CN111235310A - 猪病毒性腹泻病病原的四重TaqMan荧光定量PCR检测方法 - Google Patents

猪病毒性腹泻病病原的四重TaqMan荧光定量PCR检测方法 Download PDF

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陆佳萱
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Abstract

本发明公开了一种猪病毒性腹泻病病原的四重Taqman荧光定量PCR检测方法（荧光定量聚合酶链式反应，qPCR，又称real‑time PCR）。具体地，针对猪德尔塔冠状病毒、猪凸隆病毒、猪流行性腹泻病毒和猪急性腹泻综合征冠状病毒，设计了四对特异性引物和TaqMan探针，实现了在一个PCR反应管中同时检测四种能够引起猪群腹泻的病毒，且其检测灵敏度达到初始模板浓度为每微升1×102个拷贝（1×102 copies·μL‑1），并具有极佳的特异性和重复性，可以直接应用到临床样品检测中。

Description

猪病毒性腹泻病病原的四重TaqMan荧光定量PCR检测方法
技术领域
本发明属于病原体检测技术领域，尤其涉及一种猪病毒性腹泻病病原的四重TaqMan探针法qPCR检测技术。
背景技术
猪病毒性腹泻是造成我国养猪业经济损失的一个重要原因。造成猪病毒性腹泻的病原种类多样，并时常伴有混合感染，给相关检测、诊断、防治工作带来了很大困扰。为了更好地监测和控制猪病毒性腹泻，对于猪群中包括猪德尔塔冠状病毒(PorcineDeltacoronavirus，PDCoV)、猪凸隆病毒(Porcine Torovirus，PToV)、猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine AcuteDiarrhea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV)在内的多种高致病性、高传染性的猪病毒性腹泻病病原的检测显得十分必要。因此，针对猪病毒性腹泻病病原建立一种简便、快速、高效、经济的检测方法是兽医临床实践中亟需解决的问题。
四重qPCR检测技术可以最多同时检测出四种猪病毒性腹泻病病原，相比于普通PCR具有灵敏度高、精确度好、无需电泳便可直接分析结果等优点，极大地缩短了检测过程中的物料成本和检测人员的时间成本，尤其适用于大规模的样品检测和样品的混合感染检测。但是，由于四重qPCR在一个体系中同时存在多对引物及探针，为了保证其有效进行，各引物对和探针之间就必须要保持高度的特异性以避免出现非特异性的扩增产物和荧光信号，并且还必须要保持相对一致的扩增效率便于对模板量进行测算。另外，模板中更为复杂的核酸环境，不同引物对所要求的不同的退火温度也都是制约多重qPCR检测方法建立的主要因素。qPCR相较于传统PCR具有极高的灵敏度，而且能够允许多个通道同时检测多种不同的病原，使得建立多重qPCR检测方法更有意义。所以，建立一种四重TaqMan探针法qPCR检测方法虽然实现起来颇具难度，但具有很高的临床生产价值。
发明内容
解决的技术问题：为了解决多重PCR技术在应用于猪群的病毒性腹泻疾病诊断中效果不佳等技术问题，本发明提出了一种猪病毒性腹泻病病原的四重TaqMan探针法qPCR检测方法。
技术方案：猪病毒性腹泻病病原的四重Taqman荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：
步骤1，设计四种病毒的特异性qPCR检测引物对序列及TaqMan探针序列：
用于检测猪德尔塔冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus,PDCoV)的引物对序列及TaqMan探针序列：
上游引物PD-Detection(F)：5’-AAAGCTTTCAAGACAATACCT-3’(SEQ ID NO.1)
下游引物PD-Detection(R)：5’-TACGACAAACTCCTGAAAGCA-3’(SEQ ID NO.2)
TaqMan探针PD-Probe：5’-Texas Red-TACGATACGACTGCATTGGCCTAC-BHQ2-3’(SEQID NO.3)
用于检测猪凸隆病毒(Porcine Torovirus,PToV)的引物对序列及TaqMan探针序列：
上游引物PT-Detection(F)：5’-TCATCCACCCAGTTCAAAT-3’(SEQ ID NO.4)
下游引物PT-Detection：5’-TGCACAATTCTCTCTCCAAAT-3’(SEQ ID NO.5)
TaqMan探针PT-Probe：5’-VIC-CCTCAGaTTTCGaAGATAGaACC-BHQ1-3’(a：LNC，锁核酸)(SEQ ID NO.6)
用于检测猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)的引物对序列及TaqMan探针序列：
上游引物PE-Detection(F)：5’-CTCCCTTGAATTTGAGTTCG-3’(SEQ ID NO.7)
下游引物PE-Detection(R)：5’-ACCACCTGTAACCTTGATAC-3’(SEQ ID NO.8)
TaqMan探针PE-Probe：5’-FAM-TTACCAACAGCCTTATTAAGCAC-MGB-3’(SEQ ID NO.9)
用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(Swine Acute Diarrhea SyndromeCoronavirus,SADS-CoV)的引物对序列及TaqMan探针序列：
上游引物SA-Detection(F)：5’-CATTTGCCGTTCTTGACCAT-3’(SEQ ID NO.10)
下游引物SA-Detection(R)：5’-AACCCAGCAATTGTTATCTGAA-3’(SEQ ID NO.11)
TaqMan探针SA-Probe：5’-Cy5-CAAGTGCACGCTTACCATCAACTACT-BHQ3-3’(SEQ IDNO.12)；
步骤2，获取待检样品的cDNA：提取腹泻粪便样品或肠道组织的总RNA，反转录为cDNA模板；
步骤3，使用qPCR引物和TaqMan探针进行检测：以步骤2获得的cDNA作为模板，采用步骤1的qPCR检测引物及TaqMan探针进行qPCR扩增，并收集荧光信号；
步骤4，根据步骤3收集得到的荧光信号及Cq值判断样品中是否有PDCoV、PToV、PEDV、SADS-CoV，当Cq值大于35的结果判断为阴性。
进一步地，步骤2中反转录使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific))进行，其反应总体系为20μL，包括：1μL Random Hexamer Primer、1μL Oligo(dT)18Primer、5μL nuclease-free Water、5μL总RNA，混匀后65℃孵育5min，冰浴3min，继续加入：4μL 5×Reaction Buffer、2μL 10×dNTP预混液、1μL RevertAid M-MuLV Reverse transcriptase(RT)和1μL RiboLock RNaseInhibitor(RI)。
进一步地，步骤2中反转录的反应程序为：25℃5min，42℃60min，70℃5min，反应后得到cDNA模板。
进一步地，步骤3中PCR扩增的反应体系为：10μL 2×AceQ qPCR Probe MasterMix(南京诺唯赞生物科技有限公司)，初始浓度为10μM的PD-Detection(F)、PD-Detection(R)、PT-Detection(F)、PT-Detection(R)、PE-Detection(F)、PE-Detection(R)、SA-Detection(F)、SA-Detection(R)引物各0.6μL，初始浓度为10μM的PD-Probe、PT-Probe、PE-Probe、SA-Probe探针各0.1μL，cDNA模板与ddH2O体积和为4.8μL，体系总体积为20μL。
进一步地，步骤3中所述PCR扩增的反应程序为：荧光通道设置为温控程序设置为：95℃预变性500s，40个循环，其中：95℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸20s；qPCR仪器荧光通道设置为：通道1：FAM，通道2：VIC，通道3：Texas Red，通道4：Cy5。同时以qPCR仪器收集荧光信号。
有益效果：
与现有技术相比，本发明的猪病毒性腹泻病病原四重qPCR检测方法具有以下技术效果：
1、最多能够在一个PCR反应管中同时检测出多种猪病毒性腹泻病病毒，为猪病毒性腹泻病病原的检测提供了一种简便、高效和低成本的方法；
2、本发明利用建立的四重TaqMan探针法qPCR检测方法对各靶标病毒阳性样品进行检测，检测结果与单一的qPCR检测结果一致，进一步证明了本发明方法的可行性。同时经过验证得知，本发明对每一种病原的检测灵敏度能够达到初始模板浓度为每微升1×102个拷贝(copies·μL-1)，同时具有极佳的特异性和重复性；
3、本发明中检测方法的建立，为该类病的防控了提供可靠依据，从而很大程度上降低了单重qPCR检测的工作量，工作效率得到了大幅度地提升；
4、本发明中建立的检测方法重复性，灵敏性较高，可直接用于临床检测，通过对四种腹泻病毒的快速高效检测，从而同时对多种猪病毒性腹泻病病原进行诊断和监控。
附图说明
图1A为实施例1中四重Taqman qPCR检测方法的标准品荧光检测结果。
图1B为实施例1中四重Taqman qPCR检测方法的标准曲线。
图2为实施例1中四重Taqman qPCR检测方法检测单种病原的灵敏性试验结果。
图3为实施例1中四重Taqman qPCR检测方法最适合反应体系探索试验结果。
图4为实施例1中四种病原共感染的模拟试验结果。
图5为实施例1中任意三种病原共感染模拟试验结果。
图6为实施例1中任意两种病原共感染模拟试验结果。
图7为实施例1中特异性试验的结果。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步的具体说明，但是本发明并不限于这些实施例。
实施例1
检测方法的构建及验证
实验过程：
1、标准曲线的建立
本试验的所有引物和探针均由本团队使用引物设计软件Olido 7(版本7.60)所设计，并委托上海生工生物工程有限公司合成。
本试验中使用的标准品均源于本试验设计的引物通过高保真PCR酶Phanta MaxSuper-Fidelity DNA Polymerase(南京诺唯赞生物科技有限公司)扩增所产生的目的片段连接至pMD18-T载体(宝生物工程(大连)有限公司)所构成的重组质粒。该操作包括：
分别将本试验设计的引物对组合PE-Detection(F/R)、PT-Detection(F/R)、PD-Detection(F/R)和SA-Detection(F/R)，与高保真酶Phanta Max Super-Fidelity DNAPolymerase(南京诺唯赞生物科技有限公司)添加到同一反应体系，进行普通PCR扩增，实验在Eppendorf PCR仪(艾本德中国有限公司)中进行，实验程序设置和反应体系参照PhantaMax Super-Fidelity DNA Polymerase试剂说明书。经过高保真PCR扩增之后获得四种PCR产物。
将以上获得的四种PCR产物分别连接到pMD18-T载体上，连接反应的具体操作参照该试剂说明书，将连接产物送往测序公司(通用生物系统(安徽)有限公司)以验证正确连接。最终得到四种正确连接的重组质粒，即为用于评价该检测方法的四种质粒标准品。
分别将四种质粒标准品用ddH2O进行梯度稀释，获得浓度跨度从1×107copies·μL-1到1×101copies·μL-1七个浓度的每种病原的重组质粒标准品。
采用单重qPCR反应体系对每种病原的各个浓度的质粒标准品进行荧光定量反应，反应在Roche
Figure BDA0002388160420000041
96仪器(罗氏诊断产品(上海)有限公司)中进行。该反应的程序设置为：预变性95℃，600s；40个循环，每个循环设置95℃变性10s,55℃退火10s,以及72℃延伸20s.在每个循环结束时收集荧光信号。Cq值超过35即被视为阴性结果。
该反应所使用的qPCR探针酶为AceQ qPCR Probe Master Mix(南京诺唯赞生物科技有限公司)，反应体系为：10μL的qPCR SuperMix；0.4μL的上、下游引物(初始浓度：10μM)；0.2μL的探针(初始浓度：10μM)；2μL的DNA模板；7μL的无酶水(参照诺唯赞AceQ qPCR ProbeMaster Mix说明书)。
如图1所示，图1A分别为PEDV、PDCoV、PToV、SADS-CoV每种质粒标准品由1×107copies·μL-1至1×101copies·μL-1七个浓度的荧光扩增曲线，图1B分别为PEDV、PDCoV、PToV、SADS-CoV的标准品稀释的标准曲线。从图1A和图1B可知，用于测试该检测方法的质粒标准品已经成功建立，从而说明该项检测方法数据的可靠性。
2、最适合反应体系探索
将四种qPCR引物PE-Detection(F/R)、PT-Detection(F/R)、PD-Detection(F/R)和SA-Detection(F/R)，与四种探针PE-Probe、PT-Probe、PD-Probe和SA-Probe，加入到同一反应体系中。设置不同的探针终浓度和引物终浓度，以探索该多重反应最佳的反应条件。
该试验的反应程序以及反应所使用的探针酶如同实施例1中1所述。
表1四重Taqman qPCR检测方法最适合反应体系探索试验结果
Figure BDA0002388160420000051
上表中，图A-D分别代表当不同引物组成和不同探针组成的多重体系同时检测PEDV、PDCoV、PToV、SADS-CoV的浓度为1×103copies·μL-1的标准品质粒的Cq值结果图。
表2四重Taqman qPCR检测方法最适合反应体系探索试验结果图
Figure BDA0002388160420000061
由图3和表1、表2说明可知，用不同组合的探针和引物浓度进行最佳反应体系摸索试验，发现当探针终浓度为200nM，引物终浓度为2400nM时该多重qPCR反应中Cy5的荧光强度最高，且Cq值也相对最低(因为该多重检测方法中Cy5荧光本身就比较弱，要考虑照顾Cy5荧光，所以选择Cy5荧光强度最大的引物探针组合作为最佳组合)。
3、灵敏性试验
用以上所探究的最佳反应体系(表2)来分别检测PEDV、PDCoV、PToV、SADS-CoV的由1×107copies·μL-1至1×101copies·μL-1七个浓度的质粒标准品，从而探究该检测方法额灵敏性。为了确认该灵敏性的可靠程度，将该检测方法的灵敏度所对应的浓度，与其相邻的10倍浓度以及0.1倍浓度的质粒标准品同时设置23个重复，用优化的多重检测体系进行多重检测试验。最后根据试验结果符合95％检出率的最小浓度作为该检测方法的灵敏度。
该试验的反应程序以及反应所使用的探针酶如同实施例1中1所述。
表3A四重Taqman qPCR检测方法检测单种病原的灵敏性试验结果一
Figure BDA0002388160420000062
NC：阴性对照
表3B四重Taqman qPCR检测方法检测单种病原的灵敏性试验结果二
Figure BDA0002388160420000071
表3A中是PEDV、PDCoV、PToV、SADS-CoV每种质粒标准品由最高浓度1×107copies·μL-110倍梯度检测的结果Cq值，NC为阴性对照。表3B是该四重Taqman qPCR检测方法大量重复检测单种病原的低浓度标准品(1×103copies·μL-1，1×102copies·μL-1和1×101copies·μL-1)的结果，并将其阳性检出率参照95％阳性检出率进行对比。
图2中A-D分别为PEDV、PDCoV、PToV、SADS-CoV每种质粒标准品由最高浓度1×107copies·μL-110倍梯度检测的结果图。由图2和表1可知，本发明的多重qPCR检测方法在检测单种病原时，灵敏度稳定在1×102copies·μL-1浓度。
4、共感染检测模拟
共感染的模拟试验包括四重共感染模拟试验、三重共感染模拟试验、二重共感染模拟试验。四重共感染模拟试验是用表2优化的多重检测体系检测PEDV、PDCoV、PToV、SADS-CoV的混合标准质粒，浓度包括1×107copies·μL-1至1×102copies·μL-1。三重共感染模拟试验是用表2优化的多重检测体系检测PDCoV+PToV+SADS-CoV，PEDV+PToV+SADS-CoV，PEDV+PDCoV+SADS-CoV，PEDV+PDCoV+PToV四种共感染组合，浓度包括1×103copies·μL-1和1×102copies·μL-1。二重共感染模拟试验是用表2优化的多重检测体系检测PDCoV+SADS-CoV，PDCoV+PToV，PEDV+SADS-CoV，PEDV+PDCoV，PEDV+PToV，PToV+SADS-CoV六种共感染组合，浓度包括1×103copies·μL-1和1×102copies·μL-1。
该试验的反应程序以及反应所使用的探针酶如同实施例1中1所述。
如图4所示，A-F分别为标准品质粒从1×107copies·μL-1、1×106copies·μL-1、1×105copies·μL-1、1×104copies·μL-1、1×103copies·μL-1、1×102copies·μL-1共六个浓度的四重共感染模拟结果图。
图5任意三种病原共感染模拟试验结果图图A-D分别为1×103copies·μL-1浓度的PDCoV+PToV+SADS-CoV，PEDV+PToV+SADS-CoV，PEDV+PDCoV+SADS-CoV，PEDV+PDCoV+PToV，四种共感染组合的检测情况。图E-H分别为1×102copiesμL-1浓度的PDCoV+PToV+SADS-CoV，PEDV+PToV+SADS-CoV，PEDV+PDCoV+SADS-CoV，PEDV+PDCoV+PToV，四种共感染组合的检测情况。
图6任意两种病原共感染模拟试验结果图图A-F分别为1×103copies·μL-1浓度的PDCoV+SADS-CoV，PDCoV+PToV，PEDV+SADS-CoV，PEDV+PDCoV，PEDV+PToV，PToV+SADS-CoV六种共感染组合的检测情况。图G-L分别为1×102copies·μL-1浓度的PDCoV+SADS-CoV，PDCoV+PToV，PEDV+SADS-CoV，PEDV+PDCoV，PEDV+PToV，PToV+SADS-CoV六种共感染组合的检测情况。
图4、5、6说明：用该种多重检测方法分别检测最低浓度下的二重感染、三重感染、四重感染，结果均正常，说明该方法完全可以用于共感染检测当中。
5、特异性试验
采用本发明的四重Taqman qPCR检测方法分别检测PEDV、PDCoV、PToV、SADS-CoV、TGEV、PKV、PTV、CSFV、PSV、PoRV的阳性临床样品。该阳性样品均为本实验室保存，该试验反应体系为表2最佳反应体系，该试验的反应程序以及反应所使用的探针酶如同实施例1中1所述。
表4特异性试验结果
Figure BDA0002388160420000091
由图7和上表可知，采用本发明的检测方法同时检测多种猪病毒性腹泻病的病原，发现只有目标病原被正常检出(目标样品PEDV、PDCoV、PToV、SADS-CoV被检测出阳性。)，其他腹泻病原均不能被检出，说明该种检测方法具有很好的特异性。
6、稳定性试验
采用本发明的四重Taqman qPCR检测方法同时检测PEDV、PDCoV、PToV、SADS-CoV，标准品质粒的浓度从1×107copies·μL-1到1×102copies·μL-1。不同时间(相邻两组的实验时间间隔为1周)进行三组实验(组1、组2和组3)，每组实验三个重复(重复1、重复2和重复3)。然后分别计算其组内和组间的CV％值，根据CV％值来分析该检测方法的重复性。
该试验的反应程序以及反应所使用的探针酶如同实施例1中1所述。
表5分别用该四重Taqman qPCR检测方法同时检测PEDV、PDCoV、PToV、SADS-CoV
Figure BDA0002388160420000101
通过比较该多重检测方法检测单种病原的组内和组间重复来分析该种检测方法的稳定性，由表5可知，各个浓度梯度的变异系数(CV值)多数小于1％，少数几个位于1％-5％，说明该种检测方法具有极好的稳定性。
以上实例仅为本发明的优选方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明原理所做的改变、修饰都应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 猪病毒性腹泻病病原的四重TaqMan荧光定量PCR检测方法
<130> 20200220
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaagctttca agacaatacc t 21
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<211> 21
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcatccaccc agttcaaat 19
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<211> 21
<212> DNA
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<400> 5
tgcacaattc tctctccaaa t 21
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<211> 20
<212> DNA
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<211> 20
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<212> DNA
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catttgccgt tcttgaccat 20
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<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caagtgcacg cttaccatca actact 26

Claims (5)

1.猪病毒性腹泻病病原的四重Taqman荧光定量PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，设计四种病毒的特异性qPCR检测引物对序列及TaqMan探针序列：
用于检测猪德尔塔冠状病毒的引物对序列及TaqMan探针序列：
上游引物PD - Detection (F)：5’-AAAGCTTTCAAGACAATACCT-3’，
下游引物PD - Detection (R)：5’-TACGACAAACTCCTGAAAGCA-3’，
TaqMan探针PD - Probe：5’-Texas Red-TACGATACGACTGCATTGGCCTAC-BHQ2-3’；
用于检测猪凸隆病毒的引物对序列及TaqMan探针序列：
上游引物PT - Detection (F)：5’-TCATCCACCCAGTTCAAAT-3’，
下游引物PT - Detection：5’-TGCACAATTCTCTCTCCAAAT-3’，
TaqMan探针PT - Probe：5’-VIC- CCTCAGaTTTCGaAGATAGaACC -BHQ1-3’（a：LNC，锁核酸）；
用于检测猪流行性腹泻病毒的引物对序列及TaqMan探针序列：
上游引物PE - Detection (F)：5’-CTCCCTTGAATTTGAGTTCG-3’，
下游引物PE - Detection (R)：5’-ACCACCTGTAACCTTGATAC-3’，
TaqMan探针PE - Probe：5’-FAM-TTACCAACAGCCTTATTAAGCAC-MGB-3’；
用于检测猪急性腹泻综合征冠状病毒的引物对序列及TaqMan探针序列：
上游引物SA - Detection (F)：5’-CATTTGCCGTTCTTGACCAT-3’，
下游引物SA - Detection (R)：5’-AACCCAGCAATTGTTATCTGAA-3’，
TaqMan探针SA - Probe：5’-Cy5-CAAGTGCACGCTTACCATCAACTACT-BHQ3-3’；
步骤2，获取待检样品的cDNA：提取腹泻粪便样品或肠道组织的总RNA，反转录为cDNA模板；
步骤3，使用qPCR引物和TaqMan探针进行检测：以步骤2获得的cDNA作为模板，采用步骤1的qPCR检测引物及TaqMan探针进行PCR扩增，并收集荧光信号；
步骤4，根据步骤3收集得到的荧光信号及Cq值判断样品中是否有PDCoV、PToV、PEDV、SADS-CoV，当Cq值大于35的结果判断为阴性。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中反转录使用Revert Aid FirstStrand cDNA Synthesis Kit进行，其反应总体系为20 µL，包括：1 µL Random HexamerPrimer、1 µL Oligo(dT)18 Primer、5 µL nuclease-free Water、5 µL总RNA，混匀后65 ℃孵育5 min，冰浴3 min，继续加入：4 μL 5× Reaction Buffer、2 µL 10× dNTP预混液、1µL RevertAid M-MuLV Reverse transcriptase (RT)和1 µL RiboLock RNase Inhibitor(RI)。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2中反转录的反应程序为：25 ℃ 5min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，反应后得到cDNA模板。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中PCR扩增的反应体系为：10µL 2×AceQ qPCR Probe Master Mix，初始浓度为10 µM的PD - Detection (F)、PD - Detection(R)、PT - Detection (F)、PT - Detection (R)、PE - Detection (F)、PE - Detection(R)、SA - Detection (F)、SA - Detection (R)引物各0.6 µL，初始浓度为10 µM的PD -Probe、PT - Probe、PE - Probe、SA - Probe探针各0.1 µL，cDNA模板与ddH2O体积和为4.8μL，体系总体积为20 μL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中所述PCR扩增的反应程序为：温控程序设置为：95 ℃预变性500 s，40个循环，其中：95 ℃变性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s；qPCR仪器荧光通道设置为：通道1：FAM，通道2：VIC，通道3：Texas Red，通道4：Cy5；同时以qPCR仪器收集荧光信号。
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