CN111500791A

CN111500791A - 猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测方法

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Publication number: CN111500791A
Application number: CN202010531586.XA
Authority: CN
Inventors: 闫若潜; 班付国; 刘影; 王东方; 谢彩华; 杨海波; 郭育培; 王淑娟; 马震原; 赵雪丽; 王华俊; 王翠; 柴茂; 刘梅芬; 朱前磊; 申水莹; 唐攀; 雷从从; 杨鹏霞; 刘先敏
Original assignee: Henan Center For Animal Disease Control & Prevention
Current assignee: Henan Center For Animal Disease Control & Prevention
Priority date: 2020-06-11
Filing date: 2020-06-11
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2040-06-11
Also published as: CN111500791B

Abstract

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ‑PCR检测方法。本发明提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的特异性引物和探针，并建立了猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒的三重FQ‑PCR检测方法。本发明的特异性引物、探针和检测方法的特异性强、灵敏度高、重复性好，为猪腹泻性疾病的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。

Description

猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组、与该引物组配套使用的探针组、试剂盒以及检测方法。

背景技术

目前，能够引起猪感染的冠状病毒有6种，其中PEDV、PDCoV、SADS-CoV和TGEV主要引起猪群腹泻，PRCV引起猪呼吸道症状，PHEV引起猪呕吐和神经症状。近年来，养猪业饲养方式向更加规模化和集约化转变，同时冠状病毒存在病毒重组进化，使得猪腹泻病的病因也变得越来越复杂。

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性肠道传染病。可感染各种年龄的猪，尤其对10日龄以内的仔猪危害最为严重，临床上常引起水样腹泻、呕吐和脱水等症状。PEDV为不分节段的单股正链RNA病毒，属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α-冠状病毒属(Coronavirus)。

猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)和猪急性腹泻综合症冠状病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus，SADS-CoV)是近年来新发现的两种猪冠状病毒。PDCoV和SADS-CoV的基因组同为单股正链不分节段的RNA。PDCoV属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、δ-冠状病毒属(Coronavirus)；SADS-CoV属于尼多病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、α-冠状病毒属(Coronavirus)。PDCoV和SADS-CoV所引起的临床症状类似于其他已知的猪肠道冠状病毒引起的临诊症状，包括严重且急性的呕吐和腹泻，新生仔猪体重迅速减轻导致急性死亡。

由于PEDV、PDCoV和SADS-CoV同属于冠状病毒，且感染猪只后可引起相似的临床症状，因此，难以从感染猪的临床特征和病原的形态上加以区分。而疫病病原的确定是疫病防控的关键一步，因此快速且灵敏地实施对于这三种腹泻病原的鉴别诊断尤为重要。

目前，对于SADS-CoV等猪腹泻类疫病检测的PCR方法主要分为两种：一种是以单个病原为检测对象的荧光PCR检测方法，这种方法不能快速确定病原种类，不利于准确了解疫病的流行动态，进行疫病防控；另一种是以多个病原为检测对象的普通PCR检测方法，这种方法操作繁琐,费时费力。

实时荧光定量PCR(fluorescent quantitative PCR，简称为FQ-PCR)具有敏感、快速、准确的特点，并且在核酸快速扩增的同时实现模板的定量测定。目前发展起来的多联实时荧光PCR技术可以在同一个PCR反应中，通过荧光基团分析来区分不同的核酸片段，为同时检测多种病原提供了技术基础。

发明内容

本发明的目的之一是提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组、与该引物组配套使用的探针组，本发明的另一目的是提供猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的试剂盒以及检测方法。

本发明通过对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒的基因组序列进行分析和比对，筛选在猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒的不同毒株之间具有高度保守性且具有高度特异性的序列作为检测的靶序列，最终确定以PEDV的M基因、PDCoV的M基因和SADS-CoV的N基因中的保守片段作为靶序列。根据上述靶序列分别设计特异性引物和探针，经大量筛选和人工优化获得序列如SEQ ID NO.1-6所示的3对特异性引物，这些引物对可单独或配合序列如SEQ ID NO.7-9所示的探针实现特异灵敏的三重FQ-PCR检测。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组，所述引物组包含3对特异性引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5-6所示。

上述特异性引物中，针对猪流行性腹泻病毒的特异性引物序列如SEQ ID NO.1-2所示，针对猪δ冠状病毒的特异性引物序列如SEQ ID NO.3-4所示，针对猪急性腹泻综合征冠状病毒的特异性引物序列如SEQ ID NO.5-6所示。

SEQ ID NO.1:PEDV-P1:5’-GGCGCAGGACACATTCTTG-3’；

SEQ ID NO.2:PEDV-P2:5’-AAGTAGTGAGAAGCGCGTCTGTT-3’；

SEQ ID NO.3:PDCoV-P4:5’-TCGACCACATGGCTCCAATAC-3’；

SEQ ID NO.4:PDCoV-P5:5’-CAGCTCTTGCCCATGTAGCTT-3’；

SEQ ID NO.5:SADS-CoV-P4:5’-CTGGCACTTTTATTACCTTGGTACTG-3’；

SEQ ID NO.6:SADS-CoV-P5:5’-CCCAATGCACACCCTGAATC-3’。

上述特异性引物能够高效特异地结合猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒的靶序列，在同一个PCR体系中相互之间不会产生干扰，能够保证三重FQ-PCR检测的特异性和灵敏度。

本发明还提供与序列如SEQ ID NO.1-6所示的引物组配套使用的探针组，所述探针组包含3条探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-9所示。

上述探针中，与SEQ ID NO.1-2所示引物配套使用，针对猪流行性腹泻病毒的探针如SEQ ID NO.7所示，与SEQ ID NO.3-4所示引物配套使用，针对猪δ冠状病毒的探针如SEQID NO.8所示，与SEQ ID NO.5-6所示引物配套使用，针对猪急性腹泻综合征冠状病毒的探针如SEQ ID NO.9所示。

SEQ ID NO.7:PEDV-Probe3：5’-TGGTCTTTCAATCCTG-3’；

SEQ ID NO.8:PDCoV-Probe6：5’-CACACCAGTCGTTAAGCATGGCAAGCT-3’；

SEQ ID NO.9:SADS-CoV-Probe6：5’-TCCTCACGCAGATGCTCCTTTCAGG-3’。

上述特异性引物和探针配合使用能够显著提高猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的灵敏度和重复性。

上述探针为荧光标记探针，探针的5’端标记荧光基团为选自FAM、VIC、CY5、HEX、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记淬灭基团为选自MGB、BHQ2、BHQ1、BHQ3、Dabcyl中的任一种。

优选地，3条探针的5’端标记荧光基团分别为FAM、VIC、CY5，3’端标记淬灭基团分别为MGB、BHQ2和BHQ2。

作为本发明的优选实施方式，SEQ ID NO.7所示探针的5’端标记荧光基团为FAM，3’端标记淬灭基团分别为MGB；SEQ ID NO.8所示探针的5’端标记荧光基团为VIC，3’端标记淬灭基团分别为BHQ2；SEQ ID NO.9所示探针的5’端标记荧光基团为CY5，3’端标记淬灭基团分别为BHQ2。

本发明提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物探针组合，其包含3对特异性引物和3条探针；所述特异性引物的序列如SEQ ID NO.1-6所示，所述探针的序列如SEQ ID NO.7-9所示。

第二方面，本发明提供所述引物组和/或所述探针组在制备用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的检测的试剂盒中的应用。

第三方面，本发明提供用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的试剂盒，其包含序列如SEQ ID NO.1-6所示的引物组和SEQ ID NO.7-9所示的探针组。

所述检测试剂盒还可包含FQ-PCR反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTP、ddH₂O、阳性标准品中的一种或多种。

所述阳性标准品可采用如下方法制备得到：将PEDV的M基因、PDCoV的M基因和SADS-CoV的N基因的PCR扩增产物分别克隆至载体中，构建重组质粒，即为阳性标准品。

本发明经优化确定了最佳的三重FQ-PCR检测反应体系和反应程序。

所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度比为：SEQ ID NO.1所示引物、SEQ IDNO.2所示引物和SEQ ID NO.7所示探针的浓度比为1:1:1；SEQ ID NO.3所示引物、SEQ IDNO.4所示引物和SEQ ID NO.8所示探针的浓度比为1:1:2；SEQ ID NO.5所示引物、SEQ IDNO.6所示引物和SEQ ID NO.9所示探针的浓度比为1:1:2。

所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度优选为：SEQ ID NO.1所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.2所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.7所示探针0.3μmol/L、SEQ ID NO.3所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.4所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.8所示探针0.4μmol/L、SEQ IDNO.5所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.6所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.9所示探针0.4μmol/L。

所述试剂盒在工作时的25μL反应体系如下：2×Premix Ex Taq酶缓冲液12.5μL，cDNA模板2μL，SEQ ID NO.1所示引物0.3μmol/L，SEQ ID NO.2所示引物0.3μmol/L，SEQ IDNO.7所示探针0.3μmol/L，SEQ ID NO.3所示引物0.2μmol/L，SEQ ID NO.4所示引物0.2μmol/L，SEQ ID NO.8所示探针0.4μmol/L，SEQ ID NO.5所示引物0.2μmol/L，SEQ ID NO.6所示引物0.2μmol/L，SEQ ID NO.9所示探针0.4μmol/L，去离子水补足至总体积25μL。

所述试剂盒在工作时的反应程序优选为：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环。

第四方面，本发明提供猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测方法，包括：提取待测样品RNA，将待测样品RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板利用SEQ ID NO.1-6所示的引物组和SEQ ID NO.7-9所示的探针组进行三重FQ-PCR检测，根据扩增反应结果判断待测样品中是否含有猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒。

所述三重FQ-PCR检测的反应体系中引物和探针的工作浓度比为：SEQ ID NO.1所示引物、SEQ ID NO.2所示引物和SEQ ID NO.7所示探针的浓度比为1:1:1；SEQ ID NO.3所示引物、SEQ ID NO.4所示引物和SEQ ID NO.8所示探针的浓度比为1:1:2；SEQ ID NO.5所示引物、SEQ ID NO.6所示引物和SEQ ID NO.9所示探针的浓度比为1:1:2。

所述三重FQ-PCR检测的反应体系中引物和探针的工作浓度为：SEQ ID NO.1所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.2所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.7所示探针0.3μmol/L、SEQID NO.3所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.4所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.8所示探针0.4μmol/L、SEQ ID NO.5所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.6所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.9所示探针0.4μmol/L。

所述三重FQ-PCR检测的反应程序如下：95℃ 30s，1个循环；95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。

所述三重FQ-PCR检测的结果判定方法为：反应结束后，根据扩增曲线和Ct值判定结果，结果判断依据如表1所示：

表1三重FQ-PCR检测的结果判定依据

本发明的有益效果在于：

本发明提供了用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的3对特异性引物和配套探针，建立了猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测方法。本发明提供的特异性引物、探针和检测方法在进行猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒检测时具有特异性强(阴性对照和TGEV、PRoV、PRRSV、CSFV、FMDV、PRV、PCV2、PPV等病毒均未出现特定的扩增曲线)、灵敏度高(对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的DNA的重组质粒标准品的检测下限均为10copies/μL)和重复性好(批内重复试验变异系数(CV)为1.16％，批间重复试验CV为1.51％)的优势，为猪腹泻性疾病的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异的临床检测方法。

附图说明

图1为本发明实施例3和实施例4中PEDV/PDCoV/SADS-CoV三重FQ-PCR的扩增曲线，其中，1为PEDV的扩增曲线，2为PDCoV的扩增曲线，3为SADS-CoV的扩增曲线，4-11分别为TGEV、PRoV、PRRSV、CSFV、FMDV、PRV、PCV2、PPV的扩增曲线。

图2为本发明实施例5中FQ-PCR检测方法对PEDV的敏感性试验，其中，10⁰～10⁶分别代表阳性标准品质粒DNA溶液的浓度为10⁰～10⁶拷贝/μL。

图3为本发明实施例5中FQ-PCR检测方法对PDCoV的敏感性试验，其中，10⁰～10⁶分别代表阳性标准品质粒DNA溶液的浓度为10⁰～10⁶拷贝/μL。

图4为本发明实施例5中FQ-PCR检测方法对SADS-CoV的敏感性试验，其中，10⁰～10⁶分别代表阳性标准品质粒DNA溶液的浓度为10⁰～10⁶拷贝/μL。

图1、2、3、4中横坐标Cycle代表循环数，纵坐标ΔRn代表荧光强度。

图5为本发明实施例5中FQ-PCR检测方法检测PEDV的标准曲线。

图6为本发明实施例5中FQ-PCR检测方法检测PDCoV的标准曲线。

图7为本发明实施例5中FQ-PCR检测方法检测SADS-CoV的标准曲线。

图5、6、7中横坐标Lg Concentration代表浓度的Lg值，纵坐标CT Value代表CT值。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中，PEDV、PDCoV和SADS-CoV毒株(细胞毒)，由河南省动物疫病预防控制中心实验室提供；猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PRov)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)和口蹄疫(FMDV)等均由河南省动物疫病预防控制中心实验室提供。疑似PEDV、PDCoV和SADS-CoV感染病料样品(肠道样品、拭子等)由河南省动物疫病预防控制中心实验室提供。

以下实施例中，全自动核酸提取仪购自西安天隆公司；PCR扩增仪购自德国Biometra公司；ABI 7500荧光定量PCR仪购自美国ABI公司；凝胶成像分析系统购自美国Alpha Innotech公司；恒温水浴震荡器(HZQ-Q)购自哈尔滨东联电子技术开发有限公司；商品化病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自西安天隆公司；PrimeScript^TM RT Master Mix、ExTaq DNA聚合酶、Premix Ex Taq、Rnase Inhibitor、DL2000DNA Marker、DNA回收试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司；pGEM-Teasy载体均购自Promega公司。

以下实施例中，采用的核酸提取方法如下：利用西安天隆全自动核酸提取仪，用商品化病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒按照其操作说明进行样本核酸提取操作；得到PEDV、PDCoV和SADS-CoV细胞毒的核酸，若需长期保存应放置在-70℃冰箱，但应避免反复冻融。

以下实施例中，cDNA的制备方法如下：取提取的RNA，每3.2μl加入0.8μlPrimeScript^TM RT Master Mix(5×)反转录反应体系中，使用PCR仪进行反转录，程序为：37℃、15分钟，85℃、15秒。获得的cDNA可直接用于FQ-PCR反应或-20℃冻存备用。

实施例1用于PEDV、PDCoV和SADS-CoV的三重FQ-PCR检测的引物和探针的设计和筛选

从GenBank中下载不同PEDV毒株、PDCoV毒株和SADS-CoV毒株的基因组序列，通过序列比对分析确定以PEDV的M基因、PDCoV的M基因以及SADS-CoV的N基因中的保守区作为检测靶标。为提高检测的特异性和灵敏度，本发明针对引物、探针与靶序列的亲和力、引物之间的二级结构以及引物与靶序列之间的二级结构、引物的GC含量、Tm值、长度和扩增片段长度等进行了大量人工优化设计和筛选。最终获得了如SEQ ID NO.1-6所示的效果最优的特异性引物对和如SEQ ID NO.7-9所示的探针组。

以下为本发明设计的大量候选引物和探针的部分罗列及效果说明，引物及探针均由宝生物工程(大连)有限公司合成。

将表2所示的分别针对PEDV、PDCoV、SADS的三组引物/探针按照说明书进行稀释，配置成引物/探针混合液(含1对引物和1条探针)，加入到优化的25μl反应体系中，对10份PEDV、PDCoV、SADS的特异性质控品(TGEV、PRoV、PRRSV、CSFV、FMDV、PRV、PCV2、PPV、阳性对照、阴性对照)进行检测，检测结果如表3、表4和表5所示，结果表明表2所示的PEDV、PDCoV、SADS三组引物/探针的特异性均较好。

利用上述引物/探针混合液对PEDV、PDCoV、SADS的敏感性质控品(含PEDV的M基因的质粒、含PDCoV的M基因的质粒、含SADS-CoV的N基因的质粒))的梯度稀释样品(1×10⁶拷贝/μl、1×10⁵拷贝/μl、1×10⁴拷贝/μl、1×10³拷贝/μl、1×10²拷贝/μl、1×10¹拷贝/μl、1×10⁰拷贝/μl)进行检测，检测结果如表6、表7和表8所示，结果表明PEDV第1组、PDCoV第2组和SADS第2组的引物/探针的敏感性较好。

利用上述方法，本发明筛选了大量的引物和探针及其组合，在此不一一列举。通过筛选最终确定检测效果最优的引物/探针组合为PEDV-P1(SEQ ID NO.1)、PEDV-P2(SEQ IDNO.2)、PEDV-Probe3(SEQ ID NO.7)，PDCoV-P4(SEQ ID NO.3)、PDCoV-P5(SEQ ID NO.4)、PDCoV-Probe6(SEQ ID NO.8)以及SADS-CoV-P4(SEQ ID NO.5)、SADS-CoV-P5(SEQ IDNO.6)、SADS-CoV-Probe6(SEQ ID NO.9)，后续实施例均采用这三个引物探针组合进行检测。

表2特异性引物/探针对

表3PEDV的3组引物/探针对的特异性实验结果

注：“+”表示结果为阳性；“-”表示结果为阴性；“Unde”表示未检测到荧光信号。

表4PDCoV的3组引物/探针对的特异性实验结果

表5SADS-CoV的3组引物/探针对的特异性实验结果

表6PEDV 3组引物/探针对的敏感性性实验结果

表7PDCoV 3组引物/探针对的敏感性性实验结果

表8SADS-CoV 3组引物/探针对的敏感性性实验结果

实施例2用于PEDV、PDCoV和SADS-CoV检测的试剂盒

本实施例提供用于PEDV、PDCoV和SADS-CoV的三重FQ-PCR检测的试剂盒，该试剂盒包括SEQ ID NO.1-6所示的特异性引物对和SEQ ID NO.7-9所示的探针。

该试剂盒还包括以下组分：PrimeScript^TM RT Master Mix、Premix Ex Taq、阳性标准品、阴性对照品、ddH₂O。

其中，pGEM-PEDV-M、pGEM-PDCoV-M、pGEM-SADS-CoV-N的阳性标准品的制备方法如下：

以PEDV、PDCoV、SADS-CoV细胞毒株提取核酸反转录的cDNA为模板，分别扩增PEDV的M基因、PDCoV的M基因和SADS-CoV的N基因，将阳性扩增产物分别克隆入pGEM-T Easy载体中，筛选阳性重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测序，PEDV的M基因、PDCoV的M基因和SADS-CoV的N基因的测序结果分别如SEQ ID NO.28、SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示。测序正确的PEDV、PDCoV和SADS-CoV阳性重组质粒分别命名为pGEM-PEDV-M、pGEM-PDCoV-M、pGEM-SADS-CoV-N，作为阳性标准品。

利用分光光度计测定各阳性重组质粒的OD₂₆₀、OD₂₈₀值及OD₂₆₀/OD₂₈₀值，共重复5次，利用质粒DNA拷贝数计算方法分别确定其拷贝数，-20℃保存备用。

经检测和计算，pGEM-PEDV-M、pGEM-PDCoV-M、pGEM-SADS-CoV-N质粒DNA溶液的浓度分别为8.32×10¹⁰拷贝/μL、3.56×10¹⁰拷贝/μL和7.28×10¹⁰拷贝/μL，将上述质粒DNA溶液分别定量稀释至1.0×10⁰～1.0×10⁶拷贝/μL。

实施例3PEDV、PDCoV和SADS-CoV的三重FQ-PCR检测方法的建立

将实施例2制备的pGEM-PEDV-M、pGEM-PDCoV-M、pGEM-SADS-CoV-N重组质粒分别稀释至终浓度1.0×10⁵拷贝/μL作为检测模板，将PEDV-P1/PEDV-P2、PDCoV-P4/PDCoV-P5、SADS-CoV-P4/SADS-CoV-P5引物对分别稀释至终浓度0.1μmol/L、0.2μmol/L、0.3μmol/L、0.4μmol/L、0.5μmol/L、0.6μmol/L、0.7μmol/L、0.8μmol/L，利用荧光PCR仪采用矩阵法筛选不同浓度的引物和探针组合，确定针对PEDV、PDCoV、SADS-CoV三重FQ-PCR最佳的引物浓度、探针浓度和最佳反应条件。

检测模式设置为：PEDV设为FAM/NONE双标记模式，PDCoV设为VIC/NONE双标记模式，SADS-CoV设为CY5/NONE双标记模式。

反应条件设置为：第一阶段，预变性95℃ 30s，1个循环；第二阶段，95℃ 5s，60℃30s，40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。

经优化，确定的最佳反应体系为：25μL反应体系中，PEDV-P1、PEDV-P2、PEDV-Probe3、PDCoV-P4、PDCoV-P5、PDCoV-Probe6、SADS-CoV-P4、SADS-CoV-P5、SADS-CoV-Probe6的最佳扩增效果浓度分别为:0.3μmol/L,0.3μmol/L,0.3μmol/L；0.2μmol/L,0.2μmol/L,0.4μmol/L；0.2μmol/L,0.2μmol/L,0.4μmol/L，2×Premix Ex Taq酶缓冲液12.5μL，模板各2μL，去离子水补足至总体积25μL。

最佳反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，40个循环。

以上最佳反应条件下的PEDV、PDCoV和SADS-CoV三重FQ-PCR结果如图1所示。

实施例4三重FQ-PCR检测的特异性分析

分别提取PEDV、PDCoV和SADS-CoV以及TGEV、PRoV、PRRSV、CSFV、FMDV的RNA并反转录得到cDNA，提取PRV、PCV2、PPV的DNA，同时以PEDV、PDCoV和SADS-CoV的阳性标准品(浓度为1.0×10⁵)为阳性对照，以无酶水为阴性对照，按实施例3确定的最佳反应条件进行三重FQ-PCR扩增，以验证三重FQ-PCR检测方法的特异性。

阳性对照的FQ-PCR扩增Ct值分别为20.02、17.82和19.37且出现特定的扩增曲线；阴性对照和TGEV、PRoV、PRRSV、CSFV、FMDV、PRV、PCV2、PPV等均未出现特定的扩增曲线(图1)，说明实施例1的特异性引物和探针以及实施例2的三重FQ-PCR检测方法的特异性良好。

实施例5三重FQ-PCR检测的敏感性分析

将pGEM-PEDV-M、pGEM-PDCoV-M和pGEM-SADS-CoV-N重组质粒分别作10倍系列稀释，每种质粒终浓度调整为1.0×10⁶～1.0×10⁰拷贝/μL，共7个稀释度，按实施例3确定的最佳三重FQ-PCR反应条件进行三重FQ-PCR敏感性分析。

分别以pGEM-PEDV-M、pGEM-PDCoV-M和pGEM-SADS-CoV-N阳性重组质粒起始模板浓度取Lg(LgC)为X轴，以FQ-PCR循环次数Ct值为Y轴，建立标准曲线，确定临界值、可疑区间。

结果表明，按实施例3确定的最佳三重FQ-PCR反应条件检测pGEM-PEDV-M、pGEM-PDCoV-M和pGEM-SADS-CoV-N终浓度为1.0×10⁶～1.0×10⁰拷贝/μL的共7个稀释度的质粒，最低检出限均为1.0×10¹拷贝/μL(如图2、图3、图4和表9所示)。

表9敏感性试验结果

根据图2、3、4构建标准曲线的计算结果，三重FQ-PCR检测方法对PEDV、PDCoV及SADS-CoV核酸检测到1×10¹拷贝/μL的临界Ct值分别为31.8、33.79、33.87，检测到1×10⁰拷贝/μL的Ct值分别为35.16、37.01、37.21，由此确定实施例3确定的最佳检测方法的判定标准(如表1所示)。

由以上敏感性检测结果建立PEDV标准曲线，相关系数R²为0.998，斜率为-3.360，截距为35.16，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.3597lgX+35.16(图5)；由敏感性检测结果建立PDCoV标准曲线，相关系数R²为0.9974，斜率为-3.221，截距为37.01，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.2214lgX+37.01(图6)。由敏感性检测结果建立SADS-CoV标准曲线，相关系数R²为0.9999，斜率为-3.341，截距为37.21，从而得出拷贝数(X)与Ct值之间的线性关系表达式：y＝-3.3411lgX+37.21(图7)。

实施例6三重FQ-PCR检测的重复性分析

分别将4个浓度的10倍系列稀释的pGEM-PEDV-M、pGEM-PDCoV-M和pGEM-SADS-CoV-N重组质粒等量混合物(每种质粒终浓度1.0×10⁵～1.0×10²拷贝/μL)按照实施例3确定的最佳反应条件进行三重FQ-PCR扩增，每个系列设定3个重复，分成3个批次验证本发明的三重FQ-PCR检测方法的重复性。

结果表明，批内重复试验变异系数(CV)为1.16％，批间重复试验CV为1.51％(表10和表11)，批内重复试验变异系数和批间重复试验变异系数均在3％以下，表明本发明建立的PEDV、PDCoV和SADS-CoV三重FQ-PCR方法具有很好的重复性。

表10批内重复性试验结果

表11批间重复性试验结果

实施例7三重FQ-PCR检测的临床应用

利用实施例3确定的最佳三重FQ-PCR检测方法，以pGEM-PEDV-M、pGEM-PDCoV-M和pGEM-SADS-CoV-N重组质粒混合物为阳性对照，无酶水为阴性对照，分别对临床疑似感染PEDV、PDCoV或SADS-CoV的20份样品(样品编号为：1-20)进行临床应用检测，将三重FQ-PCR检测结果与测序结果进行比较分析。

三重FQ-PCR检测结果表明，7份样品为PEDV阳性，3份样品为PDCoV阳性，1份样品为SADS-CoV阳性，其余样品为阴性，未检测到交叉感染样品。三重FQ-PCR检测方法的检测结果与基因测序结果的符合率为100％，表明本发明建立的PEDV/PDCoV/SADS-CoV三重FQ-PCR检测方法的灵敏性高，具有很好的应用效果(见表12)。

表12三重FQ-PCR检测结果与测序结果比较

综上所述，本发明提供的三重FQ-PCR检测方法的优势在于在同一反应管内进行PEDV、PDCoV和SADS-CoV的三重扩增检测反应。通过同时收集代表不同病毒的荧光信号,对扩增产物进行实时在线检测,建立了能够同时检测PEDV、PDCoV和SADS-CoV三种病毒的实时荧光RT-PCR方法。实验室阶段的试验和临床应用试验均证实,该方法是一种快速、简便、高效的检测平台，可同时实现PEDV、PDCoV和SADS-CoV不同病毒感染的鉴别检测,大大缩短检测周期。

临床出现多种腹泻病混合感染时，两种或多种病原的含量相差较大，而且前期含毒量较低，即使存在混合感染，其中一种病毒是以潜伏感染的形式存在，病毒量很低，普通诊断方法很难检测到。而本发明建立的三重FQ-PCR检测方法检测PEDV、PDCoV和SADS-CoV的最低检出限均为1.0×10¹拷贝/μL，能够准确对PEDV、PDCoV和SADS-CoV进行鉴别区分检测。

本发明成功建立了PEDV、PDCoV和SADS-CoV的三重FQ-PCR检测方法，可用于猪腹泻类疫病的快速检测及鉴定，为PEDV、PDCoV和SADS-CoV的早期快速检测提供了特异、敏感、快速的方法。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 河南省动物疫病预防控制中心

<120> 猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测方法

<130> KHP201111969.0

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcgcaggac acattcttg 19

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagtagtgag aagcgcgtct gtt 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcgaccacat ggctccaata c 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagctcttgc ccatgtagct t 21

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctggcacttt tattaccttg gtactg 26

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cccaatgcac accctgaatc 20

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggtctttca atcctg 16

<210> 8

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacaccagtc gttaagcatg gcaagct 27

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcctcacgca gatgctcctt tcagg 25

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tggcgcagga cacattctt 19

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagtagtgag aagcgcgtct gtt 23

<210> 12

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggtctttca atcctg 16

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggcgcaggac acattcttg 19

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaagtagtga gaagcgcgtc tgt 23

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggtctttca atcctg 16

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcgaccacat ggctccaata c 21

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cagctcttgc ccatgtagct t 21

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cacaccagtc gttaagcatg gcaagc 26

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atcgaccaca tggctccaat ac 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cagctcttgc ccatgtagct t 21

<210> 21

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cacaccagtc gttaagcatg gcaagc 26

<210> 22

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctggcacttt tattaccttg gtactg 26

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ccaatgcaca ccctgaatcc 20

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcctcacgca gatgctcctt tcagg 25

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tctaactggc acttttatta ccttggt 27

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gcacaccctg aatccgtttc 20

<210> 27

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ctggtcctca cgcagatgct cctttc 26

<210> 28

<211> 567

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aagtactctg cgttcttgta tggtgtcaag atggctattc tatggatact ttggcctctt 60

gtgttagcac tgtcactttt tgatgcatgg gctagctttc aggtcaattg ggtctttttt 120

gctttcagca tccttatggc ttgcatcact cttatgctgt ggataatgta ctttgtcaat 180

agcattcggt tgtggcgcag gacacattct tggtggtctt tcaatcctga aacagacgcg 240

cttctcacta cttctgtgat gggccgacag gtctgcattc cagtgcttgg agcaccaact 300

ggtgtaacgc taacactcct tagtggtaca ttgcttgtgg agggctataa ggttgctact 360

ggcgtacagg taagtcaatt acctaatttc gtcacagtcg ccaaggccac tacaacaatt 420

gtctacggac gtgttggtcg ttcagtcaat gcttcatctg gcactggttg ggctttctat 480

gtccggtcca aacacggcga ctactcagct gtgagtaatc cgagttcggt tctcacagat 540

agtgagaaag tgcttcattt agtctaa 567

<210> 29

<211> 654

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atgtctgacg cagaagagtg gcaaattatt gttttcattg cgatcatatg ggcgcttggc 60

gttatcctcc aaggaggcta tgccacgcgt aatcgtgtga tctatgttat taaacttatt 120

ctgctttggc tgctccaacc cttcacccta gtggtgacca tttggaccgc agttgacaga 180

tcatctaaga aggacgcagt tttcattgtg tccataattt ttgccgtact gacctttata 240

tcctgggcca agtactggta tgactcaatt cgtttattaa tgaaaaccag atctgcatgg 300

gcactctcac ctgagagtag actccttgca gggattatgg atccaatggg tacatggagg 360

tgcattccca tcgaccacat ggctccaata ctcacaccag tcgttaagca tggcaagctc 420

aagctacatg ggcaagagct ggccaatggc atatcagtta gaaatccgcc acaggatatg 480

gtgatagtgt caccaagtga cacctttcac tacactttta agaaacctgt ggaatcaaac 540

aacgatccag aattcgctgt tctgatatac cagggtgacc gtgcttcaaa cgctggactt 600

cacaccataa ccacttcaaa ggccggtgac gctcgcctgt ataagtatat gtaa 654

<210> 30

<211> 1128

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

atggccactg ttaattgggg tgacgctgtt gaacaggcgg aatctcgtgg tcgtaaaaga 60

attccattgt cactctttgc gcctttgcgt gttatagatg gcaaaaactt ttggaatgtc 120

atgcctagaa atggagttcc gacaggtaaa ggcactccag atcaacagat tggttattgg 180

gttgaacaaa aacgctggcg aatgcaaaaa ggccaacgta aagatcagcc ttctaactgg 240

cacttttatt accttggtac tggtcctcac gcagatgctc ctttcaggaa acggattcag 300

ggtgtgcatt gggtcgctgt tgacggtgct aaaactagcc ccacaggtct tggtgttcgc 360

aatcgtaaca aagaacctgc tacacctcag tttgggtttc aattaccacc agacctgact 420

gttgttgagg ttacttctag aagtgcttca cgttcacagt ctcgttctcg caatcaaagt 480

caaagccgca gtggtgctca gacacctcgt gctcaacagc cgtcacagtc tgttgacatt 540

gttgctgcag ttaaacaagc tttggcagac ttgggcatag cttctagcca gtccaggcct 600

caaagtggta aaaatacacc caaaccaaga agcagagctg tctcacctgc acctgcccct 660

aaaccggctc gtaagcagat ggacaaacct gaatggaagc gtgttcctaa ttctgaggag 720

gacgtgcgta aatgctttgg tcctcgctca gtttctagaa attttggtga cagtgacctc 780

gttcagcacg gtgttgaagc taagcacttt ccaacaattg ctgagttgct tccgacacaa 840

gctgcactag cctttggtag tgaaatcaca accaaagagt ctggtgaatt tgtagaagtc 900

acctatcact atgtaatgaa ggtccccaag actgataaaa atctacccag atttcttgag 960

caagtctcgg cttactctaa acccagtcaa attaggagat ctcaatctca acaagaccta 1020

aatgctgatg ccccagtgtt cactccggca cctccagcta ctccagtttc ccaaaatcct 1080

gcttttcttg aggaggaggt tgagatggtg gatgagatta ttaattag 1128

Claims

1.用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒三重FQ-PCR检测的引物组，其特征在于，所述引物组包含3对特异性引物，其核苷酸序列分别如SEQ IDNO.1-2、SEQ ID NO.3-4和SEQ ID NO.5-6所示。

2.与权利要求1所述的引物组配套使用的探针组，其特征在于，所述探针组包含3条探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7-9所示。

3.根据权利要求2所述的探针组，其特征在于，所述探针的5’端标记荧光基团为选自FAM、VIC、CY5、HEX、TET、JOE、CY3、TAMRA、ROX中的任一种；所述探针的3’端标记淬灭基团为选自MGB、BHQ2、BHQ1、BHQ3、Dabcyl中的任一种；

4.权利要求1所述的引物组和权利要求2或3所述的探针组在制备用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的试剂盒中的应用。

5.用于猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒检测的试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1所述的引物组和权利要求2或3所述的探针组。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度比为：SEQ ID NO.1所示引物、SEQ ID NO.2所示引物和SEQ ID NO.7所示探针的浓度比为1:1:1；SEQ ID NO.3所示引物、SEQ ID NO.4所示引物和SEQ ID NO.8所示探针的浓度比为1:1:2；SEQ ID NO.5所示引物、SEQ ID NO.6所示引物和SEQ ID NO.9所示探针的浓度比为1:1:2；

优选地，所述试剂盒中，各引物和探针的工作浓度为：SEQ ID NO.1所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.2所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.7所示探针0.3μmol/L、SEQ ID NO.3所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.4所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.8所示探针0.4μmol/L、SEQ IDNO.5所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.6所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.9所示探针0.4μmol/L。

7.根据权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒在工作时的反应程序如下：95℃30s，1个循环；95℃5s，60℃30s，40个循环。

8.猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒的三重FQ-PCR检测方法，其特征在于，包括：提取待测样品的RNA，将待测样品的RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板利用权利要求1所述的引物组和权利要求2或3所述的探针组，进行三重FQ-PCR检测，根据扩增反应结果判断待测样品中是否含有猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、猪急性腹泻综合征冠状病毒。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述三重FQ-PCR检测的反应体系中引物和探针的工作浓度比为：SEQ ID NO.1所示引物、SEQ ID NO.2所示引物和SEQ ID NO.7所示探针的浓度比为1:1:1；SEQ ID NO.3所示引物、SEQ ID NO.4所示引物和SEQ ID NO.8所示探针的浓度比为1:1:2；SEQ ID NO.5所示引物、SEQ ID NO.6所示引物和SEQ ID NO.9所示探针的浓度比为1:1:2；

优选地，所述三重FQ-PCR检测的反应体系中引物和探针的工作浓度为：SEQ ID NO.1所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.2所示引物0.3μmol/L、SEQ ID NO.7所示探针0.3μmol/L、SEQID NO.3所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.4所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.8所示探针0.4μmol/L、SEQ ID NO.5所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.6所示引物0.2μmol/L、SEQ ID NO.9所示探针0.4μmol/L。

10.根据权利要求8或9所述的检测方法，其特征在于，所述三重FQ-PCR检测的反应程序如下：95℃ 30s，1个循环；95℃ 5s，60℃ 30s，40个循环。