CN103397108A - 猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量rt-pcr检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒。利用猪瘟兔化弱毒疫苗株（HCLV株）的基因序列，设计了特异性的HCLV荧光探针和引物。经过对反应条件的优化，研发了猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒。通过特异性、敏感性、稳定性和重复性试验，证明该试剂盒只能特异性的扩增HCLV株；灵敏度比RT-nPCR高1个数量级；试剂盒的保存期在6个月以上。该试剂盒还具有操作简单，自动化程度高等优点，可用于对猪瘟疫苗生产中间产品的效价进行评价研究，代替传统的兔热反应方法，能够更准确、快速指导疫苗的生产，定量配苗，缩短疫苗生产周期，节约生产成本，产生更明显的经济和社会效益。

Description

猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒

技术领域

本发明所涉及的猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒，属于兽医微生物学领域动物病毒学技术。 

背景技术

猪瘟（Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起的高度接触性、致死性传染病。根据OIE制定的《陆生动物卫生法典》第五版，CSF被列为必须报告的动物疫病之一，在中国被列为“一类动物疫病”。猪瘟兔化弱毒疫苗株（Hog Cholera Lapinized Virus，HCLV），简称“C”株（Chinese strain），是目前世界公认的最好的猪瘟活疫苗制苗毒株，在中国乃至国外许多国家防控猪瘟工作中起着重要的作用。目前，按照《中华人民共和国兽药典》三部2010年版，猪瘟兔化弱毒疫苗依然主要采用兔体定型热反应进行疫苗的效力检验，但由于试验动物的个体差异、环境因素及原材料等多方面原因，检测结果不是十分准确；兔体定型热试验还存在成本比较高，实验周期过长，用于检测的样本量不符合统计学标准等缺点，因此建立实用、标准化的疫苗效力检验替代方法势在必行。 

建立荧光定量RT-PCR对猪瘟兔化弱毒疫苗细胞苗的效价测定方面，已有探索性研究，陈玉栋等（陈玉栋,张楚瑜,邹俊煊,等.建立快速定量检测猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR技术.中国病毒学,2003,18(2):124-128.）建立了猪瘟兔化弱毒疫苗核酸定量检测的荧光PCR方法，并与兔体定型热反应进行了比较，结果两只兔子均产生定型热反应疫苗样品中HCLV含量为10⁶～10⁷个病毒粒/mL；一只有定型热一只没有的为10⁶个病毒粒/mL。蒋春燕等（蒋春燕.猪瘟病毒实时荧光定量PCR快速检测试剂盒的研制与应用.中国兽医药品监察所硕士学位论文,2006.）将CSFVFQ-PCR技木应用于HCLV疫苗细胞培养液半成品的效力检验，分别对3个批次，总共13收次的疫苗原液和5、10、15、20、25万倍稀释液，同时用兔体定型热反应和CSFVFQ-PCR进行检测，比较并确立两种实验结果之间的相关性，即两只兔子均为定型热反应的CT值范围为26.63～28.80;只有一只无定型热反应的CT值范围为28.29～30.72;两只兔子均无定型热反应的CT值范围为30.3～32.79，分析并证实了不同的兔体定型热反应与相应的CT值范围、病毒含量之间都存在着很好的相 关性。 

上述文献中设计的荧光定量PCR检测方法都是针对所有猪瘟病毒毒株，造成特异性、敏感性都有所降低，尚待需要在生产厂家进行足够数量的疫苗效力检测评价。本发明针对HCLV毒株，设计HCLV特异性的引物和MGB探针，建立一套检测疫苗核酸含量的HCLV荧光定量RT-PCR检测方法（HCLV-MGB-RT-PCR），并组装猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒，为HCLV中间产品效力检验提供敏感、准确和快速的替代方法。 

发明内容

一、本发明的主要技术原理 

实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time Fluorogenetic Quantitative PCR,FQ-PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术（Heid,C.A.,et al.,Real time quantitative PCR..Genome Res,1996.6(10):986-94.），该技术是通过始点定量和荧光检测系统实时监测累积荧光强度而实现的，它可以采用绝对定量和相对定量两种方式实现定量检测。 

FQ-PCR技术包括探针类和染料类两种（Wittwer,C.T.,et al.,Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.Biotechniques,1997.22(1):130-1,134-8）。探针类是利用与模板特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，以TaqMan^TM技术为代表，常用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX；染料类是应用一种能与双链DNA小沟结合的荧光染料，荧光信号强弱与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量，常用的是SYBR GreenI染料。实时荧光PCR技术常用的探针技术包括TaqMan^TM水解探针技术和TaqMan MGB探针技术。 

TaqMan^TM水解探针技术（Heid,C.A.,et al.,Real time quantitative PCR.Genome Res,1996.6(10):986-94.）由美国Perkin Elmer公司研制，它在PCR扩增体系中加入一条20多bp的特异荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记上荧光发射基团（R）和淬灭基团（Q），在PCR反应中设立标准模板系列对照反应管和阴性对照管，在PCR扩增的退火或延伸步骤中检测荧光信号的变化，得出FQ-PCR的动力学曲线图。探针完整时，两者发生荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET），R基团发射的荧光信号被Q基团淬灭；PCR扩增进行时，Taq酶发挥5'→3'外切酶活性，将探针降解，R基团与Q基团分离，Q基团淬灭作用随即消失，R基团释放荧光信号，被荧光监测系统接收，即每完成一次扩增，就有一个荧光信号累积，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全 同步（Hiyoshi,M.and Hosoi S.,Assay of DNA denaturation by polymerase chain reaction-driven fluorescent label incorporation and fluorescence resonance energy transfer.Anal Biochem,1994.221(2):306-11；Holland,P.M.,et al.,Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the5'-3'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase.Proc Natl Acad Sci USA,1991.88(16):7276-80.）。其工作原理见图1。并计算出Rn值、△Rn值、Ct值和阈值，Rn值是表示在各个反应循环数仪器所检测的荧光信号值，△Rn值是指在各个反应循环数仪器所检测的荧光信号值减去PCR扩增前的背景信号荧光值；Ct值是指样品管的荧光信号达到某一固定阈值的PCR反应循环数；阈值是由所选定作为基线的各个循环数的△Rn值的平均数加上其标准差所得的数值决定。根据CT值与初始模板呈线性关系，利用标准品模板10倍梯度稀释系列绘制出标准曲线，结合各样品的Ct值，实现对初始模板的定性或定量检测(Heid et al.,1996)。 

TaqMan MGB探针技术（TaqMan Minor Groove Binder probe）（Decaro,N.,et al.,A minor groove binder probe real-time PCR assay for discrimination between type2-based vaccines and field strains of canine parvovirus.J Virol Methods,2006.136(1-2):65-70）与普通TaqMan水解探针不同之处在于TaqMan MGB探针的3’端连接一个不发荧光的Q基团和一个特殊的小沟结合子（Minor Groove Binder，MGB）。MGB是一个三肽结构，可以结合在DNA双螺旋的小沟里，起到稳定DNA双螺旋的作用。这种特殊的设计赋予了MGB探针较TaqMan^TM水解探针技术具有三大优势：一是显著提高Tm值，这样可以减少探针设计长度，对AT富含区的探针设计更为有利；二是可以降低背景荧光信号，提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；三是提高了探针与互补模板的结合特异性，即使一个碱基的不匹配都能精确分辨。其工作原理见图2。该方法已经广泛用于等位基因鉴定、单核苷酸多态性分析、定点突变检测等。因此将该技术用于HCLV效力检测评价，通过对疫苗中间产品病毒核酸含量的相对定量，较准确指导疫苗的配苗，可创新性的为HCLV中间产品效力检验提供敏感、准确和快速的替代方法。 

二、本发明的技术方案 

1.猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒主要用于猪瘟疫苗生产制备中半成品及成品的效力检验。 

2.该猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒中含有：阳性对照、阴性对照、RT-PCR反应液、反应酶、探针溶液、无酶水，其中： 

（1）阳性对照和阴性对照：采用HCLV标准毒株冻干样品作为阳性对照，MEM细胞 培养基作为阴性对照； 

（2）RT-PCR反应液：每个反应包括10×PCR Buffer5μL、dNTP Mixture（2.5μM each）1.5μL、HCLV-F1.5μL、HCLV-R2μL，共10.0μL；其引物序列如下： 

HCLV-F：5’-CCGCCAGTAGGACCCTAT-3’ 

HCLV-R：5’-GTGTAGTGTGGTAACTTGAGGTA-3’ 

（3）反应酶：每个反应包括SSⅢ^TM反转录酶0.3μL、Taq HS DNA聚合酶0.5μL，共0.8μL； 

（4）探针溶液：每个反应需3μL，该探针序列为 

HCLV-P：5’-FAM-AGATAACACTAATTTTCTTTTTTCTTT-MGB-3’ 

其中：FAM为羧基荧光素;MGB为小沟结合子； 

（5）无酶水：超纯水高压灭菌后，加入终浓度为0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC），处理过夜，次日高压灭菌以去除DEPC。 

三、本发明的详细描述 

1.引物和探针的设计 

对GenBank公布的CSFV、BVDV和BDV全序列进行综合比对，发现CSFV疫苗株（HCLV株）3’UTR比CSFV野毒株的3’UTR多一段12个碱基的插入，避开与BVDV、BDV的同源区，保证了HCLV荧光探针和引物的特异性，利用Primer Express3.0软件，在3’UTR区域设计了HCLV特异性引物和MGB探针，命名为：上游引物HCLV-F、下游引物HCLV-R、探针HCLV-P，序列如下： 

HCLV-F：5’-CCGCCAGTAGGACCCTAT-3’ 

HCLV-R：5’-GTGTAGTGTGGTAACTTGAGGTA-3’ 

HCLV-P：5’-FAM-AGATAACACTAATTTTCTTTTTTCTTT-MGB-3’ 

其中：FAM为羧基荧光素;MGB为小沟结合子。 

2．阳性对照的制备 

将0.5mL的HCLV疫苗半成品与等量的冻干保护液混合后，冻干后，-20°保存。使用时加入1mL的生理盐水复溶。 

3.质控样本信息 

40份质控样本的背景信息见表1，用于试剂盒特异性、重复性、灵敏度、敏感性、稳定性试验。将所有质控样本用甲醛灭活后进行定量分装，200μL/管。 

表1猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒质控样本信息 

备注：IVDC表示“中国兽医药品监察所”，a表示“农业部预防兽医学重点开放实验室”；b表示“浙江易邦生物技术有限公司”；c表示“中牧实业股份有限公司江西生物药厂”；d表示“成都天邦生物制品有限公司”；e表示“新疆天康畜牧生物技术股份有限公司”；f表示“北京信得威特科技有限公司”；g表示“中牧股份有限公司兰州生药厂”；h表示“成都天邦生物制品有限公司”。 

4.阴性对照背景信息 

取0.5ml MEM细胞培养液与等量的冻干保护液混合，冻干后，-20°保存。使用时加入1mL的生理盐水复溶。 

5.试剂 

Super Script^TMⅢ（200U/μL）反转录酶（Super Script^TMⅢ Reverse Transcriptase）购自Invitrogen公司； 

Taq HS DNA聚合酶（5U/μL）、10×PCR缓冲液（PCR Buffer，pH8.3Tris-HCl，100mM；KCl，500mM；MgCl₂，15mM）、dNTP混合液（dNTP Mixture，2.5mM/每种）购自宝生物工程（大连）有限公司； 

探针和引物由上海基康生物技术有限公司合成。 

7.反应体系的建立 

使用常规方法或商品化试剂盒提取猪瘟兔化弱毒疫苗标准品RNA，作为反应模板，对SSⅢ^TM反转录酶、Taq HS DNA聚合酶（Taq HS DNA Polymerase）、上下游引物、探针和反 应体系的逐步优化。最终选用的反应体系见表2。 

表2最佳反应体系 

仪器：荧光PCR检测仪（ABI7500荧光定量PCR仪，美国应用生物系统（ABI）公司产品）。 

反应条件：50℃20min；94℃3min；92℃15sec、60℃35sec，40个循环。每个循环在60℃时采集一次FAM荧光信号。 

四、猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒生产组装及应用 

猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒的规格为24个反应/盒。因此，根据检测数量对试剂的各组分进行制备和分装。 

1.试剂盒生产组装 

（1）对照品及水 

阳性对照：将0.5mL的HCLV疫苗半成品与等量的冻干保护液混合后，冻干后，-20℃保存。使用时加入1mL的生理盐水复溶。 

阴性对照：取0.5mlMEM细胞培养液与等量的冻干保护液混合，冻干后，-20℃保存。使用时加入1mL的生理盐水复溶。 

无酶水：超纯水高压灭菌后，加入终浓度为0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC），处理过夜，第二天高压灭菌以去除DEPC，分装为2mL/管，2～8℃保存备用。 

（2）试剂 

RT-PCR反应液：每个反应包括10×PCR Buffer5μL、dNTP Mixture（2.5μM each）1.5μL、HCLV-F（10μM）1.5μL、HCLV-R（10μM）2μL，共10.0μL，因此RT-PCR反应液分装为270μL管（考虑到试剂损耗），－20℃冻存备用。 

反应酶：每个反应包括SSⅢ^TM反转录酶0.3μL、Taq HS DNA聚合酶0.5μL，共0.8μL。因此，反应酶分装为20μL／管（考虑到试剂损耗），－20℃冻存备用。 

探针溶液：每个反应需3μL，因此探针溶液分装为80μL／管（考虑到试剂损耗），－20℃ 冻存备用。 

（3）试剂盒组装 

阳性对照和阴性对照各2管，RT-PCR反应液1管、反应酶1管、探针溶液1管、无酶水1ml、8联PCR反应管及管盖6组。 

2试剂盒的相关试验 

（1）特异性试验 

采用1201、1202、1203三个批号的猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒反应液，对40个质控样本和7个不同厂家的8批次猪瘟兔化弱毒疫苗株进行检测，结果显示：该试剂盒检测HCLV株均为阳性，猪瘟野毒株和其它病原检测均为阴性。证实该方法与其他相关病毒无交叉反应，具有很好的特异性，且能鉴别HCLV株与猪瘟野毒株。 

（2）灵敏度试验 

将HCLV疫苗半成品提取RNA进行10倍梯度稀释后，同时用猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒和检测猪瘟病毒的RT-nPCR方法（CSFV-RT-nPCR）（汤波.猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法的建立及病毒分子流行病学研究.西南大学硕士学位论文,2009）检测，猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒可检测至10^-6数量级，而常规的RT-nPCR能检测至10^-5数量级，测序结果证明RT-nPCR产物均为HCLV株。以模板浓度的对数值为横坐标，CT值为纵坐标绘制标准曲线，扩增曲线及标准曲线图结果表明，模板用量在10^-1～10^-6稀释度均呈现良好的线性关系，r值为0.9998，斜率为-3.2948，结果见图3。由公式扩增效率EHCLV=10^(-1/Slope)-1，计算扩增效率EHCLV＝101.14％，在模板用量为9.5×10^-6ng，即4.72个拷贝时荧光曲线依然清晰可见。结果表明，猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒具有较高的灵敏度，较RT-nPCR方法高1个数量级。说明优化的各反应体系和反应参数完全能保证HCLV RNA模板的有效扩增，结果见图3。 

（3）批间、批内重复性试验 

采用1201、1202、1203共3批猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR试剂盒，对40个质控样本，按常规方法进行RNA抽提。将获得的RNA用猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR试剂盒进行检测。统一设定参数为：3～15cycle基线（Baseline）。根据CT值计算试剂盒三批试剂批间、批内变异系数（CV）。 

结果显示：1201批试剂盒对40个质控样本的检测CT值变异系数为0.4%～1.9%，；1202批试剂盒对40个质控样本的检测CT值变异系数为0.4%～6.8%；1203批试剂盒对40个质控样本的检测CT值变异系数为0.4%～2.2%，说明三批试剂盒具有很好的批内重复性。同时， 1201、1202、1203批试剂盒对40个质控样本的检测CT值变异系数为0.1%～1.1%，均小于10％，说明1201、1202、1203这3批试剂盒具有很好的批间重复性。 

（4）稳定性试验 

分别使用1201、1202、21203三批试剂盒对40个质控样本进行检测，每个月1次，每批试剂做3个重复，持续6个月，测定猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR试剂盒的稳定性。结果显示，3批试剂盒对40个质控样本在6个月的CT值变异系数为1.1%～4.0%，均小于10％，说明该试剂盒在6个月内具有很好的稳定性。 

3.试剂盒的应用 

（1）RNA的抽提及存放 

RNA的抽提采用商品化试剂盒或采用常规RNA抽提方法。提取的RNA须在2h内进行扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。 

（2）反应体系的配制 

从试剂盒中取出各组分，室温融化后，2000r/min离心5s。设需PCR数为n，其中n=待检样品数×重复数+1（阳性对照）+1（阴性对照），每个样本测试反应体系配制见表3。 

表3反应体系配制表 

（3）扩增 

将配制好的反应液放入荧光PCR检测仪（ABI7500荧光定量PCR仪，美国应用生物系统（ABI）公司产品）内，记录样本摆放顺序。 

循环条件设置： 

第一阶段，反转录50℃/20min； 

第二阶段，预变性94℃/3min； 

第三阶段，92℃/15s，60℃/35s，40个循环，60℃采集FAM荧光信号。 

试验检测结束后，根据荧光信号曲线和CT值综合判定结果。 

（4）结果判定 

1）结果分析条件设定 

直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。 

2）质控标准 

阴性对照：无CT值并且无扩增曲线。 

阳性对照：CT值应在15.0～25.0。 

否则，此次实验视为无效。 

3）结果描述及判定 

①阴性：无CT值并且无典型的扩增曲线，表示样品中无猪瘟兔化弱毒疫苗株。 

②阳性：CT值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在猪瘟兔化弱毒疫苗株。 

③可疑：CT值>35且出现典型的扩增曲线的样本建议重做。重做结果出现CT值≤35和典型的扩增曲线者为阳性，否则为阴性。 

附图说明：

图1实时荧光定量技术的原理 

在PCR扩增体系中加入一条特异的寡核苷酸荧光探针，该探针可与目的片段特异性结合，两端分别标记了荧光发射基团（R）和淬灭基团（Q）。退火阶段时，探针完整，两者发生荧光共振能量转移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET），R基团发射的荧光信号被Q基团淬灭；PCR扩增进行延伸时，Taq酶发挥5'→3'外切酶活性，将探针降解，R基团与Q基团分离，Q基团淬灭作用随即消失，R基团释放荧光信号，被荧光定量PCR仪器所接收，并通过荧光信号的强弱绘制扩增曲线。 

图2TaqMan MGB探针技术工作原理 

MGB探针的5’端标记一个荧光报告基团，3’端连接一个不发荧光的淬灭基团和一个特殊的小沟结合子，这种特殊的设计使得MGB探针与模板的结合特异性更高，探针序列必须与模板序列完全互补匹配才能与之退火结合，引发聚合酶介导的探针降解，释放荧光，检测系统检测到信号；但如果有一个碱基不匹配，MGB探针就不能和模板互补结合，不能引发聚合酶介导的探针降解，不能释放荧光，检测系统检测不到荧光信号。 

图3猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR与检测猪瘟病毒的RT-nPCR扩增结果比较 

A.病毒稀释度与Ct值之间线性回归分析；B.荧光扩增曲线;C.nPCR凝胶电泳图. 

图中：M:DL2000DNA标记;0,1,2,3,4,5,6分别代表模板RNA10⁰,10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5,10^-6稀释梯度。 

微生物资源信息 

本发明涉及的微生物资源是猪瘟病毒猪瘟兔化弱毒株（CVCC AV1412），由中国兽医药品监察所鉴定、保存和供应，请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版农业科学技术出版社，2002,p145 

本发明的积极意义 

根据GenBank公布的CSFV、BVDV和BDV全序列进行综合比对，发现HCLV株3’UTR比猪瘟病毒野毒株的3’UTR多一段12个碱基的插入，为避开与BVDV、BDV的同源区，保证了HCLV荧光探针和引物的特异性，利用Primer Express3.0软件，在3’UTR区域设计了HCLV特异性引物和MGB探针，经过反转录酶浓度、DNA聚合酶浓度、上下游引物浓度和探针浓度的进一步优化，建立了检测猪瘟疫苗（HCLV）的FQ RT-PCR检测方法，并组装了猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒。通过对40个指控样本进行的特异性、敏感性、稳定性和重复性试验，证明该试剂盒只扩增HCLV株，不扩增猪瘟病毒野毒株和BVDV、BDV、PRRSV、FMDV等9种主要相关病毒核酸，显示良好的特异性；其灵敏度比实验室建立的检测猪瘟病毒的RT-nPCR高1个数量级；6个月的稳定性试验显示其CT值变异系数为1.1～4.0%，证实该试剂盒具有良好的重复性和稳定性。该方法具有良好的重复性和稳定性，该试剂盒操作简单，自动化程度高。采用该试剂盒对猪瘟疫苗生产中间产品的效价进行评价研究，代替传统的兔热反应方法，能够更准确、快速的指导疫苗生产，定量配苗，缩短疫苗生产周期，节约生产成本，从而产生更明显的经济和社会效益。 

该试剂盒设计的MGB探针较TaqMan^TM水解探针技术具有三大优势：一是显著提高Tm值，这样可以减少探针设计长度，对AT富含区的探针设计更为有利；二是可以降低背景荧光信号，提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；三是提高了探针与互补模板的结合特异性，即使一个碱基的不匹配都能精确分辨。该方法已经广泛用于等位基因鉴定、单核苷酸多态性分析、定点突变检测等。 

本发明的优点，可以归纳为：1)特异性好：通过MGB探针的单突变特异性对HCLV核酸的SNP位点行甄别，准确性高，同时靶序列由特异引物和探针双重控制，特异性好，假阳性低。2)灵敏度高：反应过程由荧光检测系统实时监控，荧光检测系统对荧光信号具有很灵敏的检测能力；3)线性关系好：由于荧光信号的强弱与模板扩增产物的对数呈线性关系，通过荧光信号的检测可以直接对样品初始模板浓度进行定量；4)操作简单：自动化程度高，对模板的扩增和检测在闭管的情况下一步完成，不需要开盖，对环境污染机会少； 5)没有后处理过程：不用杂交、电泳、拍照等过程。 

实施例

本发明为更好的说明本发明，本实施例不对本发明构成限制。 

实施例1 

为检测该试剂盒对猪瘟疫苗中间产品效力检验代替方法的准确性，对4个厂家17个批次的34份猪瘟兔化弱毒疫苗半成品进行100万倍稀释，采用本研究建立的HCLV FQ-PCR方法检测了各稀释度的病原含量，同时用兔体定型热反应测定了各稀释倍数的兔热反应情况，评估该方法作为疫苗中间产品效力检验的可行性。 

（1）RNA的抽提及存放 

RNA的抽提采用商品化试剂盒或采用常规RNA抽提方法。提取的RNA须在2h内进行扩增；若需长期保存须放置-70℃冰箱。 

（2）扩增试剂准备 

从试剂盒中取出各组分，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设需PCR数为n，其中n为待检样品数×重复数、1管阳性对照及1管阴性对照之和，每个样本测试反应体系配制见表3。 

表3反应体系配制表 

（3）加样 

在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述待检样品RNA的制备中制备的10μLRNA溶液，补水至50μL盖紧管盖。 

（4）HCLV-MGB-RT-PCR检测 

将上述PCR管放入荧光PCR检测仪（ABI7500荧光定量PCR仪，美国应用生物系统（ABI）公司产品）内，记录样本摆放顺序。 

循环条件设置： 

第一阶段，反转录50℃/20min； 

第二阶段，预变性94℃/3min； 

第三阶段，92℃/15s，60℃/35s，40个循环，60℃采集FAM荧光信号。 

试验检测结束后，由检测仪上根据采集的动态荧光信号曲线和CT值综合判定结果。 

（5）结果判定 

1）结果分析条件设定 

直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。 

2）质控标准 

阴性对照：无CT值并且无扩增曲线。 

阳性对照：CT值应在15.0～25.0。 

否则，此次实验视为无效。 

3）结果描述及判定 

①阴性：无CT值并且无典型的扩增曲线，表示样品中无猪瘟兔化弱毒疫苗株。 

②阳性：CT值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在猪瘟兔化弱毒疫苗株。 

③可疑：CT值>35且出现典型的扩增曲线的样本建议重做。重做结果出现CT值≤35和典型的扩增曲线者为阳性，否则为阴性。 

根据34份疫苗半成品原液稀释100万倍后的兔热反应情况进行参考，比较HCLV MGB-FQ-PCR测定病毒RNA拷贝数及兔热反应之间的相关性。结果显示：两只兔子都无热反应的情况下，其疫苗半成品原液CT值为21.15～27.30，对应病毒含量为8.80×10²copy/μL～6.52×10⁴copy/μL；当两只兔子有热反应但疫苗判定不合格的情况下其疫苗半成品原液中荧光定量CT值为17.47～23.70，病毒含量1.10×10⁴copy/μL～8.55×10⁵copy/μL；两只兔子都呈现定型热或者一只呈现定型热一只呈现轻热反应的情况下，CT值为17.10～20.81，病毒含量为8.27×10⁴copy/μL～1.11×10⁶copy/μL。HCLV-MGB-FQ-PCR与兔热反应之间存在良好的相关性，HCLV-MGB-FQ-PCR检测方法可以代替传统的兔热反应，对疫苗成品配制进行指导。 

Claims (2)

1.一种猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒的应用，其特征在于：该猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒主要用于猪瘟疫苗生产中半成品的效力检验。

2.如权利要求1所述一种猪瘟兔化弱毒疫苗荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中含有：阳性对照和阴性对照，RT-PCR反应液、反应酶、探针溶液、无酶水，其中：

（1）阳性对照和阴性对照：采用猪瘟兔化弱毒疫苗标准毒株冻干样品作为阳性对照，MEM细胞培养液作为阴性对照。

（2）RT-PCR反应液：每个反应包括10×PCR Buffer5μL、dNTP Mixture（2.5μM each）1.5μL、10μM HCLV-F1.5μL、10μM HCLV-R2μL，共10.0μL；其引物序列如下：

HCLV-F：5’-CCGCCAGTAGGACCCTAT-3’

HCLV-R：5’-GTGTAGTGTGGTAACTTGAGGTA-3’

（3）反应酶：每个反应包括SSⅢ^TM反转录酶0.3μL、Taq HS DNA聚合酶0.5μL，共0.8μL；

（4）探针溶液：每个反应需3μL，该探针序列为

HCLV-P：5’-FAM-AGATAACACTAATTTTCTTTTTTCTTT-MGB-3’

其中：FAM为羧基荧光素;MGB为小沟结合子；

（5）无酶水：超纯水高压灭菌后，加入终浓度为0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC），处理过夜，次日高压灭菌以去除DEPC。

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