CN111763766B - 一步法检测犬腹泻病毒的引物对、TaqMan探针及方法与应用 - Google Patents

一步法检测犬腹泻病毒的引物对、TaqMan探针及方法与应用 Download PDF

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Abstract

本申请公开一步法检测犬腹泻病毒的引物对、TaqMan探针及方法与应用，从引物探针的特异性、反应体系的关键因子、质控构建等多个方面对多重荧光PCR进行了探索研究，以待检样品的核酸或反转录产物扩增检测片段并连接pMD18‑T载体，成功构建质粒作为模板，建立了犬细小病毒，犬冠状病毒，犬星状病毒，犬库布病毒多重实时荧光定量PCR方法，该专利允许在一个反应管中最多同时检测出4种能够导致犬腹泻的病毒，其检测灵敏度达到1×102个拷贝明显提高了四种犬腹泻病毒检测的灵敏性和特异性，而且有效的缩短了其检测周期，具有重要意义。

Description

一步法检测犬腹泻病毒的引物对、TaqMan探针及方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一步法检测犬腹泻病毒的引物对、TaqMan探针及方法与应用。
背景技术
犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)、犬冠状病毒(Canine Coronavirus,CCoV)、犬星状病毒(Canine Astrovirus,CAstV)和犬库布病毒(Canine Kobuviruses,CaKoV)在我国宠物乃至全球宠物犬中引起的发病率和死亡率居高不下，是主要的几种犬腹泻病毒病，常常会造成较严重的经济和养主精神损失。尤其是CPV可造成幼犬70％的死亡率，并引起犬出血性肠炎；CCV主要引起肠胃炎；而CAstV临床表现形式及其流行规律，目前尚未清楚，主要与CPV伴发感染；CaKoV被认为与犬病毒性腹泻存在一定相关，该病毒第一次在美国从患急性胃肠炎的犬中检测出。这四种传染病的临床特征及病理变化都十分相似，临床上很难辨别，且多有共感染情况。但使用常规的病原学检测方法，不但耗时长，而且过程繁琐，目前还没有对CPV、CCoV、CAstV和CaKoV同时进行快速鉴别检测的方法。所以建立一种便捷、快速、准确的犬病毒性腹泻类疾病的检测方法用于临床诊断就显得极为必要。
荧光定量PCR技术作为一种高灵敏性、简便快速的检测方法已经在许多领域得到广泛应用。
发明内容
针对现有技术中存在的多个问题进行解释，本发明提供了一种对CPV、CCoV、CAstV和CaKoV进行定性、定量检测的一步法检测犬腹泻病毒的引物对、TaqMan探针及方法与应用。它可以实现在一个反应体系中同时检测上述四种犬腹泻病毒病，满足了快捷、准确的检测需求，检测效果结果准确率高。
为了解决这一问题，本发明通过以下技术方案实现：
一步法检测犬腹泻病毒的引物对，所述犬腹泻病毒为犬细小病毒、犬冠状病毒、犬库布病毒或犬星状病毒；
当犬腹泻病毒为犬细小病毒时，引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3
SEQ ID NO：1，即5’-TTCGGTAAACTTAACACCAAC-3’，
SEQ ID NO：2，即5’-CTGTATGTTAATATAGTCACCCA-3’；
SEQ ID NO：3，即5’6-FAM-CTGCAATTTCTCTGAGCTTA-3’MGB；
当犬腹泻病毒为犬冠状病毒时，引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：4和SEQ IDNO：5，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6
SEQ ID NO：4，即5’-CAGTCTAGAAATAGATCTCAATC-3’，
SEQ ID NO：5，即5’-GCTTGTTCTACACTGTCA-3’；
SEQ ID NO：6，即5’HEX-CCTTCTTGTTATTGGATTGTTGCCTTC-3’BHQ1；
当犬腹泻病毒为犬库布病毒时，引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9；
SEQ ID NO：7，即5’-CCGGATTATGTCTACTCCA-3’，
SEQ ID NO：8，即5’-CAACGATCCTGGTGAGTC-3’；
SEQ ID NO：9，即5’Texas Red-TCCTGAAAGATGAACTCCGCCC-3’BHQ2；
当犬腹泻病毒为犬星状病毒时，引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：12；
SEQ ID NO：10，即5’-CAGAGCAATGGTCAATGA-3’。
SEQ ID NO：11，即5’-CTCACTTAGTGTAGGGAGA-3’；
SEQ ID NO：12，即5’CY5-CGCTCAGCCTGGTCCTCTGG-3’BHQ2。
基于上述引物对和探针对犬腹泻病毒的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，使用天隆科技试剂盒抽提病料中所含的RNA和DNA混合模板，并进行反转录，其反应总体系为20μL，包括：1μL Random Hexamer Primer,1μL Oligo(dT)18Primer,5μL nuclease-free Water,5μL混合模板，混匀后65℃孵育5min，冰浴2min，继续加入：4μL 5×Reaction Buffer、2μL 10×dNTP预混液、1μL RevertAid M-MuLV Reversetranscriptase(RT)和1μL RiboLock RNase Inhibitor(RI)，搅拌均匀后，在普通PCR反应体系中进行反应，反应结束获得DNA和cDNA混合模板；
步骤2，利用引物对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，SEQID NO：7和SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11进行PCR扩增，获得扩增模板，构建各自对应的阳性标准品；
步骤3，将上所述CPV、CCoV、CAstV和CaKoV置于反应体系中使用等浓度混合包装的标准品，按照10倍梯度将混合液中各标准品浓度稀释至1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μL；以不同浓度的标准品混合液作为模板，通过多重荧光定量PCR进行检测，检测结束后，以各标准品的浓度Log值作为X轴对其相应Ct值作为Y轴进行作图，绘制标准曲线。
作为改进的是，步骤1中所述的普通PCR反应条件为25℃5min，42℃60min,70℃5min。
作为改进的是，步骤2中所用的PCR反应体系为20μl，包括：10μl 2×qPCR ProbeMaster Mix，CPV、CCoV、CAstV和CaKoV对应的引物均为0.4μL，Taqman探针均为0.1μL，ddH2O0.4μL，混合模板6μL。
作为改进的是，步骤3中多重实时荧光定量PCR检测条件为：先95℃预变性5min；然后95℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸30s(40个循环)分别选取荧光定量PCR的通道1：FAM，通道2：HEX，通道3：Texas Red和通道4：Cy5。
上述引物对和TaqMan探针在制备检测试剂盒上的应用。
有益效果：
与现有技术，本发明中将四种犬腹泻病毒病通过一次多重荧光定量PCR的检测，可以同时检测到四种犬病毒性腹泻病病原，相对于单重荧光定量PCR极大的缩短了检测时间和消耗的成本，尤其适用于大批量病料检测的流行病情况分析。其中需要注意的是四重荧光具有4对引物，要保证引物之间没有相互干扰，使各个片段间有相似的扩增效率。所以建立该多重TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法虽然为较困难，但其对临床检测具有重要意义。具体如下：
(1)建立了同时在一个反应管内对CPV、CCoV、CAstV和CaKoV四种犬腹泻病毒病病原的多重实时荧光定量PCR检测方法，包括检测DNA以及RNA病毒，并且明显提高了四种犬腹泻病毒病检测的灵敏性、稳定性和特异性，大大缩短了其检测周期；
(2)本发明利用建立的四重荧光定量检测方法对犬腹泻相关病料进行检测，检测结果与RT-PCR检测结果基本一致，进一步证明了本发明方法的可行性，可以用于流行病的临床上高效准确的检测。同时经过验证得知，本发明对每一种病原的检测灵敏度能够达到1×102个拷贝(copies/μL)，且在多次重复以及与其他相关病毒进行特异性试验后发现该方法具有极佳的特异性和重复性；
(3)确定优化了该多重荧光的引物和探针，构建了检测方法的基本体系和流程。
附图说明
图1为本发明犬病毒性腹泻病病原的四重TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测方法检测标准品扩增曲线及其对应的标准曲线和方程，(A)CPV,(B)CCoV,(C)CaKoV和(D)CAstV；
图2为本发明CPV、CCoV、CAstV和CaKoV进行四重TaqMan探针法实时荧光定量PCR检测方法的特异性试验结果图。
具体实施方式
实施例1
第一步，分析CPV、CCoV、CAstV和CaKoV全基因组序列，设计引物和荧光探针，针对每种病原体根据保守区域，保证不干扰情况下各设计了一组引物对和探针，探针分别标记不同的荧光，其中
用于检测犬细小病毒(Canine Parvovirus,CPV)的引物对序列及TaqMan探针序列为：
上游引物CPV-QF的引物序列SEQ ID NO：1，即为5’-TTCGGTAAACTTAACACCAAC-3’，
下游引物CPV-QR的引物序列SEQ ID NO：2，即为5’-CTGTATGTTAATATAGTCACCCA-3’，
Taqman探针CPV-probe的序列SEQ ID NO：3，即为5’6-FAM-CTGCAATTTCTCTGAGCTTA-3’MGB；
用于检测犬冠状病毒(Canine Coronavirus,CCoV)的引物对序列及TaqMan探针序列为：
上游引物CCV-QF的引物序列SEQ ID NO：4，即为5’-CAGTCTAGAAATAGATCTCAATC-3’，
下游引物CCV-QR的引物序列SEQ ID NO：5，即为5’-GCTTGTTCTACACTGTCA-3’，
Taqman探针CCV-probe的序列SEQ ID NO：6，即为5’HEX-CCTTCTTGTTATTGGATTGTTGCCTTC-3’BHQ1；
用于检测犬库布病毒(Canine Kobuviruses,CaKoV)的引物对序列及TaqMan探针序列为：
上游引物CaKoV-QF的引物序列SEQ ID NO：7，即为5’-CCGGATTATGTCTACTCCA-3’，
下游引物CaKoV-QR的引物序列SEQ ID NO：8，即为5’-CAACGATCCTGGTGAGTC-3’，
Taqman探针CaKoV-probe的序列SEQ ID NO：9，即为5’Texas Red-TCCTGAAAGATGAACTCCGCCC-3’BHQ2；
用于检测犬星状病毒(Canine Astrovirus,CAstV)的引物对序列及TaqMan探针序列为：
上游引物CAstV-QF的引物序列SEQ ID NO：10，即为5’-CAGAGCAATGGTCAATGA-3’，
下游引物CAstV-QR的引物序列SEQ ID NO：11，即为5’-CTCACTTAGTGTAGGGAGA-3’，
Taqman探针CAstV-probe的序列SEQ ID NO：12，即为5’CY5-CGCTCAGCCTGGTCCTCTGG-3’BHQ2。
基于上述引物对和探针对犬腹泻病毒的检测方法，包括以下步骤：
(1)提取DNA，RNA，以上样品反转录提取cDNA，
具体步骤如下：粪便拭子，加入磷酸盐缓冲液或者DMEM高糖培养基冲洗，使用天隆科技核酸提取仪提取DNA和RNA，将以上混合样品进行反转录，反转录使用Revert AidFirst Strand cDNA Synthesis Kit进行，其反应总体系为20μl，包括：1μl RandomHexamer Primer,1μl Oligo(dT)18Primer,5μl nuclease-free Water,5μl混合模板，混匀后65℃孵育5min，冰浴3min，继续加入：4μl 5×Reaction Buffer、2μl 10×dNTP预混液、1μl RevertAid M-MuLV Reverse transcriptase(RT)和1μl RiboLock RNase Inhibitor(RI)；反转录时反应程序为：25℃5min，42℃60min，70℃5min，反应后得到cDNA模板；
(2)设计引物和荧光探针，引物和荧光探针的设计原则为：先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针。所选序列应该高度特异，尽量选择具有最小二级结构的扩增片段，扩增长度理想不高于150bp，保证GC含量在20％到80％之间，将引物和探针互相进行配对检测，以避免二聚体和发夹结构的形成。遵循上述设计原则，分析基因的序列，针对每种病原体均设计了引物和探针，探针分别标记不同染料。设计的引物探针分别为：
表1引物探针序列
Figure BDA0002450130450000061
Figure BDA0002450130450000071
(3)反应总体系为20μl
表2荧光定量PCR检测体系
Figure BDA0002450130450000072
如图2所示，为本申请犬病毒性腹泻病病原的四重荧光定量PCR检测方法检测靶标病和非靶标病毒的特异性试验的结果图。其中包括犬病毒DNA或cDNA模板分别为犬细环病毒(TTCV)，犬流感病毒(H3N2 CIV)，犬瘟热病毒(CDV)，以及本发明中的CPV、CCoV、CAstV和CaKoV，由此可见，本实验有一个较好的特异性，对靶标病料可检测出，非靶标病料无法检测出。
临床检测
选取82份临床病料(犬粪便或肛拭子)，并对其进行提取DNA，RNA，以上样品反转录提取cDNA的方法后，分别使用普通PCR和本发明的多重荧光定量PCR方法分别进行检测。
表3多重实时荧光定量PCR检测和普通PCR检测的结果对比表
Figure BDA0002450130450000081
结果如表3，可清晰的看出本发明较普通PCR的检测方法相比能获得更高的阳性率，由此可见，本发明直接在临床检测上应用，并且其检测的效率更高，且能有效排除实验中出现的假阳性情况。
实施例2CPV、CCoV、CAstV和CaKoV的多重实时荧光定量PCR检测
基于实施例1的引物对和探针，我们进行如下验证操作。
步骤1，收集腹泻犬只的肛拭子或者粪便，进行病料的预处理，利用实验室已有设备提取腹泻粪便样品或肠道组织的总RNA和DNA，反转录为cDNA模板，最终获得的模板为DNA和RNA混合物，由于CPV为DNA病毒，其余三种为RNA病毒，所以检测模板需要为DNA和cDNA混合物；
步骤2，利用第一步所设计的引物对，通过普通PCR的方法扩增目的基因并且连接pMD18-T载体，构建靶标重组质粒。
步骤3，根据本发明所用的qpcr方法和荧光采集通路验证该方法的可行性，本发明Cq值大于35判断其为阴性。
一.制备标准品：提取cDNA后构建重组质粒
具体步骤如下：粪便拭子，加入磷酸盐缓冲液或者DMEM高糖培养基冲洗，使用天隆科技核酸提取仪提取DNA和RNA，将以上混合样品进行反转录，反转录使用Revert AidFirst Strand cDNA Synthesis Kit进行，其反应总体系为20μl，包括：1μl RandomHexamer Primer,1μl Oligo(dT)18Primer,5μl nuclease-free Water,5μl总RNA，混匀后65℃孵育5min，冰浴3min，继续加入：4μl 5×Reaction Buffer、2μl 10×dNTP预混液、1μlRevertAid M-MuLV Reverse transcriptase(RT)和1μl RiboLock RNase Inhibitor(RI)；反转录时反应程序为：25℃5min，42℃60min，70℃5min，反应后得到cDNA模板。
扩增引物范围内的片段全长，连接pMD18T，分别构建四种荧光定量引物对对应的片段，并以10倍比梯度稀释，各标准品浓度稀释至1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μl，以不同浓度的标准品混合液作为模板验证荧光的可行性。
二.建立CPV、CCoV、CAstV和CaKoV的多重实时荧光定量PCR检测的标准曲线
1.荧光PCR检测体系反应体系为20μl，包括：10μl 2×qPCR Probe Master Mix，CPV-F、CPV-R、CCV-F、CCV-R、CAstV-F、CAstV-R、CaKoV-F、CaKoV-R各0.4μl，Taqman探针各0.1μl，ddH2O 0.4μl，混合模板6μl。所述步骤中的多重实时荧光定量PCR检测条件为：先95℃预变性5min；然后95℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸30s(40个循环)。
2.建立实时荧光定量PCR标准曲线：如图1所示，为本申请中犬病毒性腹泻病病原的四重荧光定量PCR检测方法的标准曲线的制备，从左至右分别为1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101copies/μl拷贝数验证，检测结束后，以各标准品的浓度的Log值作为X轴，以循环数(Ct值)作为Y轴作图，绘制标准曲线，标准曲线如图1所示，其中CPV、CCV、CaKoV、CAstV的相关系数均为R2＝1.00，因此误差较小，绘制得到的标准曲线可用于对本发明进行多重实时荧光定量PCR检测，由标准曲线得到的线性方程分别为：Y＝-3.1611*X±38.90(CPV)；Y＝-3.2261*X±38.26(CCV)；Y＝-3.3264*X±37.08(CaKoV)；Y＝-3.40540*X±38.43(CAstV)。
三.敏感性分析
如表4所示，利用本发明的引物对和探针组合对CPV、CCoV、CAstV和CaKoV进行多重实时荧光定量PCR检测的灵敏性。本发明对CPV、CCoV、CAstV和CaKoV进行多重实时荧光定量PCR的检测方法可以检测至1×102copies/μl。
表4多重实时荧光定量PCR检测方法的敏感性结果
Figure BDA0002450130450000101
Figure BDA0002450130450000111
四.重复性分析
利用上述实施例2获得的各标准品，重组质粒浓度均为1×107、1×106、1×104、1×103copies/μl的10倍梯度标准品混合液，每个梯度分别在组内和组间各重复三次，以不同浓度的标准品混合液作为模板。
表5多重实时荧光定量PCR检测方法的重复性结果
Figure BDA0002450130450000112
Figure BDA0002450130450000121
检测结果如表5所示，CPV、CCoV、CAstV和CaKoV结果可知每个浓度梯度的循环数无明显差距，循环数变异系数最高为2.22％，可见本发明对CPV、CCoV、CAstV和CaKoV进行多重实时荧光定量PCR检测方法的重复性较好。
上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一步法检测犬腹泻病毒的引物对、TaqMan探针及方法与应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 21
<212> DNA
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<212> DNA
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tcctgaaaga tgaactccgc cc 22
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cgctcagcct ggtcctctgg 20

Claims (6)

1.一种多重荧光定量PCR检测犬腹泻病毒的引物对和TaqMan探针组合，其特征在于，所述犬腹泻病毒为犬细小病毒、犬冠状病毒、犬库布病毒和犬星状病毒；检测犬细小病毒的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：3；检测犬冠状病毒的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6；检测犬库布病毒的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：9；检测犬星状病毒的引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11，TaqMan探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：12。
2.基于权利要求1所述的引物对和TaqMan探针组合对犬腹泻病毒检测的方法，所述方法为非疾病诊断治疗目的，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，抽提病料中所含的RNA和DNA混合模板，并进行反转录，反应结束后获得DNA和cDNA混合模板；步骤2，利用权利要求1所述的引物对和TaqMan探针组合进行多重荧光定量PCR反应；步骤3，进行结果判定。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1中反转录反应条件为25℃5min，42℃60min,70℃5min。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2中PCR反应体系为20μl，包括：10μl 2×qPCR Probe Master Mix，引物均为0.4μL，Taqman探针均为0.1μL，ddH2O 0.4μL，混合模板6μL。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2中PCR反应条件为：先95℃预变性5min；然后95℃变性10s，56℃退火10s，72℃延伸30s，总共进行40个循环。
6.基于权利要求1所述的引物对和TaqMan探针组合在制备多重荧光定量PCR检测犬腹泻病毒试剂盒中的应用，其特征在于，所述犬腹泻病毒为犬细小病毒、犬冠状病毒、犬库布病毒或犬星状病毒。
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