAGGAACC
SEQ ID NO.3：5’ AGGCCGGTATTATTGATGC
SEQ ID NO.4：5' TTTCTCTGGATGGTATGC
SEQ ID NO.5：5' AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC
其中引物序列3的5’端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5’端有生物素荧光基团标记。
核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下：            
成分                            浓度            加样量              
Bst酶                          5U/μL           1μL
Bst酶缓冲液                       -             5μL
SEQ ID NO.1：                  10μmol/L        1μL
SEQ ID NO.2：                  10μmol/L        1μL
SEQ ID NO.3：                  10μmol/L        0.5μL
SEQ ID NO.4：                  10μmol/L        0.5μL
SEQ ID NO.5：                  10μmol/L        0.2μL
DNA样品                                         2μL
双蒸水                                           13.8μL
总体积                                           25 μL 
其中Bst酶缓冲液的成分为20 mM Tris-HCl 、10 mM (NH4)2SO4、10 mM KCl、2 mM MgSO4、质量百分比0.1 % Triton X-100，且pH 为8.8 。
核酸扩增程序为：
（1）63℃   90分钟； 
（2）80℃   2分钟。
所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的检测方法，将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在15-30分钟内读取结果，如果仅在质控区C出现一条红线，表示样品中无沙门氏菌；如果出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在沙门氏菌；如果无红线出现，表明检测失败，样品需要重新检测。 
与现有技术相比，本发明的有益效果是：相比传统生理生化检测方法，交叉引物核酸恒温扩增技术适用于直接从患者含菌体液、食品和体液培养物等临床样品中扩增靶基因，只需要一次恒温扩增就能够检测沙门菌是否存在，大大提高了效率节约了时间。相比较其它方法，本方法制仅需要简单的设备即可，大大提高了性价比节约了成本。该技术检测沙门菌具有检测准确、特异性强、灵敏度高的特点，可以快速、准确地鉴定，避免了反复培养，节约时间；该方法不受培养条件和细菌生理状态的影响，较生理生化鉴定方法更为准确。
附图说明
图1本发明结果判读示意图。
图2本发明运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的实验结果（检测条1.肠炎沙门菌Np10012检测结果；检测条2.肠炎沙门菌CIQ021207检测结果；检测条3.肠炎沙门菌CIQ070123检测结果；检测条4.志贺氏菌ATCC12022检测结果；检测条5. 空白对照）。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
本发明是通过以下技术方案实现的：
（1）设计特异性寡核苷酸引物用于交叉引物核酸恒温扩增技术检测；
（2）整合各引物使之不相互干扰。
（3）以引物序列组，扩增待测样品模板，进行目的基因的特异性扩增；
（4）扩增完毕后可通过特定的胶体金检测试纸条目测结果。
本发明运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，包括以下五个引物 ：
SEQ ID NO.1：5’ GCGGAAGTCGCGGCCCG
SEQ ID NO.2：5’ TCGCACCGTCAAAGGAACC
SEQ ID NO.3：5’ AGGCCGGTATTATTGATGC
SEQ ID NO.4：5' TTTCTCTGGATGGTATGC
SEQ ID NO.5：5' AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC
其中引物序列3的5’端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5’端有生物素荧光基团标记。
该引物为和沙门菌致病性密切相关的侵袭性蛋白A的基因中（invasion protein A）挑选设计的，参考序列为GenBank CP002487.1 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium str. ST4/74, complete genome，检测基因区域为3060976~ 3063033。
优选的核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下：            
成分                            浓度            加样量              
Bst酶                          5U/μL           1μL
Bst酶缓冲液                       -             5μL
SEQ ID NO.1：                  10μmol/L        1μL
SEQ ID NO.2：                  10μmol/L        1μL
SEQ ID NO.3：                  10μmol/L        0.5μL
SEQ ID NO.4：                  10μmol/L        0.5μL
SEQ ID NO.5：                  10μmol/L        0.2μL
DNA样品                                         2μL
双蒸水                                           13.8μL
总体积                                           25 μL 
其中Bst酶缓冲液的成分为20 mM Tris-HCl 、10 mM (NH4)2SO4、10 mM KCl、2 mM MgSO4、质量百分比0.1 % Triton X-100，且pH 为8.8 。
上述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的扩增方法，核酸扩增程序为：
（1）63℃   90分钟； 
（2）80℃   2分钟。
如图1、2所示，上述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的检测方法，将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在15-30分钟内读取结果，如果仅在质控区C出现一条红线，表示样品中无沙门氏菌；如果出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在沙门氏菌；如果无红线出现，表明检测失败，样品需要重新检测。
实施例1
样本：某肉馅。
用常规生理、生化方法检测出沙门菌疑似菌落，然后进行如下交叉引物核酸恒温扩增检测：
（1）取100克待检样品，粉碎。
（2）取1克样品进行核酸抽提。 
（3）交叉引物核酸恒温扩增
反应体系中各组分构成比例如下：
成分                            浓度            加样量              
Bst酶                          5U/μL           1μL
Bst酶缓冲液                       -             5μL
引物序列一：                   10μmol/L        1μL
引物序列二：                   10μmol/L        1μL
引物序列三：                   10μmol/L        0.5μL
引物序列四：                   10μmol/L        0.5μL
引物序列五：                   10μmol/L        0.2μL
DNA样品                                       2μL
双蒸水                                         13.8μL
总体积                                         25 μL 。
其中Bst酶缓冲液的成分为20 mM Tris-HCl 、10 mM (NH4)2SO4、10 mM KCl、2 mM MgSO4、质量百分比0.1 % Triton X-100且pH 为8.8 。
核酸扩增程序为：
63℃   90分钟； 80℃   2分钟。
共进行3管实验，其中DNA样品所加入的分别为：沙门菌DNA模板标准品；本待测样品DNA； 无DNA 的阴性对照。
（4）结果观察
将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在20分钟内读取结果，沙门菌DNA模板标准品和本待测样品DNA出现两条红线，一条检测线，一条质控线；无DNA 的阴性对照仅在质控区C出现一条红线。综合以上结果，表示待测样品中存在沙门菌。 
3天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为沙门菌。交叉引物核酸恒温扩增检验结果与生化检测结果一致。
实施例2
样本：某速冻肉饼。
用常规生理、生化方法检测出沙门菌疑似菌落，然后进行如下交叉引物核酸恒温扩增检测：
（1）取100克待检样品，粉碎。
（2）取1克样品进行核酸抽提。 
（3）交叉引物核酸恒温扩增
反应体系中各组分构成比例如下：
成分                            浓度            加样量              
Bst酶                          5U/μL           1μL
Bst酶缓冲液                       -             5μL
引物序列一：                   10μmol/L        1μL
引物序列二：                   10μmol/L        1μL
引物序列三：                   10μmol/L        0.5μL
引物序列四：                   10μmol/L        0.5μL
引物序列五：                   10μmol/L        0.2μL
DNA样品                                       2μL
双蒸水                                         13.8μL
总体积                                         25 μL 。
其中Bst酶缓冲液的成分为20 mM Tris-HCl 、10 mM (NH4)2SO4、10 mM KCl、2 mM MgSO4、质量百分比0.1 % Triton X-100且pH 为8.8 。
核酸扩增程序为：
63℃   90分钟； 80℃   2分钟。
共进行3管实验，其中DNA样品所加入的分别为：沙门菌DNA模板标准品；本待测样品DNA； 无DNA 的阴性对照。
（4）结果观察
将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在20分钟内读取结果，沙门菌DNA模板标准品和本待测样品DNA出现两条红线，一条检测线，一条质控线；无DNA 的阴性对照仅在质控区C出现一条红线。综合以上结果，表示待测样品中存在沙门菌。 
3天后，通过常规微生物培养和生化检测证明，所检验的目的菌落为沙门菌。交叉引物核酸恒温扩增检验结果与生化检测结果一致。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims (4)

1.一种运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，其特征在于，包括以下五个引物 ：
SEQ ID NO.1：5’ GCGGAAGTCGCGGCCCG
SEQ ID NO.2：5’ TCGCACCGTCAAAGGAACC
SEQ ID NO.3：5’ AGGCCGGTATTATTGATGC
SEQ ID NO.4：5' TTTCTCTGGATGGTATGC
SEQ ID NO.5：5' AGATGAGTATTGATGCCGATTTGTCAGTACGCTTCGCCGTTCGC
其中引物序列3的5’端有异硫氰酸荧光素基团标记，引物序列4的5’端有生物素荧光基团标记。
2.根据权利要求1所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂，其特征在于，核酸扩增反应体系中各组分构成比例如下：            
成分                            浓度            加样量              
Bst酶                          5U/μL           1μL
Bst酶缓冲液                       -             5μL
SEQ ID NO.1：                  10μmol/L        1μL
SEQ ID NO.2：                  10μmol/L        1μL
SEQ ID NO.3：                  10μmol/L        0.5μL
SEQ ID NO.4：                  10μmol/L        0.5μL
SEQ ID NO.5：                  10μmol/L        0.2μL
DNA样品                                         2μL
双蒸水                                           13.8μL
总体积                                           25 μL 
其中Bst酶缓冲液的成分为20 mM Tris-HCl 、10 mM (NH4)2SO4、10 mM KCl、2 mM MgSO4、质量百分比0.1 % Triton X-100，且pH 为8.8 。
3.一种权利要求1所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的扩增方法，其特征在于，核酸扩增程序为：
（1）63℃   90分钟； 
（2）80℃   2分钟。
4.一种权利要求1所述的运用交叉引物核酸恒温扩增技术检测沙门菌的试剂的检测方法，其特征在于，将反应液滴至能够检测异硫氰酸荧光素基团和生物素荧光基团同时标记的核酸样品的胶体金检测试纸上，在15-30分钟内读取结果，如果仅在质控区C出现一条红线，表示样品中无沙门氏菌；如果出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在沙门氏菌；如果无红线出现，表明检测失败，样品需要重新检测。
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