CN110093461A - 四种猪腹泻病毒的四重rt-pcr检测引物及试剂盒 - Google Patents

四种猪腹泻病毒的四重rt-pcr检测引物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒的四重RT‑PCR检测引物及试剂盒，属于分子检测技术领域。本发明所述四重RT‑PCR检测引物，包括猪流行性腹泻病毒检测引物PEDV F和PEDV R；猪传染性胃肠炎病毒检测引物TGEV F和TGEV R；猪A群轮状病毒检测引物PoRV F和PoRV R；和猪德尔塔冠状病毒检测引物PDCoV‑F和PDCoV‑R。本发明所述引物特异性强，具有可重复性，灵敏度高，且临床可靠性高。

Description

四种猪腹泻病毒的四重RT-PCR检测引物及试剂盒
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒的四重RT-PCR检测引物及试剂盒。
背景技术
猪流行性腹泻病是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrheavirus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，各种年龄和品种的猪都易感，其中2周龄以下仔猪的致死率可达100％。猪流行性腹泻病的不断爆发给我国带来了巨大的经济损失。猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis of swine，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的一种高度接触性传染病，各个年龄的猪都易感，对仔猪的影响最为严重，致死率达100％。该病在世界各养猪国家均有发生，给世界养猪业带来了极大的经济损失。轮状病毒(Rotavirus,RV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridas)，轮状病毒属(Rotavirus)，是引起幼龄儿童和多种幼龄动物病毒性腹泻的重要病原之一，在我国，1979年庞其方等人首次从儿童腹泻粪便中检测到轮状病毒，倪亚伟首次报道了短型猪RV的分离，随后我国兽医研究人员先后在犊牛和羔羊等多种动物的粪便中检测并分离到了轮状病毒，猪轮状病毒(PoRV)常与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和大肠杆菌(E.coli)等混合感染，从而加重病情，因此，轮状病毒会危害全世界的人类健康，同时也会给畜牧业生产造成巨大的危害。猪丁型冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)是一种最近几年新出现的能够引起猪的腹泻的肠道冠状病毒。猪丁型冠状病毒主要引起仔猪的粥样腹泻、呕吐和昏睡等临床症状，调查结果显示，对仔猪具有较高的致病性，自从新的冠状病毒被发现后，已经在几个国家中被证实存在。
临床上上述四种猪腹泻病毒感染情况较多，且混合感染的情况普遍存在，传统单项RT-PCR技术虽然具有快捷、特异性高的特点，但是并不适用与临床大规模的病毒检测。
发明内容
本发明的目的在于提供猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒的四重RT-PCR检测引物及试剂盒。本发明所述引物特异性强，具有可重复性，灵敏度高，且临床可靠性高。
本发明提供了一组四重RT-PCR检测引物，包括猪流行性腹泻病毒检测引物PEDV F和PEDV R；猪传染性胃肠炎病毒检测引物TGEV F和TGEV R；猪A群轮状病毒检测引物PoRV-F和PoRV-R；和猪德尔塔冠状病毒检测引物PDCoV F和PDCoV R；
所述PEDV F的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述PEDV R的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述TGEV F的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述TGEV R的序列如SEQ ID NO.4所示；
所述PDCoV-F的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述PDCoV-R的序列如SEQ ID NO.6所示；
所述PoRV F的序列如SEQ ID NO.7所示；
所述PoRV R的序列如SEQ ID NO.8所示。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括上述技术方案所述引物、2×TaqPCR MasterMix和水。
优选的是，每28.5μL检测体系中含有PEDV F和PEDV R各0.4μL，TGEV F和TGEV R各0.35μL，PDCoV-F和PDCoV-R各0.25μL，PoRV F和PoRV R各0.5μL，2×Taq PCR MasterMix 15μL和水8.5μL。
优选的是，所述试剂盒的反应程序为：95℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃，1min，40个循环；72℃10min；4℃1h。
本发明提供了猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒的四重RT-PCR检测引物。利用本发明所述引物能够实现猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒的四重RT-PCR检测，能够为进一步研究上述四种猪腹泻病毒流行情况作技术上的有力支持，为兽医临床大规模的流行病学调查的技术手段。本方法所述引物特异性强，后续使用时无非特异性扩增，具有可重复性，在灵敏度上略低于单一RT-PCR技术，但应用于临床检测，吻合率与单一RT-PCR一致，具有临床可靠性。
附图说明
图1为本发明提供的PEDV最佳退火温度图；
图2为本发明提供的TGEV最佳退火温度图；
图3为本发明提供的PDCoV最佳退火温度；
图4为本发明提供的PoRV最佳退火温度；
图5为本发明提供的PDCoV双酶切；
图6为本发明提供的PEDV\PoRV\TGEV双酶切；
图7为本发明提供的PEDV\TGEV\PoRV\PDCoV重组质粒PCR鉴定；
图8为本发明提供的PEDV单一PCR灵敏度实验；
图9为本发明提供的TGEV单一PCR灵敏度实验；
图10为本发明提供的PDCoV单一PCR灵敏度实验；
图11为本发明提供的PoRV单一PCR灵敏度实验；
图12为本发明提供的四重RT-PCR方法退火温度优化结果；
图13为本发明提供的四重RT-PCR的引物浓度的优化结果；
图14为本发明提供的四重RT-PCR方法灵敏度验证结果；
图15为本发明提供的四重RT-PCR方法特异性验证结果；
图16为本发明提供的四重RT-PCR方法稳定性验证结果；
图17为本发明提供的四重RT-PCR方法临床应用结果。
具体实施方式
本发明提供了一组四重RT-PCR检测引物，包括猪流行性腹泻病毒检测引物PEDV F和PEDV R；猪传染性胃肠炎病毒检测引物TGEV F和TGEV R；猪A群轮状病毒检测引物PoRV F和PoRV R；和猪德尔塔冠状病毒检测引物PDCoV F和PDCoV R；
所述PEDV F的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述PEDV R的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述TGEV F的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述TGEV R的序列如SEQ ID NO.4所示；
所述PDCoV-F的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述PDCoV-R的序列如SEQ ID NO.6所示；
所述PoRV F的序列如SEQ ID NO.7所示；
所述PoRV R的序列如SEQ ID NO.8所示。
在本发明中，所述引物的具体序列如表1所示。
表1引物序列表
在本发明中，所述猪流行性腹泻病毒(PEDV)的检测引物对应的产物长度703bp；所述猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的检测引物对应的产物长度639bp；所述猪A群轮状病毒(PoRV)的检测引物对应的产物长度271bp；所述猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)的检测引物对应的产物长度383bp。本发明所述引物的组合具有高特异性和稳定性，能够在同一PCR反应体系中对四种病毒的目的片段同时进行有效扩增，从而达到在同一个PCR反应体系中可以同时检出上述四种病毒的能力，使得检测过程更加简便、省时省力和经济实惠，且所述引物之间不发生非特异性结合，可以有效避免产生引物二聚体和发夹结构，确保PCR高效扩增，增强该检测技术的特异性和敏感性。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括上述技术方案所述引物、2×Taq PCR MasterMix和水。在本发明中，所述水优选为双蒸水。在本发明中，所述2×Taq PCR MasterMix优选购自TIANGEN公司，2×Taq PCR MasterMix包含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂以及稳定剂，浓度为2×。具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。在本发明中，所述试剂盒检测的样品包括猪肠道组织、肠道内容物、粪便等样本或肠系膜淋巴结、脾脏等脏器组织。本发明优选对所述样品的RNA进行提取，之后进行反转录，得到cDNA，本发明所述试剂盒优选对cDNA进行检测。本发明对所述反转录的方法没有特殊限定，优选采用本领域技术人员熟知的常规反转录试剂盒进行处理即可，如EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA SynthesisSuperMix反转录试剂盒。
在本发明中，每28.5μL检测体系中含有PEDV F和PEDV R各0.4μL，TGEV F和TGEV R各0.35μL，PDCoV-F和PDCoV-R各0.25μL，PoRV F和PoRV R各0.5μL，2×Taq PCR MasterMix15μL和水8.5μL。由于四重RT-PCR技术复杂，主要是引物对的浓度搭配，上述引物的特定添加体积，有效降低了PCR反应中一些优势引物的影响，确保了引物对与目的片段之间的反应均衡性。在本发明中，检测样品优选为cDNA，所述样品的添加量优选为2μL。
在本发明中，所述试剂盒的反应程序为：95℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃，1min，40个循环；72℃10min；4℃1h。此PCR反应程序可以使四种病毒的特异性引物在较短时间内对目的片段进行高效扩增，节约检测时间，另外所选的退火温度56℃降低了引物之间非特异性结合或发卡结构出现，并确保了引物与模板特异性结合。
下面结合具体实施例对本发明所述的猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒和猪德尔塔冠状病毒的四重RT-PCR检测引物及试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
实验材料：猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪A群轮状病毒(PoRV)及猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)阳性样本来自安徽农业大学动物传染病实验室，RNA提取试剂盒(过柱法)购自北京亿森宝生物科技有限公司、2×Taq PCR MasterMix购自TIANGEN公司、Trans1-T1 Phage Resistant化学感受态细胞和反转录试剂盒及pEASY-T1Clonging Kit载体购自北京全式金生物科技有限公司、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自TIANGEN公司、质粒小提试剂盒购自TIANGEN公司等。
实验方法：
1.病料的收集与处理
由安徽农业大学动物传染病实验室收集安徽地区猪场猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪A群轮状病毒(PoRV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)阳性样本，样本标记好后存入负80℃超低温冰箱。取小肠组织0.3g至2mL研磨管中研磨5-6次，反复冻融3次后，12000r/min离心4min，使用RNA提取试剂盒(过柱法)提取样本核酸，使用高压灭菌后的1.5mLEP管收集核酸，长期保存放入负80℃超低温冰箱，短期保存放入负20℃冰箱。
2.引物设计如表1所示
3.单一RT-PCR反应体系的建立
整个实验过程均在生物安全柜中进行，根据每种病毒检测引物的Tm值，设置4个退火温度，2℃为一个间隔，其中PEDV引物Tm值为59℃，设置的退火温度为：54℃、56℃、58℃、60℃；TGEV引物Tm值为54℃，设置的退火温度为：50℃、52℃、54℃、56℃；PDCoV引物Tm值为59℃，设置的退火温度同PEDV一致；PORV引物平均Tm值为55.5℃，设置的退火温度为：52℃、54℃、56℃、58℃。每种病毒分开进行实验，各取4个PCR反应管，分别加入各自的上游、下游引物各1μL、病毒cDNA2μL、ddH2O 2μL、2×TaqPCR MasterMix 12.5μL，使用涡旋振荡仪混匀后，用低速离心机瞬时离心5～10秒，然后置于梯度PCR仪中进行反应，PCR反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s；退火30s；72℃延伸1min，共计35个循环；72℃补充延伸7min。
将PCR产物使用加入2～3滴EB染色液的1％的琼脂糖进行凝胶电泳，电压120V，时长30～45min，置于凝胶成像仪中进行观察分析。
PEDV反应条件的建立和退火温度：图1为PEDV最佳退火温度图(M：DL 2000Marker；1：54℃，2：56℃，3：58℃，4：60℃，-：阴性对照)，从图1可以看出，目的条带大小(703bp)符合预期设想。PEDV引物随着温度的改变而目的条带有所改变，从54-60℃温度范围内均出现条带。在58℃时条带最亮。
TGEV反应条件的建立和退火温度：图2为TGEV最佳退火温度图(M：DL 2000Marker；1：50℃，2：52℃，3：54℃，4：56℃，-：阴性对照)，从图2可以看出，目的片段大小546bp，为目的条带大小符合预期设想。退火温度对TGEV引物有一定影响，但并没有明显差别，从50-56℃温度范围内均出现条带。在54℃时条带最亮。
PDCoV反应条件的建立和退火温度：图3为PDCoV最佳退火温度图(M：DL 2000Marker；1：54℃，2：56℃，3：58℃，4：60℃，-：阴性对照)，从图3可以看出，PDCoV目的片段大小为383bp，条带与预期大小一致，切退火温度对该引物影响不大，在54℃、56℃、58℃、60℃扩增效果均良好。
PoRV反应条件的建立和退火温度：图4为PoRV最佳退火温度图(M：DL 2000Marker；1：52℃，2：54℃，3：56℃，4：58℃，-：阴性对照)，从图4可以看出，PoRV目的片段大小为271bp，条带与预期大小一致，切退火温度对该引物影响不大，在52℃、54℃、56℃、58℃扩增效果均良好。
4.RT-PCR扩增产物的纯化和回收
凝胶回收RT-PCR产物的方法是采用TIANGEN公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行切胶回收，具体步骤如下：使用凝胶成像仪在紫外照射的条件下快速进行切胶，在凝胶上找到目的条带，使用洁净的手术刀片进行切胶，尽量切除多余部分，放入高压灭菌后的1.5mL离心管中，称取重量。向胶块中加入等体积PN溶液，50℃水浴放置，中途温和翻转离心管3～4次，确保胶块彻底溶解。将上述液体加入一个吸附柱CA2中，室温静置2min，12000rpm离心1min，倒掉管中废液。向吸附柱中加入600μL漂洗液PW(使用前需要按照说明书加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，倒掉管中废液。重复上一步骤，倒掉管中废液后，12000rpm空柱离心2min，将吸附柱CA2置于室温放置数分钟，确保彻底晾干，防治残留的漂洗液影响下一步实验。将吸附柱CA2置于一个干净的离心管中，向吸附膜中央位置悬空加入ddH2O 30～50μL，室温放置2min，12000rpm离心2min后收集管中DNA溶液。长期保存应放入-80℃超低温冰箱。
5.连接和转化
5.1质粒连接
使用北京全式金生物有限公司的pEASY-T1Clonging Kit载体分别进行四种病毒基因的PCR胶回收产物的连接。方法如下：取1个高压灭菌后的PCR管，按照说明书分别加入胶回收产物4μL、pEASY-T1 Clonging Vector 1μL，使用10μL移液器轻轻吹打混匀，室温(20～37℃)反应5min，按照模板片段长度，长度在0.1～1kb之间，反应时间则在5～10min之间。
5.2转化
加连接产物于50μLTrans1-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚融化时加入)，轻弹混匀，冰浴30min；42℃水浴热激30s，立即置于冰上冰浴2min；加入提前配制好高压灭菌后的LB培养基250μL(需要提前平衡至室温)，置于摇床上，固定好，200rpm、37℃培养1h；取出后将离心管置于离心机中，4000rpm离心1min，弃去上清液，保留100μL，并将底部的菌体轻轻吹打均匀悬浮于液体中；取上一步骤中的菌液100μL，在超净工作台中使用玻璃涂布棒均匀涂布于LB平板培养基中(使用前需要加入千分之一的氨苄西林，防止杂菌污染)，置于37℃温箱过夜培养；过夜培养后取出，在超净工作台中使用接种环挑取单个菌落，置于LB液体培养基中，为了防止挑到杂菌或者空质粒，至少需要挑取3个菌落，使用3个LB液体培养基进行培养，将LB液体培养基置于恒温摇床中，37℃、250rpm过夜培养。
6.质粒提取
使用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒对质粒进行阳性鉴定，具体步骤如下：取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，12000rpm离心1min，尽量吸除上清液；向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(使用前需要加入RNaseA)，使用移液器吹打彻底悬浮菌体沉淀；向离心管中加入250μL溶液P2，温和的上下翻转6-8次，使菌体充分裂解；向离心管中加入350μL溶液P3，温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min；将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意不能吸出沉淀，12000rpm离心1min，弃去管中废液，将吸附柱放入收集管中；向吸附柱CP3中加入600μL漂洗液PW(使用前加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃去废液；重复上一步；将吸附柱CP3放入收集管，12000rpm离心2min，去除吸附柱中残余漂洗液；室温静置数分钟，彻底晾干吸附材料中的残余漂洗液；将吸附柱CP3置于干净离心管中，向吸附膜中央悬空加入ddH2O 50μL，室温静置2min，12000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中，放于﹣20℃保存待用。
7.阳性重组质粒的鉴定
使用Takara生物公司的双酶切试剂对提取的四种病毒基因重组质粒进行双酶切，具体步骤如下：分别取出4个PCR管，分别加入10×K buffer 1μL、HindⅢμL、XhoⅠμL、ddH2O2μL、重组质粒5μL。使用10μL移液器混匀后低速离心数秒，置于37℃水浴5h；吸取产物5μL，与2μL 10×DNA buffer试剂混合后，加入1％琼脂糖凝胶中，电泳30-40min，电压110V，将凝胶置于凝胶成像仪中观察分析。随后将四种病毒基因片段的阳性重组质粒使用各自的特异性引物进行PCR鉴定，将PCR产物使用1％琼脂糖凝胶，电泳30～40min，电压110V，将凝胶置于凝胶成像仪中观察分析。
将四种病毒的重组质粒进行双酶切验证，可出现两个条带，第一条是连接的质粒片段，大小约为3928bp，第二条为四种病毒的目的基因片段。PDCOV重组质粒双酶切结果如图5(M：DL 2000 Marker；1：PDCoV双酶切样本)所示，在3928bp位置左右出现了质粒的阳性片段，在383bp左右位置处出现PDCoV目的片段。PEDV、PoRV、TGEV重组质粒双酶切结果如图6(M:DL2000Marker；1：PEDV双酶切样本；2：PoRV双酶切样本；3：TGEV双酶切样本)所示，在3928bp处出现质粒阳性片段，在703bp、271bp、546bp左右位置处分别出现PEDV、PoRV、TGEV的目的片段。将四种病毒基因片段的阳性重组质粒使用各自的特异性引物进行PCR鉴定，将电泳后的凝胶置于凝胶成像仪中观察分析，PEDV\TGEV\PoRV\PDCoV重组质粒PCR鉴定结果如图7(M：DL 2000 Marker；1：PEDV；2：TGEV；3：PORV；4：PDCOV)所示，结果证明四种病毒的重组质粒均与目的基因片段成功连接，PCR检测均为阳性。
以上实验结果证明四种病毒的目的片段均与质粒连接成功，且PCR检测均为阳性，所构建的四种病毒的阳性重组质粒可用于后续实验。
实施例2
单一RT-PCR反应的灵敏性实验
测定四种病毒的阳性质粒浓度，使用五蒸水将四个病毒阳性质粒分别进行10倍对比稀释，从10-1稀释到10-9共9个稀释度。四种病毒取单一病毒的9个稀释度的模板进行反应。四种病毒TGEV、PEDV、PORV和PDCoV分别进行灵敏性实验，同时设置阴性对照组。
PEDV的RT-PCR的灵敏性实验:用已经优化好的PEDV RT-PCR反应进行灵敏性实验，将已经测定好浓度的PEDV阳性质粒做十倍倍比稀释，稀释倍数为10-1-10-10。PEDV单一PCR灵敏度实验结果如图8(M：DL 2000 Marker；+：PEDV质粒原始浓度；1-10：十倍梯度稀释10-1-10-10)所示,10-10仍有条带显示。PEDV单一RT-PCR最低检测到3.828pg。
TGEV的RT-PCR的灵敏性实验:用已经优化好的TGEV RT-PCR反应进行灵敏性实验，将已经测定好浓度的TGEV阳性质粒做十倍倍比稀释，稀释倍数为10-1-10-10。TGEV单一PCR灵敏度实验结果如图9(M：DL 2000 Marker；+：TGEV质粒原始浓度；1-10：十倍梯度稀释10-1-10-10)所示,10-8仍有条带显示,10-9开始变为阴性。TGEV单一RT-PCR最低检测到4.76pg。
PDCOV的RT-PCR的灵敏性实验:用已经优化好的PDCOV RT-PCR反应进行灵敏性实验，将已经测定好浓度的PDCOV阳性质粒做十倍倍比稀释，稀释倍数为10-1-10-10。PDCOV单一PCR灵敏度实验结果如图10(M：DL 2000 Marker；+：PDCOV质粒原始浓度；1-10：十倍梯度稀释10-1-10-10)所示,10-8仍有条带显示,10-9开始变为阴性。PDCOV单一RT-PCR最低检测到5.56pg。
PORV的RT-PCR的灵敏性实验:用已经优化好的PORV RT-PCR反应进行灵敏性实验，将已经测定好浓度的PORV阳性质粒做十倍倍比稀释，稀释倍数为10-1-10-10。PORV单一PCR灵敏度实验结果如图11(M：DL 2000 Marker；+：PORV质粒原始浓度；1-10：十倍梯度稀释10-1-10-10)所示,10-8仍有条带显示,10-9开始变为阴性。PORV单一RT-PCR可检测到1.26pg。
实施例3
猪四种腹泻病毒多重RT-PCR的建立
(1)猪四种腹泻病毒四重RT-PCR方法的退火温度的优化
取TGEV、PEDV、PORV和PDCoV四种病毒阳性质粒为模板，选择不同温度，同时对四种病毒进行检测的试验，证明本申请保护的温度，效果最好，其它温度扩增效果差或者不能有效扩增。本实验选择50℃、52℃、54℃、56℃、58℃作为试验退火温度，对四重RT-PCR检测体系的退火温度优化结果如图12(M：DL 2000 Marker；-：阴性对照；1-5：50℃、52℃、54℃、56℃、58℃)所示，在退火温度为56℃时，本四重RT-PCR检测方法对四种病毒的扩增效果最佳，条带清晰明亮，结果证明本申请保护的温度(56℃)为最佳退火温度。
(2)猪四种腹泻病毒四重RT-PCR条件的优化
1.四重RT-PCR的引物浓度的优化
选择适当的引物间浓度是确保多重RT-PCR成功的一个关键因素。针对不同病毒特异引物的取不同添加量进行四重RT-PCR反应，实验结果证明10号样本所选择的引物体积为最佳体积，该体积下四种病毒的目的片段清晰明亮，其余10种效果均不如10号(图13，其中，M：DL 2000 Marker；-：阴性对照1-11：引物对1-11号)，引物比例如表2所示：
表2引物添加比例表
(3)猪四种腹泻病毒四重RT-PCR方法灵敏度验证
将四种病毒的核酸进行浓度测定，以此进行稀释，设置10-1至10-12共12个稀释度。再将稀释好的模板用于多重RT-PCR的灵敏性实验，根据结果计算出四种病毒的最低质量浓度，来评价所研究实验方法的灵敏性优劣。
以PEDV、TGEV、PORV和PDCOV的阳性质粒为模板进行对比稀释，四重RT-PCR方法灵敏度验证结果如图14(M：DL 2000 Marker；-：阴性对照1-12：PEDV、TGEV、PORV和PDCOV混合模板作10-1～10-12稀释PCR扩增结果)所示，多重RT-PCR对PEDV、TGEV、PORV和PDCOV低核酸模板检出量分别为55.0pg、6.2pg、77.2pg和7.6pg。
(4)猪四种腹泻病毒四重RT-PCR方法特异性验证
分别将实验室收集的PCV2、PRV、CSFV、PRRSV的阳性病料提取的基因组DNA和四种病毒阳性质粒混合物以及四种病毒的单个阳性质粒为模板。用已经成功优化好反应体系以及反应程序的多重RT-PCR方法进行扩增，以检测多重RT-PCR的特异性。
使用已经建立的四重RT-PCR对PCV2、PRV、CSFV、PRRSV的阳性病料提取的基因组DNA进行检测，均为阴性，而以四种病毒阳性质粒混合物以及四种病毒的单个阳性质粒为模板，可以有效扩增出对应的目的条带。四重RT-PCR方法特异性验证结果如图15(M：DL 2000Marker；-：阴性对照+：四重PCR阳性对照1：PEDV、2：TGEV、3：PDCOV、4：PORV、5：PRV阳性样本、6：CSFV阳性样本、7：PRRSV阳性样本、8：PCV-2阳性样本)所示：
(5)猪四种腹泻病毒四重RT-PCR方法稳定性验证
为了验证本四重RT-PCR检测方法的稳定性，用已经建立好的方法，分别对不同保存时间的四种病毒的混合阳性样品进行检测。
以PEDV、TGEV、PORV和PDCOV阳性质粒DNA为混合模板用建立的多重PCR方法进行检测，不同时间重复检测5次，结果均一致，说明该方法稳定性良好。四重RT-PCR方法稳定性验证结果如图16(M：DL 2000 Marker；-：阴性对照1-5：PEDV、TGEV、PORV和PDCOV阳性质粒DNA混合模板五个保存时间样本，分别为1d、3d、5d、7d、9d)所示：
实施例4
猪四种腹泻病毒四重RT-PCR方法的临床应用
使用已经建立的猪四种腹泻病毒四重RT-PCR方法对实验室收集的来自安徽不同地市猪共计167份临床腹泻样本进行检测。取0.3g样本剪碎后放入研磨管中，加入10mmol/LPBS(pH＝7.2)700-900μL，使用自动研磨机研磨6-8次后，冻融3次，让组织细胞尽可能的完全破裂，使用高速离心机，12000rpm离心5min，取上清液使用核酸提取试剂盒提取核酸，其余步骤按照之前描述的方法进行。
将本实验室收集的187份临床腹泻样本提取核酸，同时提取病毒阴性组织核酸作为阴性对照，将其反转录得到cDNA，应用已经优化好的猪腹泻病毒四重RT-PCR方法对其进行检测，共计检出PEDV阳性样本17份、TGEV阳性样本10份、PDCoV阳性样本5份、PORV阳性样本4份，其中PEDV\PDCOV混合感染2份、PEDV\PoRV混合感染1份、PEDV\TGEV混合感染5份。四重RT-PCR方法临床应用结果如图17(M：DL 2000 Marker；-：阴性对照；+：阳性对照1-14：临床部分猪腹泻样本检测结果；3：TGEV感染；7：PEDV\PDCoV混合感染；8：PEDV\PoRV混合感染；11：PEDV感染；12：PEDV\TGEV混合感染；13：PoRV感染)所示。
将四重RT-PCR临床检测结果与优化后的四种病毒单一RT-PCR检测结果对比，检测结果一致，吻合率100％。
本发明建立了猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪A群轮状病毒、猪德尔塔冠状病毒的四重RT-PCR检测方法，为进一步研究猪以上四种腹泻病毒流行情况作技术上的有力支持，可作为兽医临床大规模的流行病学调查的技术手段。本方法特异性强，无非特异性扩增，具有可重复性，在灵敏度上略低于单一RT-PCR技术，但应用于临床检测，吻合率与单一RT-PCR一致，具有临床可靠性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 四种猪腹泻病毒的四重RT-PCR检测引物及试剂盒
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
accatactgg gtttaccttt cct 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgtctaact ctgctttctt cac 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctacgatttc ataacagagc g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atattgtccc aaccaccata a 21
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggctactg gctgcgttac 20
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcgtttcctg ggctgatt 18
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaaccagatt agctcgaca 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aagaatcaag tccggcca 18

Claims (4)

1.一组四重RT-PCR检测引物，其特征在于，包括猪流行性腹泻病毒检测引物PEDV F和PEDV R；猪传染性胃肠炎病毒检测引物TGEV F和TGEV R；猪A群轮状病毒检测引物PoRV F和PoRV R；和猪德尔塔冠状病毒检测引物PDCoV F和PDCoV R；
所述PEDV F的序列如SEQ ID NO.1所示；
所述PEDV R的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述TGEV F的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述TGEV R的序列如SEQ ID NO.4所示；
所述PDCoV-F的序列如SEQ ID NO.5所示；
所述PDCoV-R的序列如SEQ ID NO.6所示；
所述PoRVF的序列如SEQ ID NO.7所示；
所述PoRV R的序列如SEQ ID NO.8所示。
2.一种基于权利要求1所述引物的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物、2×Taq PCR MasterMix和水。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，每28.5μL检测体系中含有PEDVF和PEDVR各0.4μL，TGEV F和TGEV R各0.35μL，PDCoV-F和PDCoV-R各0.25μL，PoRV F和PoRV R各0.5μL，2×Taq PCR MasterMix 15μL和水8.5μL。
4.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应程序为：95℃5min；94℃40s，56℃40s，72℃，1min，40个循环；72℃10min；4℃1h。
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