KR102516022B1 - 아프리카돼지열병 및 돼지열병 동시감별 실시간유전자 진단법 - Google Patents

아프리카돼지열병 및 돼지열병 동시감별 실시간유전자 진단법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스의 감별진단용 키트 및 감별진단 방법에 관한 것이다.
본 발명의 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스의 감별진단용 키트 및 감별진단 방법을 이용하는 경우, 한번의 PCR 반응으로 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스를 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있다.

Description

아프리카돼지열병 및 돼지열병 동시감별 실시간유전자 진단법 {Detection and Differentiation of African Swine Fever Virus and Classical Swine Fever Virus by One Step Duplex Reverse Transcriptase Quantitative PCR Assay}
본 발명은 아프리카돼지열병(African Swine Fever; ASF)과 돼지열병(Classical Swine Fever; CSF)을 동시에 감별진단 할 수 있는 진단키트 및 진단방법에 관한 것이다.
아프리카돼지열병은 아프리카지역에서 주로 발생하다가 2007년 조지아 유입 후 러시아, 폴란드 등 동유럽국가로 확산되었다. 2018년 8월 아시아지역에서는 중국에서 최초 발생하여 베트남, 미얀마 등 확산되어 2019년 9월 국내 양돈장에서 처음 발생하였다. 이 질병은 사육돼지 및 멧돼지의 돼지과 동물에서만 발생하는 급성열성바이러스성 질병으로 전연령대에 거쳐 발생하며 급성의 경우 1주 이내 100% 폐사가 나타난다. 아직까지 상용화된 효과적인 백신이 없기 때문에 발생시 양돈산업에 매우 큰 영향을 미치며 바이러스 특성상 환경저항성이 높기 때문에 유입 시 질병근절이 매우 어렵다. 특히 유럽의 경우 야생멧돼지에서 임상증상없이 전파가 계속 이루어지는 저병원성 바이러스가 확인되었고 이 질병 전파의 중요 요인으로 작용하고 있다. 이런 이유로 아프리카돼지열병의 유입방지 및 유입 후 근절을 위해서는 야생멧돼지의 통제가 매우 중요하다. 아프리카돼지열병은 2019년 9월 국내 유입 후 14차까지 발생이 확인되었으며, 10월에 야생멧돼지에서 발생이 확인되었다. 이후 야생멧돼지에서 지속적으로 발생하고 있으며 2020년 10월 사육돼지에서 다시 발생하였다. 아프리카돼지열병은 돼지열병과 임상증상 및 부검소견이 매우 유사하여 감별해야 하는 가장 중요한 질병이며 두 질병은 반드시 실험실진단을 통해서 감별진단되어야한다. 국내 사육돼지에서는 돼지열병 백신접종이 실시되고 있으며, 야생멧돼지에서는 돼지열병 항원이 지속적으로 검출되고 있기 때문에 이와 같은 감별진단은 특히 필요하다.
본 발명의 목적은 아프리카돼지열병바이러스의 capsid 영역을 인코딩하는 p72 부위와 돼지열병바이러스의 non-translated region (NTR) 부위에 특이적으로 결합하는 프라이머 및 프로브를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 프라이머 및 프로브를 가지고 RT-qPCR을 이용하여 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스를 높은 민감도로 감별진단하는 방법을 제공하는 데 있다.
한편, 이러한 본 발명의 목적은 상기의 목적들로 국한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 검출용 프라이머 쌍; 및 (ii) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지열병바이러스 검출용 프라이머 쌍; 또는 이들의 조합을 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스의 감별진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, (i) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 구성되는 제1 프라이머 세트; 및 (ii) 서열번호 4의 염기서열을 가지는 정방향 프라이머 및 서열번호 5의 염기서열을 가지는 역방향 프라이머로 구성되는 제2 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 RT-PCR에 이용하여, 아프리카돼지열병바이러스 감염 개체와 돼지열병바이러스 감염 개체를 감별하는 방법을 제공한다.
본 발명은 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스의 검출용 프라이머 쌍, 상기 프라이머 쌍을 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 감별진단용 키트 및 조성물, 상기 감별진단용 키트 및 조성물을 포함하는 감별진단 방법에 관한 것으로, 본 발명의 감별진단용 키트 및 감별진단 방법을 이용하면 검체 시료로부터 한번의 PCR 반응으로 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스를 높은 민감도 및 특이도로 검출할 수 있다.
본 발명자들은 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스를 소량의 시료를 가지고 높은 민감도로 신속하게 감별진단 할 수 있는 프라이머 및 프로브를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스의 염기서열을 다중서열을 정렬하고 가장 보존적인 지역을 선별하여 프라이머의 2차구조분석과 서열 수정을 통해 최적의 증폭효율과 특이성을 갖는 한 쌍의 프라이머 세트를 제작하고, 상기 프라이머 세트를 이용하는 경우, 높은 민감도 및 특이도로 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스를 감별진단 할 수 있음을 규명하였다.
본 발명은 다음 1. 내지 15.의 발명을 개시한다.
1. 다음을 포함하는 아프리카돼지열병바이러스의 capsid 영역을 인코딩하는 p72 유전자 및 돼지열병바이러스의 NTR 부위 표적서열 검출용 조성물:
(a) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 검출용 프라이머 쌍;
(b) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지열병바이러스 검출용 프라이머 쌍; 또는 이들의 조합을 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스의 감별진단용 조성물;
2. 1.에 있어서, 상기 (a)는 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하고, 상기 (b)는 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 프로브를 추가적으로 포함하는, 조성물.
3. 2.에 있어서, 상기 서열번호 3, 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열의 5'-말단의 프로브는 FAM, TET, HEX, JOE, ROX, TMR, Cy5, TxR, 및 Cal Red 610로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광물질(fluorophore)로 표지된 것인, 조성물.
4. 2.에 있어서, 상기 서열번호 3, 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열의 3'-말단의 프로브는 BHQ-1, BHQ-2 또는 TAMRA의 퀀처(quencher)로 변형된 것인, 조성물.
5. 1.에 있어서, 상기 조성물은 (a) 내지 (b)의 프라이머 쌍 중, 1 종 이상을 포함하는 것인, 조성물.
6. 1. 내지 5.의 조성물을 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 감별진단용 키트.
7. 6.에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시되는 것인, 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 감별진단용 키트.
8. 7.에 있어서, 상기 유전자 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것인, 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 감별진단용 키트.
9. 8.에 있어서, 상기 유전자 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것인, 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 감별진단용 키트.
10. 다음의 단계를 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스의 감별진단 방법:
(a) 검체 시료로부터 핵산을 준비하는 단계;
(b) (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 검출용 조성물;
(ii) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 포함하는 돼지열병바이러스 검출용 조성물; 및
(iii) 상기 조성물을 이용하여 검체 시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
(c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계.
11. 10.에 있어서, 상기 (i), (ii)의 조성물은 각각 서열번호 3, 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 추가적으로 포함하는 것인, 방법.
12. 10.에 있어서, 상기 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것인, 방법.
13. 10.에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것인, 방법.
14. 13.에 있어서, 상기 실시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것인, 방법.
15. 14.에 있어서, 상기 프로브는 표지가 결합되어 있고, 상기 단계 (c)의 확인은 상기 프로브로부터 발생되는 시그널을 검출하여 실시하는 것인, 방법.
본 발명에서 사용되는 용어 "실시간 RT-PCR (real-time RT-PCR)"은 각각의 의미를 가지는 PCR 및 실시간 (RT-)PCR의 총합을 의미한다. 각각의 의미를 살펴보면, PCR은 DNA의 특정 영역을 시험관 내에서 대량으로 증폭하는 기술을 의미하며, RT-PCR은 시험관 내에서 RNA를 DNA로 역전사시킨 다음, 이렇게 만들어진 상보적 DNA (complementary DNA; cDNA)의 특정 영역을 대량으로 증폭하는 기술을 의미한다. 실시간 (RT-)PCR은 특정 영역 증폭의 결과가 실시간으로 모니터링되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프라이머 (primer)"는 주형 (template) 핵산에 상보적으로 결합하여 합성을 위한 시발점으로 기능하는 자유 3'-수산화기 (free 3'-hydroxyl group)를 가지는 짧은 핵산 단편을 의미한다. 프라이머는 적절한 반응 완충 용액 (buffer) 및 온도에서 중합 반응을 위한 효소 [DNA 중합 효소 (DNA polymerase), 역전사 효소 (reverse transcriptase) 등] 및 상이한 4가지 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 (deoxynucleoside triphosphates; dNTPs)의 존재 하에서 주형에 상보적인 가닥의 합성을 개시할 수 있는데, 프라이머 길이 및 반응 조건 등은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 프라이머는 필요할 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있으며, 표지의 예로는 효소, 방사선 동위원소, 형광성 분자, 화학 그룹 등이 있다.
본 발명에 있어서, 상기 프라이머는 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스를 검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 1 내지 3, 서열번호 4 내지 6의 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)들을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "프로브 (probe)"는 혼성화 (hybridization)에 의해 상보적인 목적 핵산 서열의 존재를 검출하는데 사용되어지는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 DNA 또는 RNA 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단일 가닥 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 프로브는 해당 염기서열의 5'과 3'말단에 각각 검출에 이용되는 표지자를 포함할 수 있으며, 이러한 표지자로는 형광단 (fluorophore)과 퀀처 (quencher)가 각각 5'과 3'말단에 표지 될 수 있다. 이에 따라, 프로브에 형광단과 퀀처가 서로 결합한 형태로 존재할 때에는 상호 간섭에 의해 발광이 억제되고, PCR 반응 등을 통해 프로브의 분해가 이루어지면 프로브에 표지된 형광단과 퀀처 간의 간섭이 사라져 발광을 하게 된다. 상기 5'말단에 표지 될 수 있는 형광단은 당업계에서 통상적으로 사용되는 형광 물질이 제한 없이 사용될 수 있는데, 예를 들면, 6-카르복시플루오레세인 (6-Carboxyfluorescein; FAM), TET, 핵사클로로-6-카르복시플루오레세인 (Hexachloro-6-carboxyfluorescein; HEX), JOE, ROX, TMR, 시아닌-5 (Cyanine-5; Cy5), 텍사스 레드 (Texas Red, TxR), 및 칼 레드 610 (CAL Red 610) 등이 사용될 수 있다. 상기 3'말단에 표지 될 수 있는 퀀처 또한 당업계에서 통상적으로 사용되는 퀀처가 제한 없이 사용될 수 있는데, 예를 들면, BHQ-1, BHQ-2, 및 TARMA 등이 사용될 수 있다. 이처럼 형광 물질이 표지된 프로브를 사용하여 실시간 (RT-)PCR을 수행하면, 증폭된 산물을 실시간으로 모니터링할 수 있고, DNA 및 RNA의 정량이 가능하며, 전기영동이 필요 없어 빠르고 간편하게 정확한 진단이 가능하다는 장점을 갖는다.
본 발명에 있어서, 상기 프로브는 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스를 검출할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 서열번호 3 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드를 사용할 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브는 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명에서 목적으로 하는 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당업계에 공지된 통상적인 수단을 이용하여 프라이머 및 프로브가 변형될 수 있다.
본 명세서에서는 프라이머 및 프로브의 염기서열을 나타냄에 있어 국제 생화학 연합 (International Union of Biochemistry; IUB) 중의성 코드 (ambiguity code)를 사용하였다. 염기서열에서 A는 아데닌 (adenine)을, C는 시토신 (cytosine)을, G는 구아닌 (guanine)을, T는 티민 (thymine)을, R은 아데닌과 구아닌 둘 다 가능한 자리를, Y는 시토신과 티민 둘 다 가능한 자리를 나타낸다. 이는 본 명세서의 모든 염기서열을 제시하는 데에 있어 동일하게 적용되었다.
본 발명의 진단 키트는 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스를 경제적으로 빠르고 간편하게 수행하기 위한 실시간 RT-PCR 진단 키트로서, 상기 조성물에 포함되는 서열번호 1 내지 6 중 1종 이상의 프라이머 및 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.
구체적인 일례로서, 본 발명의 진단 키트는 역전사 반응 및 PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 상기 진단 키트는 각 검출 부위에 대한 특이적인 각각의 프라이머/프로브 세트 외에도 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, cDNA의 특정 영역을 대량으로 증폭하기 위한 DNA 중합 효소, 반응 완충 용액, dNTPs, RNA 분해 효소 억제제 (RNase inhibitor), 멸균수, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 각 테스트 튜브에 포함되는 성분들로는, 이에 국한되지 않지만, 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스를 동시 검사를 위한 다중 올리고 혼합 조성물, DNA 중합 효소, 역전사 효소, RNA 분해 효소 억제제, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Tris-HCl, MgCl2, KCl, BSA 및 핵산 분해 효소 제거수 (nuclease-free water) 등이 있으며, 특정 반응을 위해 사용되는 성분 또는 반응물의 최적량은 당업자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 진단 키트를 이용하여 시료 중의 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스를 감별 검출하는 방법을 제공한다.
구체적으로 본 발명의 아프리카돼지열병바이러스를 검사하는 방법은 (a) 검체에서 핵산을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 핵산을 대상으로, 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 포함하는 조성물 또는 진단 키트를 이용하여 실시간 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 돼지열병바이러스를 검사하는 방법은 (a) 검체에서 핵산을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 핵산을 대상으로, 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 쌍을 포함하는 조성물 또는 진단 키트를 이용하여 실시간 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명의 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스를 동시에 검사하는 방법은 구체적으로, (a) 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 감염이 의심되는 동물로부터의 검체에서 핵산을 분리하는 단계; 및 (b) 상기 분리된 핵산을 대상으로, 상기 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 검출용 진단 키트를 이용하여 실시간 RT-PCR 반응을 통해 표적 서열을 특이적으로 증폭 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 검체는 사육돼지 및 야생멧돼지로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이로부터 분리된 혈액, 혈청, 혈장, 분변 및 조직 등을 포함한다.
본 발명에 따르면, 당업계에서의 공지의 방법에 따라 검체에서 핵산을 추출한 다음, 추출된 핵산을 함유한 추출액에 본 발명의 프라이머/프로브 세트들을 포함하는 조성물을 포함하는 진단 키트를 이용하여 단일 튜브에서 실시간 RT-PCR을 실시한다. 증폭 및 검출의 결과는 실시간으로 확인되는데, 예를 들어 서열번호 3의 프로브에 표지된 형광 물질의 발광이 확인되면, 이는 검체 내에 아프리카돼지열병바이러스가 존재함을 의미하며, 마찬가지 방식으로 서열번호 6의 프로브에 표지된 형광 물질의 발광이 확인되면, 이는 검체 내에 돼지열병바이러스가 존재함을 의미한다. 즉, 검체 내의 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 검출 여부와 함께 감별진단 또한 가능하다.
본 발명에서는 아프리카돼지열병바이러스를 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 신규한 프라이머/프로브 세트들 및 돼지열병바이러스를 특이적으로 증폭 검출할 수 있는 신규한 프라이머/프로브 세트들을 설계하고, 상기 프라이머/프로브 세트들을 포함하는 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트를 이용하여 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스를 동시에 선택적으로 진단할 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트는 단일 튜브 내 실시간 RT-PCR 반응을 통해 최적의 증폭효율과 특이성을 갖는 검사를 할 수 있도록 구성되어 있으며, 돼지에서 아프리카돼지열병바이러스와 반드시 감별진단 해야하는 바이러스 전염병들, 예를 들면, PRRSV Type I (E38), PRRSV Type II (LMY), PEDV CU777, Aujeszky's Disease virus, BVDV 1 및 BVDV 2에 대한 비특이 반응이 존재하지 않도록 제작되어 있으므로, 아프리카돼지열병 바이러스 및 돼지열병바이러스 감별진단에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용하여 RT-qPCR을 수행하면, 소량의 시료를 가지고 높은 민감도로 아프리카돼지열병바이러스의 capsid 영역을 인코딩하는 p72 유전자와 돼지열병바이러스의 NTR 부위를 검출함으로써 각각의 질병의 감염여부를 신속하게 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 두 질병에 대한 감별진단이 가능하다. 또한 원스텝 실시간 유전자진단으로 신속하고 정확하게 진단하여 시간과 노동력, 경비절감 효과 뿐만 아니라 신속한 방역조치를 통한 질병확산 방지 및 결과적으로 국내 축산업 보호에 기여할 수 있다.
아울러, 상술한 효과 이외의 다양한 효과들이 후술될 본 발명의 실시예에 따른 상세한 설명에서 직접적 또는 암시적으로 개시될 수 있다.
도 1은 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스 혼합 샘플에 대하여 본 발명의 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시한 실시간 PCR 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 특이도를 평가하기 위하여 PRRSV, PEDV, Aujeszky's disease virus 및 BVDV에 대하여 실시한 실시간 PCR 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적, 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 한편, 본 명세서에서 사용된 용어들은 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로서, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.
실시예 1: 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작
NCBI에 등록된 아프리카돼지열병바이러스(표 1) 및 돼지열병바이러스(표 2)의 염기서열을 다중서열정렬 후 가장 보존적인 지역으로 아프리카돼지열병바이러스의 capsid 영역을 인코딩하는 p72 유전자와 돼지열병바이러스의 NTR 영역을 선별 후 각각 4쌍의 후보 프라이머세트를 제작하였다. 제작된 각각의 프라이머 세트를 이용하여 실제 바이러스에 대한 검출여부 확인 후 민감도를 평가하였다.
아프리카돼지열병바이러스 검출용 프라이머/프로브 도출을 위한 염기서열 목록
연번 Genbank Accession No. 유전형(Genotype)
1 DQ250119.1 1
2 DQ250114.1 1
3 AM999746.1 2
4 KY963545.1 2
5 MH713612.1 2
6 AF504886.1 3
7 AF449477.1 4
8 KJ526369.1 5
9 AY578704.1 5
10 AF270711.1 6
11 AF270710.1 6
12 AF302818.1 7
13 AY274464.1 8
14 AY351564.1 9
15 AY351530.1 10
16 AY351522.1 11
17 AY351561.1 12
18 AY351542.1 13
19 AY351565.1 14
20 AY494552.1 15
21 AY494551.1 16
22 DQ250119.1 17
23 DQ250122.1 18
24 DQ250112.1 19
25 DQ250123.1 20
26 DQ250111.1 21
27 DQ250117.1 22
28 KT795354.1 23
29 KY353989.1 24
돼지열병바이러스 검출용 프라이머/프로브 도출을 위한 염기서열 목록
연번 Genbank Accession No.
1 EU789580.1
2 D49532
3 DQ415937.1
4 U90951.1
5 Z46258.1
6 AF517834.1
7 D49533.1
8 AY367767.1
9 AB019166.1
10 AY168611.1
11 L49347.1
12 AF037405.1
13 MH548930.1
4쌍의 세트중 가장 민감도가 높은 각각의 프라이머 세트를 선발 annealing 온도, 프라이머 및 프로브 농도 등을 조정하여 선발 동시진단 후보로 우선 선정하였다. Annealing 온도 조건 optimization 실험의 경우, 1차 실험 시 민감도가 좋지 않은 ASF3을 제외한 (data not shown) 3쌍의 후보 프라이머와 ASF-OIE 프라이머를 가지고 진행하였다. 그 결과, ASF2 프라이머 쌍의 민감도가 가장 우수하여 이를 선발하였다 (표 3). 이를 이용하여 동시진단평가를 실시한 결과 개별 PCR(singleplex PCR)에서는 민감도가 좋았으나 동시진단으로 사용시 저해(inhibition) 반응에 의해 민감도가 감소 및 형광값(RFU)이 낮아지는 결과를 나타냈다. 이에 민감도가 유사했던 다른 프라이머 세트를 이용하여 동시진단용으로 조합하여 평가 후 가장 저해반응이 적으면서 민감도가 좋은 프라이머 세트를 선발하였다.
또한 아프리카돼지열병 진단 프로브에 FAM, 돼지열병 진단 프로브에 Cy5를 붙여 사용한 경우보다 아프리카돼지열병 진단 프로브에 Cy5, 돼지열병 진단 프로브에 FAM을 붙여 사용한 경우에 형광값이 개선되어 민감도가 향상되었으며, 특히 형광물질 상호 교체 이전의 실험 결과에서 detection되지 않았던 두 genotype (It14 cag 및 It14 sas)이 상기 실험에서 detection되어 더 많은 종류의 ASF 바이러스를 검출할 수 있게 되었다 (표 4).
이후 두 질병에 대한 유전자형에 대한 평가에서 일부 유전형의 경우 낮은 농도에서 OIE 진단법에 비해 검출이 잘 되지 않는 결과를 나타내 다시 프라이머의 2차구조분석과 서열 수정 및 프라이머와 프로브 재조합을 통해 최적의 증폭효율과 특이성을 갖는 한 쌍의 프라이머 세트를 제작하였다 (표 5).
Figure 112021014827627-pat00001
Figure 112021014827627-pat00002
최적의 증폭효율 및 특이성을 갖는 한 쌍의 프라이머 세트 염기서열 목록
서열번호 구분 프라이머 및 프로브 서열(5' to 3') 위치
1 ASF primer F CGTATCCGATCACATTACCT P72의 337-356
2 ASF primer R TCTCTTGCTCTGGATACGTT P72의 128-147
3 ASF probe CGATTAAAACCCCYGAYGATCCGGGTGCG P72의 205-233
4 CSF primer F AGTCGTCAGTAGTTCGACGTGA NTR의 182-203
5 CSF primer R TGCCATGTACAGCAGAGATT NTR의 355-374
6 CSF probe CACCTTAACCCTRGCGGGGGTCGCYA NTR의 253-278
실시예 2: 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 검출시험
2-1. 검출시험
시료로부터 핵산을 분리하고, 표 6의 조건에 따라 동일한 튜브에서 reverse transcription과 PCR이 연쇄적으로 일어나는 1 step 실시간 RT-PCR로 PCR을 수행하였다.
단계 온도/시간 반복 수
Reverse Transcription 45℃ 10분 1cycle
initial activation 95℃ 10분 1cycle
PCR denaturation 94℃ 15초 40cycle
annealing 58℃ 30초
2-2. 듀플렉스 qPCR 검출한계 측정 평가
최종 확립된 ASF 및 CSF 감별을 위한 듀플렉스 qPCR의 검출한계를 조사한 결과, 바이러스에 대해서는 ASF는 100 HAD50/㎖, CSFV는 100 TCID50/㎖, 합성유전자에 대해서는 ASF는 1x101 copy, CSF는 1x101 copy, ASF는 1x101 copy까지 검출하였다 (표 7).
실험 방법 바이러스
(HAD50/㎖ or TCID50/㎖)		 합성된 DNA
(Copies /㎕)
ASF CSF ASF CSF
Duplex
RT-qPCR		 100 100 101 101
35.22 38.86 35.75 37.45
2-3. 특이도 평가
돼지에서 아프리카돼지열병과 반드시 감별진단 해야하는 바이러스 전염병을 대상으로 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 진단법을 평가한 결과 비특이 반응이 존재하지 않음을 확인하였다 (표 8).
Viruses Titer Duplex RT-qPCR
PRRSV Type I (E38) 1Х106.59 TCID50/㎖ Not detected
PRRSV Type II (LMY) 1Х105.73 TCID50/㎖ Not detected
PEDV CU777 1Х106 TCID50/㎖ Not detected
Aujeszky's Disease virus 1Х107.6 TCID50/㎖ Not detected
BVDV 1 1Х106 TCID50/㎖ Not detected
BVDV 2 1Х106 TCID50/㎖ Not detected
실시예 3: 야외 시료를 이용한 듀플렉스 qPCR 효능 시험
본 발명자들은 발명된 진단법은 OIE Terrestrial Manual에 표기된 아프리카돼지열병은 King et al.(J.Virol.Methods. 2003.107,53-61), 돼지열병은 Hoffmann et.al.(J.Virol.Methods. 2005.130,36-44)에 개시된 프라이머 및 프로브 세트를 논문에 개시된 조건 하에서 PCR을 수행하여 Ct 값을 비교하였다. 하기 본 발명의 Duplex RT-qPCR과 상기 King et al., Hoffman et al. 과의 비교실험에서는 결과값이 객관적으로 비교가 될 수 있도록, 각 시험군마다 동일한 시약과 같은 농도의 프라이머 및 프로브를 사용하여 비교하였다.
3-1. 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 유전형 평가
본 발명자들은 아프리카돼지열병바이러스(표 9)및 돼지열병바이러스(표 10) 각 유전형 임상시료를 대상으로 본 발명의 듀플렉스 qPCR을 수행하였다. 그 결과 사용된 모든 유전형 시료에 대해 검출되었다.
Strain Genotype King et al Duplex RT-qPCR
Ken06 9 29.74 31.45
UG10/Tk3.2 10 32.28 35.76
Arm07 2 28.14 27.87
E70 1 30.34 31.24
MOL16 (CERNO.1) 2 33.14 33.01
MOL16 (DP-MOSA1) 2 31.06 30.41
Ken11/KisP52 9 29.16 28.35
LT14/1490 2 27.67 27.19
Ken08Tk.2/1 10 27.61 31.14
Ukr12/Zapo 2 27.61 26.69
MwLil 10/120 8 29.56 29.39
Moz64 5 28.46 27.67
SS14/DP-Cagliaril 1 33.70 35.48
BF07/IqTC 1 31.87 31.43
Est14/WB-Valga-1 2 30.96 30.69
Lv14/DP/Robez3 2 32.04 31.59
Pol14/Krus 2 29.30 28.81
SS14/WB-Sassaril 1 30.51 28.59
Eth13/1505 23 28.77 32.30
Est15/Wb-Tartu14 2 31.44 33.20
Ukr15/DP-Kieve 1 2 29.31 29.09
Strain (Genotype) Hoffmann et al Duplex RT-qPCR Origin
LOM (I) ② 30.44 27.47 농림축산검역본부 바이러스질병과
① 장간막 임파절
② 악하 임파절
③ 서혜 임파절
LOM (I) ③ 31.84 28.85
YC11WB (II) ① 27.89 25.44
YC11WB (II) ② 23.79 20.96
YC11WB (II) ③ 24.45 21.67
YI9903(III) ① 22.50 22.14
YI9903(III) ② 23.13 22.10
YI9903(III) ③ 25.80 23.88
3-2. 아프리카돼지열병바이러스 및 돼지열병바이러스 야생멧돼지 시료 평가
본 발명자들은 600개의 야외시료 (아프리카돼지열병 및 돼지열병 검사용 야생멧돼지 전혈)를 대상으로 본 발명의 듀플렉스 qPCR을 수행하고 Ct값을 비교하였다. 그 결과 본 발명의 진단법은 돼지열병바이러스 양성샘플을 Hoffmann et.al.에 개시된 진단법과 비교하여 비슷한 민감도로 양성을 검출하였다.
sample Hoffmann et al. Duplex RT-qPCR
ASF CSF ASF CSF
Wild boar sample 1 - 23.83 - 24.43
Wild boar sample 2 - 21.63 - 21.93
<110> REPUBLIC OF KOREA(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Detection and Differentiation of African Swine Fever Virus and Classical Swine Fever Virus by One Step Duplex Reverse Transcriptase Quantitative PCR Assay <130> PN200416 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASF primer F <400> 1 cgtatccgat cacattacct 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASF primer R <400> 2 tctcttgctc tggatacgtt 20 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ASF probe <400> 3 cgattaaaac cccygaygat ccgggtgcg 29 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF primer F <400> 4 agtcgtcagt agttcgacgt ga 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF primer R <400> 5 tgccatgtac agcagagatt 20 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CSF probe <400> 6 caccttaacc ctrgcggggg tcgcya 26

Claims (26)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 검출용 프라이머 쌍, 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브; 및
    (ii) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 돼지열병바이러스 검출용 프라이머 쌍, 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 포함하고,
    상기 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에는 형광물질로서 Cy5가 표지되고, 상기 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에는 형광물질로서 FAM이 표지된 것인, 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스의 감별진단용 조성물.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서, 상기 프로브의 뉴클레오타이드 서열의 3'-말단은 BHQ-1, BHQ-2 또는 TAMRA의 퀀처 (quencher)로 변형된 것인, 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제4항 또는 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스의 감별진단용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 키트는 유전자 증폭에 의해 실시되는 것인, 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스의 감별진단용 키트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것인, 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스의 감별진단용 키트.
  14. 제13항에 있어서, 상기 유전자 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것인, 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스의 감별진단용 키트.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 다음의 단계를 포함하는 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스의 감별진단 방법:
    (a) 인간을 제외한 검체 시료로부터 핵산을 준비하는 단계;
    (b) (i) 서열번호 1 및 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 포함하는 아프리카돼지열병바이러스 검출용 조성물; 및
    (ii) 서열번호 4 및 5의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프라이머 쌍 및 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브를 포함하는 돼지열병바이러스 검출용 조성물을 이용하여 상기 검체 시료 내 목적 뉴클레오타이드 서열을 증폭하는 단계; 및
    (c) 상기 증폭 결과를 확인하는 단계,
    상기 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에는 형광물질로서 Cy5가 표지되고, 상기 서열번호 6의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에는 형광물질로서 FAM이 표지된 것인, 아프리카돼지열병바이러스와 돼지열병바이러스의 감별진단 방법.
  22. 삭제
  23. 제21항에 있어서, 상기 증폭은 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 실시되는 것인, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR에 의해 실시되는 것인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 실시간 PCR은 TaqMan 프로브 방법으로 실시되는 것인, 방법.
  26. 삭제
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN110760620A (zh) * 2019-12-12 2020-02-07 黑龙江八一农垦大学 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法

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