CN108866243B

CN108866243B - 一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN108866243B
Application number: CN201811007934.2A
Authority: CN
Inventors: 刘光亮; 陈佳宁; 黄鑫
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2022-02-08
Anticipated expiration: 2038-08-31
Also published as: CN108866243A

Abstract

发明公开一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒，其内包括有序列为SEQ ID No.1～SEQ ID No.8的八条六碱基随机反转录引物，及序列为SEQ ID No.9～SEQ ID No.12的四条探针引物。本发明试剂盒中的引物是根据引起猪消化道病毒病主要病原的保守基因的高度保守区设计特异性引物，所建立的检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒的4重荧光定量PCR检测方法，为及时治疗和防控疫情提供最直接的依据，为养猪业的健康发展保驾护航。

Description

一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种兽医用检测试剂盒及这种检测试剂盒在非疾病检测的使用方法，确切讲本发明是一种用于猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR及相应的使用方法，所述的4重猪病毒性腹泻病毒是指：猪流行性腹泻病毒，猪传染性胃肠炎病毒，猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒。

背景技术

猪病毒性腹泻是严重危害养猪业的重要传染病之一，造成猪病毒性腹泻的最主要传统病原有猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)。近年来，新发现了猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪肠道α冠状病毒(PEAV)，这两种冠状病毒同样对仔猪危害严重。这些病毒是当前引起猪群或猪场发生病毒性腹泻主要病原，危害重大，且存在混合感染，对仔猪致死率为50％-100％不等，对养猪业造成极大的经济损失。除此之外，上述几种病毒引起的病毒性腹泻的临床症状、病理变化、流行特点极其相似，仅凭临床诊断很难进行鉴别诊断，常导致误诊，因此该病的防控及其早期诊断及鉴别诊断显得尤为重要。然而，腹泻病的病因复杂以及现有诊断方法的局限性，导致基层兽医和养殖场对腹泻病的确诊很困难，使腹泻病的防控不能做到有的放矢、对症下药。导致该现象发生的最根本原因是现地缺少可应用的快速、准确、方便的商品化检测方法。长期以来针对猪病毒性腹泻的检测试剂盒主要是以传统的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)的血清学检测方法为主，然而，近年来猪病毒性腹泻疫情发生了两个重大变化：第一，主要引起哺乳仔猪发病、死亡，而哺乳仔猪免疫系统尚未发育健全，未能有效产生血清抗体；第二，在患猪肠道中新发现了具有高度致病力的猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒，针对于此两种病毒目前尚未有成熟的检测方法。由此可见，现有的检测猪病毒性腹泻的检测试剂盒并不能满足目前疫病诊断的需求，因此急需研制符合当前疫情流行趋势的商品化检测试剂盒，且目前没有可以一次性检测、诊断、鉴别和定量检测上述4种病原的商品化试剂盒。

发明内容

本发明提供一种可克服现有不足的，具有特异、敏感、快速、使用方便、廉价的、可用于检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒的检测试剂盒，同时提供这一试剂盒在非疾病诊断检测中的使用方法。

本发明的一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒内包括有

序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8的八条引物，及序列为SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12的四条探针。

优选地，本发明的一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒内还有：B.由预混的反转录缓冲液、六碱基随机引物、dNTP、RNA酶抑制剂、反转录酶和DEPC水组成的反转录预混体系；C.由PCR缓冲液、dNTP、Taq酶、双蒸水组成的PCR扩增预混体系；D.不同浓度阳性cDNA对照；E.阴性cDNA对照。

本发明的一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒，在非疾病诊断的使用方法是：先从待检猪的待检样品中提取RNA，利用试剂盒内的六碱基随机反转录引物和探针引物反转录为cDNA，得到的待检cDNA为模板，用试剂盒内的荧光定量PCR扩增预混体系(C)进行扩增，根据扩增产物的标准曲线及Ct值，参照阳性(D)和阴性(E)对照确定待检猪样品是否感染猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒。本试剂盒仅对待检测样品中特定病毒的存在情况进行检测，不作为疾病诊断的直接依据。

由前述内容可知，本发明是一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒，以及这种检测试剂盒的非疾病诊断使用方法。

本发明根据病原的保守基因的高度保守区设计特异性引物，利用不同标记的针对不同病原的特异性探针，实现了对猪肠道冠状病毒的检测。根据不同标记的探针、标准曲线及Ct值可以准确的判定猪病毒性腹泻病料中的病原，快速确定是单一病原感染引起还是混合感染造成。该方法方便快捷，不仅能为对症治疗提供依据，还可为猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒的流行病学调查提供可靠的信息。

本发明试剂盒中的引物是根据引起猪消化道病毒病主要病原的保守基因的高度保守区设计特异性引物，根据不同标记的探针、标准曲线及Ct值，建立了检测猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒的4重荧光定量PCR检测方法，为及时治疗和防控疫情提供最直接的依据，为养猪业的健康发展保驾护航。

本发明在单一PCR反应中对四种不同的猪肠道冠状病毒进行定量检测，操作简单、快速，反应高效、特异，与其他常见的猪病毒基因组无交叉反应；待检测样品包括肠道组织、肠内容物和粪便等多种样品，该类样品便于采集和保存。因此，本发明实用性强，受众广泛，便于推广。

附图说明

图1：猪流行性腹泻病毒单一荧光定量PCR扩增Ct值；

图2：猪流行性腹泻病毒单一荧光定量PCR扩增曲线；

图3：猪流行性腹泻病毒单一荧光定量PCR扩增的标准曲线；

图4：猪传染性胃肠炎病毒单一荧光定量PCR扩增Ct值；

图5：猪传染性胃肠炎病毒单一荧光定量PCR扩增曲线；

图6：猪传染性胃肠炎病毒单一荧光定量PCR扩增的标准曲线；

图7：猪δ冠状病毒单一荧光定量PCR扩增Ct值；

图8：猪δ冠状病毒单一荧光定量PCR扩增曲线；

图9：猪δ冠状病毒单一荧光定量PCR扩增的标准曲线；

图10：猪肠道α冠状病毒单一荧光定量PCR扩增Ct值；

图11：猪肠道α冠状病毒单一荧光定量PCR扩增曲线；

图12：猪肠道α冠状病毒单一荧光定量PCR扩增的标准曲线；

图13：不同病毒单一引物分别对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒标准品的扩增Ct值；

图14：猪流行性腹泻病毒单一引物在猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒中的敏感性扩增曲线；

图15：猪传染性胃肠炎病毒单一引物在猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒中的敏感性扩增曲线；

图16：猪δ冠状病毒单一引物在猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒中的敏感性扩增曲线；

图17：猪肠道α冠状病毒单一引物在猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒中的敏感性扩增曲线；

图18：不同病毒单一引物分别对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒标准品检测的标准曲线；

图19：猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒最佳反应条件扩增Ct值；

图20：猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒最佳反应条件扩增曲线及标准曲线；

图21：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒检测方法特异性检测结果；

图22：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒方法特异性检测的扩增曲线及标准曲线；

图23：单一肠道冠状病毒在4重荧光定量PCR检测试剂盒三次批间重复检测结果；

图24：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒第一次批间重复检测结果；

图25：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒第一次批间重复检测的扩增曲线；

图26：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒第一次批间重复检测的标准曲线；

图27：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒第二次批间重复检测结果；

图28：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒第二次批间重复检测的扩增曲线；

图29：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒第二次批间重复检测的标准曲线；

图30：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒第三次批间重复检测结果；

图31：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒第三次批间重复检测的扩增曲线；

图32：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒第三次批间重复检测的标准曲线；

图33：单一肠道冠状病毒在4重荧光定量PCR检测试剂盒中批内三次重复检测结果；

图34：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒批内三次重复检测的扩增曲线；

图35：猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒批内三次重复检测的标准曲线；

具体实施方式

以下结合具体实例和附图说明对本发明做进一步说明

本发明的猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒的使用方法是先将待检猪的待检样品通过Trizol法或RNA提取试剂盒提取RNA，取5μL提取的总RNA与2μL本发明试剂盒内的六碱基随机反转录引物(A)混合后于70℃水浴锅中孵育5分钟，取出后于冰浴中静置2分钟，之后将混合物加入43μL的反转录预混体系(B)，于37℃水浴锅中反转录2小时，以所得到的待检cDNA为模板，用试剂盒内的PCR预混体系(C)和上述反应条件进行荧光定量PCR扩增，同时采用阳性(D)和阴性(E)cDNA设置对照，根据扩增产物的Ct值对照标准曲线确定待检猪样品是否存在猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒。

实施例1.猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒4重荧光定量PCR引物、探针的设计与合成

利用已知的猪流行性腹泻病毒M蛋白、猪传染性胃肠炎病毒N蛋白、猪δ冠状病毒M蛋白和猪肠道α冠状病毒N蛋白基因序列比对，找出其保守区域，再利用Oligo6软件设计4重荧光定量PCR引物，引物序列由苏州金唯智科技有限公司合成。4对引物分别为：

引物名及标号	序列
		SEQ ID No.1(PEDV-F)	GATACTTTGGCCTCTTGTGT
SEQ ID No.2(PEDV-R)	CACAACCGAATGCTATTGACG
		SEQ ID No.3(TGEV-F)	CAGATAGAAGTCACGTTCACA
SEQ ID No.4(TGEV-R)	TCTCTGTTCTTTTGCCAC
		SEQ ID No.5(PDCoV-F)	ATTTGGACCGCAGTTGACA
SEQ ID No.6(PDCoV-R)	GCCCAGGATATAAAGGTCAG
		SEQ ID No.7(PEAV-F)	TCTCGGCTTACTCTAAACCC
SEQ ID No.8(PEAV-R)	CATCCACCATCTCAACCTC

探针分别为：

单一引物以不同的浓度扩增对应的模板如图1-12所示。

实施例2.引物、探针特异性的确定

利用扩增猪肠道冠状病毒的引物扩增相应片段，将扩增的片段克隆到T载体中，通过转化、质粒提取、酶切和PCR鉴定筛选出阳性质粒，测定浓度，并计算拷贝数。将猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒的标准品的4种阳性质粒分别按1×10⁷、1×10⁶等浓度以10倍比稀释，等拷贝数混合，然后分别以四对引物及相应探针进行扩增，以检测引物和探针的特异性。结果显示，针对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒的相应引物、探针仅能扩增对应目标片段，而与其余病毒不发生交叉扩增，如图13-18所示，说明引物及探针具有良好的特异性，可用于试剂盒组装。

实施例3.反应体系和反应条件的确定

筛选4重荧光定量PCR扩增反应的引物、探针最适浓度如图19、20所示；以此为基础将全部引物进行混合进行各引物最佳反应浓度的筛选。通过优化筛选最终确定4重荧光定量PCR检测方法的最佳引物、探针反应浓度分别为：

反应体系为：

反应条件为：

实施例4.特异性检测

以确定的反应体系和反应条件扩增猪常见病病原：猪呼肠孤病毒、猪蓝耳病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、口蹄疫A型病毒和口蹄疫O型病毒，以验证该试剂盒检测的特异性，以猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒标准品对照。结果显示本发明的检测方法只能特异性地扩增猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪肠道α冠状病毒的相应片段，而猪呼肠孤病毒、猪蓝耳病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、口蹄疫A型病毒和口蹄疫O型病毒无特异性扩增信号如图21、22所示，说明本发明的检测方法具有较好的特异性。

实施例5.敏感性检测

用已确定的反应体系对4重模板扩增，结果显示本发明的检测方法的检测混合四重模板敏感性分别可检测到10²、10²、10²、10²个基因拷贝如图19、20所示。结果说明本发明的检测方法的敏感性在单一病原和混合病原检测结果高度一致且敏感性极高。

实施例6.重复性检测

用已确定的方法检测检测四种混合病原，批间重复性检测为分三次在不同的时间进行检测如图23-32所示，批内重复性检测为检测一次样品做3个重复如图33-35所示，结果表明本发明的检测方法有着好的重复性。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(PEDV-F)

<400> 1

gatactttgg cctcttgtgt 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(PEDV-R)

<400> 2

cacaaccgaa tgctattgac g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(TGEV-F)

<400> 3

cagatagaag tcacgttcac a 21

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(TGEV-R)

<400> 4

tctctgttct tttgccac 18

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(PDCoV-F)

<400> 5

atttggaccg cagttgaca 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(PDCoV-R)

<400> 6

gcccaggata taaaggtcag 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(PEAV-F)

<400> 7

tctcggctta ctctaaaccc 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(PEAV-R)

<400> 8

catccaccat ctcaacctc 19

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(PEDV-Probe)

<400> 9

ttcagcatcc ttatggcttg catc 24

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(TGEV-Probe)

<400> 10

ttccttcagc agattaatgc cta 23

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(PDCoV-Probe)

<400> 11

taagaaggac gcagttttca ttgtg 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(PEAV-Probe)

<400> 12

aagacctaaa tgctgatgcc cca 23

Claims

1.一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒内包括：

序列为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8的八条引物，及序列为SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQID No.11、SEQ ID No.12的四条探针。

2.根据权利要求1所述的一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于试剂盒内还有：A.六碱基随机引物；B.由预混的反转录缓冲液、dNTP、RNA酶抑制剂、反转录酶和DEPC水组成的反转录预混体系；C.由PCR缓冲液、dNTP、Taq酶、双蒸水组成的PCR扩增预混体系；D.不同浓度阳性cDNA对照；E. 阴性cDNA对照。

3.根据权利要求1所述的一种猪肠道冠状病毒4重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于猪流行性腹泻病毒上游引物浓度为0.6 pmol/µL，下游引物浓度为0.6 pmol/µL，探针浓度为0.2 pmol/µL；猪传染性胃肠炎病毒上游引物浓度为0.4 pmol/µL，下游引物浓度为0.4pmol/µL，探针浓度为0.2 pmol/µL；猪δ冠状病毒上游引物浓度为0.4 pmol/µL，下游引物浓度为0.4 pmol/µL，探针浓度为0.4 pmol/µL；猪肠道α冠状病毒上游引物浓度为0.4 pmol/µL，下游引物浓度为0.4 pmol/µL，探针浓度为0.1 pmol/µL。