CN114703177A - 一种基于rpa等温扩增和免疫层析技术的伪狂犬病毒检测组合物、方法及试剂盒 - Google Patents

一种基于rpa等温扩增和免疫层析技术的伪狂犬病毒检测组合物、方法及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种RPA等温扩增和免疫层析技术相结合的伪狂犬病毒检测组合物、方法及试剂盒，属于疾病检测领域。本发明针对PRV的gE基因，通过筛选获得一组具有很高RPA扩增效率的引物探针，进一步结合免疫层析技术建立了胶体金试纸条RPA检测方法，实现了PRV感染的临床快速检测。同时样品通过高温处理即可实现核酸模板的制备，极大降低整个检测成本，缩短检测时间。该方法具有良好的特异性，灵敏度可达21个拷贝/反应或者6×100TCID50/反应；临床样品检测显示，本发明和国标GB/T35911‑2018推荐的PRV检测方法结果完全一致，具有较好的实际应用价值。

Description

一种基于RPA等温扩增和免疫层析技术的伪狂犬病毒检测组 合物、方法及试剂盒
技术领域
本发明涉及一种RPA等温扩增和免疫层析技术相结合的伪狂犬病毒检测组合物、方法及试剂盒，属于疾病检测领域。
背景技术
伪狂犬病毒(pseudorabies virus，PRV)是具有囊膜的双链DNA病毒，基因组大小约140kb，编码至少70个蛋白，属于α-疱疹病毒亚科，水痘病毒属。猪是PRV的唯一自然宿主，PRV感染猪后引起的疾病称为伪狂犬病(pseudorabies)，常见的临床表现包括母猪繁殖障碍、仔猪神经症状以及中大猪呼吸道症状等。PRV在我国猪群中具有较高的流行率，是危害我国养猪业的重要病原之一。此外，PRV还可感染狗、猫、牛、羊、狐狸、水貂和狼等多种动物，具有很广的感染谱，且除了猪以外，其它动物多在感染后24-48小时内死亡。特别需要注意的是，2018年以来，我国已陆续报道了多起PRV感染人的案例，提示PRV在特定条件下具有跨种传播的风险。
疫病的快速准确诊断是进行科学防控的前提。目前，关于PRV的分子诊断(PCR和荧光定量PCR等)和免疫诊断(ELISA)的技术方法多存在对设备的依赖度较高、检测时间较长和需要专业的技术人员操作等问题。重组酶聚合酶扩增(recombinase polymeraseamplification，RPA)是一种等温核酸扩增技术，反应温度为37-42℃，可在20-30分钟时间内实现对靶基因的指数级扩增；同时，结合胶体金测流层析(lateral flow assay，LFA)技术，进一步提高了反应的特异性和敏感性，降低了对专业设备的依赖度，非常适合疫病的现场快速诊断。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种基于核酸RPA等温扩增和免疫层析技术的伪狂犬病毒检测组合物、方法及试剂盒。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种基于RPA等温扩增和免疫层析技术的伪狂犬病毒检测组合物，引物和探针序列如下：
上游引物gE-For：5'-CTCCCCCAGCGGAGACAGCGGCTACGAG-3'；
下游引物gE-Rev：5'-biotin-ACAGGCGGTTGGCGGTCACGCCATAGTT-3'；
探针gE-Pro：
5'-FAM-CGACGGGCTGTACGTGCGCCCCGAGGAGGCGCCCC(THF)GCTCCGGCTTCGACGTC-C3-3'。
所述下游引物5’端用生物素biotin进行修饰；探针5’端用FAM进行修饰，离5’端第35位碱基C用四氢呋喃THF修饰，3’端有聚合酶延伸阻断基团C3-spacer。
所述的组合物在制备检测伪狂犬病毒的试剂或试剂盒中的应用。
一种利用所述的组合物制备的检测伪狂犬病毒的试剂盒，所述试剂盒由试剂A、试剂B、试剂C、试剂D、试剂E和胶体金试纸条组成；其中，试剂A为RPA重组酶聚合酶冻干粉；试剂B为RPA反应混合液；试剂C为阳性对照，包含标准质粒pUC57-gE；试剂D为阴性对照，为无菌无酶水；试剂E为磷酸盐缓冲液。
所述RPA反应混合液包括：5μM上游引物gE-For 2μL，5μM下游引物gE-Rev 2μL，5μM探针gE-Pro 0.5μL，280mM醋酸镁2.5μL，RPA重组酶聚合酶反应缓冲液25μL，无菌无酶水13μL；所述试剂C标准质粒pUC57-gE的浓度为4.2×105拷贝/μL；试剂E磷酸盐缓冲液的pH值为7.0。
一种利用所述的组合物检测伪狂犬病毒的方法，包括以下步骤：
1)待测样品DNA模板的准备；
2)采用权利要求1所述的组合物建立RPA扩增反应体系；
3)进行RPA扩增反应；
4)利用胶体金试纸条进行结果判定。
所述待测样品DNA模板的获取采用商品化试剂盒进行提取纯化或高温裂解法；
所述高温裂解法为：将100μL的待测样品和200μL、pH 7.0的PBS缓冲液混合，95-100℃加热5min，然后以5000rpm的速度离心5min，所得上清即为待测样品的DNA模板，转移至新的离心管备用；所述待测样品为血清、口腔液或组织匀浆的上清。
所述RPA扩增反应体系包括：
试剂A：RPA重组酶聚合酶冻干粉；
试剂B：RPA反应混合液：5μM上游引物gE-For 2μL，5μM下游引物gE-Rev 2μL，5μM探针gE-Pro 0.5μL，280mM醋酸镁2.5μL，RPA重组酶聚合酶反应缓冲液25μL，无菌无酶水13μL；
试剂E：磷酸盐缓冲液、pH 7.0。
所述RPA扩增反应为：将45μL试剂B加入试剂A中，然后加入5μL待测样品DNA模板；RPA扩增反应温度为39℃，反应时间20-30min；反应结束后，向反应产物中加入150μL试剂E，得到混合物；然后取100μL混合物加到胶体金试纸条上样卡的样品垫上，反应10min后读取结果。
所述胶体金试纸条的样品垫标记的为金标抗FAM的单克隆抗体，检测线标记的为抗biotin的单克隆抗体，质控线标记的为葡萄球菌A蛋白。
本发明有益效果：
本发明通过针对PRV gE基因引物和探针序列的筛选，获得了具有较高RPA扩增效率的引物和探针组合，同时结合免疫层析检测试纸卡，建立了PRV核酸测流免疫层析(RPA-LFA)检测方法。
利用RPA等温扩增聚合酶对核酸模板中各种抑制因子耐受性较强的特点，本发明建立的检测方法既可以检测常规提取纯化的核酸模板，同时也适用于本发明通过高温裂解方法制备的核酸模板。将口腔液、血清和组织匀浆上清液与磷酸盐缓冲液(PBS)按1:2的体积比稀释后，95-100℃加热5分钟，然后5000转离心5分钟，上清即为制备好的核酸模板。在降低检测成本的同时，也极大缩短了整个检测过程的时间，可以更为快速的给出检测结果，为临床疫病防控提供参考。
本发明建立的PRV核酸测流免疫层析(RPA-LFA)检测方法具有高灵敏度的特点，标准质粒最低检出限为21个拷贝/反应(同类方法的检测灵敏度约为100个拷贝/反应)，核酸免提取的PRV病毒液最低检出限为6.0×100个TCID50。与已有的同类方法相比，操作更为便捷，检测灵敏度更高，从而为PRV感染的现场快速诊断提供了良好的技术支撑。
本发明建立的PRV核酸测流免疫层析(RPA-LFA)检测试剂盒，操作便捷。实际操作过程中，只需取45μL的试剂B(RPA反应混合液)加入试剂A(RPA重组酶聚合酶冻干粉)中，然后加入5μL的核酸模板(样品核酸、阳性对照或阴性对照)，即可进行后续的RPA扩增反应，扩增产物中加入150μL的PBS进行稀释，然后取100μL左右加到胶体金试纸条的上样孔中，反应10分钟后判定结果。
临床样品检测显示，该方法与国标GB/T 35911-2018推荐的检测方法的检测结果具有良好的一致性，可用于临床PRV的快速检测。
附图说明
图1本发明实施例1组合物gE-For/gE-Rev/gE-Pro的序列比对结果；
图2本发明实施例1引物和探针组合物的筛选；
图3本发明实施例4建立的PRV核酸测流免疫层析(RPA-LFA)检测方法的特异性；
A)针对不同病毒核酸的特异性分析
B)针对不同临床样品核酸免提取时的特异性分析
图4本发明实施例5建立的PRV核酸测流免疫层析(RPA-LFA)检测方法的灵敏度；
A)标准质粒pUC57-gE的检测下限分析
B)病毒培养物核酸免提取的检测下限分析
图5本发明实施例6临床样品检测效果分析。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
本发明实施例中所用的实验材料：
(1)病毒核酸
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)HN07-1、伪狂犬病毒(PRV)HeNLH/2017、猪塞尼卡病毒(SVA)HeNNY-1/2018、圆环病毒(PCV2)和非洲猪瘟病毒(ASFV)核酸由本实验室保存。猪瘟弱毒疫苗(CSFV)和乙脑弱毒疫苗(JEV)购自武汉科前生物股份有限公司，流行性腹泻病毒/传染性胃肠炎病毒/轮状病毒(PEDV/TGEV/RoV)三联弱毒疫苗购自哈尔滨维科生物技术有限公司，对上述三种弱毒疫苗进行病毒核酸提取，经反转录获得cDNA，-40℃保存备用。上述病毒核酸样品用于本发明所建立方法的特异性分析，具体结果见图3A。
(2)主要试剂及仪器
病毒核酸提取试剂盒(FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(Vazyme)；RAA-nfo核酸扩增试剂(产品编号：S002ZC)、DNA快速提取试剂(产品编号：ND01ZC)和核酸胶体金试纸条(产品型号：D003-03)均购自杭州众测生物科技有限公司；核酸浓度测定仪NanoDrop One，美国ThermoFisher Scientific公司产品；
实施例1引物和探针组合物的筛选
根据PRV HeNLH/2017毒株(MT775883)的基因组序列信息，针对gE、gB和UL24基因序列分别设计了4组引物和探针(表1)，进一步在NCBI GenBank数据库中比对分析显示，所设计的4组引物和探针序列在已发表的伪狂犬病毒基因序列中具有高度的保守性。其中，gE-For/gE-Rev/gE-Pro检测组合物的序列比对结果如图1所示。
所有的引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，然后以同等量的PRVDNA为模板，用4组引物探针建立的胶体金试纸RPA检测方法分别进行检测。
RPA反应体系：
试剂A：单管独立包装的RPA重组酶聚合酶冻干粉(来自杭州众测生物科技有限公司的RAA-nfo核酸扩增试剂)，每管代表一个独立反应；
试剂B：RPA反应混合液成分如下：上游引物(5μM)2μL，下游引物(5μM)2μL，探针(5μM)0.5μL，醋酸镁(280mM)2.5μL，RPA重组酶聚合酶反应缓冲液25μL(来自杭州众测生物科技有限公司的RAA-nfo核酸扩增试剂)，无菌无酶水13μL；
RPA扩增反应：将45μL的试剂B加入到试剂A中，然后加入5μL的PRV DNA模板；RPA扩增反应的温度为39℃，反应时间20-30min，反应产物加入150μL的PBS缓冲液(pH值为7.0)，然后取100μL加到胶体金上样卡的样品垫上(样品垫上为金标抗FAM的单克隆抗体，检测线为抗biotin的单克隆抗体，质控线为葡萄球菌A蛋白)，反应10分钟后读取结果。
结果如图2所示，在检测线处，gE-For/gE-Rev/gE-Pro检测组合物具有最强的胶体金信号强度，扩增效果最好，因此选择该检测组合物来进行胶体金RPA检测方法和试剂盒的开发。
其中，gE-For/gE-Rev/gE-Pro检测组合物中，下游引物5’端用生物素(biotin)进行修饰，探针5’端用FAM进行修饰，离5’端第35位碱基用四氢呋喃(THF)修饰，3’末端有聚合酶延伸阻断基团C3-spacer。
表1 引物和探针序列
Figure BDA0003580058970000051
实施例2试剂盒中阳性对照和阴性对照
标准质粒pUC57-gE由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，本实验室保存，标准质粒浓度利用核酸浓度测定仪NanoDrop One测定。基因拷贝数(Y)计算公式如下：Y(copies/μL)＝[质粒DNA的浓度(ng/μL)×10-9/(质粒DNA长度bp×660)]×6.02×1023。经测定，标准质粒的基因拷贝数分别为4.2×108拷贝·μL-1，用无菌无酶水10倍倍比稀释至4.2×105拷贝·μL-1，作为阳性对照；同时用无菌无酶水作为阴性对照。
实施例3 RPA-LFA检测方法的建立
1、样品DNA模板的准备：
样品核酸可以用商品化试剂盒进行提取纯化；或者采用高温裂解法，具体方法为：临床样品包括血清、口腔液和组织匀浆的上清等，取100μL的样品和200μL的PBS缓冲液(pH7.0)混合，95-100℃加热5分钟，然后5000rpm的速度离心5分钟，所得上清即为待测样品的DNA模板，转移至新的离心管备用。
2、RPA反应体系：
试剂A：单管独立包装的RPA重组酶聚合酶冻干粉，每管代表一个独立反应；
试剂B：RPA反应混合液成分如下：上游引物gE-For(5μM)2μL，下游引物gE-Rev(5μM)2μL，探针gE-Pro(5μM)0.5μL，醋酸镁(280mM)2.5μL，RPA重组酶聚合酶反应缓冲液25μL，无菌无酶水13μL；
试剂E：磷酸盐缓冲液的pH值为7.0。
3、RPA扩增反应：
将45μL的试剂B加入到试剂A中，然后加入5μL的样品DNA模板；RPA扩增反应的温度为39℃，反应时间20-30分钟，反应产物加入150μL的PBS缓冲液(试剂E)，然后取100μL加到胶体金上样卡的样品垫上，反应10分钟后读取结果。
4、利用胶体金试纸条进行结果判定：
胶体金试纸条包含针对FAM和biotin的胶体金检测试纸条，样品垫上为金标抗FAM的单克隆抗体，检测线为抗biotin的单克隆抗体，质控线为葡萄球菌A蛋白(SPA)。
当模板中存在目的基因时，通过RPA反应，会形成5’端带有FAM标记，3’端带有biotin标记的核酸扩增产物。扩增产物在胶体金的样品垫上与金标FAM单克隆抗体发生结合，然后沿试纸条迁移，在检测线处，针对biotin的单克隆抗体会和biotin结合，从而将扩增产物拦截，带有金标FAM单抗的扩增产物达到一定量时，就会出现肉眼可见的金颗粒条带；反之，如果没有发生目的基因的扩增，则金标FAM单抗在检测线处不会被拦截，观察不到任何条带。质控线处的SPA可以和单克隆抗体发生结合，因此，金标FAM单抗会被SPA所拦截，最终出现肉眼可见的条带，作为整个反应的质量控制体系。
实施例4 PRV核酸测流免疫层析(RPA-LFA)检测方法特异性分析
分别以提取纯化的PCV2、ASFV和PRV的DNA以及制备的PRRSV、PEDV/TGEV/RoV、SVA、JEV、CSFV的cDNA为模板，进行RPA扩增，反应产物加入150μL的PBS(试剂E)，然后取100μL加到胶体金试纸条的样品垫上进行结果判定，结果如图3A所示，仅PRV DNA为模板时，检测线出现特异性的条带；同时，针对临床样品血清、口腔液和组织匀浆上清，采用高温裂解法的核酸免提取方法制备RPA扩增反应的模板，如图3B所示，仅含有PRV病毒的样品组出现了特异性的检出条带，其它各组均未检出。提示所建立的PRV RPA-LFA检测方法，在核酸提取纯化或者核酸免提取的条件下，均具有良好的特异性。
实施例5 PRV核酸测流免疫层析(RPA-LFA)检测方法灵敏度分析
将标准质粒pUC57-gE用无菌无酶水以10倍倍比稀释，然后以不同浓度的质粒为模板，进行RPA扩增反应，反应产物加入150μL的PBS(试剂E)，然后取100μL加到胶体金试纸条的样品垫上进行结果判定。结果如图4A所示，本发明建立的检测方法针对标准质粒的检测下限为21个拷贝/反应(模板浓度为4.2x100/μL,反应体系中模板量为5μL)；同时，将一定浓度PRV病毒，用PBS进行10倍倍比稀释，采用高温裂解法释放样品中的病毒核酸，同样分别取5μL为模板，进行RPA扩增反应，并用胶体金试纸条进行结果判定。
结果如图4B所示，本发明建立的检测方法针对核酸免提取的样品，检测下限为6x100TCID50/反应。
实施例6临床样品检测
选取16份疑似PRV感染的临床样品，分别通过商品化的病毒核酸提取试剂盒和高温裂解法来准备核酸样品，针对提取纯化的PRV DNA，采用国标GB/T 35911-2018推荐的检测方法进行针对gE基因的荧光定量PCR检测，检测结果见表2；同时针对高温裂解法制备的核酸样品，用本发明建立的RPA-LFA进行检测，结果如图5所示，和表2的检测结果相比，在阳性样本检出率上二者具有良好的一致性。
表2 荧光定量PCR检测结果
Figure BDA0003580058970000071
序列表
<110> 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室
<120> 一种基于RPA等温扩增和免疫层析技术的伪狂犬病毒检测组合物、方法及试剂盒
<130> RPA反应
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ctcccccagc ggagacagcg gctacgag 28
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
acaggcggtt ggcggtcacg ccatagtt 28
<210> 3
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
cgacgggctg tacgtgcgcc ccgaggaggc gccccgctcc ggcttcgacg tc 52
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
cacctgagcg tcctgcgggc cacgcccaac g 31
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
acgcgcggca tcaggtcgaa cgtgtccccg g 31
<210> 6
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
ggtgggcccc gcgcgccacg agccccgctt ccacgcgctc ggcttccact cg 52
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
atccgctgcc acaaccgctt ctacgaacgc 30
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
gcccgccccc agccgcacca cgcacacg 28
<210> 9
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 9
gtgcccgtcc ccgtgcagga gatcacggac gtgatcgacc gccgcggcaa gt 52
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 10
gcacaagttc aaggcccaca tctactacaa g 31
<210> 11
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 11
ggcgcaggtc cacctcgacg gggttctcgt c 31
<210> 12
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 12
gtgcccgtcc ccgtgcagga gatcacggac gtgatcgacc gccgcggcaa gt 52

Claims (10)

1.一种基于RPA等温扩增和免疫层析技术的伪狂犬病毒检测组合物，其特征在于，引物和探针序列如下：
上游引物gE-For：5'-CTCCCCCAGCGGAGACAGCGGCTACGAG-3'；
下游引物gE-Rev：5'-biotin-ACAGGCGGTTGGCGGTCACGCCATAGTT-3'；
探针gE-Pro：
5'-FAM-CGACGGGCTGTACGTGCGCCCCGAGGAGGCGCCCC(THF)GCTCCGGCTTCGACGTC-C3-3'。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述下游引物5’端用生物素biotin进行修饰；探针5’端用FAM进行修饰，离5’端第35位碱基C用四氢呋喃THF修饰，3’端有聚合酶延伸阻断基团C3-spacer。
3.如权利要求1所述的组合物在制备检测伪狂犬病毒的试剂或试剂盒中的应用。
4.一种利用权利要求1所述的组合物制备的检测伪狂犬病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由试剂A、试剂B、试剂C、试剂D、试剂E和胶体金试纸条组成；其中，试剂A为RPA重组酶聚合酶冻干粉；试剂B为RPA反应混合液；试剂C为阳性对照，包含标准质粒pUC57-gE；试剂D为阴性对照，为无菌无酶水；试剂E为磷酸盐缓冲液。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述RPA反应混合液包括：5μM上游引物gE-For 2μL，5μM下游引物gE-Rev 2μL，5μM探针gE-Pro 0.5μL，280mM醋酸镁2.5μL，RPA重组酶聚合酶反应缓冲液25μL，无菌无酶水13μL；所述试剂C标准质粒pUC57-gE的浓度为4.2×105拷贝/μL；试剂E磷酸盐缓冲液的pH值为7.0。
6.一种利用权利要求1所述的组合物检测伪狂犬病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)待测样品DNA模板的准备；
2)采用权利要求1所述的组合物建立RPA扩增反应体系；
3)进行RPA扩增反应；
4)利用胶体金试纸条进行结果判定。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述待测样品DNA模板的获取采用商品化试剂盒进行提取纯化或高温裂解法；
所述高温裂解法为：将100μL的待测样品和200μL、pH 7.0的PBS缓冲液混合，95-100℃加热5min，然后以5000rpm的速度离心5min，所得上清即为待测样品的DNA模板，转移至新的离心管备用；所述待测样品为血清、口腔液或组织匀浆的上清。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述RPA扩增反应体系包括：
试剂A：RPA重组酶聚合酶冻干粉；
试剂B：RPA反应混合液：5μM上游引物gE-For 2μL，5μM下游引物gE-Rev 2μL，5μM探针gE-Pro 0.5μL，280mM醋酸镁2.5μL，RPA重组酶聚合酶反应缓冲液25μL，无菌无酶水13μL；
试剂E：磷酸盐缓冲液、pH 7.0。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述RPA扩增反应为：
将45μL试剂B加入试剂A中，然后加入5μL待测样品DNA模板；RPA扩增反应温度为39℃，反应时间20-30min；反应结束后，向反应产物中加入150μL试剂E，得到混合物；然后取100μL混合物加到胶体金试纸条上样卡的样品垫上，反应10min后读取结果。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述胶体金试纸条的样品垫标记的为金标抗FAM的单克隆抗体，检测线标记的为抗biotin的单克隆抗体，质控线标记的为葡萄球菌A蛋白。
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