CN110760605B

CN110760605B - 烟曲霉的实时荧光rpa检测试剂盒及其专用引物和探针

Info

Publication number: CN110760605B
Application number: CN201911055768.8A
Authority: CN
Inventors: 田曙光; 韩黎; 陈芳艳; 苏雪婷; 胡颖嵩; 陈勇; 赵静雅
Original assignee: Chinese Pla Center For Disease Control & Prevention
Current assignee: Chinese Pla Center For Disease Control & Prevention
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2022-12-09
Anticipated expiration: 2039-10-31
Also published as: CN110760605A

Abstract

本发明涉及烟曲霉的实时荧光RPA检测试剂盒及其专用引物和探针，具体地，本发明提出了用于RPA检测的引物组合物，该引物组合物包括：正向引物，所述正向引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；反向引物，所述反向引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。利用该RPA检测的引物组合物可以在等温条件下快速、方便、高效、特异且灵敏地检测出出菌体、痰、血液、支气管肺泡灌洗液等待测样品中的烟曲霉成分。

Description

烟曲霉的实时荧光RPA检测试剂盒及其专用引物和探针

技术领域

本发明涉及生物检测领域，具体地，本发明涉及烟曲霉的实时荧光RPA检测试剂盒及其专用引物和探针。

背景技术

烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是一种常见的机会致病菌，在环境中分布广泛，其孢子被免疫缺陷或免疫低下病人吸入后极易引发侵袭性曲霉病，由于其致病机理尚不清楚，缺乏有效的治疗方法，致死率高达90％。引起侵袭性曲霉病的主要真菌是烟曲霉，一般病人只有到了患病晚期或死亡后才能检测出烟曲霉感染，因此，对烟曲霉进行早期诊断和预防至关重要。在过去的几十年里，随着高强度的免疫抑制治疗、广谱抗生素的广泛使用，导致患者体内正常菌群失调以及屏障功能被破坏，从而引起真菌移位、定植以及感染等，烟曲霉感染患者的数量也不断上升。国内外学者及临床专家普遍认为，对烟曲霉进行早期诊断并加以及时治疗是预防侵袭性曲霉病相对有效的方法。因此，建立一种特异性高、准确、灵敏、快速、方便、成本低廉的烟曲霉检测方法是降低侵袭性曲霉病发生和危害的重要途径。

现有的烟曲霉检测方法主要为镜检和培养法，镜检法检出率很低；而传统培养鉴定方法需要对患者样本先进行48小时以上培养，然后对菌落和微观形态进行直接观察[Nouer SA,Nucci M,Kumar NS,Grazziutti M,Barlogie B,Anaissie E.Earlierresponse assessment in invasive aspergillosis based on the kinetics of serumAspergillus galactomannan:proposal for a new definition.Clin Infect Dis.2011,53:671-676.]。传统的培养鉴定方法虽然简单、成本低，但耗时太长，灵敏度和特异度都很低，远不能满足临床上对烟曲霉进行快速准确检测的需要。目前，烟曲霉的检测方法除了传统的培养鉴定方法外，还有血清学检测方法和分子生物学检测方法。血清学检测方法主要是检测半乳甘露聚糖和1,3-β-D-葡聚糖，这两种物质都是烟曲霉细胞壁的组成成分，当烟曲霉菌丝在肺组织中生长时这两种物质就会释放到血液中。但是，由于病人自身的免疫低下以及进行过抗真菌治疗，用血清学检测方法可能会产生假阴性或假阳性的结果[SuLahian A,Touratier S,Ribaud P.False positive test for aspergillusantigenemia related to concomitant administration of piperacillin andtazobactam.N Engl J Med.2003,349:2366-2367.]。分子生物学检测方法主要是通过PCR技术(包括荧光定量PCR)对烟曲霉的特异性基因进行检测，PCR技术具有特异性高、准确、灵敏、快速等优点，但是PCR技术对实验人员及环境的要求很高，仪器设备昂贵，同时需要进行严格的温度控制，很难应用于烟曲霉的临床检测[Ostrosky-Zeichner L.Invasivemycoses:diagnostic challenges.Am J Med.2012,125:S14-24.]。

因此，特异性高、准确、灵敏、快速、方便、成本低廉的烟曲霉检测方法还有待进一步研究。

发明内容

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

RPA技术是由英国TwistDx Inc公司开发的重组酶聚合酶扩增(RecombinasePolymerase Amplification，RPA)，RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最适反应温度在37℃左右。重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合，防止进一步替换。整个过程进行得非常快，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。另外结合

exo探针可以实现扩增反应的实时监测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。

烟曲霉膜联蛋白anxC4为真菌膜联蛋白家族的新成员，具体功能尚不清楚[KhalajV,Smith L,Brookman J,Tuckwell D.Identification of a novel class of annexingenes.FEBS Lett.2004Mar 26；562(1-3):79-86.Khalaj V,Azarian B,Enayati S,VaziriB.Annexin C4 in A.fumigatus:a proteomics approach to understand thefunction.J Proteomics.2011Sep6；74(10):1950-8.]。烟曲霉的anxC4基因序列与其它真菌及人类的基因序列有显著差异，同源性低，是烟曲霉的特异性保守序列，可作为理想的引物和探针设计模板，用于烟曲霉核酸检测方法的研究。以烟曲霉anxC4基因序列为生物靶标建立烟曲霉的实时荧光RPA检测方法，对于临床上对烟曲霉感染进行快速诊断具有非常重要的作用。然而，目前利用RPA技术对烟曲霉进行检测的方法较少，还需进一步的研究和探索。

为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种用于RPA检测的引物组合物。根据本发明的实施例，所述引物组合物包括：

正向引物，所述正向引物具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，

CGGGAACGCGACGAATCGTGCTTGGCTGGAGGAGC(SEQ ID NO：1)；

反向引物，所述反向引物具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，

GCGATGCGCCTAGCGATCTGGAGCGTGATTTCTAC(SEQ ID NO：2)。

发明人发现，利用所述引物组合物进行烟曲霉的RPA检测时，特异性高，可以从相差仅1个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增，且灵敏度好，可以检测到10copies的样品，检测最低限值为1copies。由此，利用所述RPA检测的引物组合物可以在等温条件下快速、方便、高效、特异且灵敏地检测出出菌体、痰、血液、支气管肺泡灌洗液等待测样品中的烟曲霉成分。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面所描述的引物组合物。

根据本发明的实施例，上述试剂盒还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括：探针，所述探针具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。发明人发现，利用所述探针可以实现烟曲霉的实时荧光RPA检测，且利用包含所述探针和所述引物组合物的试剂盒进行烟曲霉的实时荧光RPA检测时，特异性更高，灵敏度更好。

CTGGAGGAGCACCATTGAGCGCCCCGGACATAACTGGACCATCTACG(SEQ ID NO：3)。

根据本发明的实施例，所述探针的3’端标记有阻抑聚合酶延伸或扩增的基团，所述探针自5’端起第31位碱基标记有荧光基团，所述探针自5’端起第35位碱基标记有淬灭基团，所述探针自5’端起第32位碱基被THF替代。

根据本发明的实施例，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的基团为磷酸基团。

根据本发明的实施例，所述荧光基团为FAM。

根据本发明的实施例，所述淬灭基团为BHQ。

根据本发明的实施例，所述正向引物与所述反向引物的摩尔浓度比为1:1。由此，利用所述试剂盒进行烟曲霉的实时荧光RPA检测时，特异性更高，灵敏度更好。

根据本发明的实施例，所述探针与所述正向引物的摩尔浓度比为1:1。由此，利用所述试剂盒进行烟曲霉的实时荧光RPA检测时，特异性更高，灵敏度更好。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测烟曲霉的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)以待测样品DNA为模板，利用前面所描述的引物组合物或前面所描述的试剂盒对所述待测样品DNA进行RPA检测；2)基于检测结果，确定待测样品中是否含有烟曲霉。若检测结果为出现荧光扩增曲线，表明待测样品中含有烟曲霉anxC4基因；若检测结果为未出现荧光扩增曲线，表明待测样品中不含有烟曲霉anxC4基因。发明人发现，根据本发明实施例的方法可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度地定性检测出菌体、痰、血液、支气管肺泡灌洗液等待测样品中的烟曲霉成分。

根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：步骤1)之前，预先将携带烟曲霉anxC4基因的质粒作为标准品，以不同浓度的标准品作为模板，并利用前面所描述的引物组合物或前面所描述的试剂盒对所述标准品进行RPA检测；且步骤2)是通过如下方式进行的：基于待测样品与所述标准品的检测结果，确定待测样品中烟曲霉的浓度。依据待测样品的荧光信号强度和已知的不同浓度的标准品的荧光信号强度，可以得出待测样品中所含的烟曲霉DNA的拷贝数。发明人发现，根据本发明实施例的方法可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度地分析菌体、痰、血液、支气管肺泡灌洗液等待测样品中的烟曲霉的含量。

根据本发明的实施例，所述携带烟曲霉anxC4基因的质粒为pMD19-T-anxC4。根据本发明的实施例，所述pMD19-T-anxC4质粒中，anxC4基因位于pMD19-T质粒的431bp位点和432bp位点之间。根据本发明的实施例，所述pMD19-T-anxC4质粒具有如图2所示的物理图谱。由此，利用根据本发明实施例的方法检测烟曲霉时，特异性更高，灵敏度更好。

根据本发明的实施例，所述待测样品DNA来源于包括选自分离的菌体，痰、肺泡灌洗液，血液和咽拭子的至少之一。

根据本发明的实施例，所述RPA检测是在温度为37～42℃的条件下进行15～25分钟。

附图说明

图1为根据本发明实施例的RPA扩增的烟曲霉anxC4基因特异性保守区的1％琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图2为根据本发明实施例的携带烟曲霉anxC4基因的重组载体PMD19-T-anxC4的物理图，其中，Cloning Site表示克隆位点；

图3为根据本发明实施例的以标准品质粒为模板进行实时荧光RPA的扩增曲线，其中，fluorescence表示荧光强度，copies表示拷贝数，Time表示时间；

图4为根据本发明实施例的烟曲霉实时荧光RPA检测方法特异性的检测结果，其中，fluorescence表示荧光强度，Time表示时间；

图5为根据本发明实施例的以不同引物组进行烟曲霉实时荧光RPA检测的检测结果，其中，fluorescence表示荧光强度，Time表示时间。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

本发明提供了根据烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4基因)的特异性保守序列设计的烟曲霉实时荧光RPA检测试剂盒及其引物和

exo探针。本发明技术可用于定性检测菌体、痰、血液、支气管肺泡灌洗液等待测样品中的烟曲霉成分，可在等温条件下快速、方便、高效、高特异性、高灵敏度地检测出烟曲霉。

本发明的第一个目的是以烟曲霉anxC4基因序列作为设计模板，提供用于对烟曲霉进行实时荧光RPA检测的引物与

exo探针，以实现烟曲霉的批量检测，提高检测的特异性和灵敏度。

本发明所提供的一对用于对烟曲霉进行实时荧光RPA检测的引物，其上游引物(Af-A)的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物(Af-B)的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。由上述引物衍生的引物序列也属于本发明的保护范围。所述衍生序列是指在SEQ IDNO：1和/或SEQ ID NO：2的基础上经过一至十个碱基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

本发明所提供的用于对烟曲霉进行实时荧光RPA检测的

exo探针(TaqManProbe(Af))，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：16所示；所述探针为经过荧光标记的，其靠近5’端标记有报告荧光基团，靠近3’端标记有淬灭荧光基团。所述探针中FAM-dT为荧光集团，BHQ-dT为淬灭集团，THF为Tetrahydrofuran缩写，探针的3’端进行磷酸化处理。由上述

exo探针序列的衍生序列也属于本发明。所述衍生序列是指在SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：16的基础上，在序列的5’端和/或3’端再添加、减少一个或多个碱基得到的序列。

本发明的第二个目的是提供用于对烟曲霉进行实时荧光RPA检测试剂盒。本发明所提供的实时荧光RPA检测试剂盒，包括上述用于对烟曲霉进行实时荧光RPA检测的引物和

exo探针。

在一些实施例中，所述试剂盒包括以下用于25μL实时荧光RPA反应体系的试剂：实时荧光RPA反应液(2x Reaction Buffer,10x Probe E-mix，20x Core Reaction Mix，50xExo，MgOAc等)，还有配置的dNTP Mixture，10uM引物Af-A(SEQ ID NO：1)，10uM引物Af-B(SEQ ID NO：2)，10μM exo探针(SEQ ID NO：16)。

在一些具体实施例中，所述试剂盒包括以下用于50μL实时荧光RPA反应体系的试剂(按照

Liquid exo试剂盒操作说明配置)：(1)每个0.2mL的反应管中加入10uM上游引物和下游引物各2.1μL，加入10μM exo探针0.6μL。(2)配置预混液(每个反应按)：2xReaction Buffer 25uL，dNTPs和H₂O 8.2uL，10x Probe E-mix 5uL，涡旋混匀并短暂离心。(3)向预混液中加入2.5uL 20x Core Reaction Mix，然后转移到管盖上，颠倒后剧烈振荡混匀并短暂离心。(4)加1uL 50x Exo到管盖，颠倒后剧烈振荡混合和短暂离心。(5)取混合液41.7uL加入到装有引物探针的反应管中，涡旋混匀并短暂离心。(6)取280mM MgOAc2.5uL和模板DNA 1uL添加到反应管的盖子中，涡旋混匀并短暂离心。(7)将反应物置于荧光定量PCR(或其他荧光反应仪)中，37-42℃运行20分钟。

为方便检测，所述试剂盒中还可包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为烟曲霉标准株基因组DNA或携带烟曲霉anxC4基因的克隆质粒(优选为pMD19-T-anxC4)，所述阴性对照为不含烟曲霉anxC4基因的反应体系，如H₂O(双蒸水、无菌去离子水等)。

本发明第三个目的是提供上述引物、探针和试剂盒的应用，即在对烟曲霉检测中的应用。

本发明第四个目的是提供一种用上述实时荧光RPA检测试剂盒对烟曲霉检测的方法，包括以下步骤：

(1)提取待测样品的DNA，以提取的DNA为模板，在试剂盒中引物和

exo探针的引导下进行烟曲霉anxC4基因的实时荧光RPA检测；

(2)根据荧光信号的变化及强度，对待测样品中的烟曲霉anxC4基因检测，出现荧光扩增曲线表明样品中含有烟曲霉anxC4基因，未出现荧光扩增曲线表明样品中不含有烟曲霉anxC4基因。

在一些实施例中，对烟曲霉进行实时荧光RPA检测，可包括以下步骤：

1)建立标准曲线：将携带烟曲霉anxC4基因的克隆质粒作为标准品，梯度稀释成10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷拷贝/μL，以不同浓度的标准品作为模板，在试剂盒中引物和

exo探针的引导下进行实时荧光RPA检测，观察最低检测限值；

2)提取待测样品的DNA，以提取的DNA为模板，在试剂盒中引物和

exo探针的引导下进行烟曲霉anxC4基因的实时荧光RPA检测；

3)根据荧光信号的变化及强度，对待测样品中的烟曲霉anxC4基因检测，出现荧光扩增曲线表明样品中含有烟曲霉anxC4基因，未出现荧光扩增曲线表明样品中不含有烟曲霉anxC4基因，再根据样品的荧光信号强度和步骤1)中的标准曲线，得出待测样品中所含的烟曲霉DNA的拷贝数。

在上述检测方法中，所述步骤1)中携带烟曲霉anxC4基因的克隆质粒优选为pMD19-T-anxC4。

所述步骤2)中的待测临床样本主要包括分离的菌体和痰、肺泡灌洗液、血液、咽拭子等标本。

所述步骤1)和步骤2)中的50μL实时荧光RPA反应体系按照

Liquid exo试剂盒操作说明配置，包括10uM上游引物和下游引物各2.1μL，以及10μM exo探针0.6μL。

所述步骤1)和步骤2)中的实时荧光RPA反应条件可为：37-42℃运行20分钟。

总结：

本发明烟曲霉的实时荧光RPA检测，首先设计针对烟曲霉anxC4基因的引物与

exo探针，再以待测样品的DNA为模板，结合实时荧光RPA检测技术，实现对烟曲霉检测的目的。具有以下优点：

1、简便、快速：整个检测(包括加样)可在20min内完成，整个检测过程比普通PCR完成一次反应节省了大概两个小时，计算机自动报告结果，无需后续实验工作(电泳等)，减少了工作量。

2、特异性高：用本发明对黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉、杂色曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、浅白隐球菌、指甲隐球菌、新生隐球菌、桔青霉、马内菲青霉、棘状外瓶霉、皮炎外瓶霉、荚膜组织胞浆菌、尖孢镰刀菌、红色毛癣菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和人A549细胞的DNA进行检测，结果均呈阴性，仅对烟曲霉的检测结果呈阳性。本发明设计的引物和

exo探针对烟曲霉anxC4基因的特异性识别保证了实时荧光RPA的高度特异性，即能从相差仅1个核苷酸的基因标本中找出相应的靶序列进行扩增。

综上所述，本发明中烟曲霉的实时荧光RPA检测方法明显优于现有的烟曲霉检测方法，具有特异性高、灵敏度高、准确度高、检测速度快、低污染、对仪器设备要求低和成本低廉等优点，可用于临床、科研以及生产中对烟曲霉进行定性和定量分析。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《MolecuLar Cloning:A Laboratory Manual》(《分子克隆实验指南》)[Sambrook，J.，Russell，David W.，MolecuLar Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor.]。

所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

所用引物和探针均由华大基因公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述实施例。

实施例1设计对烟曲霉检测的实时荧光RPA引物及

exo探针

从NCBI的核酸数据库GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)检索获得烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4或ANXC4)的序列(GenBank：KU575861.1)，用DNA Man软件进行比对后，获得烟曲霉膜联蛋白anxC4基因为烟曲霉的特异性保守序列(它相对其他真菌和人是特异性的，因此作为检测模板)；选取烟曲霉anxC4基因(GenBank：KU575861.1)反向互补序列为模板，对烟曲霉进行实时荧光RPA检测的引物及

exo探针设计，共设计出1条探针与多条上游引物和下游引物，任意1条上游引物和1条下游引物可构成1套组合。通过敏感性检测筛选出性能最佳的一套引物探针组合，序列如下：

上游引物Af-A：

5’-CGGGAACGCGACGAATCGTGCTTGGCTGGAGGAGC-3’(SEQ ID NO：1)；

下游引物Af-B：

5’-GCGATGCGCCTAGCGATCTGGAGCGTGATTTCTAC-3’(SEQ ID NO：2)；

未被修饰的exo Probe(AF)：

5’-CTGGAGGAGCACCATTGAGCGCCCCGGACATAACTGGACCATCTACG-3’(SEQ ID NO：3)；

被修饰的exo Probe(AF)：

5’CTGGAGGAGCACCATTGAGCGCCCCGGACA[FAM-dT][THF]AC[BHQ-dT]GGAC CATCTACG[3’-block]3’(SEQ ID NO：16)。

上述引物特异性扩增anxC4基因(GenBank：KU575861.1)反向互补序列中自5’端第85-226位碱基序列；

exo探针中FAM-dT为荧光集团，BHQ-dT为淬灭集团，THF为Tetrahydrofuran缩写，探针的3’端进行磷酸化处理。

实施例2用本发明的引物及

exo探针进行烟曲霉的实时荧光RPA检测

1、提取烟曲霉的基因组DNA

用CTAB法提取烟曲霉(ATCC13073)的基因组DNA，具体方法包括以下步骤：

1)配制CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)抽提缓冲液(pH 8.0)：称取十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)30g，Tris 12.12g，乙二胺四乙酸(EDTA)5.84g，氯化钠(NaCl)82g，用800mL去离子水充分搅拌溶解，再加入100mL二硫苏糖醇(DTT)溶液，用NaOH调pH至8.0，最后定容到1L，室温保存；

2)配制CIA溶液：CIA饱和酚/氯仿/异戊醇25：24：1(V/V/V)，4℃保存；

3)向烟曲霉样本中加入600μL CTAB抽提缓冲液，振荡混匀后在65℃下裂解(裂解菌体释放基因组DNA)，裂解时间优选为30min，每隔10min充分混匀一次；

4)将裂解液放在冰水(约0℃)中冷却，冷却时间优选为10min；

5)再向裂解液中加入CIA溶液(除去蛋白质并获得DNA)400μL，充分混匀，4℃、10000rpm离心5min，将水相转移到新的离心管中；

6)加入等体积预冷的异丙醇(沉淀DNA)，颠倒混匀数次后静置5min，4℃、10000rpm离心10min；

6)轻轻倒出上清,将离心管倒置在滤纸上排干水分，用40μL去离子水重悬DNA，放置-20℃备用。

2、构建携带烟曲霉(Af)膜联蛋白anxC4基因(anxC4)的克隆质粒(实时荧光RPA标准品)

根据烟曲霉(Af)膜联蛋白anxC4基因(GenBank：KU575861.1)序列设计PCR扩增烟曲霉anxC4基因的引物(上游引物Af-1序列：5’-CAAATCTTCGACCAGTGA-3’，下游引物Af-2序列：5’-GTTCACACTCTGGAATGG-3’)，用CTAB法提取烟曲霉(ATCC13073)的基因组DNA，再以烟曲霉的基因组DNA为模板，在引物Af-1和Af-2的引导下进行PCR扩增。25μL PCR反应体系为：DNA模板2μL，2×Taq mix(配方：Taq DNA Polymerase(recombinant)：0.05units/μl；MgCl₂：4mM；dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)：0.4mM)12.5μL，引物Af-1 0.5μL(10μM)，引物Af-2 0.5μL(10μM)，无菌水9.5μL。PCR反应条件为：先95℃3min，然后95℃30s，58℃30s，72℃40s，共35个循环，最后72℃7min。反应结束后，取50μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(100V 30min)，结果如图1所示，经扩增获得了长度为381bp的DNA片段，用琼脂糖DNA胶回收试剂盒(OMEGA公司)回收、纯化PCR扩增产物，将其连接到载体PMD19-T(购自Takara公司)中，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，用蓝白斑法筛选阳性克隆，对阳性克隆进行测序，测序结果表明经PCR扩增获得了序列正确的烟曲霉anxC4基因(检测基因)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示(SEQ ID NO：5为插入到标准品质粒中的检测序列)，而且烟曲霉anxC4基因成功连接入载体PMD19-T中的431bp位点和432bp位点之间，与预期结果相符，将携带烟曲霉anxC4基因的重组载体命名为pMD19-T-anxC4，其物理图谱如图2所示。

CAAATCTTCGACCAGTGACGTATGAGAGTCCCTCGGATGACTCCTACTCAGATACGGACGACGAGGCGCTGGCCTACGGCGATGCGCCTAGCGATCTGGAGCGTGATTTCTACGGATACAGAAAGCCAGCGCGTGCGTCCTCGCCTCGCGTAGATGGTCCAGTTATGTCCGGGGCGCTCAATGGTGCTCCTCCAGCCAAGCACGATTCGTCGCGTTCCCGTCATGCTTCAGATGAGGACATTCCCGGTCATCATCCCAGCTATGCCAGACCCGGACAGTTCCAGTATGCCATGCCGTCACAGTATGGCCAATTCCAGCCTAGCTATCCTCCGACATCATCTGCACCGCAGTCAAATTGGGCCCCCATTCCAGAGTGTGAA C(SEQ ID NO：5)。

将携带pMD19-T-anxC4的阳性克隆接入LB培养基中，在37℃条件下培养15小时，培养结束后用质粒小提试剂盒(OMEGA公司)提取质粒，得到携带烟曲霉膜联蛋白anxC4基因(anxC4)的克隆质粒。

用紫外分光光度计对克隆质粒准确定量后，根据以下公式计算出其拷贝数，进行10倍梯度稀释，浓度依次为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷拷贝/μL，作为标准品保存于-20℃备用。

分子量＝片段大小×660g/(mol bp)

3、敏感性分析

以步骤2获得的拷贝数分别为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷拷贝/μL的pMD19-T-anxC4标准品质粒为模板，在实施例1中引物Af-A、Af-B及探针TaqManProbe(AF)的引导下用ROCHE lc96荧光定量PCR仪进行RPA反应。50μL实时荧光RPA反应体系按照

Liquid exo试剂盒操作说明配置，包括10uM上游引物和下游引物各2.1μL，以及10μM exo探针0.6μL。RPA反应条件可为：37-42℃运行20分钟。

结果显示，各稀释度的pMD19-T-anxC4均能产生荧光信号，扩增曲线如图3所示(从下至上依次为以1、5、10¹、10²、10⁴、10³、10⁶、10⁵拷贝/μL标准品质粒为模板的扩增曲线)，从不同浓度起始模板的扩增曲线可以看出，反应开始不久就出现扩增曲线，指数区明显，大致存在浓度越高斜率越大的趋势，这些均说明在引物Af-A、Af-B及探针TaqManProbe(AF)的引导下模板的扩增是较为理想的。可以检测到10copies的样品，检测最低限值为1copies。

4、样品检测

用CTAB法提取待测样品的基因组DNA(模板)，同时设阴性对照(不加模板，NTC)和阳性对照(已知烟曲霉基因组DNA)，用步骤3中的反应体系及反应条件进行烟曲霉的实时荧光RPA检测。

实施例3检测烟曲霉实时荧光RPA检测方法的特异性

分别以烟曲霉(ATCC13073)、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉、杂色曲霉、白色念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、浅白隐球菌、指甲隐球菌、新生隐球菌、桔青霉、马内菲青霉、棘状外瓶霉、皮炎外瓶霉、荚膜组织胞浆菌、尖孢镰刀菌、红色毛癣菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌(以上菌株均来自中国人民解放军疾病预防控制所医院感染监督中心)、人A549细胞基因DNA为模板，以10⁴拷贝/2μL烟曲霉克隆质粒pMD19-T-anxC4标准品为阳性对照，以无菌去离子水为阴性对照，检测本发明烟曲霉实时荧光RPA检测方法的特异性。实时荧光RPA检测的反应体系及反应条件与实施例2中步骤3相同。

特异性检测结果如图4所示，可以看出，只有烟曲霉DNA作为模板时会出现明显的扩增曲线(阳性)，以其它菌和人(Human)的基因组DNA为模板均为直线(无扩增曲线，阴性)，空白对照也为直线(无扩增曲线，阴性)，与预期结果相符，表明本发明的检测方法具有较高的特异性。

实施例4制备用于烟曲霉实时荧光RPA检测的试剂盒

本发明提供的试剂盒包括：用于对烟曲霉进行实时荧光RPA检测的引物和

exo探针，上游引物(Af-A，SEQ ID NO：1)，下游引物(Af-B，SEQ ID NO：2)，

exo探针(TaqManProbe(AF)，SEQ ID NO：16)。

具体的，将实时荧光RPA反应液(2x Reaction Buffer,10x Probe E-mix，20xCore Reaction Mix，50x Exo，MgOAc等)，还有配置的dNTP Mixture，10uM引物Af-A(SEQ IDNO：1)，10uM引物Af-B(SEQ ID NO：2)，10μM exo探针(SEQ ID NO：16)，作为阳性对照的携带烟曲霉anxC4基因的克隆质粒(pMD19-T-anxC4)，以及作为阴性对照的双蒸水或无菌去离子水(优选)共同包装，得到用于50μL反应体系的烟曲霉的实时荧光RPA检测试剂盒。

该烟曲霉实时荧光RPA检测试剂盒可参考实施例2的方法使用。

对比例

实时荧光RPA检测的反应体系及反应条件与实施例2中步骤3基本相同，区别仅在于：所采用的上游引物为表1中SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：6～9，下游引物为表1中SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：10～16，取上游引物和下游引物各一条两两组合组成引物对。

表1：烟曲霉实时荧光RPA检测的引物及

exo探针组合

检测结果：敏感性分析结果如图5所示(同一烟曲霉基因组DNA为模板的扩增曲线)，可以发现，当反应体系采用引物对(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)时敏感性显著最高。

结论：利用本发明的引物对(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2)进行烟曲霉的实时荧光RPA检测，灵敏度显著更高，可用于临床、科研以及生产中对烟曲霉进行检测分析。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军疾病预防控制中心

<120> 烟曲霉的实时荧光RPA检测试剂盒及其专用引物和探针

<130> PIDC3193224

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物Af-A

<400> 1

cgggaacgcg acgaatcgtg cttggctgga ggagc 35

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物Af-B

<400> 2

gcgatgcgcc tagcgatctg gagcgtgatt tctac 35

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 未被修饰的exo Probe(AF)

<400> 3

ctggaggagc accattgagc gccccggaca taactggacc atctacg 47

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物RPA P3 R8

<400> 4

ggatacagaa agccagcgcg tgcgtcctcg cctcg 35

<210> 5

<211> 381

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 烟曲霉anxC4基因

<400> 5

caaatcttcg accagtgacg tatgagagtc cctcggatga ctcctactca gatacggacg 60

acgaggcgct ggcctacggc gatgcgccta gcgatctgga gcgtgatttc tacggataca 120

gaaagccagc gcgtgcgtcc tcgcctcgcg tagatggtcc agttatgtcc ggggcgctca 180

atggtgctcc tccagccaag cacgattcgt cgcgttcccg tcatgcttca gatgaggaca 240

ttcccggtca tcatcccagc tatgccagac ccggacagtt ccagtatgcc atgccgtcac 300

agtatggcca attccagcct agctatcctc cgacatcatc tgcaccgcag tcaaattggg 360

cccccattcc agagtgtgaa c 381

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物RPA P3 F2

<400> 6

catgacggga acgcgacgaa tcgtgcttgg ctgga 35

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物RPA P3 F3

<400> 7

tgaagcatga cgggaacgcg acgaatcgtg cttgg 35

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物RPA P3 F4

<400> 8

tcatctgaag catgacggga acgcgacgaa tcgtg 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 上游引物RPA P3 F5

<400> 9

tgtcctcatc tgaagcatga cgggaacgcg acgaa 35

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物RPA P3 R2

<400> 10

tctacggata cagaaagcca gcgcgtgcgt cctcg 35

<210> 11

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物RPA P3 R3

<400> 11

tgatttctac ggatacagaa agccagcgcg tgcgt 35

<210> 12

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物RPA P3 R4

<400> 12

gagcgtgatt tctacggata cagaaagcca gcgcg 35

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物RPA P3 R5

<400> 13

atctggagcg tgatttctac ggatacagaa agcca 35

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物RPA P3 R6

<400> 14

tagcgatctg gagcgtgatt tctacggata cagaa 35

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 下游引物RPA P3 R7

<400> 15

gcgcctagcg atctggagcg tgatttctac ggata 35

Claims

1.一种用于RPA检测的引物组合物，其特征在于，包括：

正向引物，所述正向引物为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，

反向引物，所述反向引物为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

2.一种试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1所述的引物组合物。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括：探针，所述探针为SEQ IDNO：3所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的3’端标记有阻抑聚合酶延伸或扩增的基团，所述探针自5’端起第31位碱基标记有荧光基团，所述探针自5’端起第35位碱基标记有淬灭基团，所述探针自5’端起第32位碱基被THF替代。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述阻抑聚合酶延伸或扩增的基团为磷酸基团。

6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM。

7.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述淬灭基团为BHQ。

8.根据权利要求2～7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物与所述反向引物的摩尔浓度比为1:1。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述探针与所述正向引物的摩尔浓度比为1:1。

10.权利要求1所述的引物组合物在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测烟曲霉其特征在于，所述检测包括：

1)以待测样品DNA为模板，利用权利要求1所述的引物组合物或权利要求2～9任一项所述的试剂盒对所述待测样品DNA进行RPA检测；

2)基于检测结果，确定待测样品中是否含有烟曲霉。

11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，进一步包括：

步骤1)之前，预先将携带烟曲霉anxC4基因的质粒作为标准品，以不同浓度的标准品作为模板，并利用权利要求1所述的引物组合物或权利要求2～9任一项所述的试剂盒对所述标准品进行RPA检测，

步骤2)是通过如下方式进行的：

基于待测样品与所述标准品的检测结果，确定待测样品中烟曲霉的浓度。

12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述携带烟曲霉anxC4基因的质粒为pMD19-T-anxC4。

13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述pMD19-T-anxC4质粒中，anxC4基因位于pMD19-T质粒的431bp位点和432bp位点之间。

14.根据权利要求12所述的用途，其特征在于，所述pMD19-T-anxC4质粒具有如图2所示的物理图谱。

15.根据权利要求10～14中任一项所述的用途，其特征在于，所述待测样品DNA来源于包括选自分离的菌体，痰、肺泡灌洗液，血液和咽拭子的至少之一。

16.根据权利要求10～14中任一项所述的用途，其特征在于，所述RPA检测是在温度为37～42℃的条件下进行15～25分钟。