KR102200925B1 - 보툴리눔균 (독소 a형)을 포함하는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 15종을 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험방법 - Google Patents
보툴리눔균 (독소 a형)을 포함하는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 15종을 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 출원은 15종의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험 방법과 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 검출용 프라이머 세트를 제공한다. 본 출원에 따른 시험방법은 동시에 복수의 종을 신속하게 실시간으로 검출할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 출원은 보툴리눔균 (독소 A형)을 포함하는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 15종을 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험방법, 이를 검출하기 위한 프라이머 세트에 관한 것이다.
생물테러의 목적으로 이용되거나 사고 등에 의하여 외부에 유출될 경우 국민 건강에 심각한 위험을 초래할 수 있는 감염병 병원체를 생물테러 병원체라 한다.
생물테러 병원체와 그의 아형의 종류로는, 보툴리눔균(Clostridium botulinum), 보툴리눔균 (독소 A형)(Clostridium botulinum neurotoxin A), 보툴리눔균 (독소 B형)(Clostridium botulinum neurotoxin B), 보툴리눔균 (독소 E형)(Clostridium botulinum neurotoxin E), 드물게 보툴리눔균 (독소 F형) (Clostridium botulinum neurotoxin F), 탄저균(Bacillus anthracis), 페스트균(Yersinia pestis), 야토균(Francisella tularensis), 야토균 A형(Francisella tularensis subsp. Tularensis), 야토균 B형(Francisella tularensis subsp. Holarctica), 야토균 아형 Novicida(Francisella tularensis subsp. Novicida), 두창 바이러스(variola virus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 원숭이폭스 바이러스(monkeypox virus), 수두 바이러스(Varicella zoster virus) 등이 있다.
보툴리눔 독소증은 이완성 신경마비(Flaccid paralysis) 질환으로, 병의 원인물질은 보툴리눔균(Clostridium botulinum)이라는 그람 양성의 혐기성 세균에서 생성되는 강력한 단백질 독소성분이다. 보툴리눔 독소는 혈청형에 따라 A에서 G까지 7가지 형으로 구분되며 보툴리눔균 (독소 A형)(Clostridium botulinum neurotoxin A), 보툴리눔균 (독소 B형)(Clostridium botulinum neurotoxin B), 보툴리눔균 (독소 E형)(Clostridium botulinum neurotoxin E), 드물게 보툴리눔균 (독소 F형)(Clostridium botulinum neurotoxin F)이 사람에게 보툴리눔 독소증을 일으킨다.
탄저는 탄저균(Bacillus anthracis)이 원인 병원체로 일반적 감염과정은 탄저균이 생성하는 내생 포자가 토양에 방출되어 영양세포로 생장한 후 초식동물에 의해 섭취되는 형태로 감염된다. 인간에게는 피부나 위장관을 통하여 감염되는 것이 일반적이며, 감염된 동물이나 부산물을 다루는 과정이나 오염된 동물을 섭취함으로써 감염된다.
페스트는 페스트균(Yersinia pestis) 감염에 의해 발생되는데 흔히 벼룩에 물려 전파되며 인간과 동물에 모두 감염을 일으키는 인수공동 전염병이다. 일반적인 보균체는 설치류이다.
야토병(Tularemia)은 그람 음성 세균인 야토균(Francisella tularensis)에 의해 감염된다. 일반적으로 감염성이 매우 높고 전파가 용이하며 질환의 치사율이 높은 것으로 알려져 있다. 야토균은 아형으로 야토균 A형(Francisella tularensis subsp. Tularensis), 야토균 B형(Francisella tularensis subsp. Holarctica), 야토균 아형 Novicida(Francisella tularensis subsp. Novicida) 등이 있다.
두창(smallpox)은 두창 바이러스(variola virus)에 의해 감염되고, 호흡기, 타액, 직접 접촉 등으로 감염되며, 사람이 숙주이다. 병증과 사망률에 따라 대두창(variola major)와 소두창(variola minor)으로 분류되는데, 대두창은 사망률이 15~40%에 이른다.
백시니아 바이러스(vaccinia virus)는 우두를 일으키는 바이러스로, 천연두를 박멸한 백신의 활성 성분이다.
원숭이폭스 바이러스(monkeypox virus)는 감염시 두창과 유사한 증상과 림프절 종대를 보인다. 감염된 동물에게 물리거나 직접 접촉하거나, 호흡기를 통해 감염된다. 숙주는 사람, 다람쥐, 영장류, 쥐, 돼지, 토끼 등이다.
수두 바이러스(Varicella zoster virus)는 급성 발진성 감염병인 수두(varicella)와 대상포진(herpes zoster)을 유발하는 병원체이다. 수두 바이러스는 전염력이 매우 강하고, 가장 흔한 전파 경로는 호흡기 분비물에 의한 사람간 전파이다.
중합효소 연쇄반응(Polymerase chain reaction, PCR)은 유전자 증폭장치를 이용하여 표적이 되는 특정 유전자를 연쇄적으로 복제하여 기하 급수적으로 증폭시키는 기술로 생명과학, 의학분야 등에서 사용되고 있다.
일반 중합효소 연쇄반응(conventional PCR) 방법을 이용하는 고위험성 병원체 검출 시약은 시험 결과를 판독하기 위한 별도의 추가 과정이 요구되므로 시간이 많이 소모되고 노동 집약적이며 상대적으로 낮은 민감도를 갖는 단점이 있다.
이러한 단점을 보완하기 위해 개발된 시험법이 실시간 중합효소 연쇄반응 기술로서, 이 기술은 열순환기(thermal cycler)와 분광형광광도계가 일체화된 장치를 이용하여 검출 시약에 포함된 형광물질의 종류, 반응량에 따라 증폭산물을 실시간으로 관찰 가능하다.
생물테러 병원체에 의한 테러 등의 위기 상황의 발생 시 병원체를 신속하게 분석하여 즉각적인 의사결정을 내릴 수 있는 현장진단법은 아직 도입되지 않은 실정이다. 또한, 여러 종의 병원체가 섞여 있는 경우 이들을 동시에 검출할 필요도 있다.
현장에서 주로 이용되는 면역크로마토그래피 시험법으로는 검출 가능한 병원체가 한정되어 있어 검출 가능한 병원체의 확대가 요구되고 있다. 또한 면역크로마토그래피 시험법의 경우, 민감도 개선 필요성이 제기됨에 따라 이를 보완할 수 있는 실시간 유전자증폭장비(real-time PCR)에서 운용될 수 있는 현장진단법이 필요하다.
따라서, 여러 종의 생물테러 병원체에 대하여 현장에서 동시에 신속하게 검출할 수 있는 방법의 개발이 필요하다.
본 출원이 해결하고자 하는 과제는, 보툴리눔균 (독소 A형)을 포함하는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체들을 동시에 신속하게 검출할 수 있는 실시간 유전자 시험 방법을 제공하는 것이다.
본 출원이 해결하고자 하는 다른 과제는, 보툴리눔균 (독소 A형)을 포함하는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체들을 동시에 그리고 신속하게 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 출원이 해결하고자 하는 다른 과제는, 여러 종의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 동시에 검출할 수 있는 검출용 조성물과 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 출원의 하나의 실시예는, 검체로부터 채취한 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; 분리된 DNA에 하기 프라이머 세트를 처리하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 증폭된 산물에서 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체의 존재 유무를 확인하는 단계; 를 포함하고, 상기 프라이머 세트는, 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 (독소 A형)(Clostridium botulinum neurotoxin A)을 검출하기 위한 프라이머 세트와, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균(Clostridium botulinum)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 B형(Clostridium botulinum neurotoxin B)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 E형(Clostridium botulinum neurotoxin E)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 F형(Clostridium botulinum neurotoxin F)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 탄저균(Bacillus anthracis)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 페스트균(Yersinia pestis)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균(Francisella tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 A형(Francisella tularensis subsp. Tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 B형(Francisella tularensis subsp. Holarctica)을 검출하기 위한 프라이머 세트, 서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 아형 Novicida(Francisella tularensis subsp. Novicida)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 34 및 서열번호 35의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 두창 바이러스(Variola virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 37 및 서열번호 38의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 백시니아 바이러스(Vaccinia virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 40 및 서열번호 41의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 원숭이폭스 바이러스(Monkeypox virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및 서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 수두 바이러스(Varicella zoster virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 하나 이상 또는 둘 이상 선택되는 프라이머 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험 방법을 제공한다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 서열을 증폭시키는 단계는, 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 수행될 수 있다.
상기 실시간 PCR은 이격 배치되는 복수의 열 블록; 샘플 용액이 주입되는 유입부; 상기 샘플 용액의 PCR 반응이 수행되는 반응 챔버; 및 상기 샘플 용액이 배출되는 유출부를 포함하고, 상기 복수의 열 블록과 순차적으로 접촉하면서 내부에 상기 샘플 용액의 PCR 반응이 수행되는 PCR 칩; 상기 PCR 칩이 장착되고, 상기 PCR 칩이 상기 복수의 열 블록과 순차적으로 접촉하도록 상기 PCR 칩을 이동시키는 칩 홀더; 및 상기 칩 홀더를 이동시키고, 상기 칩 홀더의 이동 방향을 가이드하는 구동부;를 포함하는 핵산 증폭 장치에서 수행될 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 칩 홀더는, 상기 복수의 열 블록 사이에서 수평 이동하는 제 1 플레이트; 상기 PCR 칩이 탈착 가능하게 결합하는 제 2 플레이트; 및 상기 제 1 플레이트와 상기 제 2 플레이트를 상하 방향으로 연결하는 탄성 연결부를 포함하고, 상기 탄성 연결부는, 상기 제 2 플레이트에 탄성력을 발생시켜, 상기 제 2 플레이트가 상하 방향으로 이동하면서 상기 복수의 열 블록과 순차적으로 접촉하게 할 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예는, 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 (독소 A형)(Clostridium botulinum neurotoxin A)을 검출하기 위한 프라이머 세트와, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균(Clostridium botulinum)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 B형(Clostridium botulinum neurotoxin B)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 E형(Clostridium botulinum neurotoxin E)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 F형(Clostridium botulinum neurotoxin F)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 탄저균(Bacillus anthracis)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 페스트균(Yersinia pestis)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균(Francisella tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 A형(Francisella tularensis subsp. Tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 B형(Francisella tularensis subsp. Holarctica)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 아형 Novicida(Francisella tularensis subsp. Novicida)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 34 및 서열번호 35의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 두창 바이러스(Variola virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 37 및 서열번호 38의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 백시니아 바이러스(Vaccinia virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 40 및 서열번호 41의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 원숭이폭스 바이러스(Monkeypox virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및 서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 수두 바이러스(Varicella zoster virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 하나 이상 또는 둘 이상 선택되는 프라이머 세트를 포함하는 것인, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 출원의 하나의 실시예는 상기 프라이머 세트를 포함하는, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 조성물은 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브와, 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 9의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 12의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 15의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 18의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 21의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 24의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 27의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 30의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 33의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 36의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 39의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 42의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 및 서열번호 45의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 로 이루어진 군으로부터 하나 이상 또는 둘 이상 선택되며, 상기 프라이머 세트에 대응되는 프로브를 포함할 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 프로브는, 5‘말단과 3’말단에 각각 형광물질과 소광제를 포함하고, 복수의 프로브를 포함할 때 각각의 프로브의 5' 말단에 포함된 형광물질이 모두 동일할 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 형광물질은, 6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texas red), Cy3(Cyanine-3) 및 Cy5(Cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 소광제는, BHQ1(Black hole quencher 1), BHQ2(Black hole quencher 2), BHQ3(Black hole quencher 3), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ (Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예는 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 동시 검출용 키트를 제공한다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 키트는 실시간 PCR(real-time PCR)용 키트일 수 있다.
본 출원에 따른 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험 방법은 동시에 복수의 종을 신속하게 실시간으로 검출할 수 있는 장점이 있다.
본 출원의 시험 방법에 따르면, 여러 종의 프라이머를 사용함에도 동일한 온도에서 PCR 증폭을 수행하기 때문에 동시에 복수의 종을 신속하게 검출할 수 있는 장점이 있다.
또한, 본 출원의 시험 방법에 따르면, 여러 종의 프라이머를 동시에 반응시킴에도 복수의 생물테러 병원체 또는 바이러스에 동일한 리포터 형광물질을 사용할 수 있는 장점이 있다.
그리고, 본 출원의 시험 방법에 따르면, 여러 종의 프라이머를 각각의 반응 채널에 주입하고 동시에 반응시킬 수 있는 PCR 칩을 사용하므로 복수의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 신속하게 검출할 수 있는 장점이 있다. 또한, 2개의 열 블록을 포함하는 PCR 장치를 사용함으로써, 더욱 자연스럽고 신속한 PCR 칩의 열 접촉 및 분리를 가능하게 하여 전체 PCR 반응 시간을 줄이는 효과가 있다.
본 출원에 따른 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 검출용 프라이머 세트는 해당 병원체의 유전체 DNA에서만 특이적으로 증폭되고, 다른 병원체에서는 증폭되지 않아 해당 병원체만을 특이적으로 검출할 수 있다. 본 출원의 프라이머 세트를 이용하여 생물 무기 중 특정 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 신속하고 정확하게 분석 검출함으로써 생물 무기에 의한 사고에 신속하게 대처할 수 있다.
본 출원에 따른 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 검출용 프라이머 세트는 15종의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 중 복수 종 또는 15종 모두를 동시에 동일한 조건에서 빠른 시간 내에 검출할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 본 출원의 보툴리눔균 (독소 A형)의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 PCR 수행 시 최소 검출 한계를 확인한 그래프이다.
도 2 및 3은 본 출원의 보툴리눔균 (독소 A형)의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 PCR 수행 시 타균주와의 교차반응 유무를 확인한 결과이다.
도 4는 본 출원의 보툴리눔균 (독소 A형)의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 PCR 수행 시 간섭 물질과의 간섭 반응의 유무를 확인한 결과이다.
도 5는 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치의 하나의 실시예를 도시한 것이다.
도 6은 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치에서 칩 홀더의 하나의 실시예를 도시한 것이다.
도 7은 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치에서 가이드부의 하나의 실시예를 도시한 것이다.
도 8은 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치의 동작을 도시한 것이다.
도 9는 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치에서 칩 패키지의 분해도를 도시한 것이다.
도 2 및 3은 본 출원의 보툴리눔균 (독소 A형)의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 PCR 수행 시 타균주와의 교차반응 유무를 확인한 결과이다.
도 4는 본 출원의 보툴리눔균 (독소 A형)의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 PCR 수행 시 간섭 물질과의 간섭 반응의 유무를 확인한 결과이다.
도 5는 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치의 하나의 실시예를 도시한 것이다.
도 6은 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치에서 칩 홀더의 하나의 실시예를 도시한 것이다.
도 7은 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치에서 가이드부의 하나의 실시예를 도시한 것이다.
도 8은 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치의 동작을 도시한 것이다.
도 9는 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치에서 칩 패키지의 분해도를 도시한 것이다.
이하, 본 출원에 따른 실시예들은 첨부된 도면들을 참조하여 설명한다. 각 도면의 구성 요소들에 참조 부호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 대해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 부호를 가지도록 하고 있음에 유의해야 한다. 또한, 본 출원의 실시예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 출원의 실시예에 대한 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 출원의 실시예들을 설명할 것이나, 본 출원의 기술적 사상은 이에 한정되거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있다. 한편, 이하에서 기재되는 편의상 상하좌우의 방향은 도면을 기준으로 한 것이며, 해당 방향으로 본 출원의 권리범위가 반드시 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 출원의 범주에 포함된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 다른 부분과 "연결"되어 있다고 할 때, 이는 "직접적으로 연결"되어 있는 경우뿐 아니라, 그 중간에 다른 소자를 사이에 두고 "간접적으로 연결"되어 있는 경우도 포함한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 본 출원의 실시예의 구성 요소를 설명하는 데 있어서, 제 1, 제 2, A, B, (a), (b) 등의 용어를 사용할 수 있다. 이러한 용어는 그 구성 요소를 다른 구성 요소와 구별하기 위한 것일 뿐, 그 용어에 의해 해당 구성 요소의 본질이나 차례 또는 순서 등이 한정되지 않는다.
본 출원의 하나의 실시예는, 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 (독소 A형)(Clostridium botulinum neurotoxin A)을 검출하기 위한 프라이머 세트를 포함하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균(Clostridium botulinum)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 B형(Clostridium botulinum neurotoxin B)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 E형(Clostridium botulinum neurotoxin E)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 F형(Clostridium botulinum neurotoxin F)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 탄저균(Bacillus anthracis)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 페스트균(Yersinia pestis)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균(Francisella tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 A형(Francisella tularensis subsp. Tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 B형(Francisella tularensis subsp. Holarctica)을 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 아형 Novicida(Francisella tularensis subsp. Novicida)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 34 및 서열번호 35의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 두창 바이러스(Variola virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 37 및 서열번호 38의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 백시니아 바이러스(Vaccinia virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 서열번호 40 및 서열번호 41의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 원숭이폭스 바이러스(Monkeypox virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및 서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 수두 바이러스(Varicella zoster virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 프라이머 세트를 포함하는, 더욱 구체적으로는 15종의 프라이머 세트를 포함하는, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체의 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 출원에서 용어 "프라이머"란 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머레이즈)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
본 출원에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오타이드는 또한 뉴클레오타이드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프라이머는 본 출원의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 또는 카바메이트와 같이 하전되지 않은 연결체로의 변형을 포함할 수 있다. 또는 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트와 같은 하전된 연결체로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신과 같은 단백질; 아크리딘, 프로랄렌과 같은 삽입제; 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속과 같은 킬레이트화제; 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 또한, 본 출원의 프라이머는 필요한 경우, 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 표지의 예로는, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타아제와 같은 효소, 32P와 같은 방사성 동위원소, 바이오틴과 같은 형광성 분자 및 화학그룹 등이 있다.
본 출원의 하나의 실시예는 상기 프라이머 세트를 포함하는, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 검출용 조성물을 제공한다.
본 출원의 하나의 실시예는 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 보툴리눔균 (독소 A형)(Clostridium botulinum neurotoxin A)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트를 포함하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 보툴리눔균(Clostridium botulinum)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 9의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 보툴리눔균 독소 B형(Clostridium botulinum neurotoxin B)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 12의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 보툴리눔균 독소 E형(Clostridium botulinum neurotoxin E)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 15의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 보툴리눔균 독소 F형(Clostridium botulinum neurotoxin F)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 18의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 탄저균(Bacillus anthracis)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 21의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 페스트균(Yersinia pestis)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 24의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 야토균(Francisella tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 27의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 야토균 A형(Francisella tularensis subsp. Tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 30의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 야토균 B형(Francisella tularensis subsp. Holarctica)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 33의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 야토균 아형 Novicida(Francisella tularensis subsp. Novicida)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 34 및 서열번호 35의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 36의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 두창 바이러스(Variola virus)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 37 및 서열번호 38의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 39의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 백시니아 바이러스(Vaccinia virus)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 40 및 서열번호 41의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 42의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 원숭이폭스 바이러스(Monkeypox virus)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 45의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 수두 바이러스(Varicella zoster virus)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 구체적으로는 둘 이상 선택되는 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 더욱 구체적으로는 15종을 모두 포함하는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 동시 검출용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
본 출원의 하나의 실시예는 상기 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 출원의 하나의 실시예는 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 보툴리눔균 (독소 A형)(Clostridium botulinum neurotoxin A)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트를 포함하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 보툴리눔균(Clostridium botulinum)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 9의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 보툴리눔균 독소 B형(Clostridium botulinum neurotoxin B)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 12의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 보툴리눔균 독소 E형(Clostridium botulinum neurotoxin E)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 15의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 보툴리눔균 독소 F형(Clostridium botulinum neurotoxin F)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 16 및 서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 18의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 탄저균(Bacillus anthracis)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 21의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 페스트균(Yersinia pestis)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 22 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 24의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 야토균(Francisella tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 27의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 야토균 A형(Francisella tularensis subsp. Tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 28 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 30의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 야토균 B형(Francisella tularensis subsp. Holarctica)을 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 33의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 야토균 아형 Novicida(Francisella tularensis subsp. Novicida)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 34 및 서열번호 35의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 36의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 두창 바이러스(Variola virus)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 37 및 서열번호 38의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 39의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 백시니아 바이러스(Vaccinia virus)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 40 및 서열번호 41의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 42의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 원숭이폭스 바이러스(Monkeypox virus)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프라이머와 서열번호 45의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브를 포함하는 수두 바이러스(Varicella zoster virus)를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 세트; 로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 구체적으로는 둘 이상 선택되는 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 더욱 구체적으로는 15종을 모두 포함하는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 출원은 2종 이상의 프라이머 및 프로브 세트를 사용하거나, 15종의 프라이머 및 프로브 세트를 모두 사용하여 동시에 반응시킬 수 있고, 교차반응 없이 복수의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 동시에 검출할 수 있는 장점이 있다. 이때, 복수의 프라이머 및 프로브 세트에 대하여 모두 동일한 변성 단계를 위한 온도, 예를 들어, 90℃ 내지 100℃, 구체적으로는 93℃ 내지 98℃, 더욱 구체적으로는 95℃로 가열 및 유지하여 변성시키고, 동일한 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 위한 온도, 예를 들어, 45℃ 이상, 구체적으로 48℃ 이상, 75℃ 이하, 구체적으로 60℃ 이하, 더 구체적으로 55℃ 이하, 더욱 더 구체적으로 48℃, 52℃ 또는 54℃로 가열 및 유지하여 어닐링 및 연장을 수행할 수 있다.
본 출원에서 용어 "PCR(중합효소 연쇄 반응)"이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다.
본 출원에서 용어 "실시간 PCR(실시간 중합효소 연쇄 반응: real-time Polymerase chain reaction)"이란 중합효소 연쇄 반응을 기반으로 하여 실시간으로 DNA를 증폭시키고, 증폭된 양의 측정을 동시에 하는 방법이다.
본 출원에서 용어 "프로브(probe)"란 유전자 또는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하는데, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고, 보다 용이하게 검출하기 위하여 라벨링 될 수 있다.
프로브로서 이용된 올리고뉴클레오타이드는 또한 뉴클레오타이드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 상기 프로브는 주형이 되는 폴리뉴클레오타이드 서열에 완전하게 상보적인 서열일 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로 상보적인 서열일 수도 있다.
프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 프로브는 본 출원의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 검출할 수 있는 효과를 나타내는 한, 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 또는 카바메이트와 같이 하전되지 않은 연결체로의 변형을 포함할 수 있다. 또는 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트와 같은 하전된 연결체로의 변형을 포함할 수 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그널 펩타이드, 폴리-L-리신과 같은 단백질; 아크리딘, 프로랄렌과 같은 삽입제; 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속과 같은 킬레이트화제; 및 알킬화제를 함유할 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 프로브는, 5‘말단과 3’말단에 각각 형광물질과 소광제를 포함하고, 각각의 프로브의 5' 말단에 포함된 형광물질이 모두 동일할 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 형광물질은, 6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texas red), Cy3(Cyanine-3) 및 Cy5(Cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 구체적으로 FAM일 수 있다.
복수의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 동시 검출용 조성물의 경우 각각의 프로브는 모두 5' 말단에 FAM을 포함할 수 있다. 복수의 반응 챔버 또는 반응 채널마다 상이한 병원성균이 동시에 반응이 이루어지는 방식을 사용하는 경우 복수의 병원성균에 모두 동일한 리포터 형광표지를 사용하여도 검출이 용이한 장점이 있다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 소광제는, BHQ1(Black hole quencher 1), BHQ2(Black hole quencher 2), BHQ3(Black hole quencher 3), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ(Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예는 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 검출용 키트를 제공한다.
본 출원의 하나의 실시예에서, 상기 키트는 실시간 PCR(real-time PCR)용 키트일 수 있다. 상기 키트는 상기 복수의 종, 15종의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 동시에 검출할 수 있다.
상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 프라이머 세트, 프로브, (디옥시)리보뉴클레아제 저해제, 내열성 중합효소 및 반응 완충액 등을 포함할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 반응 완충액은 Taq 중합효소 완충액 및 PCR 완충액 양자를 모두 포함하고 내열성 중합효소는 EF Taq 중합효소 등을 이용할 수 있다. PCR 완충액은 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 성분들의 안정성, 활성 및/또는 지속성(longevity)을 변화시키는, 증폭 반응에 첨가되는 화합물이다. 완충제(buffering agent)는 PCR 증폭 및 부위-특이적 RNase H 절단 활성(site-specific RNase H cleavage activity)과 양립가능하다. 일부 완충제들이 해당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 트리스, 트리신, MOPS(3-(N-모르폴리노)프로판술폰산), 및 HEPES(4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산)을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, PCR 완충액은 일반적으로 KCl, MgCl2, 및 각각의 뉴클레오타이드 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함할 수 있다. 본 출원의 완충액은 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화하기 위한 첨가물질들을 포함할 수 있다. 상기 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 출원의 하나의 실시예는, (a) 검체로부터 채취한 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 DNA에 상기 프라이머 세트를 처리하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및 (c) 상기 증폭된 산물에서 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체의 존재 유무를 확인하는 단계; 를 포함하는, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 검출하는 방법, 또는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험 방법을 제공한다.
상기 검체는 임상시료 또는 환경시료로부터 수득되는 것일 수 있다. 예를 들어, 임상시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨로부터 수득되는 시료일 수 있다.
본 출원의 검출방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 상기 프라이머 및 프로브 세트를 처리할 수 있고, 구체적으로 상기 프라이머 및 프로브 세트는 둘 이상의 세트일 수 있으며, 더욱 구체적으로 15종 모두를 포함하는 세트일 수 있다.
본 출원의 검출방법에 있어서, 상기 (b) 단계는 당업계에서 통상적으로 사용되는 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR), 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction; LCR), Gap-LCR, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self sustained sequence replication), 표적 폴리뉴클레오티드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR), 핵산 염기서열 기반 증폭(nucleic acid sequence based amplification; NASBA), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification), 고리-중재 항온성 증폭(loop-mediated isothermal amplification; LAMP), 다중 중합효소연쇄반응(multiplex Polymerase chain reaction; multiplex PCR), 이중 중합효소연쇄반응(nested Polymerase chain reaction; nested-PCR), 단일 튜브 이중 중합효소연쇄반응(single tube nested Polymerase chain reaction; single tube nested-PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(reverse transperase Polymerase chain reaction; RT-PCR), 역 중합효소연쇄반응(inverse Polymerase chain reaction; inverse PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(real-time Polymerase chain reaction), 또는 실시간 중합효소연쇄반응 정량검사(Real-time Quantitative Polymerase chain reaction; RQ-PCR)등의 방법을 이용하여 수행될 수 있고, 바람직하게는 실시간 중합효소연쇄반응일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 실시간 PCR은 하기 핵산 증폭 장치에서 수행될 수 있다.
본 출원의 검출방법에 있어서, 상기 (b) 단계에서 증폭은 복수의 프라이머 및 프로브 세트에 대하여 모두 동일한 변성 단계를 위한 온도, 예를 들어, 90℃ 내지 100℃, 구체적으로 93℃ 내지 98℃, 더욱 구체적으로 95℃에서 변성시키고, 모두 동일한 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 위한 온도, 예를 들어, 45℃ 이상, 구체적으로 48℃ 이상, 75℃ 이하, 구체적으로 60℃ 이하, 더 구체적으로 55℃ 이하에서, 더욱 더 구체적으로 48℃, 52℃ 또는 54℃로 가열 및 유지하여 어닐링 및 연장을 수행할 수 있다.
도 5는 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치의 일 실시예를 도시한 것이다.
핵산 증폭 장치(1000)는 특정 염기 서열을 갖는 핵산을 증폭하는 PCR(Polymerase Chain Reaction)에 사용하기 위한 장치이다. 예를 들어, 장치(1000)는 이중 가닥의 DNA를 포함하는 샘플 용액을 특정 온도, 예를 들어 90℃ 내지 100℃, 구체적으로 93℃ 내지 98℃, 더욱 구체적으로 95℃로 가열하여 상기 이중 가닥의 DNA를 단일 가닥의 DNA로 분리하는 변성 단계(denaturing step), 상기 샘플 용액에 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프라이머를 제공하고, 상기 분리된 단일 가닥의 DNA와 함께 특정 온도, 예를 들어, 45℃ 이상, 구체적으로 48℃ 이상에서, 75℃ 이하, 구체적으로 60℃ 이하, 더 구체적으로 55℃ 이하에서, 더욱 더 구체적으로 48℃, 52℃ 또는 54℃로 냉각하여 상기 단일 가닥의 DNA의 특정 염기 서열에 상기 프라이머를 결합시켜 부분적인 DNA-프라이머 복합체를 형성하는 어닐링 단계(annealing step) 및 어닐링 단계와 동일한 온도로 유지하여 연장(혹은 증폭) 단계(extension step)를 수행하고, 이와 같은 과정을 예를 들어, 20회 내지 40회로 반복함으로써 특정 염기 서열을 갖는 DNA를 기하급수적으로 증폭시킬 수 있다.
구체적으로, 장치(1000)는, 이격 배치되는 복수의 열 블록(110, 120); 샘플 용액의 PCR 반응이 수행되는 PCR 칩(400); 복수의 열 블록(110, 120)과 순차적으로 접촉하도록 PCR 칩(400)을 이동시키는 칩 홀더(200); 상기 칩 홀더(200)를 이동시키는 구동부(300); 및 PCR 칩(400)을 포함할 수 있다.
열 블록(110, 120)은, 제 1 열 블록(110) 및 제 2 열 블록(120)을 포함할 수 있다. 제 1 열 블록(110) 및 제 2 열 블록(120)은 핵산을 증폭하기 위한 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 온도를 유지하기 위한 것으로서, 제 1 열 블록(110) 및 제 2 열 블록(120)은 각 단계들에 요구되는 필요한 온도를 제공하고, 이를 유지하기 위한 다양한 모듈을 포함하거나 또는 그러한 모듈과 구동 가능하게 연결될 수 있다.
PCR 칩(400)이 장착된 칩 홀더(200)가 각 열 블록(110, 120)의 일 면에 접촉되는 경우, 제 1 열 블록(110) 및 제 2 열 블록(120)은 PCR 칩(400)과의 접촉면을 전체적으로 가열 및 온도 유지할 수 있어서, PCR 칩(400) 내의 샘플 용액을 균일하게 가열 및 온도 유지할 수 있다. 종래 단일 열 블록을 사용하는 장치는 단일 열 블록에서의 온도 변화율이 초당 3 내지 7℃ 범위 내에서 이루어지는데 반해, 본 출원에서는, 각각의 열 블록에서의 온도 변화율이 초당 20 내지 40℃ 범위 내에서 이루어져 PCR 반응 시간을 크게 단축시킬 수 있다.
2개의 열 블록을 포함하기 때문에 비특이적 반응(nonspecific binding) 시간을 감소시킬 수 있고, 특이적 반응(specific binding) 시간에 빨리 도달할 수 있는 장점이 있어서 전체 PCR 반응 시간을 크게 단축시킬 수 있다.
종래 핵산증폭장치에서 시험시 70~100분의 반응 시간이 소요된 것에 비해 본 출원의 핵산증폭장치를 사용한 시험방법의 경우 복수 종 또는 15종 모두를 동시 검출할 경우에도 30분 이내의 반응시간이 소요되는 큰 장점이 있다.
제 1 열 블록(110) 및 제 2 열 블록(120)은 그 내부에 열선(도시되지 않음)이 배치될 수 있다. 열선은 변성 단계, 어닐링 단계 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 온도를 유지하도록 다양한 열원과 구동 가능하게 연결될 수 있고, 열선의 온도를 모니터링하기 위한 다양한 온도 센서와 구동 가능하게 연결될 수 있다. 열선은 제 1 열 블록(110) 및 제 2 열 블록(120) 내부 온도를 전체적으로 일정하게 유지하기 위해 각각의 열 블록 면의 중심점을 기준으로 상하 및/또는 좌우 방향으로 대칭되도록 배치될 수 있다. 상하 및/또는 좌우 방향으로 대칭된 열선의 배치는 다양할 수 있다. 또한, 제 1 열 블록(110) 및 제 2 열 블록(120)은 그 내부에 박막 히터(thin film heater, 도시되지 않음)가 배치될 수도 있다. 박막 히터는 제 1 열 블록(110) 및 제 2 열 블록(120) 내부 온도를 전체적으로 일정하게 유지하기 위해 각각의 열 블록 면의 중심점을 기준으로 상하 및/또는 좌우 방향으로 일정한 간격으로 이격 배치될 수 있다. 상하 및/또는 좌우 방향으로 일정한 박막 히터의 배치는 다양할 수 있다.
제 1 열 블록(110) 및 제 2 열 블록(120)은 동일한 면적에 대한 고른 열 분포 및 신속한 열 전달을 위해 금속 재질, 예를 들어 알루미늄 재질을 포함하거나 또는 알루미늄 재질로 구성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
제 1 열 블록(110)은 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 적정 온도를 유지하도록 구현될 수 있다. 예를 들어, 제 1 열 블록(110)은 45℃ 내지 100℃를 유지할 수 있다. 제 1 열 블록(110)에서 변성 단계를 수행하는 경우, 90℃ 내지 100℃를 유지할 수 있고, 구체적으로는 93℃ 내지 98℃, 더욱 구체적으로 95℃를 유지할 수 있다. 이와 달리, 제 1 열 블록(110)에서 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하는 경우에는 45℃ 이상, 구체적으로는 48℃ 이상에서, 75℃ 이하, 구체적으로 60℃ 이하, 더 구체적으로 55℃ 이하에서, 보다 더 구체적으로 48℃, 52℃ 또는 54℃로 유지하여 어닐링 및 연장을 수행할 수 있다.
마찬가지로, 제 2 열 블록(120) 또한, 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하기 위한 적정 온도를 유지하도록 구현될 수 있다. 예를 들어, 제 2 열 블록(120)은 45℃ 내지 100℃를 유지할 수 있다. 제 2 열 블록(120)에서 변성 단계를 수행하는 경우, 90℃ 내지 100℃를 유지할 수 있고, 구체적으로는 93℃ 내지 98℃, 더욱 구체적으로 95℃를 유지할 수 있다. 이와 달리, 제 2 열 블록(120)에서 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행하는 경우에는 45℃ 이상, 구체적으로는 48℃ 이상에서, 75℃ 이하, 구체적으로 60℃ 이하, 더 구체적으로 55℃ 이하에서, 보다 더 구체적으로 48℃, 52℃ 또는 54℃로 유지하여 어닐링 및 연장을 수행할 수 있다.
다만, 제 1 열 블록(110) 및 제 2 열 블록(120)에서, 변성 단계, 또는 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행할 수 있는 온도라면 이에 제한되는 것은 아니며, 제 1 열 블록(110) 및 제 2 열 블록(120)은 서로 상이한 온도를 유지하도록 구현되는 것이 바람직하다.
제 1 열 블록(110)과 제 2 열 블록(120)은 상호 열 교환이 일어나지 않도록 미리 결정된 거리로 이격 배치될 수 있다. 이에 따라, 제 1 열 블록(110)과 제 2 열 블록(120) 사이에서 열 교환이 일어나지 않기 때문에, 미세한 온도 변화에 의해서도 중대한 영향을 받을 수 있는 핵산 증폭 반응에 있어서, 변성 단계와 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계의 정확한 온도 제어가 가능하다.
칩 홀더(200)는 PCR 칩(400)이 안정적으로 장착되는 공간을 제공하고, 구동부(300)에 의한 움직임을 PCR 칩(400)으로 전달할 수 있다. 칩 홀더(200)의 내벽은 핵산 증폭 반응이 수행되는 경우 PCR 칩(400)이 칩 홀더(200)로부터 이탈하지 않도록 PCR 칩(400)의 외벽과 고정 장착되기 위한 형상 및 구조를 가질 수 있다.
구동부(300)는 PCR 칩(400)이 장착된 칩 홀더(200)를 제 1 열 블록(110) 및 제 2 열 블록(120) 위로 이동 가능하게 하는 모든 수단을 포함할 수 있다. 구동부(300)는 수평 방향으로 연장된 레일 및 레일을 통해 칩 홀더(200)를 이동시키는 모터 부재로 이루어진 가동부를 포함할 수 있다. 이러한 구동부(300)의 수평 이동에 의해, PCR 칩(400)이 장착된 칩 홀더(200)는 제 1 열 블록(110)과 제 2 열 블록(120) 사이에서 왕복 운동할 수 있다.
또한, 구동부(300)의 수평 이동과 함께 또는 개별적으로 칩 홀더(200)는 PCR 칩(400)을 상하 이동시킴으로써 각 열 블록(110, 120)과 PCR 칩(400)을 접촉 및 분리시킬 수 있다. 이를 위해 구동부(300)는 칩 홀더(200)의 상하 운동을 위한 가이드부(310)를 포함할 수 있다.
PCR 칩(400)은 제 1 열 블록(110) 또는 제 2 열 블록(120)의 일 면에 접촉되고, 핵산, 예를 들어 이중 가닥 DNA, 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머, DNA 중합효소, 삼인산화데옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide triphosphates, dNTP), PCR 반응 완충액(PCR reaction buffer)을 포함하는 샘플 용액을 포함할 수 있다. PCR 칩(400)은 샘플 용액이 주입되는 유입부, 샘플 용액의 핵산 증폭 반응이 수행되는 반응 챔버(또는 채널) 및 핵산 증폭 반응을 완료한 샘플 용액을 배출하기 위한 유출부를 포함할 수 있다. PCR 칩(400)이 제 1 열 블록(110) 또는 제 2 열 블록(120)에 접촉하는 경우 제 1 열 블록(110) 또는 제 2 열 블록(120)의 열은 PCR 칩(400)에 전달되고, PCR 칩(400)의 반응 챔버(또는 채널)에 포함된 샘플 용액은 가열 및 온도 유지될 수 있다. 또한, PCR 칩(400)은 전체적으로 평면 형상을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, PCR 칩(400)의 외벽은 핵산 증폭 반응이 수행되는 경우 PCR 칩(400)이 칩 홀더(200)로부터 이탈하지 않도록 칩 홀더(200)의 내부 공간에 고정 장착되기 위한 형상 및 구조를 가질 수 있다.
장치(1000)의 동작 과정을 살펴보면, 먼저, PCR 칩(400)에 핵산, 예를 들어 이중 가닥 DNA, 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머, DNA 중합효소, 삼인산화데옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide triphosphates, dNTP), PCR 반응 완충액(PCR reaction buffer)를 포함하는 샘플 용액을 도입하고, PCR 칩(400)을 칩 홀더(200)에 장착하는 단계를 수행할 수 있다.
그 후 또는 이와 동시에 제 1 열 블록(110)을 변성 단계를 위한 온도, 예를 들어, 90℃ 내지 100℃로 가열 및 유지하고, 구체적으로는 93℃ 내지 98℃, 더욱 구체적으로는 95℃로 가열 및 유지하는 단계를 수행할 수 있다. 제 2 열 블록(120)을 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 위한 온도, 예를 들어, 45℃ 이상, 구체적으로 48℃ 이상, 75℃ 이하, 구체적으로 60℃ 이하, 더 구체적으로 55℃ 이하, 더욱 더 구체적으로 48℃, 52℃ 및 54℃로 가열 및 유지하는 단계를 수행할 수 있다.
구동부(300)를 통해 칩 홀더(200)를 제 1 열 블록(110) 측으로 이동시키고, PCR 칩(400)을 제 1 열 블록(110)에 접촉시켜 PCR의 제 1 변성 단계를 수행할 수 있다.
그 후, 구동부(300)를 통해 칩 홀더(200)를 제 2 열 블록(120) 측으로 이동시키면서, PCR 칩(400)을 제 1 열 블록(110)으로부터 분리시켜 PCR의 제 1 변성 단계를 종료하고, PCR 칩(400)을 제 2 열 블록(120)에 접촉시켜 PCR의 제 1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 수행할 수 있다.
마지막으로, 구동부(300)를 통해 칩 홀더(200)를 제 2 열 블록(120)으로부터 분리시켜 PCR의 제 1 어닐링 및 연장 (혹은 증폭) 단계를 종료함으로써 제 1 순환의 PCR 반응을 완료할 수 있다. 이러한 PCR 반응은 복수 회 수행될 수 있다.
이때, 구동부(300)가 제 1 열 블록(110) 또는 제 2 열 블록(120) 측으로 칩 홀더(200)를 이동시키는 경우, 칩 홀더(200)는 PCR 칩(400)을 하측으로 이동시켜, 각각의 열 블록(110, 120)과 PCR 칩(400)이 접촉하도록 하고, 이와 달리, 제 1 열 블록(110) 또는 제 2 열 블록(120) 측으로부터 중앙으로 칩 홀더(200)를 이동시키는 경우, 칩 홀더(200)가 PCR 칩(400)을 상측으로 이동시켜, 각각의 열 블록과 PCR 칩(400)이 분리되도록 할 수 있다.
즉, 본 출원에서는, 칩 홀더(200)가 PCR 칩(400)을 상하 방향으로 이동시킬 수 있다는 점에서, 구동부(300)가 PCR 칩(400)을 열 블록과 접촉 또는 분리하기 위해 PCR 칩(400) 및/또는 칩 홀더(200)를 상하 방향으로 이동시킬 필요 없으며, 따라서, 구동부(300)가 칩 홀더(200)를 수평 방향으로 이동시키는 동작만으로, 용이하게 PCR 칩(400)이 열 블록(110, 120)과 접촉 또는 분리되면서 PCR 반응이 수행되도록 할 수 있다.
또한, 본 출원에서는 PCR 칩(400)에 대해 수평 운동과 수직 운동이 순차적으로/개별적으로 작용하는 것이 아니라, 동시에 작용한다는 점에서, 보다 자연스럽고 신속한 PCR 칩(400)의 열 접촉 및 분리를 가능하게 할 수 있다.
도 4에서는 칩 홀더(200)에 PCR 칩(400)이 장착되는 것으로 설명되나, 이는 예시적인 것으로서, 실시예에 따라, 칩 홀더(200)에는, 하기 설명되는 PCR 칩 패키지가 장착될 수도 있다. 도 4 및 하기 도 5 내지 도 10에서는 편의상 칩 홀더(200)에 PCR 칩(400)이 배치되는 것으로 기재되지만, 이는 PCR 칩(400) 단독으로 배치되거나, PCR 칩(400)이 PCR 칩 패키지 형태로 배치되는 것을 모두 포함하는 것이다.
도 6은 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치의 칩 홀더의 일 실시예를 도시한 것이다.
칩 홀더(200)는, 제 1 플레이트(210); 제 2 플레이트(230); 및 탄성 연결부(250)를 포함할 수 있다.
제 1 플레이트(210)는, 평판 형상으로 이루어지고, 제 1 연결 부재(212)에 의해 구동부(300)와 연결되어, 구동부(300)에 의해 수평 방향으로 이동할 수 있다.
제 2 플레이트(230)는, 제 1 플레이트(210)와 상하 방향으로 연결될 수 있으며, 하부에 PCR 칩(400)이 장착되는 공간을 제공할 수 있다. 구체적으로, 제 2 플레이트(230)는 양 단부에 내측 방향으로 절곡부가 형성되어 PCR 칩(400) 또는 PCR 칩 패키지가 슬라이딩 결합되도록 할 수 있다.
또한, 제 2 플레이트(230)는 제 2 연결 부재(232)를 구동부(300), 특히 구동부(300)의 가이드부(310)와 연결될 수 있으며, 이를 통해 하기 더 상세히 설명할 바와 같이, 제 1 플레이트(210)의 수평 방향 운동 시에 상하 방향으로 운동할 수 있다.
또한, 제 1 플레이트(210) 및 제 2 플레이트(230)는 서로 대응하는 영역에 관통부(214, 234)가 형성될 수 있는데, 해당 영역은 PCR 칩(400)의 반응 챔버 또는 반응 채널에 대응하는 것으로서, 하기 더 상세히 설명할 바와 같이, PCR 칩(400)이 칩 홀더(200)에 장착된 상태로 PCR 반응 결과를 검출하기 위함이다.
탄성 연결부(250)는, 제 1 플레이트(210)와 제 2 플레이트(230)를 상하 방향으로 연결하기 위한 것으로서, 예를 들어, 스프링 등과 같은 탄성 부재로 이루어질 수 있다. 탄성 연결부(250)는 제 1 플레이트(210)의 수평 운동에 따라 제 2 플레이트(230)는 상하 방향으로 이동시키면서 복수의 열 블록(110, 120)과 순차적으로 접촉하게 할 수 있으며, 제 2 플레이트(230) 측으로 탄성력을 발생시켜 PCR 칩(400)이 열 블록(110, 120)에 보다 긴밀하게 접촉하도록 할 수 있다.
도 7은 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치의 가이드부를 도시한 것이다.
상기 가이드부는, 상기 제 2 플레이트의 연결 부재가 삽입되는 함몰 공간으로 구성되고, 상기 함몰 공간의 저면에 상기 연결 부재가 접촉하되, 상기 저면은 상기 열 블록 방향으로 갈수록 하측으로 굴곡 형성될 수 있다.
구동부(300)의 가이드부(310)는, 칩 홀더(200), 특히 칩 홀더(200)의 제 2 플레이트(230)를 상하 방향으로 운동하도록 하기 위한 것으로서, 수직 방향의 평판으로 구현되며, 일 측면에 함몰 공간(312)이 형성될 수 있다.
가이드부(310)의 상단에는 칩 홀더(200)의 제 1 플레이트(210)의 일 단부가 배치되도록 하여, 제 1 플레이트(210)를 지지할 수 있다
또한, 가이드부(310)의 함몰 공간(312)에는 제 2 플레이트(230)의 제 2 연결 부재(232)가 배치되도록 할 수 있다. 탄성 연결부(250)에서 제 2 플레이트(230)로 발생시키는 탄성력으로 인하여, 이때 제 2 연결 부재(232)는, 함몰 공간(312)의 저면(314)에 밀착될 수 있다.
이에 따르면, 구동부(300)에 의해 제 1 플레이트(210)가 수평 방향으로(도 4에서 좌우 방향으로) 이동하는 경우, 제 2 플레이트(230)의 제 2 연결 부재(232)는 함몰 공간(312)의 저면(314)를 따라 이동함으로써, 결과적으로 제 2 플레이트(230)가 상하 방향으로 이동하게 할 수 있다.
즉, 제 1 플레이트(210)가 양 측으로 이동하면, 제 2 플레이트(230)는 하측으로 이동하고, 제 1 플레이트(210)가 중앙으로 이동하면, 제 2 플레이트(230)는 상측으로 이동할 수 있다.
도 8은 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치의 동작을 도시한 것이다.
도 8을 참조하면, 먼저 PCR 칩(400)이 배치된 칩 홀더(200)가 가이드부(310)의 중앙에 위치할 수 있다. 이때, 칩 홀더(200)의 제 1 플레이트(210)의 일 단부가 가이드부(310)의 상단에 배치되고, 제 2 플레이트(230)의 제 2 연결 부재(232)가 함몰 공간(312)의 중앙 저면(314)에 위치할 수 있다. PCR 칩(400)은 열 블록(110, 120)과 접촉하지 않는 중립 상태에 있을 수 있다.
구동부(300)를 통해 칩 홀더(200)(특히, 제 1 플레이트(210))를 제 1 열 블록(110) 측으로 이동시킬 수 있다. 칩 홀더(200)의 제 1 플레이트(210)의 일 단부가 가이드부(310)의 상단에서 좌측으로 이동하고, 제 2 플레이트(230)의 제 2 연결 부재(232) 또한 함몰 공간(312)의 저면(314)을 따라 좌측으로 이동한다. 이때, 탄성 연결부(250)의 탄성력에 의해 제 2 연결 부재(232)는 함몰 공간(312)의 저면(314)과 밀착하여 이동하며, 따라서, 제 2 플레이트(230) 전체가 하측으로 이동하면서 제 1 열 블록(110)과 접촉할 수 있다.
이후, 구동부(300)를 통해 칩 홀더(200)를 제 2 열 블록(120) 측으로 이동시킬 수 있다. 제 2 플레이트(230)의 제 2 연결 부재(232)는 함몰 공간(312)의 저면(314)에 밀착하여 이동하고, 따라서 제 1 플레이트(210)가 가이드부(310)의 상단을 따라 우측으로 이동할 때, 제 2 플레이트(230)는 상측으로 이동하여 중립 상태에 있다가, 하측으로 이동하면서 제 2 열 블록(120)과 접촉할 수 있다.
특히, 가이드부(310)에서 함몰 공간(312)의 저면(314) 중 열 블록(110, 120)에 인접한 영역은 열 블록(110, 120)보다 낮게 위치하여, 탄성 연결부(250)가 제 2 플레이트(230)를 열 블록(110, 120) 측으로 보다 견고하게 하방 가압하게 할 수 있다.
도 9는 본 출원의 시험 방법에서 사용되는 핵산 증폭 장치의 칩 패키지의 분해도를 도시한 것이다.
PCR 칩 패키지는 PCR 칩(400)을 내부에 수용하고, 칩 홀더(200)에 삽입되어, 칩 홀더(200)와 함께 이동하면서 PCR 칩(400)을 보다 안정적이고 견고하게 열 블록(110, 120)에 접촉시킬 수 있다. 구체적으로, PCR 칩 패키지는 PCR 칩(400), PCR 칩 케이스(600) 및 밀폐부(700)를 포함할 수 있다.
PCR 칩(400)은, 핵산, 예를 들어 이중 가닥 DNA, 증폭하고자 하는 특정 염기 서열과 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머, DNA 중합효소, 삼인산화데옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotide triphosphates, dNTP), PCR 반응 완충액(PCR reaction buffer)을 포함하는 샘플 용액을 포함할 수 있다. PCR 칩(400)은 샘플 용액을 도입하기 위한 하나 이상, 구체적으로 복수 개의 유입부, 핵산 증폭 반응을 완료한 샘플 용액을 배출하기 위한 하나 이상, 구체적으로 복수 개의 유출부 및 증폭하고자 하는 핵산을 포함하는 샘플 용액이 수용된 하나 이상의, 구체적으로 복수 개의 PCR 반응 챔버(또는 채널)를 포함할 수 있다. PCR 칩(400)은 광 투과성 재질로 구현될 수 있고, 바람직하게는 광 투과성 플라스틱 재질을 포함한다. PCR 칩(400)은 플라스틱 재질을 사용하여, 플라스틱 두께 조절만으로 열 전달 효율을 증대시킬 수 있고, 제작 공정이 단순하여 제조 비용을 절감할 수 있다.
상기 PCR 칩의 반응 챔버마다 상이한 병원성균과 바이러스를 반응시킬 수 있다. 구체적으로, 15종의 병원성균과 바이러스를 동시 검출하는 경우 상기 PCR 칩의 반응 챔버 15개 이상을 포함할 수 있다. 반응 챔버마다 별도로 반응하는 랩 칩 방식이기 때문에 위양성 반응이나 위음성 반응의 위험을 낮출 수 있는 장점이 있다.
PCR 칩 케이스(600)는, 결합 가능한 상판(610) 및 하판(630)으로 구성되고, 상판(610) 및 하판(630) 간의 힌지 회동을 통해 열고 닫힐 수 있다. 열린 상태에서는 PCR 칩(400) 및/또는 밀폐부(700)가 PCR 칩 케이스(600) 내에 수용되거나 제거될 수 있으며, 닫힌 상태에서는, 내부의 PCR 칩(400) 및/또는 밀폐부(700)를 가압하여 안정적으로 배치시킬 수 있다. 또한, 결합 부재(650)를 통해 상판(610)과 하판(630)은 닫힌 상태로 유지될 수 있다.
PCR 칩 케이스(600) 내에 PCR 칩(400)이 수용되도록 상판(610) 및 하판(630) 중 하나의 내측면에는 PCR 칩(400)이 안착되는 수용 공간(612, 632)이 형성될 수 있다. 수용 공간(612, 632)은 밀폐부(700)와 결합된 PCR 칩(400)에 대응하거나 그보다 적은 크기로 형성될 수 있다. 따라서, PCR 칩 케이스(600)가 닫힐 때, 연질의 밀폐부(700)를 통해 PCR 칩(400)을 가압 고정시킬 수 있다. 이를 통해 PCR 칩(400)이 열 블록(110, 120)과 접촉 시에 발생하는 응력에 의한 PCR 칩(400)의 변형을 방지할 수 있다.
또한, PCR 칩(400)이 PCR 칩 케이스(600) 또는 칩 홀더(200)에 배치된 상태에서 PCR 반응의 관찰이 가능하도록, 상판(610) 및 하판(630)에는 PCR 칩(400)의 반응 챔버에 대응하는 개방 영역(614, 634)이 형성될 수 있다.
PCR 칩(400)은 하판(630)의 개방 영역(634)을 통해 열 블록(110, 120)과 긴밀하게 열 접촉할 수 있다. PCR 칩(400)이 열 블록(110, 120)과 접촉하는 경우, PCR 칩(400)을 향하여 발생하는 응력을 방지하기 위해 상판(610)의 개방 영역(614)에는 PCR 칩(400)과 접하는 적어도 하나의 지지부(616)가 형성될 수 있다.
밀폐부(700)는, PCR 칩(400)의 유입부 및 유출부를 밀폐할 수 있다. 이를 위해 밀폐부(700)는 고무 등의 연성 재질로 이루어져, 신축성과 탄성을 가질 수 있다. 구체적으로, 밀폐부(700)는, 평판 형상의 덮개부(710)와 덮개부(710)에서 형성되는 복수의 돌출부(730)로 이루어질 수 있으며, 각 돌출부(730)는 PCR 칩(400)의 유입부 및 유출부에 삽입되어 PCR 칩(400)을 밀폐할 수 있다.
또한, 밀폐부(700)는 PCR 칩(400)과 보다 견고하게 밀착하기 위해 서로 대응하는 형상을 가질 수 있다. 예를 들어, PCR 칩(400)은 유입부 및 유출부를 둘러싸는 돌출 영역이 형성될 수 있고, 밀폐부(700)에는 PCR 칩(400)의 돌출 영역이 밀착 수용되는 수용 영역(750)이 함몰 형성될 수 있다. 상기 PCR 칩이 안착되는 수용 영역은 상기 상판 및 하면 중 적어도 하나의 내측면에 형성될 수 있다. 상기 밀폐부가 결합된 상기 PCR 칩이 상기 PCR 칩 케이스에 수용되는 경우, 상기 PCR 칩 케이스가 상기 밀폐부를 통해 상기 PCR 칩을 가압하여 상기 PCR 칩과 상기 열 블록 간의 접촉 시에 발생하는 응력에 의한 상기 PCR 칩의 변형을 방지할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 출원을 예시하기 위한 것으로서, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 타겟 유전자 선정 및 프라이머 및 프로브 제작
총 15종의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 한번에 동시 검출할 수 있는 프라이머와 프로브를 제작하였고, 각 서열은 아래 표 1과 같다. 하기 표 1과 같은, 15종의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 동시에 검출할 수 있는 프라이머를 선정하기 위해 다수의 프라이머 서열을 대상으로 실험적으로 성능을 평가한 후, 현저한 효과를 가지는 성능을 보이는 프라이머 서열들을 선택하였다. 하기 표 1의 프라이머와 프로브 서열은 동일한 조건에서 단시간 내에 한번의 반응으로 15종의 동시 검출이 가능하며, 민감도가 우수하고, 82개 균주와 교차반응이 없었다. 또한 상기 프라이머와 프로브 서열은 검체 내 포함되어 검출 결과에 영향을 미칠 수 있는 간섭물질과의 간섭반응이 없었고, 재현성 있는 결과를 나타내었으며, 365일 동안의 보관 안정성을 보였다. 프로브의 5' 말단에는 리포터 FAM(6-carboxyfluorescein)을 결합시켰으며, 3' 말단에는 소광자 BHQ(black hole quencher) 1을 결합시켰다.
F; forward primer, R; reverse primer, P; probe, Tm; 융해온도(melting temperature)
<실시예 2> 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 민감도 평가
실시예 1에서 제작한 총 15종의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR의 분석적 민감도를 평가하기 위해 보툴리눔균 (독소 A형)의 게놈 DNA를 이용하여 최소 검출한계(limit of detection, LoD)를 확인하였다. 실험은 식품의약품안전처의 '체외진단용 의료기기 허가심사 가이드라인'에 따라 수행하였고, 최소 검출한계는 가이드라인의 정의대로 '표준물질을 이용하여 95% 검출률을 보이는 최저 농도'로 계산하였다.
구체적으로, 각각의 샘플 3 ㎕, 2x 마스터 믹스(Master mix) 5 ㎕, 프라이머/프로브 믹스(primer probe mix) 1 ㎕ 및 PCR이 잘 수행되었는지 확인하는 내부 양성 대조군(Internal positive control) 1 ㎕을 혼합(표 2)한 후, 하기 표 3에 기재된 반응 조건으로 본 출원의 PCR 장치를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 동일한 조건으로 15회 반복실험을 수행하여 측정한 Ct(cycle threshold)값의 평균(average), 표준편차(standard deviation, SD), 변동계수(coefficient of variation, CV), 및 검출률을 측정하였고, 95% 양성구간을 통계프로그램(IBM SPSS Statistics, IBM)을 이용하여 프로빗(probit) 회귀모델로 검증하였다.
합성된 프라이머가 15종의 병원성균과 바이러스만을 특이적으로 검출할 수 있는지 확인하기 위하여, 표 1의 15종의 프라이머와 프로브 세트를 이용하여 각각 PCR을 수행하였다. PCR 반응을 위한 2×qPCR 프리믹스(premix)는 (주)나노헬릭스(NanoHelix)로부터 입수하여 사용하였고 PCR 반응 혼합물의 조성은 표 2에 나타낸 바와 같았다. PCR 조건은 표 3에 나타난 바와 같이 95℃에서 8초 동안 예비 변성단계 1 사이클을 수행하고 95℃에서 13초 동안 변성단계, 54℃에서 13초 동안 어닐링 및 연장단계로 구성된 PCR 주기를 45 사이클을 수행하였다.
그 결과, 본 출원의 각각의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 15종의 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR의 최소 검출한계는 하기 표 4와 같았다. 보툴리눔균 (독소 A형)의 경우 1.56 카피(copy)/반응까지 100% 검출됨을 확인하였으며, probit 분석 결과 95% 검출률을 보이는 최소 검출값은 1.33 카피(copy)/반응으로 나타나 이 값을 보툴리눔균 (독소 A형)의 최소 검출한계(LoD)로 설정하였다.
보툴리눔균 (독소 A형)의 분석적 민감도 Ct값 결과를 아래 표 5에 나타내었다. 도 1은 본 출원의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 PCR 수행 시 검출한계를 확인한 결과이다. 빨간색은 보툴리눔균 타겟 시료이고, 초록색은 내부 양성 대조물질(IPC)이다.
(Target: 실시예 2에 사용된 게놈 DNA; IPC: 내부 양성 대조물질(internal positive control); CV: 평균 대비 표준편차의 비율(coefficient of variation))
<실시예 3> 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR의 분석적 특이도 평가
실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR의 분석적 특이도를 다른 균주에 의한 교차반응 여부로 확인하였다. 병원체 별 시험방법에 대한 특이도를 평가하기 위해, 53개의 박테리아, 22개의 바이러스, 6개의 fungi, 기생충 1개를 포함한 82개의 병원체와 인간 혈액에서 추출한 유전자를 이용하였다.
구체적으로, 사용한 균주들 중 바이러스는 104 copies/㎕의 농도로 적용하였고, 나머지 균주들은 1 ng/㎕의 농도로 적용하였다. 시험 결과, 15종의 각 시험방법에 해당되는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 제외한 다른 모든 병원체에서 반응을 나타내지 않아 15종의 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 유전자만을 특이적으로 증폭시키는 것으로 확인하였다.
보툴리눔균 (독소 A형)의 특이도를 평가하기 위해, 53개의 박테리아, 22개의 바이러스, 6개의 fungi, 기생충 1개를 포함한 82개의 병원체와 인간 혈액에서 추출한 유전자를 이용하였다. 교차반응 평가에 이용한 병원체 목록 및 교차반응 Ct값 결과를 표 6 및 도 2와 도 3에 나타내었다. 보툴리눔균 (독소 A형)의 경우 시험방법에 대한 교차반응 평가 결과 보툴리눔균 (독소 A형) gDNA에서만 반응을 확인하여 본 시험방법의 특이성을 확인하였다. 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트는 보툴리눔균 (독소 A형) 이외의 병원체 유전자 및 전사체는 증폭시키지 않았다. 이로부터, 본 출원의 프라이머 및 프로브 세트는 보툴리눔균 (독소 A형) 외의 다른 병원체에 의해 교차반응을 나타내지 않음을 알 수 있었다.
도 2 및 3에서 a는 번호 1부터 13, b는 번호 14부터 24, c는 번호 25부터 36, d는 번호 37부터 47, e는 번호 48부터 57, f는 번호 58부터 67, g는 68부터 77, h는 번호 78부터 83을 나타낸 것이다. 도 2 및 3에서 파란색은 타겟 시료이고, 초록색은 내부양성대조물질(IPC)이다.
보툴리늄균, 보툴리늄균 독소 B형, 보툴리늄균 독소 E형, 보툴리늄균 독소 F형, 탄저균, 페스트균, 야토균, 야토균 A형, 야토균 B형, 야토군 아형 Novicida, 두창바이러스, 백시니아바이러스, 원숭이폭스바이러스, 수두바이러스의 경우도 82주의 gDNA를 사용하여 특이도 테스트를 진행한 결과, 이들을 제외한 모든 병원체에서 교차반응은 나타나지 않는 것으로 확인되었다.
<실시예 4> 간섭물질(inhibitor)에 대한 간섭반응 여부 확인
실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 실시간 PCR의 분석적 특이도를 간섭반응 여부로 평가하기 위해 현장에서 획득할 수 있는 혈액 검체 1종과 환경 검체 4종(편지봉투, 책상표면 채취 면봉, 밀가루, 모래), 총 5종의 검체를 준비하여 사용하였다. 모래의 경우 250mg의 샘플에 양성 대조물질(104 카피(copy)/반응)을 5μL 소량 첨가한 후 핵산을 추출하였고, 밀가루의 경우 100mg에 동일한 농도의 양성 대조물질을 소량 첨가한 후 핵산 추출을 진행하였다. 편지봉투는 동일한 농도의 양성 대조물질을 도포한 후 도포된 표면을 포함하도록 잘라낸 뒤 200μL가 되도록 멸균 증류수를 첨가하였으며, 면봉 샘플은 책상 표면에 동일 양의 양성 대조물질을 도포하고 상온에서 건조시킨 후 멸균된 면봉을 이용하여 채취한 후 편지봉투와 동일하게 200μL의 멸균 증류수를 첨가하여 핵산 추출을 진행하였다. 평가 기준은 환경시료가 미 첨가된 양성 대조물질과의 Ct 값을 기준으로 ±3 이내에 포함되면 간섭반응이 없음으로 평가한다. 시험 결과, 15종의 시험방법 모두에서 환경 검체에 대한 간섭반응이 나타나지 않음을 확인하였다.
보툴리눔균 (독소 A형)에 대한 시험방법의 간섭반응 평가 결과, 환경시료가 미 첨가된 양성 대조물질과의 Ct값 차이가 최소 0.21에서 최대 2.26로 모두 ±3 이내에 포함되는 결과를 보여 환경시료에 대해 간섭반응이 나타나지 않음을 확인하였다. 보툴리눔균 (독소 A형) 간섭반응 평가 Ct값 결과와 그래프를 도 4에 나타내었다. 도 4에서 파란색은 타겟 시료이고, 초록색은 내부 양성 대조물질(IPC)이다.
보툴리늄균, 보툴리늄균 독소 B형, 보툴리늄균 독소 E형, 보툴리늄균 독소 F형, 탄저균, 페스트균, 야토균, 야토균 A형, 야토균 B형, 야토군 아형 Novicida, 두창바이러스, 백시니아바이러스, 원숭이폭스바이러스, 수두바이러스의 경우도 간섭반응 평가 결과, 환경시료에 대해 간섭반응이 나타나지 않음을 확인하였다.
<실시예 5> 재현성 및 안정성 확인
실시예 1에서 제작한 15종의 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR의 분석적 재현성을 반복실험을 통해 확인하였다. 실시예 2에서 도출한 최소 검출한계의 5배, 25배 또는 100배의 농도로 반응시킨 것을 제외하고는 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다. 5일 동안 1일 2회씩 총 10번의 반복실험을 수행하였으며, 각 회당 2회씩 측정하였고, 측정한 Ct값의 평균, 표준편차 및 변동계수를 계산하여 비교하였다. 음성 대조군은 해당 균을 포함하지 않은 시료이다. 그 결과, 음성 대조군 시료의 경우 반복실험 모두에서 전혀 검출되지 않았으며, 10번의 반복실험에 따른 변동계수(CV) 값이 0.03% 이하로 나타나, 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR은 재현성이 있었다.
실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트의 분석적 보관 안정성을 가속노화실험을 통해 평가하였다. 실험은 '식품의약품안전처 고시 제2014-178호'에 제시된 의료기기의 안정성 시험기준에 따라 수행하였다. 본 평가에 적용된 계산식은 재질의 퇴화와 관련된 아레니우스 반응율 함수에 기초된 것으로 일반적으로 10℃ 온도가 증가하면 일반적으로 화학 반응률은 2배 증가한다는 것을 말한다.
AAF = Q 10 [(T AA - T RT)/ 10]
T AA ≡ 가속노화온도(℃)
T RT ≡ 주변 온도(℃)
AAT = 설정된 유효기간/AAF
설정된 유효기간: 365일
구체적으로, 상기 계산식을 이용하여 가속노화계수(accelerated aging factor, AAF) 및 가속노화시간(accelerated aging time, AAT)을 산출한 뒤, 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트를 산출된 조건에 따라 45℃에서 4일 동안 보관하였다. 이후, 0, 1, 2, 3 및 4일째에 가속노화시킨 프라이머 및 프로브를 이용하여 각각 2회씩 실시예 2에 기재된 것과 동일한 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다. 이때, 사용된 병원체는 실시예 2에서 도출한 최소 검출한계의 5배, 25배 또는 100배의 농도로, 효소의 변성을 방지하기 위해 가속노화반응을 시키지 않고 첨가하였다. 각 시료의 평균 Ct값과 0일째 Ct값의 차이를 계산하여 비교하였다. 그 결과, 실시예 1에서 제작한 프라이머 및 프로브 세트는 365일의 안정성을 보였다.
<실시예 6-1> 야토균 3종에 대한 실시간 PCR
야토균 A형, 야토균 B형 및 야토균 아형 Novicida에 대한 실시간 PCR을 실시하였다. PCR 반응 혼합물의 조성은 표 2에 나타낸 바와 같았다. PCR 조건은 표 3에 나타난 바와 동일하며 48℃에서 어닐링 및 연장단계를 수행하였다. 결과는 하기 표 7과 같았다.
<실시예 6-2> 야토균 3종에 대한 실시간 PCR
야토균 A형, 야토균 B형 및 야토균 아형 Novicida에 대한 실시간 PCR을 실시하였다. PCR 반응 혼합물의 조성은 표 2에 나타낸 바와 같았다. PCR 조건은 표 3에 나타난 바와 동일하며 50℃에서 어닐링 및 연장단계를 수행하였다. 결과는 하기 표 8과 같았다.
<실시예 6-3> 야토균 3종에 대한 실시간 PCR
야토균 A형, 야토균 B형 및 야토균 아형 Novicida에 대한 실시간 PCR을 실시하였다. PCR 반응 혼합물의 조성은 표 2에 나타낸 바와 같았다. PCR 조건은 표 3에 나타난 바와 동일하며 52℃에서 어닐링 및 연장단계를 수행하였다. 결과는 하기 표 9와 같았다.
<실시예 6-4> 야토균 3종에 대한 실시간 PCR
야토균 A형, 야토균 B형 및 야토균 아형 Novicida에 대한 실시간 PCR을 실시하였다. PCR 반응 혼합물의 조성은 표 2에 나타낸 바와 같았다. PCR 조건은 표 3에 나타난 바와 동일하며 54℃에서 어닐링 및 연장단계를 수행하였다. 결과는 하기 표 10과 같았다.
<실시예 6-5> 야토균 3종에 대한 실시간 PCR
야토균 A형, 야토균 B형 및 야토균 아형 Novicida에 대한 실시간 PCR을 실시하였다. PCR 반응 혼합물의 조성은 표 2에 나타낸 바와 같았다. PCR 조건은 표 3에 나타난 바와 동일하며 56℃에서 어닐링 및 연장단계를 수행하였다. 결과는 하기 표 11과 같았다.
표 7 내지 표 11에 나타낸 바와 같이, 야토균 A, 야토균 B형 및 야토균 아형 Novicida에 대해 동시에 실시간 PCR을 수행한 결과, 48℃, 50℃, 52℃, 54℃ 및 56℃에서 모두 타겟이 검출되었으나, 56℃에서는 검출양이 상대적으로 적은 것을 확인할 수 있었다.
1000: 핵산 증폭 장치 110: 제 1 열 블록
120: 제 2 열 블록 200: 칩 홀더
210: 제 1 플레이트 212: 제 1 연결 부재
214: 관통부 230: 제 2 플레이트
232: 제 2 연결 부재 234: 관통부
250: 탄성 연결부 300: 구동부
310: 가이드부 312: 함몰 공간
314: 저면 400: PCR 칩
600: PCR 칩 케이스 610: 상판
612: 수용 공간 614: 개방 영역
616: 지지부 630: 하판
632: 수용 공간 634: 개방 영역
650: 결합 부재 700: 밀폐부
710: 덮개부 730: 돌출부
750: 수용영역
120: 제 2 열 블록 200: 칩 홀더
210: 제 1 플레이트 212: 제 1 연결 부재
214: 관통부 230: 제 2 플레이트
232: 제 2 연결 부재 234: 관통부
250: 탄성 연결부 300: 구동부
310: 가이드부 312: 함몰 공간
314: 저면 400: PCR 칩
600: PCR 칩 케이스 610: 상판
612: 수용 공간 614: 개방 영역
616: 지지부 630: 하판
632: 수용 공간 634: 개방 영역
650: 결합 부재 700: 밀폐부
710: 덮개부 730: 돌출부
750: 수용영역
<110> Korea Center for Disease Control and Prevention
MICO BIOMED CO., LTD.
<120> METHOD OF TESTING GENES IN REAL-TIME PCR FOR RAPID DETECTING 15
SPECIES OF BIO TERROR PHATOGENS AND SUBSPECIES PHATOGENS
COMPRISING CLOSTRIDIUM BOTULINUM NEUROTOXIN A
<130> 19P0456
<160> 45
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 1
cgaaatggtt atggctctac tcaa 24
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 2
ttgcctgcac ctaaaagagg at 22
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 3
acttcaagtg actcctcaaa accaaatgta aaatctg 37
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 4
tggttttgag gagtcacttg aa 22
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 5
tcatgtcccc caaatgttct 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 6
tgcaggcaaa tttgctacag atcca 25
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 7
caagaaaaca aaggcgcaag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 8
ctgggatctt gycctccaaa 20
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 9
cgtggatatt tttcagatcc agccttg 27
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 10
ataatgggag cagagcctga 20
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 11
ccctttagcc ccatatagtc c 21
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 12
tgccaagcaa tcacggtttt gg 22
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 13
gcaatatagg attactaggt tttcattc 28
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 14
gaaataaaac tccaaaagca tccatt 26
<210> 15
<211> 29
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<223> reverse primer
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atttatgaat aatccgccag ttac 24
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<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 40
cgcgggatac atcatctatt atagca 26
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
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gttggtctac gacaatggat gct 23
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<223> probe
<400> 42
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 43
tcgggacatg ccaagtaaag 20
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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taatggagat gtatcccggt ttg 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 45
atatcggtac caagcggtcg tgtt 24
Claims (11)
- 검체로부터 채취한 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
분리된 DNA에 하기 프라이머 세트를 처리하여 표적 서열을 증폭시키는 단계; 및
증폭된 산물에서 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체의 존재 유무를 확인하는 단계; 를 포함하고,
상기 프라이머 세트는,
서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 (독소 A형)(Clostridium botulinum neurotoxin A)을 검출하기 위한 프라이머 세트와,
서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균(Clostridium botulinum)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 B형(Clostridium botulinum neurotoxin B)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 E형(Clostridium botulinum neurotoxin E)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 F형(Clostridium botulinum neurotoxin F)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 16 및 서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 탄저균(Bacillus anthracis)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 페스트균(Yersinia pestis)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 22 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균(Francisella tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 A형(Francisella tularensis subsp. Tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 28 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 B형(Francisella tularensis subsp. Holarctica)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 아형 Novicida(Francisella tularensis subsp. Novicida)를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 34 및 서열번호 35의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 두창 바이러스(Variola virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 37 및 서열번호 38의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 백시니아 바이러스(Vaccinia virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 40 및 서열번호 41의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 원숭이폭스 바이러스(Monkeypox virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및
서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 수두 바이러스(Varicella zoster virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 프라이머 세트를 포함하는 것인, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험 방법. - 청구항 1에 있어서,
상기 서열을 증폭시키는 단계는,
핵산 증폭 장치에서 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 수행되고,
상기 핵산 증폭 장치는,
이격 배치되는 복수의 열 블록;
샘플 용액이 주입되는 유입부; 상기 샘플 용액의 PCR 반응이 수행되는 반응 챔버; 및 상기 샘플 용액이 배출되는 유출부를 포함하고, 상기 복수의 열블록과 순차적으로 접촉하면서 내부에 상기 샘플 용액의 PCR 반응이 수행되는 PCR 칩;
상기 PCR 칩이 장착되고, 상기 PCR 칩이 상기 복수의 열 블록과 순차적으로 접촉하도록 상기 PCR 칩을 이동시키는 칩 홀더; 및
상기 칩 홀더를 이동시키고, 상기 칩 홀더의 이동 방향을 가이드하는 구동부; 를 포함하는, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험 방법. - 청구항 2에 있어서,
상기 칩 홀더는,
상기 복수의 열 블록 사이에서 수평 이동하는 제 1 플레이트; 상기 PCR 칩이 탈착 가능하게 결합하는 제 2 플레이트; 및 상기 제 1 플레이트와 상기 제 2 플레이트를 상하 방향으로 연결하는 탄성 연결부를 포함하고,
상기 탄성 연결부는, 상기 제 2 플레이트에 탄성력을 발생시켜, 상기 제 2 플레이트가 상하 방향으로 이동하면서 상기 복수의 열 블록과 순차적으로 접촉하게 하는, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체를 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험 방법. - 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 (독소 A형)(Clostridium botulinum neurotoxin A)을 검출하기 위한 프라이머 세트와,
서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균(Clostridium botulinum)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 B형(Clostridium botulinum neurotoxin B)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 E형(Clostridium botulinum neurotoxin E)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 F형(Clostridium botulinum neurotoxin F)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 16 및 서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 탄저균(Bacillus anthracis)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 페스트균(Yersinia pestis)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 22 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균(Francisella tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 A형(Francisella tularensis subsp. Tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 28 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 B형(Francisella tularensis subsp. Holarctica)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 아형 Novicida(Francisella tularensis subsp. Novicida)를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 34 및 서열번호 35의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 두창 바이러스(Variola virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 37 및 서열번호 38의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 백시니아 바이러스(Vaccinia virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 40 및 서열번호 41의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 원숭이폭스 바이러스(Monkeypox virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및
서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 수두 바이러스(Varicella zoster virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 프라이머 세트를 포함하는 것인, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 검출용 조성물. - 삭제
- 청구항 4에 있어서,
서열번호 6의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브와,
서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 9의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 12의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 15의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 18의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 21의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 24의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 27의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 30의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 33의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 36의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 39의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 서열번호 42의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 및 서열번호 45의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 프로브; 로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되며, 상기 프라이머 세트에 대응되는 프로브를 포함하는 것인, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 검출용 조성물. - 청구항 6에 있어서,
상기 프로브는,
5‘말단과 3’말단에 각각 형광물질과 소광제를 포함하고,
각각의 프로브의 5' 말단에 포함된 형광물질이 모두 동일한, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 검출용 조성물. - 청구항 7에 있어서,
상기 형광물질은,
6-FAM(6-carboxyfluorescein), 5-FAM(5-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(Hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(Tetrachloro-6-carboxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신클로로트리아지닐(Fluorescein chlorotriazinyl), 로다민그린(Rhodamine green), 로다민레드(Rhodamine red), 테트라메틸로다민(Tetramethylrhodamine), FITC(Fluorescein isothiocyanate), 오레곤그린(Oregon green), 알렉사플루오로(Alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-X-Rhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(Tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 텍사스레드(Texas red), Cy3(Cyanine-3) 및 Cy5(Cyanine-5)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 검출용 조성물. - 청구항 7에 있어서,
상기 소광제는,
BHQ1(Black hole quencher 1), BHQ2(Black hole quencher 2), BHQ3(Black hole quencher 3), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), NFQ(Nonfluorescent quencher), 답실(Dabcyl), Eclipse, DDQ(Deep Dark Quencher), 블랙베리퀸처(Blackberry Quencher), 아이오와블랙(Iowa black)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 검출용 조성물. - 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하고,
상기 프라이머 세트는,
서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 (독소 A형)(Clostridium botulinum neurotoxin A)을 검출하기 위한 프라이머 세트와,
서열번호 1 및 서열번호 2의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균(Clostridium botulinum)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 B형(Clostridium botulinum neurotoxin B)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 E형(Clostridium botulinum neurotoxin E)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 13 및 서열번호 14의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 보툴리눔균 독소 F형(Clostridium botulinum neurotoxin F)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 16 및 서열번호 17의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 탄저균(Bacillus anthracis)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 19 및 서열번호 20의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 페스트균(Yersinia pestis)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 22 및 서열번호 23의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균(Francisella tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 25 및 서열번호 26의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 A형(Francisella tularensis subsp. Tularensis)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 28 및 서열번호 29의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 B형(Francisella tularensis subsp. Holarctica)을 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 31 및 서열번호 32의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 야토균 아형 Novicida(Francisella tularensis subsp. Novicida)를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 34 및 서열번호 35의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 두창 바이러스(Variola virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 37 및 서열번호 38의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 백시니아 바이러스(Vaccinia virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트;
서열번호 40 및 서열번호 41의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 원숭이폭스 바이러스(Monkeypox virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 및
서열번호 43 및 서열번호 44의 올리고뉴클레오타이드로 구성된 수두 바이러스(Varicella zoster virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트; 로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 프라이머 세트를 포함하는 것인, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 검출용 키트. - 청구항 10에 있어서,
상기 키트는 실시간 PCR(real-time PCR)용 키트인, 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 검출용 키트.
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|---|---|---|---|
| KR1020190092756A KR102200925B1 (ko) | 2019-07-30 | 2019-07-30 | 보툴리눔균 (독소 a형)을 포함하는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 15종을 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190092756A KR102200925B1 (ko) | 2019-07-30 | 2019-07-30 | 보툴리눔균 (독소 a형)을 포함하는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 15종을 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험방법 |
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Family Applications (1)
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| KR1020190092756A KR102200925B1 (ko) | 2019-07-30 | 2019-07-30 | 보툴리눔균 (독소 a형)을 포함하는 생물테러 병원체 또는 그의 아형 병원체 15종을 신속하게 검출하기 위한 실시간 유전자 시험방법 |
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| KR20230056908A (ko) | 2021-10-21 | 2023-04-28 | 대한민국(질병관리청장) | 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 수두바이러스 검출 및 정량 방법 |
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| CN116219071B (zh) * | 2022-12-14 | 2023-12-05 | 广州凯普医药科技有限公司 | 一种用于同时检测并鉴别猴痘病毒I型、IIa型和IIb型的多重qPCR试剂盒 |
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