TWI810144B - 核酸偵測和定量方法及組合物 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於一種偵測基因之方法。本發明亦關於一種判定基因之表現程度的方法。本發明亦關於用於此等方法之組合物。
Description
本發明係關於一種偵測基因之方法。本發明亦係關於一種判定基因之表現程度的方法。本發明亦係關於用於此等方法之組合物。
大量微生物存活於人類、家畜及野生動物當中。大多數此等物種以有益或共生方式存在，然而，一些物種能夠產生毒素或可在其他方面為有害的，從而可導致具有人類、家畜及野生動物的亞臨床或臨床指標之疾病或其他有害影響。因此，需要一種允許以特定、敏感且具時間及成本效益的方式偵測及/或定量微生物(例如，病原性微生物)或由微生物產生之有害物質(例如，毒素或其他毒力因子)的製程，其中微生物之樣本經由長距離運輸。傳統方法要求：將樣本遞送至實驗室(使其對來自溫度及其他環境條件的損害敏感)；將樣本塗於選擇性培養基上以分離個別菌落；使用端點聚合酶鏈反應(PCR)以擴增任何相關基因；及運行電泳凝膠以判定核酸之大小及純度。此等方法允許判定核酸的存在或不存在，但不允許定量。最近，已經開發定量即時PCR以使用螢光技術定量核酸之量。儘管此製程推進偵測系統，但其並未解決與使用選擇性平面培養(plating)法以回收微生物相關聯的勞動密集及價格。
申請人已開發出一種方法，該方法1)消除對回收微生物之勞動密集型及昂貴選擇性平面培養法的需求，及2)能夠定量微生物及/或其特異基因(例如，毒素或毒力相關基因)。該方法亦允許判定總微生物負荷且允許(例如)在室溫下穩定經由長距離運輸之核酸。此方法及其對應的組合物允許比利用先前方法更快且提供更準確結果之先進製程。
亦藉由以下枚舉條款描述本發明之若干實施例：
1.一種定量來自微生物之基因之表現程度的方法，該方法包含以下步驟：自穩定在卡上之樣本提取核酸，擴增核酸；及定量基因之表現程度，其中將正向引子及反向引子用於擴增。
2.如條款1之方法，其進一步包含將探針雜交至核酸以特異性識別基因之步驟。
3.如條款1或2之方法，其中反向引子包含選自由SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8組成之群的序列。
4.如條款1至3中任一項之方法，其中核酸為DNA。
5.如條款1至3中任一項之方法，其中核酸為RNA。
6.如條款1至5中任一項之方法，其中使用PCR擴增核酸。
7.如條款6之方法，其中PCR為反轉錄PCR。
8.如條款6之方法，其中PCR為反轉錄定量PCR。
9.如條款2至8中任一項之方法，其中探針經螢光標記。
10.如條款1至9中任一項之方法，其中引子經螢光標記。
11.如條款1至10中任一項之方法，其中微生物係選自由哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、坎普氏弧菌(Vibrio campbellii)、弗氏弧菌(Vibrio fluvialis)及副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)組成之群。
12.如條款1至10中任一項之方法，其中微生物係選自由產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、空腸曲桿菌(Campylobacter jejuni)及大腸曲桿菌(Campylobacter coli)組成之群。
13.如條款1至12中任一項之方法，其中樣本為來自動物之樣本。
14.如條款1至13中任一項之方法，其中樣本為水生樣本。
15.如條款14之方法，其中水生樣本係來自魚類孵化場。
16.如條款14之方法，其中水生樣本係來自養蝦池。
17.如條款1至13中任一項之方法，其中樣本為農業樣本。
18.如條款17之方法，其中農業樣本係來自動物墊料(litter)。
19.如條款17之方法，其中農業樣本係來自豬類或禽類物種的拭子。
20.如條款1至19中任一項之方法，其中基因為編碼毒素之基因。
21.如條款1至20中任一項之方法，其中基因為細菌物種之基因。
22.如條款1至20中任一項之方法，其中基因為病毒物種之基因。
23.如條款1至11或13至21中任一項之方法，其中基因為溶血素(hly)基因。
24.如條款1至10或12至21中任一項之方法，其中基因為產氣莢膜梭菌腸毒素(cpe)基因。
25.如條款1至10或12至21中任一項之方法，其中基因為產氣莢膜梭菌β毒素(cpb)基因。
26.如條款1至25中任一項之方法，其中核酸穩定在卡上歷時一段時間以允許海外運輸。
27.如條款1至26中任一項之方法，其中核酸穩定在卡上歷時一段時間以允許大於1000英里的運輸。
28.如條款1至26中任一項之方法，其中核酸穩定在卡上歷時一段時間以允許大於2000英里的運輸。
29.如條款1至26中任一項之方法，其中核酸穩定在卡上歷時一段時間以允許大於3000英里的運輸。
30.如條款1至26中任一項之方法，其中核酸穩定在卡上歷時一段時間以允許大於5000英里的運輸。
31.如條款1至30中任一項之方法，其中卡為WHATMAN® FTA®卡。
32.如條款1至31中任一項之方法，其中反向引子具有SEQ ID NO：6之序列。
33.如條款1至31中任一項之方法，其中反向引子具有SEQ ID NO：8之序列。
34.一種套組，其包含至少一個引子對，其中至少一個引子對包含正向引子及反向引子，且其中反向引子具有選自由SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8組成之群的序列。
35.如條款34之套組，其中至少一個引子對為螢光的。
36.如條款35之套組，其中至少一個引子對經螢光標記。
37.如條款34至36中任一項之套組，其中正向引子具有選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO.7組成之群的序列。
38.如條款34至37中任一項之套組，其中反向引子具有SEQ ID NO.6之序列。
39.如條款34至37中任一項之套組，其中反向引子具有SEQ ID NO.8之序列。
40.如條款34至39中任一項之套組，其進一步包含反轉錄酶。
41.如條款34至40中任一項之套組，其進一步包含DNA聚合酶。
42.如條款34至41中任一項之套組，其進一步包含dNTPs。
43.如條款34至42中任一項之套組，其進一步包含螢光探針。
44.如條款1至10或13至21中任一項之方法，其中微生物係選自由豬類產腸毒素性大腸桿菌(ETEC)、禽類病原性大腸桿菌(APEC)及棲息性(attaching and effacing)大腸桿菌(AEEC)組成之群。
45.如條款44之方法，其中ETEC為選自由K88、F18、F41、987P及K99組成之群的抗原類型。
圖1.展示針對qPCR反應的擴增(A圖)及標準曲線(B圖)分析。
圖2.A圖、B圖、C圖及D圖展示來自家禽墊料樣本之產氣莢膜梭菌的相對量。
圖3.展示對FTA卡及基因體DNA對照組之qPCR分析。
圖4.展示針對FTA卡對照組及樣本的標準曲線。
圖5.展示基於標準曲線的定量資料。
圖6.展示經測試樣本中總細菌負荷與總弧菌負荷之間的相關性。
圖7.展示針對弧菌屬(hyl)的RNA提取及qRT-PCR分析。
圖8.展示針對坎普氏弧菌、哈維氏弧菌、總弧菌的水產養殖池分析。
在一個實施例中，提供一種用於定量來自微生物之基因之表現程度的方法。該方法包含以下步驟：自穩定在卡上之樣本提取核酸；擴增核酸；及定量基因之表現程度，其中將正向引子及反向引子用於擴增。在另一實施例中，提供一種套組。該套組包含至少一個引子
對，其中至少一個引子對包含正向引子及反向引子，且其中反向引子具有由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8組成的序列。在一個實施例中，套組進一步包含螢光探針。
如本文所使用，術語「核酸」可意謂(例如)DNA、RNA(包括mRNA、siRNA、iRNA或微RNA)。
如本文所使用，術語「卡」可意謂已經化學修飾或化學處理以穩定核酸的任何有形培養基(例如，紙)。用於本文中所描述之方法的「卡」之實例為Whatman® FTA®卡。
在本專利申請案之發明內容部分中描述本發明之若干實施例，且在本申請案之此實施方式部分中所描述之每一實施例適用於發明內容中描述之該等實施例，包括由下文之所枚舉條款描述的實施例。在本文所描述的各種實施例中之任一者中，所枚舉條款中之以下特徵可在適用時呈現，從而提供本發明之額外實施例。對於所有實施例，亦預期實施例之任何可適用組合。
1.一種定量來自微生物之基因之表現程度的方法，該方法包含以下步驟：自穩定在卡上之樣本提取核酸，擴增核酸；及定量基因之表現程度，其中將正向引子及反向引子用於擴增。
2.如條款1之方法，其進一步包含將探針雜交至核酸以特異性識別基因之步驟。
3.如條款1或2之方法，其中反向引子包含選自由SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8組成之群的序列。
4.如條款1至3中任一項之方法，其中核酸為DNA。
5.如條款1至3中任一項之方法，其中核酸為RNA。
6.如條款1至5中任一項之方法，其中使用PCR擴增核酸。
7.如條款6之方法，其中PCR為反轉錄PCR。
8.如條款6之方法，其中PCR為反轉錄定量PCR。
9.如條款2至8中任一項之方法，其中探針經螢光標記。
10.如條款1至9中任一項之方法，其中引子經螢光標記。
11.如條款1至10中任一項之方法，其中微生物係選自由哈維氏弧菌、坎普氏弧菌、弗氏弧菌及副溶血弧菌組成之群。
12.如條款1至10中任一項之方法，其中微生物係選自由產氣莢膜梭菌、空腸曲桿菌及大腸曲桿菌組成之群。
13.如條款1至12中任一項之方法，其中樣本為來自動物之樣本。
14.如條款1至13中任一項之方法，其中樣本為水生樣本。
15.如條款14之方法，其中水生樣本係來自魚類孵化場。
16.如條款14之方法，其中水生樣本係來自養蝦池。
17.如條款1至13中任一項之方法，其中樣本為農業樣本。
18.如條款17之方法，其中農業樣本係來自動物墊料。
19.如條款17之方法，其中農業樣本係來自豬類或禽類物種的拭子。
20.如條款1至19中任一項之方法，其中基因為編碼毒素之基因。
21.如條款1至20中任一項之方法，其中基因為細菌物種之基因。
22.如條款1至20中任一項之方法，其中基因為病毒物種之基因。
23.如條款1至11或13至21中任一項之方法，其中基因為溶血素(hly)基因。
24.如條款1至10或12至21中任一項之方法，其中基因為產氣莢 膜梭菌腸毒素(cpe)基因。
25.如條款1至10或12至21中任一項之方法，其中基因為產氣莢膜梭菌β毒素(cpb)基因。
26.如條款1至25中任一項之方法，其中核酸穩定在卡上歷時一段時間以允許海外運輸。
27.如條款1至26中任一項之方法，其中核酸穩定在卡上歷時一段時間以允許大於1000英里的運輸。
28.如條款1至26中任一項之方法，其中核酸穩定在卡上歷時一段時間以允許大於2000英里的運輸。
29.如條款1至26中任一項之方法，其中核酸穩定在卡上歷時一段時間以允許大於3000英里的運輸。
30.如條款1至26中任一項之方法，其中核酸穩定在卡上歷時一段時間以允許大於5000英里的運輸。
31.如條款1至30中任一項之方法，其中卡為WHATMAN® FTA®卡。
32.如條款1至31中任一項之方法，其中反向引子具有SEQ ID NO：6之序列。
33.如條款1至31中任一項之方法，其中反向引子具有SEQ ID NO：8之序列。
34.一種套組，其包含至少一個引子對，其中至少一個引子對包含正向引子及反向引子，且其中反向引子具有選自由SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8組成之群的序列。
35.如條款34之套組，其中至少一個引子對為螢光的。
36.如條款35之套組，其中至少一個引子對經螢光標記。
37.如條款34至36中任一項之套組，其中正向引子具有選自由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5及SEQ ID NO.7組成之
群的序列。
38.如條款34至37中任一項之套組，其中反向引子具有SEQ ID NO.6之序列。
39.如條款34至37中任一項之套組，其中反向引子具有SEQ ID NO.8之序列。
40.如條款34至39中任一項之套組，其進一步包含反轉錄酶。
41.如條款34至40中任一項之套組，其進一步包含DNA聚合酶。
42.如條款32至41中任一項之套組，其進一步包含dNTPs。
43.如條款34至42中任一項之套組，其進一步包含螢光探針。
44.如條款1至10或13至21中任一項之方法，其中微生物係選自由豬類產腸毒素性大腸桿菌(ETEC)、禽類病原性大腸桿菌(APEC)及棲息性大腸桿菌(AEEC)組成之群。
45.如條款44之方法，其中ETEC為選自由K88、F18、F41、987P及K99組成之群的抗原類型。
用於偵測及/或定量微生物或其基因(例如，毒素或毒力基因)之方法及組合物為特定的。在各種實施例中，經偵測或其基因之表現程度經定量的微生物可為感染動物之任何微生物。在各種實施例中，微生物可包括病原體，諸如細菌(包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性球菌或桿菌)、真菌、病毒(包括DNA及RNA病毒)，黴漿菌及寄生蟲。
在一個實施例中，微生物為細菌。在此實施例之一個態樣中，細菌可包括(但不限於)：醋桿菌、放線菌、農桿菌、邊蟲、固氮根瘤菌、固氮菌、芽孢桿菌、擬桿菌、巴爾通體菌、博德氏桿菌、伯克霍爾德菌、曲桿菌、衣原體、嗜衣體、梭菌、棒狀桿菌、柯克斯氏體、艾利希體、腸桿菌、腸球菌、埃希氏菌、弗朗西斯氏菌、梭桿菌、加德納菌、嗜血桿菌、螺旋桿菌、克雷伯氏菌、乳桿菌、軍團菌、李斯 特菌、甲烷桿菌、微桿菌、微球菌、莫拉菌、分枝桿菌、支原體、奈瑟氏菌、巴氏桿菌、消化鏈球菌、卟啉單胞菌、普氏菌、假單胞菌、根瘤菌、立克次體、羅克利馬氏體菌、羅克利馬氏體菌、羅氏菌、沙門氏菌、沙雷氏菌、志賀桿菌、葡萄球菌、寡養單胞菌、鏈球菌、密螺旋體、弧菌、沃爾巴克氏體或耶氏桿菌。
在另一態樣中，微生物係選自由豬類產腸毒素性大腸桿菌(ETEC)、禽類病原性大腸桿菌(APEC)及棲息性大腸桿菌(AEEC)組成之群。在又一說明性態樣中，ETEC為選自由K88、F18、F41、987P及K99組成之群的抗原類型。APEC產生毒素，諸如(但不限於)：不穩定毒素(LT)、穩定毒素A(StA)、穩定毒素B(StB)及維羅毒素(志賀樣毒素，SLT)。
在另一實施例中，微生物為病毒。在一個態樣中，病毒可包括(但不限於)DNA病毒，諸如乳突狀瘤病毒、小病毒、腺病毒、疱疹病毒及牛痘病毒；及RNA病毒，諸如沙粒狀病毒、冠狀病毒、鼻病毒、呼吸道融合細胞病毒、流感病毒、小核糖核酸病毒、副黏液病毒、里奧病毒、反轉錄病毒及棒狀病毒。
真菌之實例包括成長為黴菌或為類酵母的真菌，包括例如引起疾病(諸如癬菌病、組織漿菌病、芽生菌病、麴菌病、隱球菌病、孢子絲菌病、球黴菌病、巴西副球黴菌病(paracoccidio-idomycosis)及念珠菌病)的真菌。
例示性寄生蟲包括(但不限於)軀體絛蟲、血吸蟲、組織蛔蟲、變形蟲及瘧原蟲、錐蟲、利什曼原蟲及弓蟲種。在先前段落中描述之微生物實施例的各種態樣中，由此等微生物中之任一者表現之任何基因表現可使用本文中所描述之方法定量。在各種實施例中，基因可為編碼毒素或毒力因子之基因。
在另一實施例中，經測試之樣本可為來自任何動物之任何樣
本。如本文所使用，詞語「動物」意謂人類、家畜(例如犬種或貓種)、實驗動物、農業動物、或野生動物或任何其他類型之動物。如本文所使用，農業動物可包括任何經飼養以供個人使用(例如用於提供食物、燃料等)或盈利之動物。在又一實施例中，家畜可包括任何出於陪伴目的而餵養或飼養的動物(例如狗或貓)。因此，在各種實施例中，本發明可應用於來自動物之樣本，該等動物包括(但不限於)人類(例如人類患者)、實驗動物(如齧齒動物(例如小鼠、大鼠、倉鼠等)、兔、猴、黑猩猩)、家畜(諸如狗、貓及兔)、農業動物(諸如牛、馬、小馬、豬、綿羊、山羊、魚、甲殼動物、雞、火雞、雉、鵪鶉、鴕鳥及鴨)，及野生動物，例如圈養的野生動物(諸如熊、熊貓、獅、虎、豹、象、斑馬、長頸鹿、大猩猩、海豚及鯨魚)。
在一個態樣中，取樣之農業動物可包括牛種(例如牛及野牛)、馬種(例如馬、小馬及驢)、綿羊種(例如綿羊)、山羊種(例如山羊)、兔及家禽(例如雞、火雞、雉、鴨、鴕鳥、鴯鶓、鵪鶉及鵝)。
在其他實施例中，樣本可來自環境，包括動物環境。樣本可為水生樣本，諸如來自魚類孵化場之水樣本、來自養蝦池之樣本、來自動物之飲用水的樣本，等。在另一態樣中，樣本可為農業樣本，諸如來自動物墊料之樣本、或任何其他農業環境樣本、來自農業動物(例如，豬類或家禽物種)之腸道的拭子、來自農業動物之鼻道的拭子、來自農業動物之皮膚的拭子、來自農業動物之耳朵的拭子、來自農業動物之眼部的拭子、來自農業動物之尿液樣本、來自農業動物之鼻分泌物樣本、來自農業動物之支氣管灌洗、農業動物之脊髓液樣本、來自農業動物之胸膜液樣本、來自農業動物之滑液樣本、來自農業動物之胃分泌物樣本、來自農業動物之糞便的樣本、或來自農業動物之血清或血漿樣品。
在各種說明性實施例中，來自人類之可針對微生物或其基因之存在測試或可自其定量基因表現的樣本包括(但不限於)：尿液、鼻分泌物、鼻洗液、內耳液、支氣管灌洗、支氣管洗液、肺泡灌洗、脊髓液、骨髓抽出物、痰、胸膜液、滑膜液、心包液、腹膜液、唾液、淚液、胃分泌物、糞便、生殖道分泌物(諸如，精液)、淋巴液、及全血、血清或血漿。在另一實施例中，樣本可使用本文中所描述之卡的類型經製備以如本文中所描述來測試。在各種實施例中，此等樣本可包括組織活檢體。如本文所使用，術語「組織」包括但不限於：活檢體、屍檢標本、細胞提取物、組織切片、抽出物、組織拭子及細針抽出物。在另一實施例中，樣本可為任何環境樣本。
根據本文中所描述之方法經測試的樣本可穩定(例如，核酸可穩定)於卡(例如，Whatman® FTA®卡)上歷時一段時間以允許海外運輸或長距離運輸。在各種實施例中，核酸穩定於卡上歷時一段時間以允許大於1000英里、大於2000英里、大於3000英里、大於4000英里、大於5000英里、大於6000英里、大於7000英里、大於8000英里、大於9000英里或大於10000英里之運輸。在各種實施例中，核酸可穩定於卡上歷時選自由以下各者組成之群的一段時間：3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、1個月、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月、11個月及12個月，或大於此等時間段中的任一者。
本文中所描述之方法及組合物可用於偵測及/或定量微生物及/或其基因(例如，基因之表現程度)。在一個說明性實施例中，提供一種用於定量來自微生物之基因之表現程度的方法。該方法包含以下步驟：自卡上之樣本提取核酸；擴增核酸；及定量基因之表現程度。在擴增步驟中使用反向引子及正向引子。該方法可進一步包含將探針雜交至核酸以特異性識別基因。
在一些實施例中，基於即時PCR之方法可用於擴增核酸且藉由將探針雜交至核酸以偵測及/或定量微生物及/或由微生物表現之基因。PCR描述於以引用之方式併入本文中的美國專利第4,683,202號及第4,800,159號中，且用於PCR之方法為此項技術中熟知的。即時PCR組合擴增與同步的探針雜交以實現對微生物或基因(該等微生物即時地表現藉此提供瞬時偵測及/或定量)之敏感及特定偵測及/或定量。在此實施例中，偵測及/或定量微生物或基因表現之時間大大減少。可根據此項技術中熟知的方法進行即時PCR。反轉錄PCR為用於偵測及定量mRNA之高度敏感技術，該反轉錄PCR包含藉由反轉錄自RNA合成cDNA及藉由PCR擴增特定cDNA。反轉錄定量PCR藉由使用螢光探針定量地量測cDNA之擴增。
可根據本發明使用之例示性探針及引子及其目標核酸展示如下。正向引子及反向引子經展示且為本領域中之熟知術語。
在本文中所描述之各種實施例中，用於擴增核酸及用於偵測及/或定量微生物及/或其基因之引子及探針為自約十個至約一百個、更通常地自約十個至約三十個或約六個至約二十五個鹼基對長但可使用任何合適之序列長度的寡核苷酸。在說明性實施例中，引子及探針可為雙股或單股，但引子及探針通常為單股。在另一實施例中，本文中所描述之引子及探針能夠在適合之雜交條件(例如，適合緩衝液、離子強度、溫度、甲醯胺及MgCl2濃度)下特異性雜交至目標核酸區域。在另一態樣中，本文中所描述之引子及探針基於在一定範圍內具有融合溫度，且與目標核酸實質上互補來設計。用於設計引子及探針之方法描述於Sambrook等人之「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001))」中，該文件以引用之方式併入本文中。
在一個說明性實施例中，通用引子可用於提供在進行目標特異性分析之前用於判定核酸之存在或用於判定特定核酸相對於所存在總核酸之程度的方法。例示性細菌性通用引子可具有以下序列：
正向引子，5'-GCGGATCCGCGGCCGCTGCAGAGTTTGATCCTGGCTCA
G-3'(SEQ ID NO.13)
正向引子5'-GCGGATCCTCTAGACTGCAGTGCCAGCAGCCGCGGTAA-3'(SEQ ID NO.14)
反向引子5'-GGCTCGAGCGGCCGCCCGGGTTACCTTGTTACGACTT-3'(SEQ ID NO.15).
在各種實施例中，本文中所描述之用於PCR之引子及探針可藉由取代、缺失、截斷經修改，及/或可與其他核酸分子融合，其中所得引子及探針特異性雜交至預期目標核酸，且可在本文所描述之方法中使用以擴增目標核酸。在一個實施例中，亦可製得衍生物(諸如，硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基磷酸酯及甲基膦酸酯衍生物)，該等衍生物特異性結合至(例如)單股DNA或RNA(Goodchild等人，Proc.Natl.Acad.Sci.83：4143-4146(1986))。
在一個實施例中，本發明涵蓋經分離或實質上經純化的核酸。在另一實施例中，「經分離」或「經純化」核酸分子在由重組技術產生時實質上不含其他細胞物質或培養基，或在經化學合成時實質上不含化學前驅體或其他化學品。較佳地，「經分離」或「經純化」核酸在衍生核酸之基因體核酸中不含天然位於該核酸之側翼的序列。舉例而言，在各種實施例中，經分離或經純化核酸在衍生核酸之細胞的基因體核酸中可含有天然位於該核酸側翼之小於約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列。
在一個實施例中，提供在極嚴格條件下與本文中所描述之探針及引子互補的核酸，及雜交至本文中所描述之核酸的彼等或雜交至其互補體的彼等。在一個態樣中，「極嚴格條件」意謂在65℃下在5X SSPE及50%甲醯胺中雜交，且在65℃下在0.5X SSPE中洗滌。針對高嚴格度、低嚴格度及中度嚴格雜交的條件描述於Sambrook等人之「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(第3版，Cold Spring
Harbor Laboratory Press,(2001))中，該文件以引用之方式併入本文中。在一些說明性態樣中，雜交沿核酸之全長發生。
在一個實施例中，可使用與本文中所描述之探針及引子具有約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、96%、97%或98%之同源性的核酸。可(例如)藉由使用GAP程式(Genetics Computer Group，軟體；目前可在http：//www.accelrys.com上經由Accelrys獲得)測定序列之間的百分比一致性或類似性，且可使用(例如)ClustalW演算法(VNTI軟體，InforMax公司)實現對準。在一個態樣中，可使用所關注之核酸序列搜尋序列資料庫。在另一態樣中，用於資料庫搜尋之演算法通常係基於BLAST軟體(Altschul等人，1990)，且百分比一致性可沿核酸之全長測定。
如本文所使用，術語「互補」指代嘌呤核苷酸序列及嘧啶核苷酸序列經由氫鍵結締合以形成雙股核酸之能力。鳥嘌呤及胞嘧啶、腺嘌呤及胸腺嘧啶、及腺嘌呤及尿嘧啶互補且可經由氫鍵結締合，從而導致在兩個核酸具有「互補」序列時形成雙股核酸。互補序列可為DNA或RNA序列。互補DNA或RNA序列被稱為「互補體」。
用於合成本文中所描述之探針及引子的技術為此項技術中熟知的，且包括(但不限於)化學合成及重組方法。此類技術描述於Sambrook等人之「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001))中，該文件以引用之方式併入本文中。引子及探針亦可在商業上獲得(例如，CytoMol,Sunnyvale,CA或Integrated DNA Technologies,Skokie,IL)。用於純化或分離本文中所描述之探針及引子之技術為此項技術中熟知的。例示性技術描述於Sambrook等人之「Molecular Cloning：A Laboratory Manual」(第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,(2001))中，該文件以引用之方式併入本文中。本文中所描述之引子及探針可藉由此
項技術中已知之技術分析，諸如，限制酶分析或定序，以判定引子及探針之序列是否正確。
在本文中所描述之方法及組合物的各種實施例中，探針及/或引子可經標記，諸如經螢光標記、放射性標記、或藉由抗原、化合物(諸如生物素-抗生物素蛋白、比色化合物)或熟習此項技術者已知之其他標記劑予以標記，以允許(諸如)藉由即時反轉錄定量PCR來偵測及定量經擴增核酸。在說明性實施例中，標記可包括6-羧基螢光素(FAMTM)、TETTM(四氯-6-羧基螢光素)、JOETM(2,7,-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基螢光素)、VICTM、HEX(六氯-6-羧基螢光素)、TAMRATM(6-羧基-N,N,N',N'-四甲基若丹明)、BHQTM、SYBR®Green、Alexa 350、Alexa 430、AlexaFluor 488及AlexaFlour 647(Molecular Probes,Eugene,Oregon)、AMCA、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、喀斯喀特藍(Cascade Blue)、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、螢光素、若丹明、藻紅素、生物素、釕、DyLight螢光劑(DyLight 680、CW 800、反式環辛烯、四嗪、甲基四嗪及其類似物)、俄勒岡綠(Oregon Green)(諸如，俄勒岡綠488、俄勒岡綠500及俄勒岡綠514)、太平洋藍(Pacific Blue)、REG、若丹明綠(Rhodamine Green)、若丹明紅(Rhodamine Red)、ROX及/或德克薩斯紅(Texas Red)。在一個實施例中，探針及/或引子可為螢光的(亦即，產生或增強螢光)。舉例而言，探針及/或引子可包含藉由化合物(例如，酵素)起作用以產生或增強螢光之螢光標記或非螢光分子。
本文中所描述之方法實施例可提供診斷感染之方法。在一個實施例中，需要診斷感染之人類可包括呈現感染徵兆的人員、癌症病患、手術後病患、移植病患、傷口護理病患、經受化學療法之病患、免疫抑制病患及其類似物。在另一實施例中，需要診斷感染之家畜、
農業動物、實驗動物或野生動物可包括呈現感染跡象或徵兆的任何動物。
在一個實施例中，提供套組。套組適用於偵測及/或定量微生物及/或其基因表現(例如，毒素或毒力基因之表現)。在一個態樣中，套組可含有本文中所描述之探針及/或引子。在一個態樣中，引子或探針可為螢光的(例如，經螢光標記)。在另一實施例中，套組亦可含有用於核酸擴增之組分，諸如熱穩定DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶或Vent聚合酶)、緩衝液、MgCl2、H2O、dNTPs、反轉錄酶及其類似物。在一個實施例中，試劑可以液態形式保留。在另一實施例中，可凍乾試劑。在另一說明性實施例中，套組亦可含有使用說明書。
在另一實施例中，提供一種套組，其包含具有選自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15組成之群的序列或選自由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15組成之群的序列之互補體的核酸。在另一實施例中，提供一種套組，其包含具有選自由SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8組成之群的序列或選自由SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8組成之群的序列之互補體的核酸。套組適用於偵測及/或定量微生物及/或其基因表現(例如，毒素或毒力基因之表現)。在一個態樣中，套組可含有此段落中所描述之探針及/或引子。在一個態樣中，引子或探針可為螢光的(例如，經螢光標記)。在另一實施例中，套組亦可含有用於核酸擴增之組分，諸如熱穩定DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶或Vent聚合酶)、緩衝液、MgCl2、H2O、dNTPs、反轉錄酶及其類似物。在一個實施例中，試劑可以液態形式保留。在另一實施例中，可凍乾試劑。在另一說明性實施例中，套組亦可含有使用說明書。
在一個實施例中，提供經純化或經分離之核酸，其包含以下或由以下組成：SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15之序列或在極嚴格條件下與由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15組成之序列雜交的序列。在另
一實施例中，提供經純化或經分離之核酸，其包含SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15之序列的互補體或在極嚴格條件下與由SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：15組成之序列的互補體雜交之序列。在另一實施例中，包含經純化或經分離核酸之套組，其具有選自由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8之序列組成的群之序列或在極嚴格條件下與由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8組成的序列雜交之序列。在另一實施例中，亦提供經純化或經分離之核酸，其包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8之序列的互補體或在極嚴格條件下與由SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8組成之序列的互補體雜交之序列。在一個實施例中，「極嚴格條件」意謂在65℃在5X SSPE及50%甲醯胺中雜交，且在65℃在0.5X SSPE中洗。
在另一實施例中，在無菌容器(例如小瓶)或封裝(例如安瓿或密封小瓶)中提供本文中所描述之引子或探針或其組合。
如本文所描述，「卡」可為例如FTA®卡(Whatman®ETA®卡；例如Whatman®目錄編號：WB12-0205、WB12-0206、WB12-0055、WB12-0056、WB12-0210、WB12-0210、WB12-0211及WB12-0208；GE Healthcare Life Sciences,Pittsburgh,PA)。諸如Whatman® FTA®卡之卡習知用於法醫科學中以收集例如血或頰細胞。Whatman® FTA®卡簡化對核酸(例如DNA及RNA，包括mRNA、siRNA、iRNA、微RNA等)之處置及加工。Whatman® FTA®卡含有溶解細胞、使蛋白質變性及保護核酸免受核酸酶、氧化及UV損害的化學品。此外，其使生物快速不活化及阻止細菌及其他微生物之生長。當將樣本應用於Whatman® FTA®卡時，細胞膜及細胞器溶解，且所釋放之核酸陷入基質之纖維中且在運輸期間在室溫保存(例如減少分解)。舉例而言，在到達遠地時，核酸可輕易經由純化步驟自卡之沖孔溶離且製備以用於下游加工，如此項技術中已知。此技術亦消除選擇性平面培養
(plating)及培養物生長之勞動密集。
以下實例提供用於進行本發明實踐的說明性方法。因此，此等實例僅出於說明之目的而提供且不欲限制。
將25mL可用的最無菌水添加至50mL錐形管。將一滿匙墊料材料添加至50mL錐形管中且劇烈搖動30秒。使木片及其他厚料短暫沈降至瓶子。使用移液管，將125μL溶液添加至FTA卡上。使卡在陰涼、乾燥區域中乾燥最少2至3小時。將卡置放於具有2個乾燥劑包的所供應拉鏈袋中。
藉由抹拭豬直腸或家禽泄殖腔以收集及吸收材料來收集樣本。將拭子緊緊按壓於FTA卡塗抹圓圈上且滾動。使卡在陰涼、乾燥區域中乾燥最少2至3小時。將卡置放於具有2個乾燥劑包的所供應拉鏈袋中。
六個盤片係自卡打孔(Miltex活組織檢查鑽孔)且置放於96孔塊中。針對每一樣本混合25μL蛋白酶K及180μL緩衝液T1。將200μL溶液添加至圓孔塊之各孔中。該塊在56℃下培育至少6小時(或視情況隔夜)。將該塊離心以收集冷凝物。將200μL緩衝液BQ1及200μL 96%至100%乙醇添加至每一樣本。樣本藉由搖動10秒至15秒劇烈混合且短暫自旋以收集樣本。溶解物轉移至組織結合板之孔中且在5000g
下自旋10分鐘。添加500μL緩衝液BW且在5000g下自旋2分鐘。添加700μL緩衝液B5且在5000g下自旋4分鐘。結合板置放於打開的管帶之托架上且在70℃下培育10分鐘以蒸發所有乙醇。藉由添加100μL預加熱至70℃之緩衝液BE，在5000g下自旋2分鐘溶離DNA。
在37℃下藉由180μL溶解緩衝液預處理樣本至少45分鐘。遵循如針對革蘭氏陰性細菌所陳述之樣本協定。使用Quantus螢光計定量濃度。在1：200濃度下在1×TE緩衝液中製備dsDNA染料。添加及渦旋10μL DNA、90μL 1×TE緩衝液及100μL所製備dsDNA染料。該管置放於螢光計中且經量測。
基於反應數目、引子濃度及反應體積計算2X MasterMix、每一引子及dH2O之量。添加所有組分、混合且分佈至pcr管中。以10-1連續稀釋樣本，將適合之參考菌株及2μL樣本添加至pcr管。將2μL樣本DNA模板添加至每一管且渦旋帶。針對根據所使用之引子集的適合之循環條件建立每一qPCR反應。一旦反應完成，即將Bio-Rad程式用於分析與參考菌株中之彼等相比的Cq值。
在Quantus螢光計機器上進行量測，且結果如下：Pen 14=0.402ng/μL
Pen 41=0.418ng/μL
Pen 43=0.502ng/μL
Pen 44=0.299ng/μL
DNA歸一化計算
方程式：V1C1=V2C2
定量PCR基於特異性設計之引子擴增經純化DNA，該等引子在基因序列中以特定區域為目標。另外，進一步當擴增DNA時藉由併入有螢光探針而啟動即時螢光量測以定量樣本，而非基於端點PCR中之譜帶強度對此進行測定，qPCR進行一個步驟。寡核苷酸探針亦添加經升高的特異性因子。探針經特異性設計而以基因序列為目標且僅在結合時發螢光，因此當探針特異性結合於目標基因dsDNA時熱循環儀進行量測，而端點PCR擴增任何dsDNA。基於DNA樣本開始擴增需要之循環數目將擴增量測為Cq值(圖1A)，且以RFU值量測螢光之強度。Cq值愈低，擴增需要之循環愈少，因此存在愈多目標基因。自標準曲線(圖1B)導出定量數目，該標準曲線係根據具有已知初始計數值之連續稀釋參考菌株計算。可接受標準曲線實現在-3.1與-3.6之間的斜率，提供在90%與110%之間的反應效率。
將相對量計算為總微生物負荷與Cq值中之每一者的百分比。在種的層次(產氣莢膜梭菌)、屬的層次(梭菌屬(Clostridium spp.))上且針對總微生物進行qPCR反應。如本文所描述，包含來自涵蓋大多數腸梭菌之梭菌群集I、IV及XIV的梭菌計數值。圖2(A圖、B圖、C圖及D圖)展示自農場試驗採集之家禽墊料樣本的實例。圓形圖表示總微生物負荷內之總梭菌屬內的產氣莢膜梭菌之量。
如先前所描述，絕對量係自由具有已知初始計數值之連續稀釋
參考菌株產生的標準曲線導出。此技術用於定量樣本中之產氣莢膜梭菌的絕對量。SQ值表示每一樣本之所計算計數值。
本文中所描述之方法用於針對所關注之病原性細菌種判定存在或不存在與基因相關聯之特定毒素以及特定毒素之絕對量或相對量。此技術中之重要區別為自DNA樣本偵測存在或不存在基因且並非量測
所表現之毒素基因的量。瞭解樣本中具有哪些毒素基因對評定疾病風險至關重要。來自樣本之RNA經存取以判定實際上正產生及表現之毒素的量，此係因為該毒素之量與疾病發生直接相關。亦經由量測樣本DNA相對於含有目標基因之已知參考菌株之擴增的qPCR反應實現毒素偵測。
分析以來自保留於FTA卡上之池水中的細胞之DNA進行的通用細菌16S rDNA qPCR分析之效能。用於分析驗證之對照DNA由無菌水中之坎普氏弧菌基因組DNA之連續稀釋組成，一式三份地進行。將來自先前弧菌偵測研究(2013-06-18)之具有在5.8×108CFU/ml與5.8×103CFU/ml之間的濃度的摻入坎普氏弧菌之FTA卡用作卡方法之定量標準。來自Dac-Loc蝦場之FTA卡為未知的。所有樣本一式三份地進行。使用20μl Bio-iTaq SYBR Green Supermix(1×)、通用細菌性16S引子1099F及1510R(Reysenbach等人，Appl Environ Microbiol，1994年6月；60(6)：2113-2119)(各400nM)之反應混合物及5μl自FTA卡提取之模板DNA執行定量PCR。包括無模板對照組。循環條件經設計成具有Bio-Rad's CFX Manager軟體中之協定自動寫入器且如下：在95℃下3分鐘，40個循環(95℃下10秒、55℃下20秒、72℃下20秒，後接板讀取)，隨後熔融曲線分析，自65℃至95℃以0.5℃遞增。使用基因組DNA對照組(E=96/6%,R2=0.993)之結果展示於圖3(A圖及B圖)中。擴增在33個循環之後發生在無模板對照組中，但此為與通用引子共有的，此係由於大多數Taq聚合酶及其他PCR酶類中之大腸桿菌gDNA污染。(參見圖3，A圖及B圖)。
FTA卡對照組及樣本之標準曲線展示於圖4(A圖及B圖中)。定量資料視用於建構標準曲線之點而改變。大多數保守版本不包括
5.8×103及5.8×104CFU/ml資料點(此係因為其與無模板對照組重疊)及在標準曲線上保持4-log範圍的一個離群值點(參見圖5，A圖)。消除5.8×108CFU/ml稀釋液改善標準曲線之擬合但縮小範圍(參見圖5，B圖)。經測試樣本中之總細菌負荷與總弧菌負荷之間的相關性展示於圖6中。
在水樣本及FTA卡樣本中經由以其溶血素(hly)基因序列為目標之PCR分析偵測哈維氏弧菌及坎普氏弧菌，且分析FTA卡樣本中之溶血素基因的表現。端點PCR分析用於偵測經稀釋之池水樣本及乾燥儲存於FTA卡上之池水樣本中存在或不存在hly基因。PCR分析藉由水樣本及FTA卡樣本評估定量PCR之效能。反向引子經開發以擴增比原始分析(對於qPCR之更佳效能)更小之hly基因切片，且檢查針對所公佈哈維氏弧菌及坎普氏弧菌序列的特異性。對於總弧菌及總細菌之額外
PCR分析用於測定池水樣本中之坎普氏弧菌及哈維氏弧菌的比例豐度。評估哈維氏弧菌RNA在FTA卡上之穩定性以判定基因表現分析之可能性。評估PCR分析的qRT-PCR基因表現分析的偵測液體培養物中之hly mRNA之效能。使用自FTA卡提取之哈維氏弧菌RNA評估qRT-PCR分析之敏感度。
按製造商所指示的來執行。
對於端點PCR，使用用於直接自FTA卡樣本沖孔進行擴增的製造商之說明書。對於定量PCR，藉由Qiagen DNeasy微型套組自卡溶離DNA。(協定：自乾血斑提純DNA。在GE Life Science之應用註釋28-9822-22 AA中列出使用QiaAmp DNA研究者套組的幾乎相同程序)。
製造商之協定用於以RNA處理緩衝液(針對RT-PCR或北方墨點分析(Northern Blot Analysis)自FTA®卡上之血及組織培養物製備RNA)或Qiagen RNeasy微型套組進行提取。
引子集如下：
RNA係自4×2.0mm沖孔提取以用於測定產量，或自每一FTA卡之取樣區域的二分之一提取以用於後續基因表現分析，其中RNeasy微型套組(Qiagen)在溶液中具有柱上DNA酶消化及額外DNA酶消化，後接藉由RNeasy微柱之RNA清除。RNA藉由螢光方法經定量，且來自每一處理劑之80ng之RNA藉由iScript反轉錄酶(Bio-Rad)一式兩份地經反轉錄，且使用每20μl反應2μl之cDNA模板、每RT反應3次技術重複執行SYBR Green定量PCR(Bio-Rad iTaq SYBR Green Supermix)。經擴增基因為hly及弧菌特異性16S rRNA。經由CFX Manager中之△△Cq方法計算具有PCR效率校正之相對歸一化表現。
來自2天長的FTA卡RNA產量之範圍為自<5ng(藉由Direct-Zol套組)至610ng(藉由Whatman RNA處理緩衝液)。低產率Direct-Zol方法自進一步分析排除。儲存溫度之效應係藉由用高產率方法(Whatman的RNA處理緩衝液)提取之樣本來測定。在-20℃或20℃下儲存20天之後並未觀測到RNA損耗。在37℃下觀測到25%減少，但產量保持在每5個穿孔提取高於400ng，在此研究中使用足夠用於藉由標準套組(諸如iScript RT超混合液)進行反轉錄的量。
自儲存了至少2個月之FTA卡成功地提取RNA，其中來自儲存於FTA卡上之純培養物的產量高達每5個穿孔製備型500ng，或每4mm穿孔100ng。在實驗過程內在室溫下或凍結樣本中未偵測到RNA濃度降低。在持續儲存於37℃下觀測到RNA產量降低25%，但FTA卡將仍適用於自遠端位置之運送，其中在運送期間預期短期的熱應力。參見圖7，A圖及B圖。
針對坎普氏弧菌、哈維氏弧菌、總弧菌及總細菌藉由上文所描述的qPCR分析來分析自越南六個蝦池收集的FTA卡上之池水樣本，每DNA提取使用18×2.0mm盤片且每qPCR使用100μl模板DNA。用於定量之標準曲線由應用於FTA卡且用同一方法提取之哈維氏弧菌及坎普氏弧菌細胞之連續十倍稀釋液組成。
在經測試池樣本中之哈維氏弧菌及坎普氏弧菌濃度範圍為自1.5×104個細胞/毫升至1.5×105個細胞/毫升，同時總弧菌濃度範圍為自9.7×104個細胞/毫升至2.3×106個細胞/毫升，且所估計總細菌群體範圍為自6.5×106個細胞/毫升至3.5×107個細胞/毫升。在所有經測試池中，坎普氏弧菌及哈維氏弧菌表示所估計細菌計數之小於2%。在池A4及A6中，其他弧菌為主要的，表示所估計細菌豐度之8-11%。參見圖8，A圖及B圖。
先前所使用之溶離方法(針對弧菌)對於梭菌而言並非最佳，此係由於梭菌之gram+結構較難溶解。對於梭菌屬，DNA分離協定在併入來自乾血斑協定(針對弧菌)及gram+細菌預處理協定之不同態樣的同時執行。使用溫度及時間之不同組合將溶菌酶預處理及添加之蛋白酶K及AL溶解緩衝液添加至樣本以判定哪一者產生最大DNA濃度及最低Cq值。經由額外乙醇步驟遵循gram+細菌預處理協定，且隨後根據產
生最佳DNA結果之乾血斑協定完成旋柱製程。
1)16S通用細菌BV4-5；梭菌群集I、IV及XIV；曲桿菌屬
2)Cpn60-產氣莢膜梭菌；空腸曲桿菌；大腸曲桿菌
3)毒素基因-cpe及cpb
4)通用細菌(cpn60)
5)梭菌族群集-I、IV、XIV
結果將展示(例如)總梭菌相對於通用細菌之相對定量、產氣莢膜梭菌、cpe及cpb毒素基因之絕對定量，及曲桿菌屬、空腸曲桿菌及大腸曲桿菌之絕對定量。
使用三個RNA提取協定測定自保留於Whatman FTA(用於分析之較快技術)卡上之細胞提取的哈維氏弧菌RNA之功效、穩定性及產量。藉由反轉錄(RT)-qPCR評定下游效能，且在20天後評定儲存於-20℃與37℃之間的樣本的穩定性。此方法亦用於偵測在儲存於FTA卡之前暴露於不同pH及鹽度處理液之細胞中的溶血素(hly)毒素基因表現之改變。三個RNA提取協定中之兩個自FTA卡成功地提取RNA，且在-20℃、25℃或37℃下的RNA產量在20天後實質上未下降。在不同pH或鹽度下的處理液中對基因表現之RT-qPCR分析確定hly基因表現相對於對照條件增加至多達五倍。應用於在田間收集之FTA卡樣本的RT-qPCR協定可用於監測及降低弧菌病的發病率，此係由於水產養殖應用中較差水質問題。
<110> 美商微生物發現公司(MICROBIAL DISCOVERY GROUP,LLC) 美商聯合動物保健公司(UNITED ANIMAL HEALTH,INC.)
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Claims (15)
- 一種偵測微生物且定量來自該微生物之基因之表現程度的方法，該方法包含以下步驟：i)自穩定在卡上之樣本提取DNA，且接著擴增該DNA並偵測該微生物；及ii)自穩定在卡上之樣本提取RNA並移除DNA，使用柱(column)純化該RNA，且接著將該RNA反轉錄為cDNA並擴增該cDNA，且定量該基因之表現程度，其中正向引子及反向引子係用於該擴增，且其中i)中的該DNA係使用定量即時PCR擴增，以及經螢光標記之探針係與該基因雜交以特異性識別該基因，且ii)中的該基因係使用反轉錄定量PCR(RT-qPCR)擴增。
- 如請求項1之方法，其中該反向引子包含選自由SEQ ID NO：6及SEQ ID NO：8組成之群的序列。
- 如請求項1之方法，其中該引子經螢光標記。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該微生物係選自由哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、坎普氏弧菌(Vibrio campbellii)、弗氏弧菌(Vibrio fluvialis)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、空腸曲桿菌(Campylobacter jejuni)及大腸曲桿菌(Campylobacter coli)組成之群。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該微生物係選自由豬產腸毒素性大腸桿菌(E.coli)(ETEC)、禽類病原性大腸桿菌(APEC)、棲息性(attaching and effacing)大腸桿菌(AEEC)、出血性大腸桿菌(EHEC)及產志賀毒素(shiga toxin)大腸桿菌(STEC)組成之群。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該樣本為選自由以下組成 之群之樣本：來自動物之樣本、水生樣本、來自魚類孵化場之水生樣本、來自養蝦池之水生樣本、農業樣本、來自動物墊料(litter)之農業樣本及來自豬類或禽類物種的拭子之農業樣本。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該基因係選自由以下組成之群：編碼毒素之基因、細菌物種之基因、病毒物種之基因、溶血素(hly)基因、產氣莢膜梭菌腸毒素(cpe)基因及產氣莢膜梭菌β毒素(cpb)基因。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該DNA及該RNA穩定在該卡上一段時間以允許海外運輸。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該DNA及該RNA穩定在該卡上一段時間以允許選自由以下組成之群之距離的運輸：大於1000英里(miles)、大於2000英里、大於3000英里及大於5000英里。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該卡為WHATMAN® FTA®卡。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該反向引子具有SEQ ID NO：6之序列。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該反向引子具有SEQ ID NO：8之序列。
- 如請求項5之方法，其中該ETEC為選自由K88、F18、F41、987P及K99組成之群的抗原類型。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該方法相較於端點PCR敏感性高至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍或至少100倍。
- 如請求項1至3中任一項之方法，其中該方法可偵測相當於每PCR管由1-3、由1-5、由1-10、由1-20、由1-30、由1-40、由1-50、由1-60、由1-70、由1-80、由1-90或由1-100個細胞中DNA之量。
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