KR102514970B1 - 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 판 파에코바이러스 검출 및 정량 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 검출 및 정량 방법을 제공하는 것으로, 판 파에코바이러스의 검출용 프라미어 세트 및 프로브를 제작하여 개발한 실시간 유전자 검출 검사법은 기존 진단법에 비해 민감도가 향상되고 유전형 1~7, 14, 17~19에 해당하는 파에코바이러스 모두를 검출할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 검출 및 정량 방법에 관한 것이다.
파에코바이러스(Human parechovirus)는 Picornaviridae과의 바이러스로 RNA 형태의 유전정보를 가지고 있으며 19개의 유전형이 존재하다. 아직 감염 시 증상이 잘 알려지지 않은 유전형들이 많이 존재하며 주요한 유전형은 파에코바이러스 1, 3이며 특히 파에코바이러스 3은 중추신경계에 감염을 일으키는 것으로 알려져있다. 현재 파에코바이러스 1, 2는 Echovirus 22 와 23에 해당한다.
파에코바이러스(Human parechovirus)는 전 세계적으로 유행하며 초기 소아기 아이들에게 잘 감염되는 것으로 알려져 있으나 아직 국내에는 유병률에 대한 조사가 많이 이루어지지 않은 실정이다. 또한, 잠복기가 밝혀지지 않았으며 감염 시 증상은 열, 피부발진, 패혈증, 뇌수막염, 뇌염 등 엔테로바이러스와 임상적 증상이 유사하여 구분이 쉽지 않다.
이러한 이유로 신속하고 정확한 진단 방법인 Real-time PCR법을 이용한 시스템 개발 필요성이 제기되었다.
본 발명은 파에코바이러스(Human parechovirus)의 유전형끼리 가장 보존되었다고 알려진 부위인 5‘ UTR을 표적 지역으로 선정하고 이를 이용해 전체 파에코바이러스를 검출할 수 있는 판 파에코바이러스 프라이머 및 프로브를 개발하였다. 또한 이를 이용한 실시간 유전자 검출 검사법을 개발하였으며, 이는 기존과 달리 유전형 1~7, 14, 17~19를 검출할 수 있으며 민감도와 특이도가 향상된 효과를 확인하였고 이에 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 검출 및 정량 방법을 제공하는 것으로, 구체적으로 판 파에코바이러스 검출용 프라미어 세트 및 프로브를 제작하여 개발한 실시간 유전자 검출 검사법은 기존 진단법에 비해 민감도가 향상된 효과를 나타내므로, 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 검출 및 정량 방법으로 사용될 수 있다.
위와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1, 2 및 3의 염기서열로 이루어진 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 의 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus)의 검출 또는 정량용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “조성물”은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프로브를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “프로브”는 5'-말단에 형광 표지인자(reporter dye)가 결합되어 있는 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “형광 표지인자”는 FAM(6-carboxyfluorescein), JOE, HEX(hexachloro-6- carboxyfluorescein), TET(tetrachlorofluorescein), 텍사스 레드(texas red), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), NED(N-(1-naphthyl ethylenediamine), Cy5(cyanine-5) 및 Cy3(cyanine-3)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus)의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “키트”는 DNA 중합효소, dNTP, 버퍼 또는 EPC를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “키트”는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 시료로부터 분리된 RNA에 대하여 서열번호 1, 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용하여 실시간 중 합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 을 수행하고 분석하는 단계를 포함하는 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, “분석하는 단계”는 Ct 값이 확인되면 시료 내에 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus)가 존재하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 시료로부터 분리된 RNA에 대하여 서열번호 1, 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용하여 실시간 중 합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 을 수행하여 얻은 Ct 값을 표준 검량선에 대입하는 단계를 포함하는 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 의 정량 방법을 제공한다.
본 발명은 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 검출 및 정량 방법을 제공하는 것으로, 구체적으로 판 파에코바이러스의 검출용 프라미어 세트 및 프로브를 제작하여 기존 진단법에 비해 민감도 및 특이도가 향상된 효과를 나타내므로, 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus)검출 및 정량 방법으로 우수한 효과가 있다.
도 1은 판 파에코바이러스 검출용 프라이머 및 프로브의 디자인에 관한 도이다.
도 2는 판 파에코바이러스 프라이머 및 프로브 성능 확인 결과에 대한 도이다.
도 3은 최종 확립된 판 파에코바이러스 프라이머 및 프로브 세트의 효율 확인 시험 결과에 대한 도이다.
도 4는 판 파에코바이러스의 Master mix 별 검출효율 비교 테스트 결과에 대한 도이다.
도 5는 판 파에코바이러스의 직선성 확인 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 판 파에코바이러스 프라이머 및 프로브 성능 확인 결과에 대한 도이다.
도 3은 최종 확립된 판 파에코바이러스 프라이머 및 프로브 세트의 효율 확인 시험 결과에 대한 도이다.
도 4는 판 파에코바이러스의 Master mix 별 검출효율 비교 테스트 결과에 대한 도이다.
도 5는 판 파에코바이러스의 직선성 확인 결과를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology) 들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
일 측면에서, 본 발명은 서열번호 1, 2 및 3의 염기서열로 이루어진 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 의 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에서의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3'-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group) 를 가지는 염기서열로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍 을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 염기서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(Deoxynucleoside triphosphate) 의 존재 하에 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus)에 특이적으로 존재하는 유전자를 증폭을 위하여 각각 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머로 구성되어 있다. 본 발명의 프라이머 세트는 프라이머의 길이, Tm 값, 프라이머의 GC 함량, 및 프라이머 내의 자가-상보적 서열에 의 한 프라이머의 복합체(dimer) 형성 방지와 같은 조건들을 충분히 고려하고 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 의 검출에 대한 민감도 및 특이도를 최대화할 수 있도록 세심하게 디자인된 것이다.
본 발명의 프라이머 세트는 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 염기서열은 또한 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스 포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등) 로의 변형이 있다. 또 한, 본 발명의 프라이머 세트의 염기서열은 검출 가능한 시그날을 직접적 또는 간 접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus)의 검출 또는 정량용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프로브를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 프로브는 프로브의 말단에 형광물질로 표지될 수 있다. 프로브의 5'-말단에는 형광 표지인자(reporter dye)가 결합될 수 있다.
상기 형광 표지인자로는 현재까지 개발된 어떠한 물질을 사용하여도 무방하며, 예를 들어, FAM(6-carboxyfluorescein), HEX(hexachloro-6-carboxyfluorescein), JOE, TET(tetrachlorofluorescein), 텍사스 레드(texas red), 로 다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다 민(tetramethylrhodamine), NED(N-(1-naphthyl) ethylenediamine), Cy5(cyanine-5) 또는 Cy3(cyanine-3)이 사용될 수 있고, 바람직하게는 FAM(6-carboxyfluorescein) 을 사용할 수 있다.
일 측면에서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus)의 검출 또는 정량용 키트를 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 시료로부터 분리된 RNA에 대하여 서열번호 1, 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction)을 수행하고 분석하는 단계를 포함하는 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 의 검출 방법을 제공한다.
본 발명에서 중합효소연쇄반응은 (i) 초기 변성(denaturation) 단계; (ii) 변성(denaturation), 부착(annealing) 및 연장(extension)으로 이루어지는 한 싸 이클을 수회 내지 수십 회 반복하는 단계; 및 (iii) 최종 열처리 단계; 또는 이들 단계을 적합하게 변형한 열 싸이클(thermal cycle) 프로그램을 통해 수행될 수 있 다.
구체적으로, 본 발명에서의 PCR 조건으로는 50℃에서 30분간 역전사 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 중합효소(Taq polymerase)를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.
본 발명에서 PCR 증폭 산물의 크기의 분석은 당업계에 알려진 임의의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 젤 전기영동에 의하 여 표적 크기 마커와의 비교를 통하여 증폭 산물의 크기를 알 수 있다
본 발명에서 실시간 중합효소연쇄반응은 타겟 DNA의 증폭과 동시에 형광 방 출에 의한 타겟 DNA의 절대 또는 상대적인 정량이 가능한 실험방법으로서, 전기영 동하여 분석하는 단계가 생략되고, 증폭산물의 증폭정도를 자동화, 수치화시켜 신 속하고 정확하게 검출 및 정량이 가능하다. 상기 방법을 수행하는 경우 타겟 DNA 내의 증폭된 서열에 특이적으로 결합하고 형광 표지인자 및 형광 억제물질이 태깅 되어 있는 프로브를 사용하여 수행될 수 있고, 프로브의 사용없이 SYBR-Green 등의 형광물질을 사용하여 수행될 수도 있다. 실시간 중합효소연쇄반응에 대한 결과는 Ct(cycle threshold) 값을 이용하여 분석될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시 예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1. 프라이머 세트(Primer set)의 개발
본 발명자들은 5‘ UTR을 표적 지역으로 선정하고 이를 이용해 프라이머 및 프로브를 디자인하였고, 다중서열을 정렬한 판 파에코바이러스의 서열정보들 사이에도 차이가 존재하기 때문에 역방향 프라이머를 2개로 디자인하였으며 프로브는 기존 프로브보다 짧게 디자인이 가능한 miner groove binder(MGB)를 이용한 프로브를 이용하여 검출률을 높이고자 하였다(도 1 참고). 최종적으로 설계된 프라이머 및 프로브는 in silico상 서열 정보가 존재하는 유전형 1~7, 14, 17~19를 검출할 수 있으며 개발된 프라이머 세트 및 프로브의 민감도 및 특이도를 평가하기 위하여 내부양성대조군은 Exogenous PCR control(EPC)인 인위적 염기서열(artificial sequence)을 사용하였다. 판 파에코바이러스 검출 검사법에 사용된 프라이머, 프로브 시퀀스 및 EPC 시퀀스는 표 1에 기재하였다.
| Target | 서열번호 |
Primer
/Probe |
Sequence (5' to 3') |
Product
size |
| 5‘ UTR | 1 | F-primer | AAC ACT AGT TGT AAG GCC CA | 79 bp |
| 2 | R-primer-1 | TCA GAT CCA TAGT GTC WCT TGT | ||
| 3 | R-primer-2 | CCA GAT CAG ATC CAT AGT GTC | ||
| 4 | Probe | FAM-AGG ATG CCC AGA AGG TA-MGB | ||
| EPC | 5 | F-primer | GAC ATC GAT ATG GGT GCC G | 68 bp |
| 6 | R-primer | CGA GAC GAT GCA GCC ATT C | ||
| 7 | Probe | FAM-TCT CAT GCG TCT CCC TGG TG-MGB |
실시예2. 판 파에코바이러스 실시간 유전자 검출 검사법의 반응조건 최적화2-1. 개발된 프라이머 세트 및 프로브의 성능확인
개발된 프라이머 세트 및 프로브의 민감도 및 특이도를 평가하기 위하여 판 파에코바이러스 및 EPC 검출용 프라이머와 프로브의 올리고를 합성하였으며 이때 다중검출을 위해 TaqMan 프로브의 형광물질은 판 파에코바이러스에 FAM, EPC에 JOE를 사용하였다.
Real-time PCR 반응액은 10 pmol/μL로 희석한 정방향 및 역방향 프라이머 각 1 μL 와 4 pmol/μL로 희석한 TaqMan 프로브 1 μL, 4X RT-PCR Master Mix 5 μL에 주형 RNA 5 μL 및 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 μL로 맞추고 주형 RNA는 ATCC에서 구매한 파에코바이러스 1, 2, 3의 배양액에서 추출한 viral RNA을 사용하였다.
PCR 조건은 50℃에서 30분간 역전사(Reverse transcription) 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq polymerase를 활성화 시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.
합성된 프라이머 및 프로브 세트를 이용해 각 파에코바이러스 1, 2, 3 양성 시료에 대한 실시간 증폭곡선을 확인한 결과 파에코바이러스 1, 2, 3 RNA 모두 정상적으로 증폭곡선을 나타내었다(도 2 참고).
2-2. 판 파에코바이러스 실시간 유전자 검출 검사법의 프라이머 및 프로브 농도 조건 확립
농도 조건 최적화 시 고려할 사항은 각 표적 지역의 증폭곡선의 △Rn 값 및 linear phase의 기울기를 조절하고, 각 TaqMan 프로브의 형광 물질들의 상호교차 현상을 최소화하기 위해서 프로브의 농도를 조절할 것, 단일 프라이머 및 프로브 조건에서와 증폭 효율을 유사하게 맞출 것을 고려하였다.
판 파에코바이러스 단일 프라이머 및 프로브 세트 반응액과 내부양성대조군이 혼합된 프라이머 및 프로브 세트 반응액 간에 증폭 곡선의 효율을 Ct 값과 증폭곡선 모양을 통해서 비교하였으며 최종 조건을 확립하였으며 조건 확립시 사용한 시료는 파에코바이러스 2, 3의 RNA를 사용하였다.
내부양성대조군인 EPC는 판 파에코바이러스의 증폭 효율에 지장을 주지 않도록 최적화된 프라이머 및 프로브 농도 조건을 사용하였다(표 2 참고).
| Target | Detection channel | Primer/Probe | Final Concentration (nM) |
| Pan HpeV | FAM | Forward primer | 500 |
| Reverse primer | 500 | ||
| Probe | 200 | ||
| EPC | JOE | Reverse primer | 75 |
| Reverse primer | 75 | ||
| Probe | 75 |
최종 확립된 프라이머 및 프로브 세트의 효율 확인 시험 결과는 표 3 및 도 3과 같다.
| Dilution |
Ct mean
(n=2) |
|
|
Pan HpeV
singleplex |
Pan HpeV + EPC Multiplex | |
| D1 | 22.6 | 22.0 |
| D2 | 26.1 | 25.4 |
| D3 | 29.8 | 29.2 |
| D4 | 33.4 | 33.1 |
2-3. Master Mix 선정 및 최적화
최적의 성능을 확보할 수 있는 Real-time RT-PCR Master Mix를 선정하기 위해서 동일한 프라이머 및 프로브 혼합 조건을 이용해 네 가지의 Master Mix 간의 성능 비교 테스트를 수행하였다.
Real-time PCR Master Mix A 반응액은 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 4 μL, ２X RT-PCR Master Mix 10 μL, 25X RT enzyme buffer 0.8 μL와 단계적으로 희석한 RNA 5 μL 및 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 μL로 맞추었다.
Real-time PCR Master Mix B 반응액은 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 4 μL, 2X Real-time Master Mix 10 μL와 단계적으로 희석한 RNA 5 μL 및 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 μL로 맞추었다.
Real-time PCR Master Mix C 반응액은 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 4 μL, 2X Real-time Master Mix 10 μL와 단계적으로 희석한 RNA 5 μL 및 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 μL로 맞추었다.
Real-time PCR Master Mix D 반응액은 각 농도로 혼합한 프라이머 및 프로브 시약 4 μL, 2X Real-time Master Mix 11 μL와 단계적으로 희석한 RNA 5 μL 및 TE buffer를 첨가하여 최종 볼륨을 20 μL로 맞추었다.
PCR 조건은 50℃에서 30분간 역전사 처리 과정을 진행하고 95℃에서 10분간 Taq polymerase를 활성화시킨 후, 95℃ 15초 및 60℃ 1분을 1 cycle로 하여 총 40 cycle을 수행하였다.
판 파에코바이러스 양성시료를 이용한 Master Mix 별 성능 비교 시험결과 Maser mix B 반응액 사용 시 상대적으로 빠른 Ct 값을 확인하였다(도 4 참고).
따라서 가장 좋은 검출효율을 나타낸 Real-time PCR Master Mix B 시약을 본 연구개발의 주 성분으로 최종 결정하였으며, Mater mix B는 Thermo Fisher사의 One step RT-PCR Master mix를 최적화한 2X Real-time RT-PCR Master Mix를 제품개발에 사용하였다.
최종적으로 판 파에코바이러스의 조건확립된 프라이머 및 프로브의 농도 조건과 Master mix를 확립하였다. 표 4는 최종 결정된 Real-time PCR 반응액에 대한 것이다.
| Components |
Volume
(μL) |
| Pan HpeV Primer/probe mix (Final Conc.: F primer 500 nM, R primer-1. 2 각 500 nM, Probe 200 nM) |
1 |
| EPC Primer/probe mix (Final Conc.: F primer 50 nM, R primer 50 nM, Probe 50 nM) |
1 |
| EPC template DNA | 1 |
| 2X Real-time RT-PCR Master Mix | 10 |
| TE buffer | 2 |
판 파에코바이러스의 Master mix 별 검출효율 비교 테스트 결과는 표 5 및 도 4와 같다.
| Dilution |
Ct mean
(n=2) |
|||
| A | B | C | D | |
| D1 | 19.7 | 17.5 | 20.8 | 23.2 |
| D2 | 21.9 | 20.7 | 24.5 | 23.8 |
| D3 | 26.3 | 24.5 | 28.7 | 30.6 |
실시예3. 판 파에코바이러스 실시간 유전자 검출 검사법의 성능평가
3-1. 판 파에코바이러스 실시간 유전자 검출 검사법의 분석적 특이도
개발한 판 파에코바이러스 실시간 유전자 검출 검사법의 특이성을 교차반응시험을 통해 확인하였다. 유사한 증상의 원인이 될 수 있는 다른 병인체 및 human genomic RNA를 포함한 핵산을 이용하여 Real-time RT-PCR을 수행한 후 각각의 시료에 대한 검출 결과를 분석하였고 시험에 사용한 물질은 용역과제 주관기관, NCCP 국가병원체자원은행, KCTC 생물자원센터(Korean Collection for Type cultures), ATCC (American Type Culture Collection)에서 분양 받거나 Vircell S.L (Santafe, Spain)에서 핵산을 구입하여 사용하였다.
교차반응 시험 결과 해당 시료에서만 형광 채널에서 검출반응이 일어났고 다른 종의 핵산에서는 검출반응이 일어나지 않았고(표 6), IC는 모든에서 증폭반응을 일으켜 검사 샘플 질평가를 위한 확인되었으며 본 연구 과제용 시약의 특이성을 입증하였다.
| Category | Organism | Reference | Pan HpeV (FAM) |
EPC
(JOE) |
| Respiratory infectious pathogens | Varicella-zoter Virus | KDCA | - | + |
|
Human
parechovirus 1 |
+ | + | ||
|
Human
parechovirus 2 |
+ | + | ||
|
Human
parechovirus 3 |
+ | + | ||
| Herpes Simplex virus 1 |
NCCP 43109 | - | + | |
| Herpes Simplex virus 2 |
NCCP 43108 | - | + | |
| Parainfluenza virus 1 |
KBPV-VR-44D | - | + | |
| Parainfluenza virus 2 |
KBPV-VR-45D | - | + | |
| Parainfluenza virus 3 |
KBPV-VR-67D | - | + | |
| Adenovirus | NCCP 43150 | - | + | |
| Respiratory syncytial virus A |
NCCP 43238 | - | + | |
| Respiratory syncytial virus B |
NCCP 43239 | - | + | |
| Mumps virus | KDCA | - | + | |
| Rubella virus | - | + | ||
| Measles virus | MBC046 | - | + | |
| Dengue virus | MBC058 | - | + | |
| Influenza virus | Influenza virus A (H1N1) |
MBC028 | - | + |
| Influenza virus A (H3) | MBC029 | - | + | |
| Influenza virus B | MBC030 | - | + | |
| Coronavirus |
||||
| Human coronavirus NL63 |
EVAg | - | + | |
| Human coronavirus 229E |
EVAg | - | + | |
| Human coronavirus OC43 |
EVAg | - | + | |
| Human coronavirus NL63 |
NCCP 43214 | - | + | |
| SARS-CoV-2 | NCCP 43326 | - | + | |
| Enterovirus | Coxsackievirus CA16 | NCCP 41207 | - | + |
| Coxsackievirus | NCCP 43221 | - | + | |
| Coxsackievirus B4 | NCCP 41203 | - | + | |
| Coxsackievirus B4 | NCCP 41204 | - | + | |
| Coxsackievirus B2 | NCCP 41206 | - | + | |
| Coxsackievirus B2 | NCCP 41201 | - | + | |
| Coxsackievirus B5 | NCCP 41205 | - | + | |
| Coxsackievirus B3 | NCCP 41202 | - | + | |
| Enterovirus 68 | MBC125 | - | + | |
| Enterovirus 71 | MBC019 | - | + | |
| Host | Human RNA | Promega | - | + |
3-2. 판 파에코바이러스 실시간 유전자 검출 검사법의 직선성 확인
시험법에 있어 직선성이란 검체 중에 함유되어있는 분석 대상물질(target analyte)의 양에 정비례하는 결과를 제공할 수 있는 능력을 말하며 시험 기준은 1/10씩 단계 희석한 시험물질을 이용하며 표준곡선을 작성하였다.
표준곡선 검사용 RNA를 사용하여 얻은 Ct값 평균을 Y축으로 각각의 농도에 log를 취한 값 Log(concentration) 을 X축으로 하여 작성한 표준곡선 결과를 검증한 후 농도정보가 없는 바이러스 시료의 농도를 측정 가능하다. 표준곡선의 선형도(R2값) 과 선형의 기울기값을 통한 PCR efficency를 통해 판 파에코바이러스 프라이머/프로브 세트가 정량에 사용가능 여부를 검증하며 표준곡선의 선형도(R2값)가 0.98 이상일 때 적합함을 의미한다.
농도(copies/μL)를 알고 있는 합성유전자(표적지역을 포함하는 올리고뉴클레오티드)를 이용해서 작성한 파에코바이러스 1, 2, 3의 표준곡선의 선형도가 적합함을 확인한 후 주관부서로부터 제공받은 판 파에코바이러스의 RNA의 농도를 측정하였으며 정량을 수행하였다.
Copy 수를 확인한 시료를 이용하여 총 3종류의 RNA에 대해 직선성을 측정하였고, 각 시료를 TE buffer를 이용해 10배씩 순차적으로 희석한 뒤, 주형 RNA로 사용하여 PCR을 수행, 측정 Ct 값과 농도를 이용해 표준곡선을 작성한 결과 모두 R2값이 0.99 이상으로 유효한 것을 확인하였다(표 7 : 파에코바이러스 1의 직선성 확인 Ct 측정값, 표 8 : 파에코바이러스 2의 직선성 확인 Ct 측정값, 표 9 : 파에코바이러스 3의 직선성 확인 Ct 측정값).
| Concentration (copies/μL) | Repeat 1 | Repeat 2 | Repeat 3 | Ct mean | SD |
| 100,000 | 19.2 | 19.4 | 19.4 | 19.3 | 0.1 |
| 10,000 | 22.8 | 23.0 | 22.8 | 22.9 | 0.1 |
| 1,000 | 26.5 | 26.3 | 26.3 | 26.4 | 0.1 |
| 100 | 29.1 | 29.5 | 29.6 | 29.4 | 0.3 |
| 10 | 32.9 | 32.7 | 33.0 | 32.8 | 0.1 |
| R2 | 0.997 | ||||
| Concentration (copies/μL) | Repeat 1 | Repeat 2 | Repeat 3 | Ct mean | SD |
| 100,000 | 19.7 | 19.8 | 19.8 | 19.8 | 0.1 |
| 10,000 | 23.4 | 23.3 | 23.2 | 23.3 | 0.1 |
| 1,000 | 27.3 | 27.0 | 26.5 | 27.0 | 0.4 |
| 100 | 31.0 | 30.7 | 30.4 | 30.7 | 0.3 |
| 10 | 35.2 | 34.7 | 34.5 | 34.8 | 0.4 |
| R2 | 0.998 | ||||
| Concentration (copies/μL) | Repeat 1 | Repeat 2 | Repeat 3 | Ct mean | SD |
| 100,000 | 20.7 | 20.6 | 20.7 | 20.6 | 0.0 |
| 10,000 | 24.3 | 24.4 | 24.2 | 24.3 | 0.1 |
| 1,000 | 27.9 | 27.7 | 27.8 | 27.8 | 0.1 |
| 100 | 31.3 | 30.9 | 31.0 | 31.1 | 0.2 |
| 10 | 33.8 | 33.9 | 33.9 | 33.9 | 0.1 |
| R2 | 0.994 | ||||
3-3. 판 파에코바이러스 실시간 유전자 검출 검사법의 최소검출한계 및 판정기준치 확인
판정기준치(cut-off)는 경계치 이상을 양성으로 경계 미만을 음성으로 볼 수 있는 경계 값을 말하는데 민감도로 추정되는 3구간을 20 반복 수행하여 결정하였다. 앞서, 직선성 테스트 결과 동일 농도(10 copies/μL) 시료에서 Ct값이 가장 높게 나타나고 증폭효율이 가장 낮은 파에코바이러스 2 RNA를 사용, 10 copies/μL의 시료를 기준으로 3배씩 단계 희석한 민감도 부근의 0.33, 1.11, 0.37 copies/μL를 20회 반복 수행하여 20개가 모두 검출되는 가장 낮은 농도의 copy 수를 최소검출한계로 결정하였다(표 10). 최소검출한계의 20반복 평균과 표준편차를 이용하여 판정기준치를 확인하였다. 20 반복 결과 20번 모두 검출된 가장 낮은 농도인 3.33 copies/μL로 최소검출한계로 결정하였으며 판정기준치는 계산식에 따라 Ct 36.0으로 결정하였다.
[계산식] 판정기준치 = Ct값의 평균 + (2 x Ct값의 표준편차)
| 반복 횟수 | Ct | ||
| 3.33 copies/μL | 1.11 copies/μL | 0.37 copies/μL | |
| 1 | 34.9 | ND | 35.0 |
| 2 | 34.6 | 39.1 | 36.0 |
| 3 | 34.5 | 38.9 | 35.0 |
| 4 | 34.5 | 37.7 | ND |
| 5 | 34.4 | 37.6 | 37.4 |
| 6 | 34.3 | 37.5 | ND |
| 7 | 34.3 | 36.3 | ND |
| 8 | 34.0 | ND | ND |
| 9 | 33.8 | 36.1 | 37.3 |
| 10 | 33.8 | 36.1 | 37.5 |
| 11 | 33.7 | 34.1 | 35.0 |
| 12 | 33.7 | 36.0 | 37.2 |
| 13 | 33.7 | 36.0 | 36.0 |
| 14 | 33.7 | 36.0 | ND |
| 15 | 33.6 | 35.1 | 36.0 |
| 16 | 33.5 | 35.0 | 37.4 |
| 17 | 33.5 | 34.8 | ND |
| 18 | 36.0 | 34.7 | ND |
| 19 | 36.1 | 34.7 | ND |
| 20 | 34.5 | 34.6 | 37.4 |
| Average | 34.3 | 36.1 | 36.5 |
| Positive | 20 | 18 | 12 |
| Detection % | 100 | 90 | 60 |
실시예 4. 판 파에코바이러스 실시간 유전자 검출 검사법의 임상적 성능
판 파에코바이러스 검사를 위한 주요 시료인 분변시료에 병원체 감염이 확인되지 않은 음성시료를 이용하여 핵산을 추출하였다. 추출한 핵산 시료를 음성 매트릭스로 사용하여 농도를 측정한 파에코바이러스 genomic RNA를 첨가하여 조제양성시료를 준비하였다. 조제된 양성시료와 음성시료를 사용하여 시험한 결과, 조제한 양성시료에 대한 양성 일치율 100% (민감도 확인), 음성시료 50개에 대한 일치율 100% (특이도) 확인하였다(표 11 : 판 파에코바이러스 임상적 성능 결과, 표 12 : 판 파에코바이러스 검출 검사법의 HpeV-1 양성 시료 20개 Ct값, 표 13 : 판 파에코바이러스 검출 검사법의 HpeV-2 양성 시료 20개 Ct값, 표 14 : 판 파에코바이러스 검출 검사법의 HpeV-3 양성 시료 20개 Ct값, 표 15 : 판 파에코바이러스 검출 검사법의 음성 시료 50개 Ct값).
| 시료 갯수 | 조제양성 및 음성 검체의 예상결과 | |||
| 양성 | 음성 | 전체 | ||
|
신규 개발한
검사법 결과 (qPCR) |
양성 | 60 | 0 | 60 |
| 음성 | 0 | 50 | 50 | |
| 판정불가 | 0 | 0 | 0 | |
| 전체 | 60 | 50 | 110 | |
|
양성 일치율
(Positive Agreement Percent) |
60/60; 100% (95% CI 94.04% to 100.00%) | |||
|
음성 일치율
(Positive Agreement Percent) |
50/50; 100% (95% CI 92.89% to 100.00%) | |||
| No. | Concentration | Ct Value | |
| Pan HpeV (FAM) | EPC (JOE) | ||
| 1 | 3x LoD | 31.7 | 24.6 |
| 2 | 3x LoD | 31.6 | 24.5 |
| 3 | 3x LoD | 32.2 | 24.5 |
| 4 | 3x LoD | 31.6 | 24.4 |
| 5 | 3x LoD | 31.7 | 24.4 |
| 6 | 2x LoD | 32.1 | 24.6 |
| 7 | 2x LoD | 32.1 | 24.5 |
| 8 | 2x LoD | 32.7 | 24.5 |
| 9 | 2x LoD | 32.2 | 24.4 |
| 10 | 2x LoD | 32.5 | 24.4 |
| 11 | 1.5x LoD | 33.0 | 24.5 |
| 12 | 1.5x LoD | 32.9 | 24.6 |
| 13 | 1.5x LoD | 32.8 | 24.4 |
| 14 | 1.5x LoD | 32.8 | 24.4 |
| 15 | 1.5x LoD | 32.7 | 24.4 |
| 16 | 1.5x LoD | 32.7 | 24.3 |
| 17 | 1.5x LoD | 32.6 | 24.4 |
| 18 | 1.5x LoD | 32.6 | 24.3 |
| 19 | 1.5x LoD | 32.6 | 24.3 |
| 20 | 1.5x LoD | 32.5 | 24.3 |
| No. | Concentration | Ct Value | |
| Pan HpeV (FAM) | EPC (JOE) | ||
| 1 | 3x LoD | 32.7 | 23.2 |
| 2 | 3x LoD | 33.0 | 23.1 |
| 3 | 3x LoD | 32.6 | 23.5 |
| 4 | 3x LoD | 33.9 | 23.4 |
| 5 | 3x LoD | 32.8 | 23.0 |
| 6 | 2x LoD | 35.1 | 23.2 |
| 7 | 2x LoD | 33.8 | 23.3 |
| 8 | 2x LoD | 34.9 | 23.3 |
| 9 | 2x LoD | 35.0 | 23.2 |
| 10 | 2x LoD | 33.9 | 23.2 |
| 11 | 1.5x LoD | 34.9 | 23.2 |
| 12 | 1.5x LoD | 34.6 | 23.2 |
| 13 | 1.5x LoD | 34.8 | 23.3 |
| 14 | 1.5x LoD | 35.4 | 23.5 |
| 15 | 1.5x LoD | 36.0 | 23.3 |
| 16 | 1.5x LoD | 37.4 | 23.3 |
| 17 | 1.5x LoD | 34.6 | 23.3 |
| 18 | 1.5x LoD | 34.3 | 23.3 |
| 19 | 1.5x LoD | 35.4 | 23.1 |
| 20 | 1.5x LoD | 35.1 | 23.3 |
| No. | Concentration | Ct Value | |
| Pan HpeV (FAM) | EPC (JOE) | ||
| 1 | 3x LoD | 33.2 | 23.0 |
| 2 | 3x LoD | 34.0 | 22.8 |
| 3 | 3x LoD | 33.1 | 22.8 |
| 4 | 3x LoD | 33.9 | 22.8 |
| 5 | 3x LoD | 33.0 | 22.7 |
| 6 | 2x LoD | 34.0 | 22.6 |
| 7 | 2x LoD | 33.7 | 22.7 |
| 8 | 2x LoD | 33.8 | 22.5 |
| 9 | 2x LoD | 33.6 | 22.7 |
| 10 | 2x LoD | 33.7 | 22.5 |
| 11 | 1.5x LoD | 37.1 | 22.5 |
| 12 | 1.5x LoD | 36.4 | 22.5 |
| 13 | 1.5x LoD | 36.3 | 22.5 |
| 14 | 1.5x LoD | 36.2 | 22.6 |
| 15 | 1.5x LoD | 36.2 | 22.6 |
| 16 | 1.5x LoD | 36.1 | 22.7 |
| 17 | 1.5x LoD | 36.1 | 22.6 |
| 18 | 1.5x LoD | 36.0 | 22.7 |
| 19 | 1.5x LoD | 35.7 | 22.5 |
| 20 | 1.5x LoD | 35.5 | 22.7 |
| No. | Ct Value | |
| Pan HpeV (FAM) | EPC (JOE) | |
| 1 | ND | 23.7 |
| 2 | ND | 23.7 |
| 3 | ND | 23.6 |
| 4 | ND | 23.9 |
| 5 | ND | 23.6 |
| 6 | ND | 23.6 |
| 7 | ND | 23.7 |
| 8 | ND | 23.6 |
| 9 | ND | 23.6 |
| 10 | ND | 23.6 |
| 11 | ND | 23.7 |
| 12 | ND | 23.8 |
| 13 | ND | 23.7 |
| 14 | ND | 23.5 |
| 15 | ND | 23.6 |
| 16 | ND | 23.6 |
| 17 | ND | 23.6 |
| 18 | ND | 23.6 |
| 19 | ND | 23.7 |
| 20 | ND | 23.5 |
| 21 | ND | 23.5 |
| 22 | ND | 23.6 |
| 23 | ND | 23.6 |
| 24 | ND | 23.6 |
| 25 | ND | 23.7 |
| 26 | ND | 23.6 |
| 27 | ND | 23.5 |
| 28 | ND | 23.5 |
| 29 | ND | 23.6 |
| 30 | ND | 23.6 |
| 31 | ND | 23.6 |
| 32 | ND | 23.5 |
| 33 | ND | 23.6 |
| 34 | ND | 23.6 |
| 35 | ND | 23.6 |
| 36 | ND | 23.6 |
| 37 | ND | 23.7 |
| 38 | ND | 23.6 |
| 39 | ND | 23.6 |
| 40 | ND | 23.6 |
| 41 | ND | 23.7 |
| 42 | ND | 23.6 |
| 43 | ND | 23.7 |
| 44 | ND | 23.6 |
| 45 | ND | 23.6 |
| 46 | ND | 23.7 |
| 47 | ND | 23.6 |
| 48 | ND | 23.7 |
| 49 | ND | 23.6 |
| 50 | ND | 23.6 |
<110> Korea Disease Control and Prevention Agency
<120> Method for detection and quantification of Pan Human parechovirus
using real-time polymerase chain reaction
<130> PN2104-175
<160> 7
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F-primer
<400> 1
aacactagtt gtaaggccca 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R-primer-1
<400> 2
tcagatccat agtgtcwctt gt 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R-primer-2
<400> 3
ccagatcaga tccatagtgt c 21
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 4
aggatgccca gaaggta 17
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> F-primer
<400> 5
gacatcgata tgggtgccg 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> R-primer
<400> 6
cgagacgatg cagccattc 19
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 7
tctcatgcgt ctccctggtg 20
Claims (11)
- 각각 500 nM 농도의 서열번호 1, 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 200 nM 농도의 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프로브;를 포함하는, 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus)의 검출 또는 정량용 조성물에서,
상기 프라이머 세트의 표적 위치는 5’UTR인 것을 특징으로 하는, 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,
상기 프로브는 5'-말단에 형광 표지인자(reporter dye) 가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제 4 항에 있어서,
상기 형광 표지인자는 FAM(6-carboxyfluorescein), JOE, HEX(hexachloro-6- carboxyfluorescein), TET(tetrachlorofluorescein), 텍사스 레드(texas red), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), NED(N-(1-naphthyl ethylenediamine), Cy5(cyanine-5) 및 Cy3(cyanine-3) 로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물. - 제 1 항, 제 4 항 또는 제 5 항의 조성물을 포함하는 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus)의 검출 또는 정량용 키트.
- 제 6 항에 있어서,
상기 키트는 DNA 중합효소, dNTP, 버퍼 또는 EPC를 추가적으로 더 포함하는 것을 특 징으로 하는 키트. - 제 6 항에 있어서,
상기 키트는 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 키트. - 시료로부터 분리된 RNA에 대하여 각각 500 nM 농도의 서열번호 1, 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 200 nM 농도의 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 을 수행하고 분석하는 단계를 포함하는 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 의 검출 방법.
- 제 9 항에 있어서, 상기 분석에서 Ct 값이 확인되면 시료 내에 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus)가 존재하는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 시료로부터 분리된 RNA에 대하여 각각 500 nM 농도의 서열번호 1, 2 및 3의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트; 및 200 nM 농도의 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real-time polymerase chain reaction) 을 수행하여 얻은 Ct 값을 표준 검량선에 대입하는 단계를 포함하는 판 파에코바이러스(Pan Human parechovirus) 의 정량 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210139460A KR102514970B1 (ko) | 2021-10-19 | 2021-10-19 | 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 판 파에코바이러스 검출 및 정량 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210139460A KR102514970B1 (ko) | 2021-10-19 | 2021-10-19 | 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 판 파에코바이러스 검출 및 정량 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102514970B1 true KR102514970B1 (ko) | 2023-03-29 |
Family
ID=85800128
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210139460A KR102514970B1 (ko) | 2021-10-19 | 2021-10-19 | 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 판 파에코바이러스 검출 및 정량 방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102514970B1 (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102200925B1 (ko) | 2019-07-30 | 2021-01-13 | 대한민국(질병관리청장) | 보툴리눔균 (독소 a형)을 포함하는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 15종을 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험방법 |
-
2021
- 2021-10-19 KR KR1020210139460A patent/KR102514970B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102200925B1 (ko) | 2019-07-30 | 2021-01-13 | 대한민국(질병관리청장) | 보툴리눔균 (독소 a형)을 포함하는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 15종을 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험방법 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GenBank Accession number MN265386 (2020.05.03.)* * |
| Lu 등, Research square, 페이지 1-19 (2021.07.26.)* * |
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