CN111471785A - 基于rpa快速检测技术的白色念珠菌检测试剂盒 - Google Patents

基于rpa快速检测技术的白色念珠菌检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于RPA检测白色念珠菌的快速、简便、特异且灵敏的适合大多数实验室的检测试剂盒，包括一对引物和一条探针，引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1～2所示，探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。前述试剂盒有两种形式：实时荧光检测试剂盒和试纸条试剂盒。实验显示本发明的试剂盒检测白色念珠菌耗时短、灵敏度及特异性高，结合简单的核酸粗提取方法进一步节约成本，可为野外及护理点检测提供新的技术参考，尤其对资源基础设备匮乏的地区病原菌检测方面意义重大。

Description

基于RPA快速检测技术的白色念珠菌检测试剂盒
技术领域
病原微生物检验领域，涉及检测白色念珠菌的试剂盒及应用，特别涉基于RPA快速检测白色念珠菌的荧光检测试剂盒、试纸条检测试剂盒及应用。
背景技术
白色念珠菌是临床引起侵袭性念珠菌病(Invasive Candidiasis，IC)最常见的真菌，是一种重要的条件致病菌。正常情况下，存在于正常人口咽腔、上呼吸道、肠道及阴道，一般在正常机体中数量少，不引起疾病。当一些风险因素(例如皮肤和胃肠道天然屏障被破坏、反复或长期使用广谱抗生素、免疫系统损害等)存在时，机体内的共生平衡状态被破坏，诱导生成毒力因子入侵，引起致病。侵袭性念珠菌病由最初症状性念珠菌血症到暴发性脓毒症，死亡率超过70％。
由于缺乏对侵袭性念珠菌病的早期快速诊断分析，大多数临床医生依赖于传统的真菌分离培养(灵敏度低、耗时长约48-72h)或是经验证据(例如重症监护病房(ICU)患者原因不明的发热或败血症使用常规抗生素治疗无效)来建立诊断，这种方法可能导致未感染者不必要的抗真菌药物使用，并且还导致对感染者的有效抗真菌治疗的干预延迟。事实上，一个有效的抗真菌治疗一旦每延迟一天，死亡风险提高约50％。因此，及早发现该病原菌，才能为该病的治疗争取时间，最大限度地减少疾病带来的损失。
鉴于这一巨大的挑战，过去几十年见证了各种早期检测发展，基于病原体衍生的生物标志物检测的PCR、实时荧光定量PCR、基于宿主衍的生物特异抗体标志物检测、前沿蛋白组学和免疫组学技术等开展，极大缩短了传统检测所需时间，但检测时间仍长2-6h且检测过程复杂、技术要求高、所需成本高，限制其进一步推广应用。
重组酶聚合酶扩增技术，简称RPA技术，是2006年由英国TwistDX公司开发的一种新型核酸恒温扩增技术，与传统PCR相比反应不再需要热循环装置，只需在恒温条件下即可实现DNA的扩增。
RPA技术扩增产物有2种主流的检测方法：实时荧光检测仪(比如常规的荧光定量PCR仪)检测和侧向流检测试纸(简称“试纸条”；例如：胶体金免疫层析试纸条)检测，不同检测方法对应原理不同，其探针构造略有不同。
实时荧光检测仪检测方法对应探针带有碱基替代物dSpcacer(通常为四氢呋喃)，dSpcacer两侧有荧光基团(5’侧)和淬灭基团(3’侧)。扩增时，核酸外切酶III从dSpcacer剪断探针，得到可延伸的3’-OH，DNA聚合酶可继续进行DNA延伸合成；因为荧光基团与淬灭基团分开，荧光信号得以释放(图1)。随着反应进行，荧光信号逐渐增强，因此可以通过实时荧光检测仪检测。
试纸条检测方法对应探针同样带有碱基替代物dSpcacer(通常为四氢呋喃)，同时探针的5’端还带有荧光基团，但不含淬灭基团。扩增时，核酸内切酶IV剪切dSpcacer，留下可延伸3’-OH，DNA聚合酶以探针为“正向引物”继续延伸合成DNA，与反向引物(带亲和标记，例如生物素)一起扩增出一种带有双重标记(荧光基团标记、亲和标记)的扩增产物(图2)；该产物在侧向流检测试纸中层析，遇到可识别亲和标记的试纸区域(通常为一条线，带有链霉亲和素)时，则被富集，表现出线形荧光信号。
RPA技术自问世以来已经被成功的探索性用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、埃博拉病毒病等病原菌引起的疾病的分子诊断。其对核酸纯度要求不高可以结合粗制样品，具有操作简单、特异性强、灵敏度高、低成本、检测核酸类型多样、检测方式灵活等优点。目前对真菌的研究明显落后于细菌与病毒，作为最常见的致病性真菌之一的白色念珠菌，迫切地需要一种快速简便有效的检测方法。
据了解，目前国内外尚无针对基于RPA开发的白色念珠菌检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于基于RPA快速检测技术的白色念珠菌检测试剂盒。
本发明的技术方案包括：
一种基于重组酶聚合酶扩增技术的白色念珠菌检测试剂盒，它包括一对引物和一条探针；引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1～2所示，探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；
探针3’端被阻断基团修饰；
探针被荧光基团标记；
探针带有碱基替代物dSpcacer；
如前述的试剂盒，所述试剂盒还包括：
核心酶冻干粉混合物、再水化合物缓冲液、醋酸镁；
所述核心酶冻干粉混合物包括：聚合酶、重组酶、单链结合蛋白、核酸酶；
优选地，聚合酶、重组酶、单链结合蛋白、识别并剪切碱基替代物dSpcacer的酶的质量比为4：1：9：3。
若试剂盒为实时荧光检测试剂盒，则所述识别并剪切碱基替代物dSpcacer的酶为核酸外切酶III；若试剂盒为试纸条试剂盒，则所述识别并剪切碱基替代物dSpcacer的酶为核酸内切酶IV；
和/或，所述试剂盒还包括具有白色念珠菌DNA序列的阳性对照样本。
如前述的试剂盒，所述阳性对照样本的序列如SEQIDNO.6所示。
如前述的试剂盒，碱基替代物dSpcacer位于探针第30-31碱基之间；
优选地，dSpcacer为四氢呋喃；
优选地，阻断基团为C3-spacer。
如前述的试剂盒，所述试剂盒是实时荧光检测试剂盒；
所述荧光基团位于探针第29碱基；
探针还带有淬灭基团，淬灭基团位于探针第32碱基；
优选地，所述荧光基团为FAM；
优选地，所述淬灭基团为BHQ1。
如前述的试剂盒，所述试剂盒是试纸条试剂盒，含有侧向流试纸条；
所述试剂盒还包括1×PBST试纸条缓冲液；
所述试剂盒的一条引物5’端标记了生物素。
进一步的，所述试剂盒的探针的荧光基团位于5’端。
本发明还提供了一种白色念珠菌的检测方法，
它是使用前述试剂盒对样品DNA进行重组酶聚合酶扩增，扩增后检测产物即可。
如前述的检测方法，它是使用前述实时荧光检测试剂盒对样品DNA进行重组酶聚合酶扩增，检测荧光信号；
优选地，重组酶聚合酶扩增在39℃下进行；和/或，反应时间为20min。
如前述的检测方法，它是使用前述的试纸条试剂盒对样品DNA进行重组酶聚合酶扩增，用侧向流试纸条检测产物；
优选地，重组酶聚合酶扩增在37℃-43℃下进行；和/或，扩增时间为15-30min；
进一步优选地，重组酶聚合酶扩增在39℃下进行，扩增时间为20min。
与现有的技术相比较，本发明具有以下优点：
1.检测快速：RPA整个反应时间为15-20min，远远低于qPCR(约2h)。
2.反应温度耗能低：不论实时RPA还是RPA结合试纸条的检测温度均可37℃进行，不再需要经过热循环(65-95℃)过程进行扩增。
3.方法简单便于操作：仅需简单混合，加入适量的镁离子，短暂离心后，启动反应。试纸条法仅需一台水浴锅，甚至用人体体温便可提供反应所需温度，使得检测结果可视化，对操作人员的专业性要求低。
4.可实现现场检测：首先由于反应温度低，可实现检测设备便携化；其次反应试剂为冻干粉可实现常温放置(＜6月)；最后检测对样品的纯度要求不高，仅需对样品进行粗提取(液氮反复冻融或者加热煮沸)。
5.特异性好：加入探针，增加了检测的特异性，与现有的qPCR结果一致。
6.灵敏度高：检测的最低检测限为102拷贝数/反应，绝大多数样本所带菌量的基因组超过了102个拷贝数，可满足白色念珠菌检测需要。
7.检测结果可靠：与现有的成熟技术qPCR检测结果一致。
8.目前RPA检测常规推荐反应体系体积为50μl，目的是保证RPA反应稳定性(与检测的重复性有关)；本发明通过优化核心酶的配比，使得每个反应体系的体积降为传统推荐量的1/3，仍能保持RPA反应稳定性(重复性良好)，进一步节约成本。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1.实时荧光检测中探针工作原理图。
图2.试纸条检测中探针工作原理图。
图3.RPA实时荧光检测试剂盒检测白色念珠菌的灵敏度分析。其中NC代表阴性对照。
图4.RPA实时荧光检测试剂盒检测白色念珠菌的特异性分析。其中非白色念珠菌代表(铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、光滑念珠菌)。
图5.RPA实时荧光检测试剂盒检测不同浓度的色念珠菌的检出率。
图6.RPA试纸条试剂盒检测白色念珠菌的灵敏度分析。其中NC代表阴性对照。
图7.RPA试纸条试剂盒检测白色念珠菌的特异性分析。
图8.RPA试纸条试剂盒检测检测不同浓度的色念珠菌的检出率。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的试剂、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实施例1基于RPA恒温检测白色念珠菌的实时荧光检测试剂盒及其使用方法
1.试剂盒的构成
1.1引物、探针
本发明的引物和探针序列如表1所示，探针序列中，第30-31碱基之间碱基替代物dSpcacer(供核酸外切酶III识别切割)为四氢呋喃，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰(它还可以是磷酸盐生物素或胺)；第29碱基的胸腺嘧啶被荧光基团FAM取代(dT-FAM)，第32碱基的胸腺嘧啶被淬灭基团BHQ1取代(dT-BHQ1)。
表1 引物、探针序列
Figure BDA0002389157450000051
Figure BDA0002389157450000061
1.2其他试剂
100μl 50×核心酶混合物冻干粉混合物，其中包括重组酶、DNA聚合酶、单链结合蛋白、核酸外切酶III(质量比4∶1∶9∶3)。
3ml再水化合物缓冲液[2×Reaction Buffer(Tiwist DXTM)]。
500μl 280mM醋酸镁。
2.实验菌株与临床样本来源
本发明中使用的白色念珠菌标准株(ATCC 10231)、金黄色葡萄球菌标准株(ATCC33591)、铜绿假单胞菌标准株(ATCC 27853)、鲍氏不动杆菌标准株(ATCC 19606)、大肠杆菌标准株(ATCC 25922)、光滑念珠菌由本实验室保存，31例疑似感染白色念珠菌临床样本来自西南医科大学附属第一医院不同临床科室和5株棉拭子取材的健康志愿者的阴道分泌物样本来自西南医科大学附属医院妇产科。
3.白色念珠菌基因组的提取
其中实验菌株使用酵母/细菌基因组提取试剂盒(TIANGEN DP307-02/DP302-02)，按照说明书进行提取，使用30μl灭菌水洗脱，-20℃保存备用。临床样本使用Lysis Buffer(Takara Code No.9164)加热煮沸裂解，离心留取上清进行后续实验。
4.标准质粒制备
提取白色念珠菌标准株(ATCC 10231)DNA。设计扩增ITS2基因的引物
上游引物(SEQ ID NO.4)：
5’-CAACTTGTCACACCAGATTATTACTAATAG-3’
下游引物(SEQ ID NO.5)：
5’-GAAGATATACGTGGTGGACGTTACCGCCGC-3’
以提取到的白色念珠菌标准株DNA为模板，扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循坏；72℃终延伸5min。反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖(3％)凝胶电泳，以确定扩增片段大小为338bp，并将PCR产物送测序进一步验证扩增产物为发明人的目的产物。用胶回收试剂盒进行PCR产物回收，并与pMD-19T克隆载体进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，均匀涂布于100mg/L氨苄青霉素的IPTG-X-gal的固体培养基，37℃培养16-18h。筛选出阳性单克隆加入含氨苄青霉素的5ml液体培养基，37℃培养，取2ml菌液提取质粒，测定序列为阳性pMD-19T-338。剩余菌液甘油保种，于-80℃保存备用。
标准质粒的核酸序列(SEQ ID NO.6)为：
Figure BDA0002389157450000071
5.反应条件优化
以试剂盒提取的实验菌株的基因组、粗提取的临床样本或者标准质粒进行实验，实验体系如下：于核心酶混合物冻干粉(100μl)中加入再水化合物缓冲液29μl，上下游引物各2μl，探针0.65μl(或者引物探针混合物4.65μl)，无DNA/RNA酶水10.35ul，以上的加样量充分考虑了加样误差及混合过程中的损耗，再将以上的混合物以每管12.5ul，分到3个pcr管中，再加入待检测模板或标准质粒2μl，于管盖加入醋酸镁(280mmol/L)0.5μl。
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如表1所示。
按照上述反应体系加入反应物，发明人分别测试的了37℃、38℃，39℃，40℃四个不反应温度，反应时间为20min，反应于ABI QuantStudio 12K实时荧光定量PCR仪中进行检测与分析，用GraphPad Prism 6.0绘制图像。通过结果分析显示39℃反应结果最佳。发明人按照同样的反应体系于39℃反应，设定了5个不同的反应时间10min、15min、20min、25min、30min，随着反应进行10min扩增曲线已有上升趋势，直到20min扩增较为完全与30min结果一致。
综上所述，本发明设计确定的反应条件为39℃反应20min。
实时荧光RPA试剂盒结果判定为：含有白色念珠菌基因组DNA的反应管荧光曲线呈明显上升趋势，阴性对照为平滑的直线。
6.实时荧光RPA试剂盒对白色念珠菌的灵敏度与特异性检测
灵敏度检测：质粒标准品用紫外分光光度计测量浓度为124.8ng/μL，pMD-19T的碱基数为2692bp，目的片段大小为338bp，每个碱基平均相对分子质量为660道尔顿/bp，每ul样品中的拷贝数按照计算公式：样品拷贝数(copies/ul)＝(6.02×1023)×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(660×碱基数)，最终计算出的拷贝数为3.7×1010copies/ul。以上的标准品按照10倍倍比稀释，取浓度在107-101copies/ul进行实验，在实时荧光定量PCR仪中39℃反应20min。结果如图3所示：随着拷贝浓度的降低，出现扩增曲线的时间延长，当拷贝数为101copies/ul并不能总是稳定地出现明显的扩增曲线。检出率结果如图5所示，表明在107-102copies/ul范围内的样品均能被检出。
特异性检测：以上述体系进行反应，加入模板分别为白色念珠菌(阳性对照)、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、光滑念珠菌，在实时荧光定量PCR仪中39℃反应20min。结果如图4所示只有白色念珠菌出现明显的荧光扩增曲线，其余非白色念珠菌扩增结果均为平滑直线。
7.重复性实验
按照上述反应体系，以107-102copies/ul的标准质粒为模板进行稳定性检测。在同一实验中每一个浓度设置3个检测副孔，以便分析组内差异；以上述相同条件分别进行3次独立重复实验，分析组间差异并计算变异系数。变异系数(CV％)＝(标准差/平均值)×100％。结果采用SPSS 19.0对数据进行分析，计量资料均符合正态分布，以x±s表示，方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。结果如表2所示：组内各孔重复值CV％在2.30-6.45之间，按照国家药品食品监督管理局要求，符合批内重复差异系数CV％应不大于10％；批间重复测定CV％在2.44-10.42之间，按照国家药品食品监督管理局要求，符合批间重复差异系数CV％应不大于15％。
表2 实时RPA检测白色念珠菌组内和组间的重复性
Figure BDA0002389157450000091
注：x为平均值，s为标准差，CV％为变异系数。
8.实时荧光RPA对临床样本的检测
发明人采用上述的15μL反应体系，对采集自西南医科大学附属第一医院不同临床科室31例疑似感染白色念珠菌临床样本和5株棉拭子取材的健康志愿者的阴道分泌物样本进行检测。使用Lysis Buffer对样本进行粗提取，离心取上清作为模板，反应结果与qPCR进行比对。其中qPCR的反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。结果如表3所示：31例疑似感染白色念珠菌临床样本中实时荧光RPA法检测出阳性样本为14例，与qPCR结果一致；5株棉拭子取材的健康志愿者的临床样本使用实时荧光RPA法均为阴性，结果与qPCR一致。
表3 实时荧光RPA与qPCR对临床样本检测结果的比较
Figure BDA0002389157450000092
本发明基于RPA恒温检测白色念珠菌的实时荧光检测试剂盒及其对应检测方法可以满足快速检测白色念珠菌的需要，具有快速、操作简单、结果可靠(灵敏度高、特异性好、重复性好、与qPCR一致性极强)。
实施例2基于RPA恒温检测白色念珠菌的试纸条检测试剂盒及其使用方法
1.试剂盒的构成
1.1引物和探针
引物和探针序列如表4所示，下游引物的5’端有生物素(biotin)标记；探针序列中，第30-31碱基之间碱基替代物dSpcacer(供核酸内切酶IV识别切割)为四氢呋喃，3’末端被阻断基团C3-spacer修饰(它还可以是磷酸盐生物素或胺)。
表4 引物、探针序列
Figure BDA0002389157450000101
1.2其他试剂
100μl 50×核心酶混合物冻干粉混合物：重组酶、聚合酶、单链结合蛋白、核酸内切酶IV(质量比4∶1：9：3)。
3ml再水化合物缓冲液[2×Reaction Buffer(Tiwist DXTM)]。
500ul 280mM醋酸镁。
胶体金免疫层析试纸条
Figure BDA0002389157450000102
由样品垫、纤维素膜、检测带、对照带、吸水垫构成，25人份/盒。
试纸条缓冲液：1×PBST缓冲液(规格：5ml)。
2.实验菌株与临床样本来源
本发明中使用的白色念珠菌标准株(ATCC 10231)、金黄色葡萄球菌标准株(ATCC33591)、铜绿假单胞菌标准株(ATCC 27853)、鲍氏不动杆菌标准株(ATCC 19606)、大肠杆菌标准株(ATCC 25922)、光滑念珠菌由本实验室保存，31例疑似感染白色念珠菌临床样本来自西南医科大学附属第一医院不同临床科室和5株棉拭子取材的健康志愿者的阴道分泌物样本来自西南医科大学附属医院妇产科。
3.白色念珠菌基因组的提取
其中实验菌株使用酵母/细菌基因组提取试剂盒(TIANGEN DP307-02/DP302-02)，按照说明书进行提取，使用30μl灭菌水洗脱，-20℃保存备用。临床样本使用Lysis Buffer(Takara Code No.9164)加热煮沸裂解，离心留取上清进行后续实验。
4.标准质粒制备
提取白色念珠菌标准株(ATCC 10231)DNA。设计扩增ITS2基因的引物
上游引物：5’-CAACTTGTCACACCAGATTATTACTAATAG-3’
下游引物：5’-GAAGATATACGTGGTGGACGTTACCGCCGC-3’
以提取到的白色念珠菌标准株DNA为模板，扩增条件为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循坏；72℃终延伸5min。反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖(3％)凝胶电泳，以确定扩增片段大小为338bp，并将PCR产物送测序进一步验证扩增产物为发明人的目的产物。用胶回收试剂盒进行PCR产物回收，并与pMD-19T克隆载体进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，均匀涂布于100mg/L氨苄青霉素的IPTG-X-gal的固体培养基，37℃培养16-18h。筛选出阳性单克隆加入含氨苄青霉素的5ml液体培养基，37℃培养，取2ml菌液提取质粒，测定序列为阳性pMD-19T-338。剩余菌液甘油保种，于-80℃保存备用。
标准质粒的核酸序列为：
Figure BDA0002389157450000111
5.反应条件优化
以试剂盒提取的实验菌株的基因组、粗提取的临床样本或者标准质粒进行实验，实验体系如下：于核心酶混合物冻干粉(100μl)中加入再水化合物缓冲液29μl，上下游引物各2μl，探针0.65μl(或者引物探针混合物4.65μl)，无DNA/RNA酶水10.35ul，以上的加样量充分考虑了加样误差及混合过程中的损耗，再将以上的混合物以每管12.5ul，分到3个pcr管中，再加入待检测模板或标准质粒2μl，于管盖加入醋酸镁(280mmol/L)0.5μl。
其中，所述的一对引物和一条探针的序列如下所示：
上游引物：5’-CAACTTGTCACACCAGATTATTACTAATAG-3’
下游引物：5’-biotin-GAAGATATACGTGGTGGACGTTACCGCCGC-3’
探针：
Figure BDA0002389157450000121
按照上述反应体系加入反应物，发明人分别测试的了16℃、25℃、30℃、35℃、37℃、38℃，39℃，40℃，43℃、50℃不反应温度，反应时间设定为30min，反应结束后取反应产物5ul加至试纸条样品垫，再将样品垫放入加有200μl的1×PBST试纸条缓冲液中，对扩增结果进行分析。通过结果分析显示低于25℃检测带没有出现条带，25℃显示较弱的检测带，随着温度升高检带颜色变深，37℃-43℃条带显色肉眼无明显差异，当温度达到50℃检测带无条带，初步判定为酶失去了活性。综上本发明反应温度范围为37-43℃。发明人按照同样的反应体系于37℃反应，设定了不同的反应时间5min、10min、15min、20min、25min、30min，随着反应进行10min出现较弱的肉眼可见检测带，10min后检测带颜色变深，15-30min检测条带肉眼无明显差异。
综上所述，本发明设计确定的反应条件为37℃反应15min。
RPA试纸条试剂盒结果判定为：质控线与检测线均出现条带则为阳性；质控线出现条带而检测线未出现条带则为阴性；两者均无条带则检测无效。
6.RPA试纸条试剂盒对白色念珠菌的灵敏度与特异性检测
灵敏度检测：质粒标准品用紫外分光光度计测量浓度为124.8ng/μL，pMD-19T的碱基数为2692bp，目的片段大小为338bp，每个碱基平均相对分子质量为660道尔顿/bp，每ul样品中的拷贝数按照计算公式：样品拷贝数(copies/ul)＝(6.02×1023)×质粒浓度(ng/μL)×10-9/(660×碱基数)，最终计算出的拷贝数为3.7×1010copies/ul。以上的标准品按照10倍倍比稀释，取浓度在107-101copies/ul进行实验，在水浴锅中37℃反应15min。结果如图6所示：当拷贝数107-102copies/ul时，试纸条的检测线均出现明显条带，当拷贝数为101copies/ul仅试纸条的对照线显色，检测线未见明显条带。检出率结果如图8所示，表明在107-102copies/ul范围内的样品均能被检出。
特异性检测：以上述体系进行反应，加入模板分别为白色念珠菌(阳性对照)、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、光滑念珠菌，在水浴锅中37℃反应15min。结果如图7所示只有白色念珠菌的测试试纸条的检测线均出现明显条带，其余非白色念珠菌的测试试纸条仅对照线显色，检测线未见明显条带。
7.RPA试纸条试剂盒对临床样本的检测
发明人采用上述的15μL反应体系，对采集自西南医科大学附属第一医院不同临床科室31例疑似感染白色念珠菌临床样本和5株棉拭子取材的健康志愿者的阴道分泌物样本进行检测。使用Lysis Buffer对样本进行粗提取，离心取上清作为模板，反应结果与qPCR进行比对。其中qPCR的反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。结果如表3所示：31例疑似感染白色念珠菌临床样本中RPA试纸条法检测出阳性样本为14例，与qPCR结果一致；5株棉拭子取材的健康志愿者的临床样本使用RPA试纸条法均为阴性，结果与qPCR一致。
表5 RPA试纸条法与qPCR对临床样本检测结果的比较
Figure BDA0002389157450000131
本发明基于RPA恒温检测白色念珠菌的试纸条检测试剂盒的检测方法可以满足快速检测白色念珠菌的需要，检测方法快速、操作简单、结果可靠。
综上，无论是本发明的实时荧光检测试剂盒，还是试纸条检测试剂盒，都能快速、简便地对白色念珠菌进行检测，检测的灵敏度高、特异性强，临床检测与qPCR法一致，十分可靠。
SEQUENCE LISTING
<110> 成都海之元生物科技有限公司
<120> 基于RPA快速检测技术的白色念珠菌检测试剂盒
<130> GY720-2020P018915CC
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
caacttgtca caccagatta ttactaatag 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
gaagatatac gtggtggacg ttaccgccgc 30
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
gagggcatgc ctgtttgagc gtcgtttctc ctcaaaccgc tgggt 45
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
caacttgtca caccagatta ttactaatag 30
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
gaagatatac gtggtggacg ttaccgccgc 30
<210> 6
<211> 1002
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
gaacggcagt gattcgagct cggtacccgg ggatcctcta gagattccca gcctgccgcc 60
agaggtctaa acttacaacc aattttttat caacttgtca caccagatta ttactaatag 120
tcaaaacttt caacaacgga tctcttggtt ctcgcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc 180
gatacgtaat atgaattgca gatattcgtg aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc 240
cctctggtat tccggagggc atgcctgttt gagcgtcgtt tctccctcaa accgctgggt 300
ttggtgttga gcaatacgac ttgggtttgc ttgaaagacg gtagtggtaa ggcgggatcg 360
ctaatcgtcg acctgcaggc atgcaagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt 420
gtgaaattgt tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa 480
agcctggggt gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc 540
tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 600
aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 660
cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 720
atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 780
taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 840
aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 900
tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 960
gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat ag 1002

Claims (10)

1.一种基于重组酶聚合酶扩增技术的白色念珠菌检测试剂盒，其特征在于：它包括一对引物和一条探针；引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，探针的核苷酸序列如SEQID NO.3所示；
探针3’端被阻断基团修饰；
探针被荧光基团标记；
探针带有碱基替代物dSpcacer。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括：
核心酶冻干粉混合物、再水化合物缓冲液、醋酸镁；
所述核心酶冻干粉混合物包括：聚合酶、重组酶、单链结合蛋白、识别并剪切碱基替代物dSpcacer的酶；
优选地，聚合酶、重组酶、单链结合蛋白、识别并剪切碱基替代物dSpcacer的酶的质量比为4∶1∶9∶3。
若试剂盒为实时荧光检测试剂盒，则所述识别并剪切碱基替代物dSpcacer的酶为核酸外切酶III；若试剂盒为试纸条试剂盒，则所述识别并剪切碱基替代物dSpcacer的酶为核酸内切酶IV；
和/或，所述试剂盒还包括具有白色念珠菌DNA序列的阳性对照样本。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照样本的序列如SEQ IDNO.6所示。
4.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：碱基替代物dSpcacer位于探针第30-31碱基之间；
优选地，dSpcacer为四氢呋喃；
优选地，阻断基团为C3-spacer。
5.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是实时荧光检测试剂盒；
所述荧光基团位于探针第29碱基；
探针还带有淬灭基团，淬灭基团位于探针第32碱基；
优选地，所述荧光基团为FAM；
优选地，所述淬灭基团为BHQ1。
6.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒是试纸条试剂盒，含有侧向流试纸条；
所述试剂盒还包括1×PBST试纸条缓冲液；
所述试剂盒的一条引物5’端标记了生物素。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒的探针的荧光基团位于5’端。
8.一种白色念珠菌的检测方法，其特征在于：
它是使用如权利要求1-7任一所述试剂盒对样品DNA进行重组酶聚合酶扩增，扩增后检测产物即可。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：
它是使用如权利要求5所述试剂盒对样品DNA进行重组酶聚合酶扩增，检测荧光信号；
优选地，重组酶聚合酶扩增在39℃下进行；和/或，反应时间为20min。
10.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于：
它是使用权利要求7或8所述的试剂盒对样品DNA进行重组酶聚合酶扩增，用侧向流试纸条检测产物；
优选地，重组酶聚合酶扩增在37℃-43℃下进行；和/或，扩增时间为15-30min；
进一步优选地，重组酶聚合酶扩增在39℃下进行，扩增时间为20min。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112941231A (zh) * 2021-04-26 2021-06-11 南方海洋科学与工程广东省实验室(湛江) 一种用于白色念珠菌检测的探针、方法及应用
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