CN108707691A

CN108707691A - 一种特异性检测烟曲霉的引物探针组合和基于荧光pcr法检测烟曲霉的试剂盒

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Publication number: CN108707691A
Application number: CN201810582569.1A
Authority: CN
Inventors: 方园; 任云; 欧阳云
Original assignee: Hangzhou Blue Biology Technology Co Ltd
Current assignee: Hangzhou Blue Biology Technology Co Ltd
Priority date: 2018-06-07
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2018-10-26

Abstract

本发明提供了一种特异性检测烟曲霉的引物探针组合和一种基于荧光定量PCR检测烟曲霉的试剂盒，属于病原微生物体外分子检测技术领域。本发明提供了一种特异性检测烟曲霉的引物探针组合，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明提供的包含引物探针组合的荧光定量PCR试剂盒能够实现烟曲霉的特异性检测，具有检测特异型强、灵敏度高的特点。

Description

一种特异性检测烟曲霉的引物探针组合和基于荧光PCR法检测烟曲霉的试剂盒

技术领域

本发明涉及病原微生物体外分子检测技术领域，具体涉及一种特异性检测烟曲霉的引物探针组合和基于荧光PCR法检测烟曲霉的试剂盒。

背景技术

深部真菌病是指致病真菌不仅侵犯皮肤、黏膜而且侵犯深部组织和内脏所致的疾病。真菌广泛分布于自然界，某些真菌可以感染人体而致病。深部真菌病常为继发感染，多在糖尿病、血液病、恶性肿瘤、大面积烧伤、严重营养不良或其他慢性消耗性疾病的基础上发病。或长期应用抗生素、糖皮质激素、免疫抑制剂、使机体内菌群失调或抑制了机体的免疫反应而诱发。

曲霉属于条件致病菌，广泛存在于生活环境中，其分生孢子微小，可随呼吸进入机体，以纤维蛋白、层连蛋白、血纤维蛋白原等为中介，黏附于宿主组织细胞，萌发菌丝，进而致病。曲霉菌病是由致病曲霉菌所引起的疾病。致病曲霉菌主要经呼吸道侵犯肺部，也可侵犯皮肤、黏膜。严重者可发生败血症，使其他组织和系统受累。常见的病原菌有烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉等，其中烟曲霉是最常见的病原菌，当免疫功能受抑制或损伤时易受感染。

目前实验室对于曲霉的检测主要有以下四种：

(1)病原体培养鉴定检测法

取自患处的标本作直接涂片或培养，涂片可见菌丝或曲霉菌孢子，培养见曲霉菌生长。曲霉菌是实验室常见的污染菌，必须反复涂片或培养，多次阳性且为同一菌种才有诊断价值。虽然培养鉴定法是临床最常采用的方法，但是其培养周期较长。

(2)病理组织检查

取受损组织或淋巴结活检，可根据真菌形态确诊。尤其对播散性曲霉菌，可及时作出诊断。病理组织检查的结果较为可靠，但是由于其具有创性，多数患者难以接受，限制了其应用。

(3)免疫学检测法

检测血清中烟曲霉IgM和IgG抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)，曲霉菌抗原检测方法主要有1,3-β-D葡聚糖检测(G试验)和半乳甘露聚糖检测(GM试验)。1,3-β-D葡聚糖抗原是除结核菌和隐球菌外所有真菌特有的一种细胞壁成分，以血清为检测样本，G试验不能够区分念珠菌属和曲霉菌属，也不能鉴定菌种，更不能鉴定是否烟曲霉。半乳甘露聚糖是存在于曲霉菌细胞壁中的一类具有高度特异性和高度保守型的多糖，可作为曲霉菌检测的特异性分子标志物，酶联免疫吸附试验(ELISA)是较为常见的半乳甘露聚糖抗原检测方法，但GM试验灵敏度不高，不能够区分不同的菌种，因此不能鉴定是否烟曲霉感染，而且常常发生假阳性或假阴性。

(4)实时荧光聚合酶链反应法(Real-Time Fluorescence Polymerase ChainReaction，荧光PCR)

基于实时荧光聚合酶链反应法的检测技术经过二十多年的实践，不断改进并完善，逐渐成为临床分子诊断最成熟的核酸检测方法，它融汇了PCR技术的核酸高效扩增、基因扩增的灵敏性、分子杂交的特异性和光谱技术的敏感性及精确定量的特点，从根本上解决了PCR扩增产物的污染问题，尤其是荧光探针法(TaqMan法)，用一对引物加一条探针，决定了其特异性非常高，基本上不存在非特异性扩增，解决了交叉反应的难题。结果判定客观、真实。通过对微生物病原体的核酸检测，不仅可以协助判断是否有微生物病原体的感染，还可以对微生物病原体的流行进行调查和监控，帮助建立微生物病原体病的检测标准，为临床考评疗效提供依据，并能协助指导临床用药和预测疾病的发展等。然而，曲霉由于种类繁多，种之间、种属之间(与其他属比如念珠菌属、隐球菌属等)的核酸序列同源性较高，同时，整个真菌基因组发生变异的几率远大于人类基因组，使得可选择做为靶基因序列进行种属检测的基因序列不多，因此，对于设计特异性检测常见曲霉比如烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉等的荧光PCR的引物和探针的难度就比较大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性检测烟曲霉的引物探针组合和一种基于荧光PCR法检测烟曲霉的试剂盒。本发明提供的引物探针组合能够实现烟曲霉的特异性检测，检测特异型强，灵敏度高。

本发明提供了一种特异性检测烟曲霉的引物探针组合，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

优选的，所述探针的5’端修饰有荧光基团，同时3’端修饰有荧光猝灭基团。

优选的，所述荧光基团包括FAM、SYBR Green I、JOE、VIC、NED、CY-3、TEXAS Red或CY-5。

优选的，所述荧光猝灭基团包括TAMRA或BHQ1。

本发明还提供了一种基于荧光PCR法检测烟曲霉的试剂盒，所述试剂盒包括：上述方案提供的引物探针组合、阴性对照、阳性对照和PCR反应液。

优选的，所述引物探针组合中上游引物、下游引物的工作浓度独立为8～12μmol/L。

优选的，所述引物探针组合中探针的工作浓度为8～12μmol/L。

优选的，所述阳性对照包括含烟曲霉阳性对照DNA片段的质粒，所述烟曲霉阳性对照DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

优选的，所述PCR反应液包括以下含量组分：400～500μmol/L的dNTP、0.1～0.2U/μL的Taq酶、0.1～0.2U/μL的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)、0.1～0.25μmol/L的参比荧光ROX、3～6mmol/L的MgCl₂和缓冲液；所述缓冲液包括10～20mmol/L的Tris-HCl、100～200mmol/L的KCl，所述Tris-HCl的pH值为8。

优选的，每20μL反应体系包括：10μLPCR反应液、0.5μL的上游引物、0.5μL的下游引物、0.5μL的探针、4.5μL水和4μL待检测样品DNA溶液。

本发明提供了一种特异性检测烟曲霉的引物探针组合。本发明提供的引物探针组合能够实现烟曲霉的检测，检测特异型强，灵敏度高。试验结果表明，本发明提供的包含引物探针组合的试剂盒对烟曲霉的最低检测限是0.01ng/mL，检测范围为0.01～1000ng/mL；与其他菌无交叉反应，说明检测特异性强；精密度CV值≤5％，说明检测的稳定性高。因此，本发明提供的引物探针组合和试剂盒检测效果好，能够实现临床上的应用效果。

附图说明

图1为本发明实施例4提供的标准荧光PCR扩增曲线图；

图2为本发明实施例4提供的扩增曲线的标准曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种基于荧光PCR法检测烟曲霉的引物探针组合，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明选择烟曲霉基因组核糖体部位做为靶基因的部位，经过大量序列比对和筛选，设计出可以特异性检测烟曲霉的引物和探针，该引物探针组合可以识别烟曲霉，但不与其他真菌菌种如黄曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、新生隐球菌、格特隐球菌、罗伦特隐球菌等进行交叉，充分实现了引物和探针的特异性，而不失灵敏性。本发明根据烟曲霉的基因组核糖体DNA片段设计特异引物及荧光标记的探针，通过检测荧光信号的强度和扩增曲线的形状来判定是否有特异性的PCR产物形成，进而判断所测样本中是否含有目的DNA片段。

本发明根据烟曲霉的核糖体RNA的基因组DNA的序列，筛选用于检测烟曲霉且与其它物种不同源的靶序列，所述靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明针对烟曲霉的靶序列进行引物的设计，本发明所述上游引物(Asp-fum-F)的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5'-GCCCGCCGTTTCGAC-3'；所述下游引物(Asp-fum-R)核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5'-CCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTAC-3'。本发明对所述引物的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的生物公司进行人工合成即可。本发明实施例中，所述引物委托上海捷瑞生物技术有限公司合成得到。

本发明依据烟曲霉的靶序列进行探针的设计，本发明得到的探针序列如SEQ IDNO.3所示(5’-CCCGCCGAAGACCCCAACATG-3’)。将所述探针的5’端用荧光基团修饰，将所述探针的3’端用荧光猝灭基团修饰。在本发明中，所述荧光基团包括FAM、SYBR Green I、JOE、VIC、NED、CY-3、TEXAS Red或CY-5，优选为FAM；在本发明中，所述荧光猝灭基团包括TAMRA或BHQ1等，优选为四甲基罗丹明(TAMRA)。本发明对所述探针的合成方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的生物公司进行合成即可。本发明实施例中，所述探针委托上海捷瑞生物技术有限公司合成得到。

本发明还提供了一种基于荧光PCR法检测烟曲霉的检测试剂盒，所述试剂盒包括以下试剂：上述技术方案提供的引物探针组合、阴性对照、阳性对照和PCR反应液。

在本发明中，所述试剂盒中包括上游引物。所述上游引物的浓度优选为8～12μmol/L，更优选为9～11μmol/L，最优选为10μmol/L。在本发明中，所述试剂盒中优选包含15～25μL的上游引物，更优选为18～23μL，最优选为22μL。在本发明中，所述上游引物的溶剂优选为去离子水。

在本发明中，所述试剂盒中包括下游引物。所述下游引物的浓度优选为8～12μmol/L，更优选为9～11μmol/L，最优选为10μmol/L。在本发明中，所述试剂盒中优选包含15～25μL的下游引物，更优选为18～23μL，最优选为22μL。在本发明中，所述下游引物的溶剂优选为去离子水。

在本发明中，所述试剂盒中包括探针。所述探针的浓度优选为8～12μmol/L，更优选为9～11μmol/L，最优选为10μmol/L。在本发明中，所述试剂盒中优选包含8～15μL的探针，更优选为10～12μL，最优选为11μL。在本发明中，所述探针的溶剂优选为去离子水。

在本发明中，所述阴性对照优选为含无关基因的质粒。在本发明的实施例中，所述无关基因为植物拟南芥的DNA片段，所述拟南芥DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明中，所述阴性对照的设置，选择一个植物模式遗传物质基因，与人的基因没有显著的同源性，与真菌的基因没有显著的同源性，不会造成与人和真菌的基因的交叉反应；然而该无关基因片段具有所有基因片段所具有的普遍特性，即由常见的四种脱氧核糖核酸ATCG组成，是一段真实的核酸基因序列，做为阴性对照比通常所用的空白对照或缓冲液对照更具代表性。所述阴性对照的浓度优选为1ng/mL。在本发明中，所述阴性对照优选为含植物拟南芥DNA片段的质粒，在本发明中，所述质粒优选为pTG19-T。本发明所述阴性对照质粒的构建过程优选为：提取拟南芥的基因组DNA；以拟南芥基因组DNA为模板，用引物A和引物B进行PCR扩增，获得拟南芥DNA片段；将该拟南芥DNA片段连入pTG19-T载体中，构建获得阴性对照质粒。在本发明中，所述引物A的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示：5'-AATCGCCAAGCCAAATTCACAC-3'；所述引物B的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示：5'-CATGATTCAGCGATTTTCTTTACG-3'。

在本发明中，所述PCR扩增拟南芥DNA片段的体系优选为：5X缓冲液4μl(50mmol/LTris-HCl[pH 8.5]，50mmol/L NaCl，0.5mg/ml BSA)；25mmol/L MgCl₂1.6μl；10mmol/LdNTP 0.5μl；10μmol/L Primer-F 0.5μl；10μmol/LPrimer-R 0.5μl；基因组DNA 1ng；5U/μlTaq酶0.25μl；消毒的超纯水加至20μl。

在本发明中，所述PCR扩增拟南芥DNA片段的扩增条件优选为：95℃4min；95℃30s，51℃30s，72℃60s，35个循环；72℃5min。

在本发明中，所述拟南芥DNA片段连入pTG19-T载体的方法优选包括：pTG19-T(25ng/μl)1μl；新鲜PCR产物4μl；10x T4Buffer 1μl；T4DNA Ligase2.5units；ddH₂O加至10μl。上述试剂混匀并离心，在16℃连接1小时，将连接反应物10μl转化100μl感受态细胞，冰浴20分钟，42℃热激45秒钟后，再在冰浴中放置2分钟，加入500μL SOC或LB培养基，在37℃震荡培养60分钟，在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落，挑选单个白色菌落，用酶切法或PCR法进行鉴定插入片段，最后将PCR产物送测序确认克隆的目的基因片段。

在本发明中，所述阳性对照包括含烟曲霉阳性对照DNA片段的质粒，所述烟曲霉阳性对照DNA片段如SEQ ID NO.5所示。本发明中，所述烟曲霉的阳性对照DNA片段是针对所述烟曲霉靶序列分别进行设计的，所述烟曲霉阳性对照DNA片段的长度分别长于烟曲霉靶序列，即所述烟曲霉的阳性对照DNA能够完全覆盖整个荧光PCR扩增的靶序列。

在本发明中，所述阳性对照优选为含所述阳性对照DNA片段的质粒，所述质粒优选为pTG19-T。所述质粒的浓度优选为20ng/mL。优选的，所述烟曲霉阳性对照DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明中，所述烟曲霉阳性对照DNA片段的克隆质粒的构建方法如下：提取烟曲霉的基因组DNA；以所述烟曲霉基因组DNA为模板，采用引物AY-F/AY-R进行PCR扩增，扩增得到烟曲霉阳性对照DNA片段；回收并纯化PCR产物，将其连入质粒载体(pTG19-T)中，转化大肠杆菌DH5α，重组转化子测序验证。重组转化子培养后提取质粒，得到克隆质粒AYc-T。在本发明中，所述引物AY-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示：5'-TTTAGAGCTGCATTCCCAAACAACT-3'；所述引物AY-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示：5'-AGGTCTGGGTAATCTTGTTAAACC-3'。

在本发明中，所述PCR反应液包括：dATP、dCTP、dGTP、dUTP、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、参比荧光、MgCl₂和缓冲液。本发明所述参比荧光优选购自美国ABI公司，货号为4440038，所述参比荧光的作用为用于矫正孔与孔之间的荧光信号ROX。在本发明中，所述PCR反应液优选包括400～500μmol/L的dNTP、0.1～0.2U/μL的Taq DNA聚合酶、0.1～0.2U/μL的尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)、0.1～0.25μmol/L的参比荧光ROX、3～6mmol/L的MgCl₂和缓冲液；在本发明中，所述缓冲液包括10～20mmol/L的Tris-HCl、100～200mmol/L的KCl，所述Tris-HCl的pH值为8。

在本发明中，所述试剂盒中各组分的储藏温度优选为-20℃，其中，所述探针优选在避光条件下保存。

本发明还提供了上述试剂盒在检测烟曲霉中的应用。

在本发明中，所述检测烟曲霉的方法优选包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)用所述基因组DNA和所述试剂盒中各组分配制反应体系；

3)将所述反应体系进行荧光定量PCR扩增，得到荧光定量PCR扩增曲线。

在本发明中，所述待检测样品包括痰液、胸水、腹水和分泌物等。本发明对所述待检测样品种的基因组DNA的提取方法没有特殊的限定，采用常规方法进行DNA提取即可。

在本发明中，反应体系优选为20μL体系，具体如下：10μL PCR反应液、1μL上游引物和下游引物、0.5μL探针、4.5μL水和4μL待检测样品。

在本发明中，所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：50℃2min；95℃10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。

在本发明中，优选设置阳性样品孔和阴性样品孔。所述阳性样品孔是将阳性样品替换待检测样品配制反应体系。所述阴性样品孔是将阴性样品替换待检测样品配制反应体系。所述阳性样品孔和阴性样品孔与待检测样品同时进行荧光定量PCR扩增。

在本发明中，根据荧光定量PCR扩增曲线判断是否有烟曲霉感染。当待测样品的Ct值≤36，且扩增曲线形状正常，即有较好的对数增长曲线，检测结果为阳性；当待测样品的Ct值＞36或者“Undetermined”或者扩增曲线形状不正常，即没有较好的对数增长曲线，检测结果为阴性。本发明优选根据标准曲线和样本的Ct值计算样本中靶基因起始模板的DNA含量。

试验结果表明，本发明提供的包含引物探针组合的试剂盒对烟曲霉的最低检测限是0.01ng/mL，检测范围为0.01～1000ng/mL；与其他菌无交叉反应，说明检测特异性强；精密度CV值≤5％，说明检测的稳定性高。因此，本发明提供的引物探针组合和试剂盒检测效果好，能够实现临床上的应用效果。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种特异性地检测烟曲霉的引物探针组合和荧光定量RCR试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

试剂盒的组成

1、引物设计

根据烟曲霉的核糖体RNA的基因组DNA的序列，筛选能够特异性地检测烟曲霉且与其他物种不同源的靶序列，烟曲霉靶序列的核苷酸序列如SEQID NO.6所示。

针对烟曲霉的靶序列，设计用于荧光PCR检测烟曲霉的特异性引物，并委托上海捷瑞生物技术有限公司合成。

特异性引物的碱基序列为：

上游引物(Asp-fum-F)：5'-GCCCGCCGTTTCGAC-3'

下游引物(Asp-fum-R)：5'-CCGTTGTTGAAAGTTTTAACTGATTAC-3'

2、荧光探针设计

本发明中上述引物和探针的设计优选是根据上述烟曲霉的靶序列设计得出。

荧光探针序列：

探针：FAM-5'-CCCGCCGAAGACCCCAACATG-3'-TAMRA。

在该荧光探针的5’端具有FAM荧光基团，FAM为羧基荧光素，其吸收波长为492nm，发射波长为518nm。该荧光探针的3’末端具有荧光淬灭基团TAMRA(四甲基罗丹明)。探针由上海捷瑞生物技术有限公司合成。

3、试剂盒的组成

(1)引物

引物由上述的上游引物和下游引物组成，浓度分别为10μmol/L。

(2)探针

探针为上述的荧光探针，探针浓度为10μmol/L。

(3)阴性对照

阴性对照为含无关基因的质粒，该无关基因为植物拟南芥的DNA片段，阴性对照浓度为1ng/mL。

阴性对照质粒的构建过程为：提取拟南芥的基因组DNA；以拟南芥基因组DNA为模板，用引物A和引物B进行PCR扩增，获得拟南芥DNA片段；将该拟南芥DNA片段连入pTG19-T载体中，构建获得阴性对照质粒。

引物A：5'-AATCGCCAAGCCAAATTCACAC-3'

引物B：5'-CATGATTCAGCGATTTTCTTTACG-3'

拟南芥DNA片段序列如SEQ ID NO.4所示。

(4)阳性对照

阳性对照为含烟曲霉阳性对照DNA序列的克隆质粒，浓度为20ng/mL。

阳性对照的制备过程为：

1)烟曲霉克隆质粒的构建

提取烟曲霉的基因组DNA；以该基因组DNA为模板，采用引物AY-F/AY-R进行PCR扩增，扩增得到烟曲霉阳性对照DNA片段；回收并纯化PCR产物，将其连入质粒载体(pTG19-T)中，转化大肠杆菌DH5α，重组转化子测序验证，烟曲霉阳性对照DNA片段(AHc)如下所示。重组转化子培养后提取质粒，得到克隆质粒AYc-T。

克隆质粒AYc-T构建过程中，采用的引物AY-F/AY-R以及扩增得到的烟曲霉阳性对照DNA片段(AYc)的序列如下：

AY-F：5'-TTTAGAGCTGCATTCCCAAACAACT-3'

AY-R：5'-AGGTCTGGGTAATCTTGTTAAACC-3'

AYc序列如SEQ ID NO.5所示。

2)含烟曲霉阳性对照DNA序列的克隆质粒浓度为0.02ng/μL。

(5)PCR反应液

PCR反应液包括dNTP(含脱氧核糖核苷三磷酸，包括dATP，dCTP，dGTP和dUTP)、耐热的TaqDNA聚合酶(Taq酶)、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)、参比荧光(用来校正孔与孔之间的荧光信号ROX)，可购自美国ABI公司，货号为4440038、MgCl₂和缓冲液。

表1、试剂盒的组成

实施例2

试剂盒的检测方法

在使用本试剂盒进行检测前，需提取待检测样本的DNA，待检测样本可以是痰液、胸水、腹水、分泌物等可能含曲霉的样本，样本DNA可采用常规方法进行提取。

1、PCR反应管的准备(试剂准备区)

(1)确定需要进行的反应管数n(样本数+阴性对照+阳性对照)；取出灭菌纯化水(用户自备)和PCR反应液；取出试剂盒中的其他组分，放冰上或室温融化。所有试剂盒组分使用前均需要瞬时离心。每份反应体系如表2：

表2、反应体系组成

PCR反应液	引物	探针	灭菌纯化水	样本/对照品	总体积
						10μL	1μL	0.5μL	4.5μL	4μL	20μL

按反应管数n计算上述各试剂(除了样本/对照品)的用量，并加入至离心管中，充分混匀(建议用移液器缓慢反复吹打混匀，同时避免液体飞溅或产生大量气泡)，瞬时离心后，向每个PCR反应管分装16μL。

(2)将上述准备好的PCR反应管及阴性对照、阳性对照转移到样本处理区或者加样区。

2、加样(样本处理区或者加样区)

向准备好的PCR反应管中分别加入4μL待测样本的DNA或阴性对照或阳性对照样本，盖紧管盖(或贴上封板膜)后瞬时离心，转移到样本检测区。

3、PCR扩增及荧光检测(样本检测区)

将准备好的反应管放置在荧光PCR仪中，依照已编辑的样本信息按下列条件进行扩增反应及检测(表3)：

表3、扩增反应条件

4、结果分析条件设定

(1)分析扩增曲线图(AmplificationPlot)结果时，一般可设定成图类型(Plottype)为：ΔRn vs Cycle。

(2)基线(Baseline)设定：荧光PCR仪的分析软件可以自动设置基线，通常是循环数2至最先扩增曲线之前3个循环数为基线。

(3)阈值(Threshold)设定：荧光PCR仪的分析软件可以自动设置阈值线，也可手动设置，通常阈值线设在基线以上扩增曲线的指数增长期内呈线性的部位，扩增曲线与阈值线相交的点即为Ct值，代表了标准化后报告集团荧光强度(Rn，The Normalized Intensityofthe Reporter)，扩增前后的变量值ΔRn[ΔRn＝Rn(PCR扩增后读数)-Rn(PCR扩增前读数)]，Ct值与反应初始目的DNA片段的量对数值呈线性负相关。

5、质控标准

本试剂盒阴、阳性对照应同时满足以下条件，否则本次实验视为无效，需要重做：

(1)阴性质控：阴性对照Ct值＞36，且扩增曲线形状正常；或“Undetermined”。

(2)阳性质控：阳性对照Ct值≤36，且扩增曲线形状正常。

6、实验结果的读取

根据荧光PCR仪器配套的分析软件说明书，首先将基线和阈值设定好(建议基线设定选自动，阈值设定如有需要可手动调节，设定原则以阈值线超过正常阴性对照扩增曲线最高点并且相交于阳性对照扩增曲线的指数增长期内呈线性的部位为准)，然后在软件内点击分析(Analyse)，系统将自动生成结果，观察每个样本扩增曲线的Ct值，并下载到Excel文件中。

利用仪器配套软件进行自动分析，得到各样本烟曲霉(FAM)Ct值，根据表4进行判定。

表4、阳性判断值

实施例3

试剂盒的性能评价

1、检测限

本试剂盒与烟曲霉阳性参考品的剂量效应曲线

烟曲霉阳性参考品：即不同浓度的烟曲霉克隆质粒AYc-T。

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对烟曲霉阳性参考品进行检测。

表5、烟曲霉阳性参考品实验结果

结果见表5，试剂盒在0.01～1000ng/mL范围内可检出。

2、特异性

1)阳性反应

提取烟曲霉的DNA(模板浓度为1ng/ul)，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测。

表6、阳性反应实验结果

样本类型	CT值	结果
			烟曲霉	12.71±0.12	阳性

结果见表6，本产品可以与烟曲霉的DNA产生阳性反应。

2)交叉反应

方法：分别提取黄曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、新生隐球菌、金黄色葡萄球菌(黄金亚种)和肺炎链球菌的DNA，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法进行检测。

结果见表7，本试剂盒与临床常见其他各类真菌病原体(黄曲霉、黑曲霉、杂色曲霉、新生隐球菌、白色念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌)不产生交叉反应。另外，与呼吸道中的金黄色葡萄球菌(黄金亚种)和肺炎链球菌不存在交叉反应。

表7、交叉反应实验结果

3、精密度

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，用高浓度(样本浓度为20ng/mL)、低浓度(样本浓度为0.4ng/mL)的阳性参考品连续重复10次检测。

高浓度样本的检测结果参见表8，低浓度样本的检测结果参见表9，计算得到高浓度样本的批内CV值为0.4％，低浓度样本的批内CV值为1.1％。

表8、高浓度样本实验结果

样本编号	CT值	结果
			J2-1	20.15664482	阳性
J2-2	20.25814629	阳性
			J2-3	20.14282608	阳性
J2-4	20.03896713	阳性
			J2-5	20.00440788	阳性
J2-6	20.15584755	阳性
			J2-7	20.16423035	阳性
J2-8	20.23410606	阳性
			J2-9	20.27788162	阳性
J2-10	20.13171959	阳性

表9、低浓度样本实验结果

样本编号	CT值	结果
			J1-1	27.48406029	阳性
J1-2	27.61301231	阳性
			J1-3	27.44113541	阳性
J1-4	27.56289673	阳性
			J1-5	26.99661255	阳性
J1-6	26.99312019	阳性
			J1-7	26.87984467	阳性
J1-8	27.06414795	阳性
			J1-9	26.9095993	阳性
J1-10	27.04838943	阳性

4、稳定性

对试剂盒进行热稳定试验，将试剂盒置于37℃温箱中放置六天后取出进行试剂盒性能指标全检量的试剂盒进行性能检测。性能指标包括最低检测限、阳性参考品符合率、特异性和精密度。

(1)最低检测限

设定试剂盒的最低检测限为0.01ng/mL，采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对浓度为0.01ng/mL的混合阳性参考品进行检测，重复20次，计算阳性检出比(阳性检出样本数/20)。

(2)阳性参考品符合率

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对10份阳性参考品进行检测，计算阳性参考品符合率(阳性样本数/10)。

阳性参考品包括：1000ng/mL烟曲霉阳性参考品、500ng/mL烟曲霉阳性参考品、200ng/mL烟曲霉阳性参考品、100ng/mL烟曲霉阳性参考品、50ng/mL烟曲霉阳性参考品、20ng/mL烟曲霉阳性参考品、10ng/mL黄曲霉阳性参考品、5ng/mL烟曲霉阳性参考品、2ng/mL烟曲霉阳性参考品、1ng/mL烟曲霉阳性参考品。

(3)特异性

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，对样本进行检测。样本包括：不含被测物的特异性样本、与被测物种属相近的特异性样本。

不含被测物的特异性样本包括：含人类DSCR3基因片段1的质粒、含人类ITM2B基因片段的质粒、含人类KLHDC8A基因片段的质粒、含人类LINC00441基因片段的质粒、含人类LPAR6基因片段1的质粒、含人类LPAR6基因片段2的质粒、含人类RB1基因片段1的质粒、含人类RB1基因片段2的质粒、含人类RCBTB2基因片段的质粒、含人类TTC3基因片段1的质粒。

与被测物种属相近、感染部位相同或感染症状相似的特异性样本包括：含黄曲霉基因片段质粒、含黑曲霉基因片段质粒、含杂色曲霉基因片段质粒、含白色念珠菌基因片段质粒、含热带念珠菌基因片段质粒、含光滑念珠菌基因片段质粒、含近平滑念珠菌基因片段质粒、含罗伦特隐球菌基因片段质粒、含格特隐球菌基因片段质粒、含新生隐球菌基因片段质粒。

(4)精密度

采用本发明实施例1的试剂盒，按照实施例2的方法，用高浓度(样本浓度为20ng/mL)、低浓度(样本浓度为0.4ng/mL)的混合阳性参考品连续重复10次检测。

以上4种性能指标的检测结果汇总参见表10。

表10、稳定性实验结果

根据表10可以得出本试剂盒在温度在37℃的温箱中放置6天后，各项性能指标包括阳性参考品符合率、最低检测限、特异性和精密度均达到设计要求。

实施例4

试剂盒可以定量检测烟曲霉

用已知浓度的标准品(用本试剂盒可检测的烟曲霉基因片段的质粒浓度1ng/μl)，进行10倍连续梯度稀释制备成5至6个浓度点的标准曲线，每个浓度4-5个复管，以建立Ct值与浓度之间的线性关系。外加一个用阳性参考品制成的阳性对照(也可以不加，因为标准曲线所用的就是阳性参考品)，另外加一个阴性对照，用无关基因拟南芥的基因片段做为阴性对照。另外，可以加一个内参，此处用人的GAPDH管家基因片段质粒，以监控样本核酸提取过程以及荧光PCR反应体系的状态。另外反应体系中加入ROX荧光素，以校准基础荧光值，消除孔与孔之间的差异。标准曲线在PCR反应的线性扩增区域形成线性方程Y＝aX+b，其中a是直线的斜率，b是直线在Y轴上的截距。可以根据起始模板含量的对数值与Ct值绘制标准曲线，本发明中荧光PCR反应中的，R²为0.992(见图1和图2；图1为定量检测方法的标准的荧光PCR扩增曲线图；图2为由上述图1所进行的标准扩增曲线的标准曲线图，其中横轴是目的DNA的含量，纵轴是Ct值)，其线性范围是：0.01～1000ng/mL，各个浓度点的平均Ct值见表5。在测量样本时，上述标准曲线、阴、阳性对照、内参以及一定浓度的样本DNA同时进行荧光PCR反应，使用ABI7500、7300、罗氏480等荧光PCR仪，定量的原理是根据标准曲线和样本的Ct值计算样本中靶基因起始模板的DNA含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 杭州缔蓝生物技术有限公司

<120> 一种特异性检测烟曲霉的引物探针组合和基于荧光PCR法检测烟曲霉的试剂盒

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcccgccgtt tcgac 15

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgttgttga aagttttaac tgattac 27

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cccgccgaag accccaacat g 21

<210> 4

<211> 826

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 4

aatcgccaag ccaaattcac acttcagtat gacttgtgtc tttccaggaa ggaatttctc 60

aacctcactt ttttccttct cagtagaaac ggccttatga cctgaaagtg acattaacat 120

caagtatcat gcataacgca ttttctataa aagaaaaagg gtctaaacca aaaaaaggtg 180

cataataaac ccacatgatg cagacggtta ataatcaaca gctcctcttc atctgtaaga 240

ctggcactac cacattctgc gaatggagta ttaaaccatt cttcgaaatt atgaattgag 300

ttaaagatgt gaggaagaag aaaattaagc agcgaccata gttcttgcag actgttctgt 360

atgggagttc cagttaatag aagtctgcgc ttaatccggt agctgcatcc aggacaaatt 420

agtgtaagca aaatgtcttt aaatttcctt tgtgacagta tctttaagag ataaatcaga 480

gtaacaacta attaacacca ttcacttcag acttcatcaa gctaatgcgt aaaaaggcat 540

gtctaaacat ctttaagaaa ctagatacag tctactcaaa gaccagagta acatacagaa 600

acatacccag ttcctagagt ctttgcgaga gcacattcat ggttcttcag acgatgtcct 660

tcatcaacaa tcatgtagtt ccagtcaatt ttcttcaaaa atgctttatc tctcatgata 720

agatcgtagt gggttatcaa cacattaaat tttcctcctg ctattcttgc tcttatttca 780

gttcttttct cctttgatcc atcgtaaaga aaatcgctga atcatg 826

<210> 5

<211> 1101

<212> DNA

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 5

tttagagctg cattcccaaa caactcgact cgtcgaagga gcttcacacg gacgcagaca 60

ccccgtccca gacgggattc tcaccctcta tgacggcccg ttccagggca cttagacggg 120

ggctgcaccc gaagcatcct ctgcaaatta caacgcggac cccgaagggg ccagctttca 180

aatttgagct cttgccgctt cactcgccgt tactgaggca atccctgttg gtttcttttc 240

ctccgcttat tgatatgctt aagttcagcg ggtatcccta cctgatccga ggtcaacctt 300

agaaaaataa agttgggtgt cggctggcgc cggccgggcc tacagagcag gtgacaaagc 360

cccatacgct cgaggaccgg acgcggtgcc gccgctgcct ttcgggcccg tcccccggga 420

gagggggacg ggggcccaac acacaagccg tgcttgaggg cagcaatgac gctcggacag 480

gcatgccccc cggaatacca gggggcgcaa tgtgcgttca aagactcgat gattcactga 540

attctgcaat tcacattact tatcgcattt cgctgcgttc ttcatcgatg ccggaaccaa 600

gagatccgtt gttgaaagtt ttaactgatt acgataatca actcagactg catactttca 660

gaacagcgtt catgttgggg tcttcggcgg gcgcgggccc gggggcgcag ggcctccccg 720

gcggccgtcg aaacggcggg cccgccgaag caacaaggta cgatagacac gggtgggagg 780

ttggacccag agggccctca ctcggtaatg atccttccgc aggttcacct acggaaacct 840

tgttacgact tttacttcct ctaaatgacc gggtttgacc aactttccgg ctctggggag 900

tcgttgccaa ctcccctgag ccagtccgaa ggcctcaccg agccattcaa tcggtagtag 960

cgacgggcgg tgtgtacaaa gggcagggac gtaatcggca cgagctgatg actcgtgcct 1020

actaggcatt cctcgttgaa gagcaataat tgcaatgctc tatccccagc acgacagggt 1080

ttaacaagat tacccagacc t 1101

<210> 6

<211> 136

<212> DNA

<213> Aspergillus fumigatus

<400> 6

ccgttgttga aagttttaac tgattacgat aatcaactca gactgcatac tttcagaaca 60

gcgttcatgt tggggtcttc ggcgggcgcg ggcccggggg cgcagggcct ccccggcggc 120

cgtcgaaacg gcgggc 136

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatcgccaag ccaaattcac ac 22

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

catgattcag cgattttctt tacg 24

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tttagagctg cattcccaaa caact 25

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggtctgggt aatcttgtta aacc 24

Claims

1.一种特异性检测烟曲霉的引物探针组合，所述引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述探针的5’端修饰有荧光基团，同时3’端修饰有荧光猝灭基团。

3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、SYBRGreen I、JOE、VIC、NED、CY-3、TEXAS Red或CY-5。

4.根据权利要求2或3所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光猝灭基团包括TAMRA或BHQ1。

5.一种基于荧光PCR法检测烟曲霉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：权利要求1～4任意一项所述引物探针组合、阴性对照、阳性对照和PCR反应液。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合中上游引物、下游引物的工作浓度独立为8～12μmol/L。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述引物探针组合中探针的工作浓度为8～12μmol/L。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照包括含烟曲霉阳性对照DNA片段的质粒，所述烟曲霉阳性对照DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

9.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括以下含量的组分：400～500μmol/L的dNTP、0.1～0.2U/μL的Taq DNA聚合酶、0.1～0.2U/μL的尿嘧啶-N-糖基化酶、0.1～0.25μmol/L的参比荧光ROX、3～6mmol/L的MgCl₂和缓冲液；所述缓冲液包括10～20mmol/L的Tris-HCl、100～200mmol/L的KCl，所述Tris-HCl的pH值为8。

10.根据权利要求5或9所述的试剂盒，其特征在于，每20μL反应体系包括：10μL PCR反应液、0.5μL的上游引物、0.5μL的下游引物、0.5μL的探针、4.5μL水和4μL待检测样品DNA溶液。