CN114672595A

CN114672595A - 一种猪病毒性腹泻检测引物组合、检测试剂盒及应用

Info

Publication number: CN114672595A
Application number: CN202210371158.4A
Authority: CN
Inventors: 张蓉; 邓红玉; 陈秀萍; 凌勇; 丁能水; 谢亚磊; 万文峰; 吴有林
Original assignee: Fujian Hake Ecological Agriculture Co ltd; Zhangzhou Aonong Modern Agriculture Development Co ltd; Shandong Aonong Pig Breeding Co ltd; Fujian Aonong Biological Technology Group Co Ltd
Current assignee: Fujian Aoxin Biotechnology Group Co ltd; Fujian Aoxin Seed Industry Technology Group Co ltd; Fujian Hake Ecological Agriculture Co ltd; Shandong Aonong Pig Breeding Co ltd; Zhangzhou Aonong Modern Agriculture Development Co ltd; Fujian Aonong Biological Technology Group Co Ltd
Priority date: 2022-04-08
Filing date: 2022-04-08
Publication date: 2022-06-28
Anticipated expiration: 2042-04-08
Also published as: CN114672595B

Abstract

本发明公开了一种猪病毒性腹泻检测引物组合、检测试剂盒及应用，涉及猪病毒性腹泻检测技术领域。其包括第一探针引物对、第二探针引物对、第三探针引物对和第四探针引物对。该检测引物组合和检测试剂盒可以一次性实现样本中猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒的检测分析，使4种病毒基因的扩增效率一致,且与每个单重反应的灵敏度一致，具有简便快捷、稳定性好、检测灵敏度高、特异性强的特点。提供的检测试剂盒具有检测便捷、准确度高、检测效率高的优势，可以应用于猪场日常检测工作，为猪病毒性腹泻4种临床表现相似病毒的临床诊断提供技术支持。

Description

一种猪病毒性腹泻检测引物组合、检测试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及猪病毒性腹泻检测技术领域，具体而言，涉及一种猪病毒性腹泻检测引物组合、检测试剂盒及应用。

背景技术

猪病毒性腹泻是严重危害养猪业的重要传染病之一，每年都引发大量仔猪腹泻、迅速脱水死亡，且常因多种腹泻病毒混合感染而使病情加重，导致高死亡率，造成严重的经济损失。病毒性腹泻最主要的病原有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪轮状病毒(RV)等。近年来，猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)作为一种新发现的肠道冠状病毒也常被检出。

其中，猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrheavirus，PED)由PEDV引起的一种急性、高度接触性传染病，各种年龄和品种的猪都易感，其中2周龄以下仔猪的致死率可达100％。断奶猪和育肥猪患病后出现4-6天水样腹泻。由于该病病程短，传播快，致使该病在世界各国的传播非常广泛。

而传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV)在各种年龄及品种的猪均易感，患猪主要表现为呕吐、水样腹泻、脱水，该病在世界各养猪国家均有发生，给世界养猪业带来了极大的经济损失。

而猪轮状病毒(Rotavirus,RV)属呼肠病毒科，轮状病毒属。猪轮状病毒是引起仔猪病毒性腹泻常见的病原之一，主要临床症状表现为黄色水样腹泻并伴随着呕吐,因该病流行范围广，发病率高，给养猪业带来了极大的经济损失。

而猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)是一种新发现的肠道冠状病毒，临床表现为水样腹泻和呕吐，迅速脱水，衰竭而亡。各阶段猪均可感染，新生哺乳仔猪最易感染，发病率可达50％～100％，死亡率高达100％。

目前针对猪病毒性腹泻的检测试剂盒主要是以传统的猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒的单重荧光定量PCR检测方法为主，然而，病毒性腹泻往往不仅仅感染单一病毒，往往是多病毒混合感染，并且猪德尔塔冠状病毒的新型病毒时有存在，针对于此种病毒目前尚未有成熟的检测方法。

基于此，现有的检测猪病毒性腹泻的检测试剂盒并不能满足目前疫病检测的需求，因此急需研制符合当前疫情流行趋势的商品化检测试剂盒。目前尚无荧光定量PCR商品化试剂盒可以一次性检测鉴别上述四种病原。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪病毒性腹泻检测引物组合、检测试剂盒及应用以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

本发明提供了一种猪病毒性腹泻检测引物组合，其包括第一探针引物对、第二探针引物对、第三探针引物对和第四探针引物对，第一探针引物对包括第一探针和第一引物对，第二探针引物对包括第二探针和第二引物对，第三探针引物对包括第三探针和第三引物对，第四探针引物对包括第四探针和第四引物对；

第一引物对具有如SEQ ID NO.1-2所示的序列，第一探针具有如SEQ ID NO.3所示的序列，第二引物对具有如SEQ ID NO.4-5所示的序列，第二探针具有如SEQ ID NO.6所示的序列，第三引物对具有如SEQ ID NO.7-8所示的序列，第三探针具有如SEQ ID NO.9所示的序列，第四引物对具有如SEQ ID NO.10-11所示的序列，第四探针具有如SEQ ID NO.12所示的序列。

本发明提供的检测引物组合可以一次性实现样本中猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒的检测分析。使4种病毒基因的扩增效率一致,且与每个单重反应的灵敏度一致。具有简便快捷、稳定性好、检测灵敏度高、特异性强的特点，可以应用于猪场日常监测工作。

猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒均属于RNA病毒，极易发生突变，因此毒株之间同源性较差。发明人通过大量毒株的同源性比对，选择PEDV M基因、TGEV N基因、RV VP7基因和PDCoV M基因的保守区域进行探针引物的设计。由此可以实现同一种RNA病毒的不同毒株的准确检出。

本发明提供的检测引物组合是发明人经过长期的引物探针筛选而出的具有较佳扩增特异性和灵敏度的检测引物组合。

本发明提供的检测引物组合特异性较强，对于猪瘟病毒，猪圆环病毒，猪伪狂犬病毒，猪蓝耳病毒，猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒，均无特异性扩增曲线，可以保证检测的准确性。

此外，本发明可以同时进行大批量的样本分析，在一次检测操作后，即可鉴别样本中是否含有猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒。

为了便于荧光定量分析，在第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端均标记有荧光报告基团，第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的3’端均标记有荧光淬灭基团。

荧光报告基团包括不限于HEX、FAM、TET、CF532、JOE、TAMRA、ROX、Cy3、Cy5、TexasRed、NED、Alexa Flour或VIC，淬灭基团包括不限于MGB、TAMRA、BHQ1、BHQ2、BHQ3或QSY。

在一种可选的实施方式中，第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端分别对应标记有FAM、HEX、Cy5和ROX，在第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的3’端分别对应标记有BHQ1、MGB、BHQ2和BHQ2。

上述第一探针引物对、第二探针引物对、第三探针引物对和第四探针引物对分别对应检测猪流行性腹泻、轮状病毒、传染性胃肠炎和德尔塔冠状病毒。

第一探针引物对如下：

上游引物PEDV-F(SEQ ID NO.1):

5’-CCAACTGGTGTAACGCTAAC-3’

下游引物PEDV-R(SEQ ID NO.2)：

5’-GACATAGAAAGCCCAACCAG-3’

荧光标记的探针PEDV-P(SEQ ID NO.3):

FAM-AGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGT-BHQ1

扩增产物的序列如下(SEQ ID NO.13)：

CCAACTGGTGTAACGCTAACACTCCTTAGTGGTACATTGCTTGTAGAGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGTACAGGTAAGTCAATTACCTAATTTCGTCACAGTCGCCAAGGCCACTACAACAATTGTCTACGGACGTGTTGGTCGTTCAGTCAATGCTTCATCTGGCACTGGTTGGGCTTTCTATGTC。

第二探针引物对如下：

上游引物RV-F(SEQ ID NO.4):5’-TGAGCGTATGATGCGAGTA-3’

下游引物RV-R(SEQ ID NO.5)：5’-AATGACCGTGATCTTTTGG-3’

荧光标记的探针RV-P(SEQ ID NO.6):

HEX-AAATGGTGGCAAGTTTTCTAT–MGB。

扩增产物的序列如下(SEQ ID NO.14)：

TGAGCGTATGATGCGAGTAAATTGGAAGAAATGGTGGCAAGTTTTCTATACAGTAGTAGATTATATTAATCAGATTGTACAAGCTATGTCCAAAAGATCACGGTCATT。

第三探针引物对如下：

上游引物TGEV-F(SEQ ID NO.7):5’-TAATGCCTATGCTCGTC-3’

下游引物TGEV-R(SEQ ID NO.8)：

5’-TACCACATCTTGCTCTGA-3’

荧光标记的探针TGEV-P(SEQ ID NO.9):

CY5-CCATCAGAAGTGGCAAAAGAACAGA–BHQ2。

扩增产物的序列如下(SEQ ID NO.15)：

TAATGCCTATGCTCGTCCATCAGAAGTGGCAAAAGAACAGAGAAAAAGAAAATCTCGTTCTAAATCTGCAGAAAGGTCAGAGCAAGATGTGGTA。

第四探针引物对如下：

上游引物PDCoV-F(SEQ ID NO.10):

5’-GACACCTTTCACTACACTT-3’

下游引物PDCoV-R(SEQ ID NO.11)：

5’-GTCACCCTGGTATATCAGA-3’

荧光标记的探针PDCoV-P(SEQ ID NO.12):

ROX-AGAAACCTGTGGAATCAAACAACGA–BHQ2。

扩增产物的序列如下(SEQ ID NO.16)：

GACACCTTTCACTACACTTTTAAGAAACCTGTGGAATCAAACAACGATCCAGAATTCGCTGTTCTGATATACCAGGGTGAC。

本发明还提供了一种猪病毒性腹泻检测试剂盒，其包括上述的猪病毒性腹泻检测引物组合。

提供的检测试剂盒具有检测便捷、准确度高、检测效率高的优势，可以应用于猪场日常检测工作，为猪病毒性腹泻4种临床表现相似病毒的临床诊断提供技术支持。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒中的猪病毒性腹泻检测引物组合分布于引物预混试剂和探针预混试剂中，且引物预混试剂为第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对的预混试剂，引物预混试剂中第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对的混合摩尔比为1:1～1.5:1:1。

四重荧光定量实验是在一个反应管中同时扩增4个靶标基因进行定量实验，因此4个靶标基因的扩增势必会互相影响，所以要通过引物设计以及反应条件的优化来同步扩增效率，而不是在同一反应管中将所有引物和模板简单的混合。由于PEDV、TGEV、RV、PDCoV是四种不同的病毒，根据具体感染情况，共感染的样本中四种病毒浓度可能存在不同程度的差异，在同一反应管中扩增时，如果出现一种病毒基因扩增效率过高，那么其他病毒基因的扩增可能受到抑制，最终影响病毒的检出率。本发明通过引物和探针的设计，在四种病毒的高度保守的序列中筛选出最优的探针引物，通过实验匹配灵敏度较高且扩增效率接近的探针引物进行多重荧光定量PCR实验，过程较困难且结果不易控制，需要进行多次实验。通过调整引物与荧光探针的比例，优化反应条件，使样本中四种病毒基因的扩增效率一致,并且与每个单重反应的灵敏度一致。

在上述摩尔比条件下，可以保证四种病毒基因的扩增效率一致，而不会出现相互抑制的情形，从而提升了检测结果的稳定性和准确性。

在一种实施方式中，上述引物预混试剂包括不限于冻干粉剂和溶液。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒中的探针预混试剂为第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的预混试剂，探针预混试剂中第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的混合摩尔比为1:1～1.5:1:1。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、PCR扩增液和酶预混液。

阳性对照为分别含有PEDV、TGEV、RV、PDCoV目的基因片段的重组质粒。阴性对照为水。

PCR扩增液在一种可选的实施方式中选自：2×One Step U⁺(诺唯赞)；在其他实施方式中，也可以选自其他的PCR扩增缓冲液。酶预混液在一种可选的实施方式中选自：OneStep U⁺Enzyme Mix(诺唯赞)。在其他实施方式中，酶预混液也可以是选自包括反转录酶、Taq DNA 聚合酶的混合酶液。

本发明还提供了一种猪病毒性腹泻检测引物组合在制备检测测试样本中猪病毒性腹泻的试剂盒中的应用。试剂盒用于：将取待测样本的RNA与上述猪病毒性腹泻检测引物组合混合进行反应，根据荧光信号进行待测样本的结果判定。

在一种可选的实施方式中，应用的检测对象为活猪、死亡的猪或环境样本。

本发明提供的应用不以疾病的诊断为目的。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述应用中，添加的探针引物对中引物对的最终摩尔浓度与探针的最终摩尔浓度之比为200nM～500nM:100nM。

上述应用中，添加的探针引物对中引物对的最终总摩尔浓度与探针的最终总摩尔浓度之比为400nM:100nM。

发明人采用不同的引物探针组合进行长期大量的反应体系摸索，发现当添加的探针引物对中引物对的最终摩尔浓度与探针的最终摩尔浓度之比在上述范围之内时，荧光强度最高，Ct值较小。有利于更高灵敏度的荧光信号表征。

在一种可选的实施方式中，上述应用中，添加的探针引物对中引物对的最终总摩尔浓度与探针的最终总摩尔浓度之比为400nM:100nM。当探针终浓度为100nM，上下游引物终浓度为400nM时，该多重qPCR反应中Cy5和ROX荧光强度最高，且Ct值也最低(因为该多重检测中Cy5和ROX荧光本身就相对较弱，因此选择Cy5和ROX荧光强度最大的引物探针组合作为最佳组合)。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述反应的程序包括：55℃15-18min；95-96℃30s；95-96℃10s，60℃25-30s，共计40-45个循环。

在一种可选的实施方式中，上述反应的程序包括：55℃15min；95℃30s；95℃10s，60℃30s采集荧光信号，共计45个循环。共设置四个荧光通道，分别是报告基团“FAM”,淬灭基团“BHQ1”，报告基团“HEX”，淬灭基团“MGB”，报告基团“Cy5”，淬灭基团“BHQ2”，报告基团“ROX”，淬灭基团“BHQ2”。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述待测样本的结果判定包括：若阳性对照四个通道Ct值＜30并出现特异的S型扩增曲线，且阴性对照无Ct值，可判定实验结果成立。

待测样本FAM通道Ct值≤35并出现特异的S型扩增曲线，判为流行性腹泻病毒核酸阳性；若无Ct值且无特异的扩增曲线，判为流行性腹泻病毒核酸阴性；35＜CT值＜45并出现特异的扩增曲线，判为流行性腹泻病毒核酸可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，复检结果若Ct值＜45判为阳性，否则判为阴性；

待测样本HEX通道Ct值≤35并出现特异的S型扩增曲线，判为轮状病毒核酸阳性；无Ct值且无特异的扩增曲线，判为轮状病毒核酸阴性；35＜CT值＜45并出现特异的扩增曲线，判为轮状病毒核酸可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，复检结果Ct值＜45判为阳性，否则判为阴性；

待测样本Cy5通道Ct值≤35并出现特异的S型扩增曲线，判为传染性胃肠炎病毒核酸阳性；无Ct值且无特异的扩增曲线，判为传染性胃肠炎病毒核酸阴性；35＜CT值＜45并出现特异的扩增曲线，判为传染性胃肠炎病毒核酸可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，复检结果Ct值＜45判为阳性，否则判为阴性。

待测样本ROX通道Ct值≤35并出现特异的S型扩增曲线，判为德尔塔冠状病毒核酸阳性；无Ct值且无特异的扩增曲线，判为德尔塔冠状病毒核酸阴性；35＜CT值＜45并出现特异的扩增曲线，判为德尔塔冠状病毒核酸可疑，需重新取样提取RNA，进行复检，复检结果Ct值＜45判为阳性，否则判为阴性。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供的检测引物组合可以一次性实现样本中猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒的检测分析。具有简便快捷、稳定性好、检测灵敏度高、特异性强的特点。使4种病毒基因的扩增效率一致,且与每个单重反应的灵敏度一致，具有简便快捷、稳定性好、检测灵敏度高、特异性强的特点。

具体地，为了提升检测的准确性，选择PEDV M基因、TGEV N基因、RV VP7基因和PDCoV M基因的保守区域进行探针引物的设计。由此可以实现同一种RNA病毒的不同毒株的准确检出。

此外，本发明可以同时进行大批量的样本分析，在一次检测操作后，即可鉴别样本中是否含有猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒。

基于上述检测引物组合，本发明还开发了相应的检测试剂盒和应用，具有检测便捷、准确度高的优势，可以应用于猪场日常监测工作。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为在不同模板浓度下的猪流行性腹泻病毒PEDV探针引物对的荧光扩增曲线图；

图2为在不同模板浓度下的猪流行性腹泻病毒PEDV探针引物对的标准曲线图；

图3为在不同模板浓度下的猪传染性胃肠炎病毒TGEV探针引物对的荧光扩增曲线图；

图4为在不同模板浓度下的猪传染性胃肠炎病毒TGEV探针引物对的标准曲线图；

图5为在不同模板浓度下的猪轮状病毒RV探针引物对的荧光扩增曲线图；

图6为在不同模板浓度下的猪轮状病毒RV探针引物对的标准曲线图；

图7为在不同模板浓度下的猪德尔塔冠状病毒PDCoV探针引物对的荧光扩增曲线图；

图8为在不同模板浓度下的猪德尔塔冠状病毒PDCoV探针引物对的标准曲线图；

图9为特异性实验得到的荧光扩增曲线图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

本实施例提供了一种猪病毒性腹泻检测试剂盒，其包括阳性对照、阴性对照、引物预混液、探针预混液、PCR扩增液和酶预混液。

阳性对照：分别含有PEDV、TGEV、RV、PDCoV目的基因片段的重组质粒。

阴性对照：双蒸水。

引物预混液：包括初始浓度为10μM的PEDV-F、PEDV-R、TGEV-F、TGEV-R、RV-F、RV-R、PDCoV-F、PDCoV-R摩尔比为1:1:1:1:1:1:1:1的预混液；

探针预混液：初始浓度为10μM的PEDV-P、TGEV-P、RV-P、PDCoV-P摩尔比为1:1:1:1的预混液；

PCR扩增液包括：2×One Step U+(诺唯赞)；

酶预混液：One Step U+Enzyme Mix(诺唯赞)。

上游引物PEDV-F(SEQ ID NO.1):

5’-CCAACTGGTGTAACGCTAAC-3’

下游引物PEDV-R(SEQ ID NO.2)：

5’-GACATAGAAAGCCCAACCAG-3’

荧光标记的探针PEDV-P(SEQ ID NO.3):

FAM-AGGGCTATAAGGTTGCTACTGGCGT-BHQ1。

上游引物RV-F(SEQ ID NO.4):5’-TGAGCGTATGATGCGAGTA-3’

下游引物RV-R(SEQ ID NO.5)：5’-AATGACCGTGATCTTTTGG-3’

荧光标记的探针RV-P(SEQ ID NO.6):

HEX-AAATGGTGGCAAGTTTTCTAT–MGB。

上游引物TGEV-F(SEQ ID NO.7):5’-TAATGCCTATGCTCGTC-3’

下游引物TGEV-R(SEQ ID NO.8)：

5’-TACCACATCTTGCTCTGA -3’

荧光标记的探针TGEV-P(SEQ ID NO.9):

CY5-CCATCAGAAGTGGCAAAAGAACAGA–BHQ2。

上游引物PDCoV-F(SEQ ID NO.10):

5’-GACACCTTTCACTACACTT-3’

下游引物PDCoV-R(SEQ ID NO.11)：

5’-GTCACCCTGGTATATCAGA-3’

荧光标记的探针PDCoV-P(SEQ ID NO.12):

ROX-AGAAACCTGTGGAATCAAACAACGA–BHQ2。

阳性对照的制备方法如下：

PEDV、TGEV、RV、PDCoV的阳性对照品用购买的病毒疫苗，提取RNA作为模板，按照天根的RNA病毒提取试剂盒，进行总RNA的提取，采用50μL的体系，反应体系包括：2×One StepMix(Dye Plus)25μL、One Step Enzyme Mix(诺唯赞)2.5μL，上游引物2μL、下游引物(上下游引物参照本实施例提供的引物)2μL、RNA 6μL以及RNase free H₂O(无核酸酶水)12.5μL。PCR扩增程序：50℃反转录30min；94℃3min；循环94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30个循环；再72℃延伸7min。扩增完成后，所有产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定为阳性的PCR产物用天根的胶回收试剂盒进行纯化回收，连接到pEASY-T1载体并转化到DH5ɑ感受态细胞，挑取阳性克隆，用LB培养液摇菌扩增后，将菌液送到上海生工生物工程有限公司进行测序。

使用上述试剂盒进行待测样本的检测应用如下：

(1)提取待测样品的总RNA备用

(2)配制反应体系：

样品RNA 6μL，引物预混液4.8μL(400nM)，探针预混液1.2μL(100nM)，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，ddH₂O 1.5μL。

(3)扩增程序

55℃15min，95℃30s，循环为95℃10s，60℃30s(采集荧光信号)，共计45个循环。共四个荧光通道，分别是报告基团“FAM”,淬灭基团“BHQ1”，报告基团“HEX”,淬灭基团“MGB”，报告基团“Cy5”,淬灭基团“BHQ2”，报告基团“ROX”,淬灭基团“BHQ2”。

(4)结果判定

若阳性对照四个通道Ct值＜30并出现特异的S型扩增曲线，且阴性对照无Ct值，可判定实验结果成立。

实验例1

本实验例进行四重荧光定量PCR条件优化。

用天根的质粒提取试剂盒提取实施例1中的测序正确的阳性菌株的质粒，用NanoDrop 2000核酸浓度测定仪检测质粒模板浓度，将四种标准质粒分别进行10倍梯度稀释后取浓度10⁴copise/μL，1:1:1:1进行混合作为模板。总体系30μL，将上下游引物与相应探针分别以不同的探针终浓度和引物终浓度进行混合，引物(上、下游)与相应探针分别添加1.2μL、1.2μL(上下游总引物浓度400nM:探针浓度400nM)；1.2μL、0.6μL(上下游总引物浓度400nM:探针浓度200nM)，1.2μL、0.3μL(上下游总引物浓度400nM:探针浓度100nM)，0.6、0.3μL(上下游总引物浓度200nM:探针浓度100nM)，所有引物探针应用浓度均为10μM。按本发明实施例1提供的扩增程序55℃15min，95℃30s，循环为95℃10s，60℃30s(采集荧光信号)，共计45个循环，进行PCR扩增，以获得最低的Ct值和较高的荧光强度增加值时的引物探针浓度比例为最佳。

引物浓度和探针浓度分组试验结果如下表所示：

实验结果说明，用不同组合探针和引物浓度进行最佳反应体系摸索实验，发现当探针终浓度为100nM，上下游引物终浓度为400nM时该多重qPCR反应中Cy5和ROX荧光强度最高，且Ct值也最低(因为该多重检测中Cy5和ROX荧光本身就相对较弱，因此选择Cy5和ROX荧光强度最大的引物探针组合作为最佳组合)。

将四种标准质粒分别进行10倍梯度稀释后作为模板，取其中浓度为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copise/μL进行敏感度测定。

采用单重qPCR反应体系：DNA模板6μL，上、下游引物1.2μL(400nM)，探针0.3μL(100nM)，PCR扩增液15μL，酶预混液1.5μL，Rnase-free ddH₂O 6μL，所有引物探针应用浓度均为10μM。扩增程序55℃15min，95℃30s，循环为95℃10s，60℃30s(采集荧光信号)，共计45个循环，进行PCR扩增，并分析其标准曲线。

PEDV探针引物对的荧光扩增曲线图参照图1所示，标准曲线参照图2所示；TGEV探针引物对的荧光扩增曲线图参照图3所示，标准曲线参照图4所示；RV探针引物对的荧光扩增曲线图参照图5所示，标准曲线参照图6所示；PDCoV探针引物对的荧光扩增曲线图参照图7所示，标准曲线参照图8所示。

在稀释的现行浓度范围内，模板量与对应的Ct值呈较好的线性关系，相关系数R²分别为0.999、0.998、0.998、0.998，本发明的荧光定量方法对于不同毒力基因有较高的扩增效率(99.13％-101.25％)，荧光定量PCR的最低检测量为10¹copise/μL，因此本发明建立的荧光定量PCR具有较高的敏感性。

实验例2

本实验例进行重复性验证实验。

分别以7个浓度的10倍梯度稀释的阳性对照质粒为模板，终浓度分别为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰copise/μL，按提供荧光定量的反应体系及程序进行荧光定量PCR，每个梯度设定3个重复，验证该方法的重复性。结果表明，本发明的重复实验变异系数(CV值)均在0.5％以下，表明本发明提供的检测试剂盒具有很好的重复性。

实验例3

本实验例进行特异性验证实验。

分别以发明人保存的猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒和猪乙型脑炎病毒阳性样品作为模板，用本发明实施例1提供的引物及探针进行荧光定量PCR扩增。

结果如图9所示，该体系中不同信号通道检测结果均为阴性，表明该方法特异性强，与其他主要传染病原无交叉反应。

综上，本发明提供的检测试剂盒及检测引物组合可以一次性实现样本中猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒的检测分析。具有简便快捷、稳定性好、检测灵敏度高、特异性强的特点，具有广阔的应用前景。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东傲农种猪有限公司

福建哈客生态农业有限公司

漳州傲农现代农业开发有限公司

福建傲农生物科技集团股份有限公司

<120> 一种猪病毒性腹泻检测引物组合、检测试剂盒及应用

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ccaactggtg taacgctaac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacatagaaa gcccaaccag 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agggctataa ggttgctact ggcgt 25

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgagcgtatg atgcgagta 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatgaccgtg atcttttgg 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaatggtggc aagttttcta t 21

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

taatgcctat gctcgtc 17

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

taccacatct tgctctga 18

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccatcagaag tggcaaaaga acaga 25

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gacacctttc actacactt 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtcaccctgg tatatcaga 19

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agaaacctgt ggaatcaaac aacga 25

<210> 13

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ccaactggtg taacgctaac actccttagt ggtacattgc ttgtagaggg ctataaggtt 60

gctactggcg tacaggtaag tcaattacct aatttcgtca cagtcgccaa ggccactaca 120

acaattgtct acggacgtgt tggtcgttca gtcaatgctt catctggcac tggttgggct 180

ttctatgtc 189

<210> 14

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

tgagcgtatg atgcgagtaa attggaagaa atggtggcaa gttttctata cagtagtaga 60

ttatattaat cagattgtac aagctatgtc caaaagatca cggtcatt 108

<210> 15

<211> 94

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

taatgcctat gctcgtccat cagaagtggc aaaagaacag agaaaaagaa aatctcgttc 60

taaatctgca gaaaggtcag agcaagatgt ggta 94

<210> 16

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gacacctttc actacacttt taagaaacct gtggaatcaa acaacgatcc agaattcgct 60

gttctgatat accagggtga c 81

Claims

1.一种猪病毒性腹泻检测引物组合，其特征在于，其包括第一探针引物对、第二探针引物对、第三探针引物对和第四探针引物对，所述第一探针引物对包括第一探针和第一引物对，所述第二探针引物对包括第二探针和第二引物对，所述第三探针引物对包括第三探针和第三引物对，所述第四探针引物对包括第四探针和第四引物对；

所述第一引物对具有如SEQ ID NO.1-2所示的序列，所述第一探针具有如SEQ ID NO.3所示的序列，所述第二引物对具有如SEQ ID NO.4-5所示的序列，所述第二探针具有如SEQID NO.6所示的序列，所述第三引物对具有如SEQ ID NO.7-8所示的序列，所述第三探针具有如SEQ ID NO.9所示的序列，所述第四引物对具有如SEQ ID NO.10-11所示的序列，所述第四探针具有如SEQ ID NO.12所示的序列；

优选地，所述第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的5’端均标记有荧光报告基团，所述第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的3’端均标记有荧光淬灭基团。

2.一种猪病毒性腹泻检测试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1所述的猪病毒性腹泻检测引物组合。

3.根据权利要求2所述的猪病毒性腹泻检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中的猪病毒性腹泻检测引物组合分布于引物预混试剂和探针预混试剂中，且所述引物预混试剂为第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对的预混试剂，所述引物预混试剂中第一引物对、第二引物对、第三引物对和第四引物对的混合摩尔比为1:1～1.5:1:1。

4.根据权利要求3所述的猪病毒性腹泻检测试剂盒，其特征在于，所述探针预混试剂为第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的预混试剂，所述探针预混试剂中第一探针、第二探针、第三探针和第四探针的混合摩尔比为1:1～1.5:1:1。

5.根据权利要求2-4任一项所述的猪病毒性腹泻检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照、PCR扩增液和酶预混液。

6.一种如权利要求1所述的猪病毒性腹泻检测引物组合在制备检测测试样本中猪病毒性腹泻的试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒用于：将待测样本的RNA与权利要求1所述的猪病毒性腹泻检测引物组合混合进行反应，根据荧光信号进行待测样本的结果判定。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用中添加的探针引物对中引物对的最终摩尔浓度与探针的最终摩尔浓度之比为200nM～500nM:100nM。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用中，添加的探针引物对中引物对的最终总摩尔浓度与探针的最终总摩尔浓度之比为400nM:100nM。

10.根据权利要求7所述的，其特征在于，所述反应的程序包括：55℃15-18min；95-96℃30s；95-96℃10s，60℃25-30s，共计40-45个循环。