KR102467600B1

KR102467600B1 - 독소작용제 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 독소작용제의 검출방법

Info

Publication number: KR102467600B1
Application number: KR1020220058863A
Authority: KR
Inventors: 정찬호; 구세훈; 송동현; 김정은; 윤형석; 이대상; 허경행
Original assignee: 국방과학연구소
Priority date: 2022-05-13
Filing date: 2022-05-13
Publication date: 2022-11-16

Abstract

본 발명은 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B를 검출하기 위한 프라이머 세트와 이를 사용하여 고리매개등온증폭법으로 독소작용제를 검출하는 방법에 관한 것으로, 상기 독소작용제의 유전자를 동시에 특이적으로 검출하고 정량할 수 있다.

Description

독소작용제 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 독소작용제의 검출방법{Primer sets for detecting toxin agents, and method for detecting toxin agents using the same}

본 발명은 독소작용제 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 독소작용제의 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B를 검출하기 위한 고리매개등온증폭 프라이머 세트와 상기 프라이머 세트를 사용하여 상기 독소작용제를 검출하는 방법에 관한 것이다.

생물학 작용제들 중에서 독소는 안정적이고 취급이 용이하며 치사율이 높고 매개체를 통하지 않고 인체에 직접 피해를 줄 수 있기 때문에 테러 목적으로 사용할 가능성이 가장 높으며 미국 오바마 정부 시절 리신이 우편을 통해 테러 목적으로 배달된 적이 있다.

주요한 독소작용제로 리신 독소, 보툴리눔 독소, 황색포도상구균 장내독소 등이 있다. 리신(Ricin)은 피마자(Ricinus communis) 씨에서 만들어지는 강력한 단백질 독소로 정제된 리신은 열에 어느 정도 안정하며 수용성이다. 리신은 안정성과 쉬운 생산과정으로 생물학전과 생물테러에 사용하는데 있어 상당한 위협으로 고려되어 왔다. 리신은 경구투여에 의한 독성보다 흡입으로 인한 독성이 수천 배 크다.

보툴리눔 독소는 그람 양성균인 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum)에 의해 만들어지는 신경독소로서, 현존하는 독소 중 가장 독성이 높아 나노 그램 수준에서도 인체에 치명적인 영향을 미친다. 보툴리눔 독소는 항원 특이성에 따라 A, B, C, D, E, F, G 의 7가지 혈청형으로 나눌 수 있으며 사람의 경우, 대부분 A, B, E, F 네 가지 혈청형에 의한 독성이 나타난다. 이러한 보툴리눔 독소를 포함하는 보툴리눔 균주는 포자 형태로 환경에 존재할 수 있으며 영유아의 경우, 꿀과 같은 음식물 섭취를 통해 감염을 일으킬 수 있으며, 성인의 경우에도 음식이나 공기, 상처를 매개로 한 감염을 일으킬 수 있다.

황색포도상구균(Staphylococcus aureus)는 포도상구균속에 속하며, 폐렴, 심장내막염, 화상 및 전쟁 상부(war wound), 패혈증, 및 독성쇼크 등의 중증 감염을 유발하는 병원성 세균이다. 황색포도상구균 식중독은 황색포도상구균이 산출하는 장독소에 의해 발생하며 원인균으로부터 오염, 오염된 식품에서의 원인균의 증식 및 장독소 생산의 3단계를 거쳐 발현된다. 16가지의 황색포도상구균 장독소 중 B형(Staphylococcal enterotoxin B, SEB)은 분자량이 가장 작으며 내열성이 가장 강하고 대부분의 유통 조건에서 안정하기 때문에 독소발현 제어에 각별한 주의가 요구된다. 특히 흡입 중독을 일으키는 특성이 있어 연무제 형태의 생물학적 무기로 사용될 위험이 큰 독소이다.

이러한 다양한 독소의 검출방법으로 종래에는 유전자 증폭법(PCR), 바이오 어세이법, 면역화학적방법 등이 사용되었다.

유전자 증폭법은 샘플에 포함되어 있는 독소를 생산하는 유전자의 단편을 검출하여 존재를 추정하는 방법으로 고온과 저온 사이의 온도 전환을 수십 초 내에 안정적으로 구현해야 하며, 또한 신속한 진단에 대한 요구로 개발된 실시간 검출 모니터링이 가능한 PCR(Real-time PCR)은 더 고도의 기술, 복잡한 절차와 요구사항이 있으므로 경제적인 부담이 큰 단점을 가지고 있다. 또한, 복잡한 매트릭스에 중합효소 억제 화합물이 존재하면 검사의 민감도가 저해될 수도 있고, 또한 유전자 증폭과정에 수 시간에서 수일이 필요하다.

바이오어세이법은 포유동물이나 포유동물 유래의 생세포를 이용하는 방법으로 정확성은 있으나 조작이 복잡하고 결과가 나올 때까지 수일을 요하며 실험동물사용으로 인한 윤리적인 우려가 제기되고 있다.

면역화학적방법은 항원항체반응을 이용한 방법으로, 항체에 효소를 결합시킨 후 반응을 이용하는 효소면역측정법(ELISA)을 사용하나, 민감도가 낮고 대용량 샘플이 필요하며, 다중 진단의 어려움 등 여러 문제점이 존재한다.

또한 최근에는 공기를 수집하여 생물입자들을 분리, 농축시킨 다음 형광과 발광 시약을 사용하여 세균과 독소의 존재유무를 밝혀내고 항원항체반응을 통해 이들의 종류를 식별해내는 탐지식별기가 개발되어 운용 중에 있으나 이러한 탐지식별기는 실험장비의 형태로 부피가 크고 고가이며 수분 내에 생물학 작용제의 존재 유무를 확인할 수 있지만 식별하기까지는 약 1 시간이 소요된다.

본 발명자들은 독소의 기존 검출방법인 유전자 증폭법(PCR), 바이오 어세이법, 면역화학적방법 등의 기술적 한계를 해결하기 위하여 독소 검출에 고리매개등온증폭법(LAMP)을 활용하고자 하였다. 고리매개등온증폭법은 반응 온도를 변화시킬 필요 없이, 단일 온도(상온 또는 65℃ 이하의 온도)에서 표적 유전물질의 증폭이 가능하므로 대형의 고가 장비인 온도조절장치를 필요로 하지 않고 등온장치만 있으면 가능하여, 간단하게 1시간 이내 원하는 타겟을 잡을 수 있으므로 일반적 PCR에서는 구현이 어려운 현장진단(Point-of-Care Detection)에 용이하며, 경제성, 편의성 측면에서도 여러 장점을 갖춰 활용도가 높다는 장점이 있다.

이에 본 발명자들은 고리매개등온증폭법에 사용할 수 있는 독소작용제 검출용 프라이머 세트를 개발하고, 독소작용제 검출용 프라이머 세트의 민감도 및 특이성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

한국 등록특허공보 제10-2200940호 (2021.01.13. 공고)

본 발명의 목적은, 독소작용제인 리신, 보툴리눔 독소 B, 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 프라이머 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 리신, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)으로 리신, 보툴리눔 독소 B 및/또는 포도상구균 엔테로톡신 B를 신속하고 정확하게 검출하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 리신, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온 실시간 다중형광 분자진단법(Multiplex Real Time LAMP, Multiplex RT-LAMP)로 한번에 상기 3종의 독소작용제를 특이적으로 구분하여 검출하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머를 포함하는, 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브와 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 포함하는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.

상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제로서 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나가 부착될 수 있다.

상기 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제로서 IABkFQ(Iowa black FQ quencher), IAbRQSp(Iowa black RQ quencher), DABCYL(4-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonyl chloride), BHQ (Black Hole Quencher), EBQ(Excellent Bioneer Quencher), 및 ZEN-IBFQ(ZEN-Iowa Black FQ)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나가 부착될 수 있다.

상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제인 Cy5(indocarbocyanine-5)가 표지되고, 상기 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ1이 표지되거나, 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ2가 표지될 수 있다.

본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 8내지 13의 프라이머를 포함하는, 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프로브와 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 포함하는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.

상기 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제로서 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나가 부착될 수 있다.

상기 프로브는 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제인 HEX가 표지되고, 상기 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ1이 표지되거나, 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ2가 표지될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 서열번호 15 내지 20의 프라이머를 포함하는, 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.

상기 프라이머 세트는 서열번호 21의 염기서열을 포함하는 프로브와 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 포함하는 프로브를 추가로 포함할 수 있다.

상기 서열번호 21의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제로서 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나가 부착될 수 있다.

상기 서열번호 21의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제인 FAM이 표지되고, 상기 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ1이 표지되거나, 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ2가 표지될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 세트; 상기 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 세트; 및 상기 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 검출용 LAMP 프라이머 세트; 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는, 독소작용제 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 상기 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 세트; 상기 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 세트; 및 상기 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 검출용 LAMP 프라이머 세트; 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 이용하여 고리매개등온증폭법을 수행하는 단계를 포함하는, 독소작용제의 검출방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 (a) 생물학적 시료부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 세트, 상기 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 세트, 및 상기 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 검출용 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭법을 수행하는 단계; 및 (c) 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B를 검출 및 정량하는 단계; 를 포함하는, 독소작용제의 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 독소작용제 검출용 LAMP 프라이머 세트(primer set)는 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B 각각에 대해 특이적으로 작용하고 민감도가 높을 뿐만 아니라 40분 정도의 단시간 내에 검출할 수 있어, 미량의 시료에 대해 중독 여부를 정확하고 신속하게 확인할 수 있는 효과가 있다.

또한, 본 발명에 따른 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 세트를 혼합하여 고리매개등온 실시간 다중형광 분자진단법으로 분석하면, 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B의 각 독소 유전자를 동시에 특이적으로 구분하여 확인할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 독소 검출용 프라이머 세트를 이용하여 리신 독소 유전자가 포함된 시료에 대해 RT-LAMP 기법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 보툴리눔 독소 B 검출용 프라이머 세트를 이용하여 보툴리눔 독소 B 유전자가 포함된 시료에 대해 RT-LAMP 기법으로 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 프라이머 세트를 이용하여 포도상구균 엔테로톡신 B 유전자가 포함된 시료에 대해 RT-LAMP 기법으로 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 독소 및 보툴리눔 독소 B 검출용 프라이머 세트를 이용하여 리신 독소/보툴리눔 독소 B/리신 독소+보툴리눔 독소 B 유전자가 포함된 시료에 대해 RT-LAMP 기법으로 각 독소를 단독 또는 동시에 특이적으로 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 독소 및 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 프라이머 세트를 이용하여 리신 독소/포도상구균 엔테로톡신 B/리신 독소+포도상구균 엔테로톡신 B 유전자가 포함된 시료에 대해 RT-LAMP 기법으로 각 독소를 단독 또는 동시에 특이적으로 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 프라이머 세트를 이용하여 보툴리눔 독소 B/포도상구균 엔테로톡신 B/보툴리눔 독소 B+포도상구균 엔테로톡신 B 유전자가 포함된 시료에 대해 RT-LAMP 기법으로 각 독소를 단독 또는 동시에 특이적으로 검출한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 프라이머 세트를 이용하여 리신 독소/보툴리눔 독소 B/포도상구균 엔테로톡신 B/리신 독소+보툴리눔 독소 B/리신 독소+포도상구균 엔테로톡신 B/보툴리눔 독소 B+포도상구균 엔테로톡신 B/리신 독소+보툴리눔 독소 B+포도상구균 엔테로톡신 B 유전자가 포함된 시료에 대해 Multiplex RT-LAMP 기법으로 각 독소를 단독 또는 동시에 특이적으로 검출한 결과를 나타낸 것이다.

이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부된 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.

그러나 본 발명은 이하에 개시되는 실시예들에 의해 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지 기술 등이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그에 관한 자세한 설명은 생략하기로 한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 생물학작용제로 사용될 수 있는 대표적인 독소인 리신 독소, 보툴리눔 독소 B, 포도상구균 엔테로톡신 B에 의한 중독 여부를 정확하고 신속하게 확인하기 위하여, 고리매개등온증폭법(Loop-mediated Isothermal Amplification Method, LAMP)에 사용하여 상기 각 독소의 유전자를 검출하고 정량할 수 있는 최적화된 3종의 프라이머 세트(Primer set)를 제공한다.

상기 3종 독소검출용 프라이머 세트는 각각 LAMP 프라이머 6종(F3, B3, FIP, BIP, LF, LB) 및 신호 프로브를 포함한다. 상기 신호 프로브는 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지된 프로브 및 소광제(quencher)가 표지된 프로브를 포함한다.

상기 리신 독소, 보툴리눔 독소 B, 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 프라이머 세트에서 독소별로 신호 프로브에 다른 형광발색제를 표지하고 고리매개등온 실시간 다중형광 분자진단법(Multiplex RT-LAMP)으로 분석하면, 상기 3종의 독소 유전자를 동시에 특이적으로 구분하여 확인할 수 있다. 구체적으로는 상기 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 프라이머 세트를 혼합하여 사용하는 경우 하나의 튜브 내에서 단독 검출 또는 다중 진단(multiplexing)이 가능한다.

이하, 리신 독소, 보툴리눔 독소 B, 포도상구균 엔테로톡신 B 각각의 검출용 프라이머 세트 및 이들을 이용한 검출방법에 대해 설명한다.

리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 세트

본 발명은 서열번호 1 내지 6의 프라이머를 포함하는, 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명이 일 실시예에 따르면, 상기 프라이머는 리신 독소 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 염기서열로서, 상기 서열번호 1 내지 6으로 표시되는 염기서열은 LAMP 프라이머 6종으로, 서열번호 1은 F3 프라이머(25 bp), 서열번호 2는 B3 프라이머(23 bp), 서열번호 3은 FIP 프라이머(44 bp), 서열번호 4는 BIP 프라이머(44 bp), 서열번호 5는 LF 프라이머(17 bp), 서열번호 6은 LB 프라이머(19 bp)을 나타낸다.

본 발명의 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 세트는 신호 프로브(fluorescence-quencher probe)를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 신호 프로브는 5' 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 서열번호 7의 염기서열을 가진 프로브(59 bp) 및 3' 말단에 소광제(quencher)가 표지되고 서열번호 22(30 bp) 또는 23(35 bp)의 염기서열을 가진 프로브 일 수 있다.

상기 형광발색제는 형광을 발하는 것이라면 제한되지 않으며, 그 예로서 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료(Cy5, Cy3 등) 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 소광제는 IABkFQ(Iowa black FQ quencher), IAbRQSp(Iowa black RQ quencher), DABCYL(4-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonyl chloride), BHQ(Black Hole Quencher: BHQ-1, BHQ-2 등), EBQ(Excellent Bioneer Quencher), 및 ZEN-IBFQ(ZEN-Iowa Black FQ)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 알려진 다양한 소광제가 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신호 프로브는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제인 Cy5가 표지되고, 상기 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ1이 표지되거나, 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ2가 표지될 수 있다.

보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 세트

본 발명은 서열번호 8 내지 13의 프라이머를 포함하는, 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명이 일 실시예에 따르면, 상기 프라이머는 보툴리눔 독소 B 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 염기서열로서, 상기 서열번호 8 내지 13으로 표시되는 염기서열은 LAMP 프라이머 6종으로, 서열번호 8은 F3 프라이머(24 bp), 서열번호 9는 B3 프라이머(25 bp), 서열번호 10은 FIP 프라이머(20 bp), 서열번호 11은 BIP 프라이머(19 bp), 서열번호 12는 LF 프라이머(44 bp), 서열번호 13은 LB 프라이머(47 bp)을 나타낸다.

본 발명의 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 세트는 신호 프로브(fluorescence-quencher probe)를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 신호 프로브는 5' 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 서열번호 14의 염기서열을 가진 프로브(55 bp) 및 3' 말단에 소광제(quencher)가 표지되고 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 가진 프로브 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신호 프로브는 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제인 HEX가 표지되고, 상기 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ1이 표지되거나, 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ2가 표지될 수 있다.

포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 세트

본 발명은 서열번호 15 내지 20의 프라이머를 포함하는, 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 세트를 제공한다.

본 발명이 일 실시예에 따르면, 상기 프라이머는 포도상구균 엔테로톡신 B 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 염기서열로서, 상기 서열번호 15 내지 20으로 표시되는 염기서열은 LAMP 프라이머 6종으로, 서열번호 15는 F3 프라이머(20 bp), 서열번호 16은 B3 프라이머(20 bp), 서열번호 17은 FIP 프라이머(49 bp), 서열번호 18은 BIP 프라이머(48 bp), 서열번호 19는 LF 프라이머(20 bp), 서열번호 20은 LB 프라이머(28 bp)을 나타낸다.

본 발명의 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 세트는 신호 프로브(fluorescence-quencher probe)를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로 상기 신호 프로브는 5' 말단에 형광발색제(fluorescent reporter dye)가 표지되고 서열번호 21의 염기서열을 가진 프로브(64 bp) 및 3' 말단에 소광제(quencher)가 표지되고 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 가진 프로브 일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 신호 프로브는 서열번호 21의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제인 FAM이 표지되고, 상기 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ1이 표지되거나, 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ2가 표지될 수 있다.

독소작용제 검출용 키트

본 발명은 전술한 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 세트; 전술한 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 세트; 및 전술한 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 검출용 LAMP 프라이머 세트; 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 포함하는, 독소작용제 검출용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 독소작용제 검출용 키트는 상기 2종 이상의 독소 검출용 프라이머 세트를 포함하고 각 독소별로 다른 형광발색제가 표지된 프로브를 사용하는 경우, 고리매개등온 실시간 다중형광 분자진단법(Multiplex RT-LAMP)으로 분석하면, 상기 2종 이상의 독소 유전자를 동시에 특이적으로 구분하여 확인할 수 있다.

독소작용제의 검출방법

본 발명은 전술한 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 세트; 전술한 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 세트; 및/또는 전술한 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 검출용 LAMP 프라이머 세트; 를 이용하여 고리매개등온증폭법을 수행하는 단계를 포함하는, 독소작용제의 검출방법을 제공한다.

구체적으로는, (a) 생물학적 시료부터 게놈 DNA를 분리하는 단계; (b) 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 3종의 LAMP 프라이머 세트를 이용하여 고리매개등온증폭법을 수행하는 단계; 및 (c) 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B를 검출 및 정량하는 단계; 를 포함한다.

본 발명의 LAMP 기반의 프라이머 세트는 전통적인 PCR과 달리 온도변화를 요구하지 아니하여 단순하고 가벼운 증폭 기기를 이용할 수 있고 분석에 소요되는 시간을 획기적으로 감소시킬 수 있다. 구체적으로, 본 발명은 실시간(Real-time) RT-LAMP 방법을 이용함으로써 종래의 Quantitative Real-time PCR(qRT-PCR)에 비해 시간을 40분 이상 단축시킬 수 있다.

본 발명에서 검체 시료는 생물학적 시료로서 혈액, 혈청, 혈장, 말초혈 단핵세포, 말초혈 백혈구, 타액, 소변, 분변, 인두 면봉 스와브(throat swabs), 피부 상처 스와브(dermal lesion swabs), 뇌척수액(cerebrospinal fluids), 경부 도말 표본(cervical smears), 농즙 샘플, 식품 기질(food matrices), 및 뇌, 비장 및 간을 포함하는 신체의 다양한 부분의 세포 또는 조직을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, "고리매개등온증폭반응(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)"은 기존 PCR법과 달리 PCR 사이클이 필요 없는 Bst, Gsp 등의 중합효소를 이용하여 등온의 조건에서 반응을 수행하는 방법으로, 기본적으로 4개의 프라이머를 이용하여, 양끝을 고리(loop) 구조로 합성하여 유전자의 특정 부위를 무한대로 증폭하고, 증폭된 DNA 산물을 형광 검출용 시약을 이용하거나 침전 반응시켜 증폭 유무를 확인하는 방법으로서, 바람직하게는 형광 검출용 시약을 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 있어서, "고리매개등온 실시간 다중형광 분자진단법(Multiplex Real-Time LAMP, Multiplex RT-LAMP)"은 증폭 유무를 실시간으로 확인하는 방법으로서, 다양한 유전자를 동시에 검출할 수 있으며, 바람직하게는 실시간으로 시료에서 표적물질을 검출할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 프라이머 세트는 고리매개등온증폭법(LAMP)에 사용되는 것이 바람직하며, 고리매개등온증폭법은 표적 DNA를 LAMP에 의하여 증폭하는 단일-단계(one-step) LAMP일 수 있고, 실시간 LAMP(Real-Time LAMP, RT-LAMP) 일 수 있으며, 또는 이들의 조합일 수 있다.

실시예

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예

독소작용제 3종으로, 리신 독소, 보툴리눔 독소 B, 포도상구균 엔테로톡신 B에 대해 GenBank에 등록되어 있는 수종의 각 독소 유전자 서열들을 참고하고 미국국립생물정보센터(NCBI)의 데이터베이스를 이용하여 특이 염기서열을 비교 분석한 다음, F3, B3, FIP, BIP, LF, LB primer 등을 Primer Explorer V5(Eiken, JP), NEB LAMP(New England BioLabs (NEB), USA)의 프로그램을 참고하여 melting temperature를 60∼65℃ 사이로 구성하도록 primer 및 probe를 디자인하였으며, 해당 primer 및 probe의 염기서열 정보는 표 1에 나타내었다.

Melting temperature, GC 비율 및 hairpin 구조 등의 quality는 OligoAnalyzer software(Integrated DNA Technologies, USA)를 사용하여 검증하였다. 또한, 여러 개의 독소를 동시에 검출하기 위한 다중형광 프로브 LBP로써 각 프로브에 부착된 형광염료들은 염료들 간의 간섭을 고려하여 서로 파장이 겹치거나 간섭하지 않는 3종을 선정하였다. 그 결과 리신 독소 LBP 5'-말단 부분에 Cy5, 보툴리눔 독소 B LBP 5'-말단 부분에 HEX, 포도상구균 엔테로톡신 B LBP 5'-말단 부분에 FAM이라는 형광발색제(fluorescent reporter dye)를 표지하도록 디자인 하였다. 이를 형광소거(??칭, quenching) 할 수 있는 ??처(quencher)인 BHQ1 또는 BHQ2를 3'-말단 부분에 표지한 ??처 프로브(quencher probe)를 디자인 하였다. 이를 통해 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신을 동시에 검출할 수 있도록 구성하였다(표 1 참조).

실시예 1

상기 제조예에서 제작한 프라이머 세트와 신호 프로브(fluorescence-quencher probe)를 이용하여 각 독소의 표적 핵산을 증폭하기 위해, 먼저 각 프라이머 세트의 F3, B3, FIP, BIP, LF, LB, LBP(형광발색제가 표지된 프로브), ??처 프로브(quencher probe, 소광제가 표지된 프로브) 및 표적 핵산 등을 포함하는 반응 혼합물을 준비하였다. 구체적으로는 1개 독소 검출시 각 독소별로 F3~LBP(7개) + 형광에 맞는 ??처 프로브 1개를 포함한 반응 혼합물을 준비하고, 2개 독소 검출시 F3~LBP(7개)X2 + ??처 프로브 1~2개를 포함한 반응 혼합물을 준비한다. 형광발색제 Cy5는 ??처 BHQ2와 쌍(pair)으로 사용하고, 형광발색제 FAM 또는 HEX는 ??처 BHQ1와 쌍으로 사용한다.

반응 혼합물은 최종 25 ㎕ volume으로서 Warmstart LAMP 2× master mix (NEB, USA) 12.5 ㎕, LAMP primer mix 1㎕, quencher probe mix 1 ㎕, target template 1㎕, DW 9.5 ㎕로 구성하였다. LAMP primer mix의 조성과 농도는 하기 표 2와 같이 준비하고 1㎕를 상기 반응 혼합물에 넣어 반응시켰다.

고리매개등온 실시간 다중형광 분자진단법의 수행은 QuantStudio 6 (Applied Biosystems, USA)을 이용하였다. 고리매개등온 실시간 다중형광 분자진단법은 다음과 같이 실시하였다. 먼저, Bst DNA 중합효소는 80℃ 이상이 되면 불활성화되는 특징을 가지고 있어, 마이크로 튜브에 동량의 LAMP primer mix와 quencher probe mix를 1× annealing buffer (10 mM Tris, pH 7.5~8.0, 50 mM NaCl, 1mM EDTA)와 함께 넣고 혼합한 후 95℃의 히팅 블록(heating block)에서 2분 어닐링 및 프로브 활성시킨 뒤 실온에서 약 한 시간 동안 천천히 식혀준 후에 반응 혼합물에 첨가하였다. 이후, 이 반응 혼합물을 61℃에서 60분간 등온 유지하여 증폭시키고 90℃ 에서 10분간 정치해 Bst DNA 중합효소를 불활성화 시킨 후 종료하는 방법으로 반응시켰다.

상기 3종의 독소작용제 프라이머 세트를 포함한 반응 혼합물 각각에 대하여, 해당되는 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 또는 포도상구균 엔테로톡신 B(유전자 서열 기반으로 합성 DNA 사용) 각각을 주형(template) DNA로 하고, 이를 단계 희석으로 10³pg부터 10^-2pg까지 총 6단계로 희석하여 농도별로 검출하였고, 이 결과를 도 1 내지 도 3으로 나타내었다.

도 1 내지 도 3을 참조하면, 본 발명의 프라이머 세트로 고리매개등온 실시간 다중형광 분자진단법으로 수행하는 경우 검출 한계는 10^-2pg 수준까지 검출 가능한 것으로 나타났다.

실시예 2

표 1에 기재된 프라이머 세트로, 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B의 유전자를 각각 구별하여 동시에 검출할 수 있는지 확인하기 위하여 다중진단(duplex 또는 multiplex)를 수행하였다.

표 2에 기재된 프라이머와 프로브의 비율로 하여 독소 2종(Ricin+BoNT/B, Ricin+SEB, BoNT/B+SEB) 또는 3종(Ricin+BoNT/B+SEB) 프라이머 세트를 포함한 반응 혼합물을 준비하고, 주형 DNA로 해당 독소를 투입하여 실시예 1와 동일하게 실시하였고, 그 결과를 도 4 내지 도 7로 나타내었다.

도 4 내지 도 7을 참조하면, 본 발명의 각 프라이머 세트가 해당 독소의 유전자에 대하여 매우 특이적으로 반응함으로써 2종 또는 3종의 독소작용제를 동시에 검출할 수 있음을 확인하였다. 또한, 약 40분 내 미량의 타켓 독소 유전자를 검출할 수 있었고, PCR과 비교했을 때 민감도가 떨어지지 않고 동일하거나 좋은 결과를 얻을 수 있었으며, 동시에 각 독소 유전자를 특이적으로 각각 검출할 수 있었다(PCR 민감도 수준: 리신은 약 3.0 genome copy/reaction, Toxins 2012 Sep;4(9):633-642 참조, 보툴리눔은 약 7.4 copies, ASM journals Vol.76 Issue 13 p4387-4395 참조).

실시예 3

표 1에 기재된 프라이머 세트의 타 독소 및 미생물에 대한 특이도(교차반응)를 확인하기 위하여, 주형(template)으로 표 3의 타 독소 및 미생물 총 35종의 유전자 샘플을 각 1 ng을 추가로 혼합한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일하게 실시하였고, 그 결과를 표 4로 나타내었다.

표 4를 참조하면, 본 발명의 프라이머 세트는 리신, 보툴리눔 독소 B, 포도상구균 엔테로톡신 B의 각 독소작용제 유전자에 대한 표적 특이성(target specificity)이 높고, 타 독소 및 미생물에 대해 교차반응(cross-reactivity)을 일으키지 않음을 확인할 수 있었다.

지금까지 독소작용제 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 독소작용제의 검출방법에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.

그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.

즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지고, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<서열목록의 설명>

서열번호 1은 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 F3(Ricin_F3)의 염기서열이다.

서열번호 2는 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 B3(Ricin_B3)의 염기서열이다.

서열번호 3은 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 FIP(Ricin_FIP)의 염기서열이다.

서열번호 4는 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 BIP(Ricin_BIP)의 염기서열이다.

서열번호 5는 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 LF(Ricin_LF)의 염기서열이다.

서열번호 6은 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 LB(Ricin_LB)의 염기서열이다.

서열번호 7은 리신 독소 검출용 LAMP 프로브 LBP(Ricin_LBP)의 염기서열이다.

서열번호 8은 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 F3(BoNT/B_F3)의 염기서열이다.

서열번호 9는 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 B3(BoNT/B_B3)의 염기서열이다.

서열번호 10은 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 FIP(BoNT/B_FIP)의 염기서열이다.

서열번호 11은 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 BIP(BoNT/B_BIP)의 염기서열이다.

서열번호 12는 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 LF(BoNT/B_LF)의 염기서열이다.

서열번호 13은 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 LB(BoNT/B_LB)의 염기서열이다.

서열번호 14는 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프로브 LBP(BoNT/B_LBP)의 염기서열이다.

서열번호 15는 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 F3(SEB_F3)의 염기서열이다.

서열번호 16은 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 B3(SEB_B3)의 염기서열이다.

서열번호 17은 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 FIP(SEB_FIP)의 염기서열이다.

서열번호 18는 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 BIP(SEB_BIP)의 염기서열이다.

서열번호 19는 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 LF(SEB_LF)의 염기서열이다.

서열번호 20은 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 LB(SEB_LB)의 염기서열이다.

서열번호 21은 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프로브 LBP(SEB_LBP)의 염기서열이다.

서열번호 22는 LAMP ??처 프로브 1(BHQ_Probe_1)의 염기서열이다.

서열번호 23은 LAMP ??처 프로브 2(BHQ_Probe_2)의 염기서열이다.

<110> AGENCY FOR DEFENSE DEVELOPMENT <120> Primer sets for detecting toxin agents, and method for detecting toxin agents using the same <130> LNP220071 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer F3 (Ricin_F3) for detecting Ricin toxin <400> 1 cttcctacta ataatacaca acctt 25 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer B3 (Ricin_B3) for detecting Ricin toxin. <400> 2 tgtttcccgt atattagaat cac 23 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer FIP (Ricin_FIP) for detecting Ricin toxin. <400> 3 agtcctctat ccatacttgt ccactgacaa ccattgttgg gcta 44 <210> 4 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer BIP (Ricin_BIP) for detecting Ricin toxin. <400> 4 gcagtgaaaa ggctgaacaa cagtgtaagg caattatctc ggtt 44 <210> 5 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer LF (Ricin_LF) for detecting Ricin toxin. <400> 5 tgcttgcaag cacagac 17 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer LB (Ricin_LB) for detecting Ricin toxin. <400> 6 tgggctcttt atgcagatg 19 <210> 7 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP probe LBP (Ricin_LBP) for detecting Ricin toxin. <400> 7 gtcagtgcag gctcccgtgt taggacgagg gtagggtagg tgggctcttt atgcagatg 59 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer F3 (BoNT/B_F3) for detecting Botulinum toxin B. <400> 8 gccagtttta aatgaaaatg agac 24 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer B3 (BoNT/B_B3) for detecting Botulinum toxin B. <400> 9 ctactttaat gccatataat ccatg 25 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer FIP (BoNT/B_FIP) for detecting Botulinum toxin B. <400> 10 agtatattta atagacgtgg 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer BIP (BoNT/B_BIP) for detecting Botulinum toxin B. <400> 11 cattataccc ccgaagcct 19 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer LF (BoNT/B_LF) for detecting Botulinum toxin B. <400> 12 tgttcaagaa aacaaaggcg cagttcatgc attaatatca aggc 44 <210> 13 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer LB (BoNT/B_LB) for detecting Botulinum toxin B. <400> 13 gcttacatat tctgggcaaa acttcaaaat cattttgcat caaggga 47 <210> 14 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP probe LBP (BoNT/B_LBP) for detecting Botulinum toxin B. <400> 14 cgggcccgta caaagggaac acccacactc gtaggagtat atttaataga cgtgg 55 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer F3 (SEB_F3) for detecting Staphylococcal Enterotoxin B. <400> 15 gttcgggtat ttgaagatgg 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer B3 (SEB_B3) for detecting Staphylococcal Enterotoxin B. <400> 16 caaatttatc tcctggtgca 20 <210> 17 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer FIP (SEB_FIP) for detecting Staphylococcal Enterotoxin B. <400> 17 caccaaatag tgacgagtta ggtaagacgt acaaactaat aagaaaaag 49 <210> 18 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer BIP (SEB_BIP) for detecting Staphylococcal Enterotoxin B. <400> 18 actctatgaa tttaacaact cgcctgtcat accaaaagct attctcat 48 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer LF (SEB_LF) for detecting Staphylococcal Enterotoxin B. <400> 19 tctaattctt gagcagtcac 20 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP primer LB (SEB_LB) for detecting Staphylococcal Enterotoxin B. <400> 20 tatgaaacgg gatatattaa atttatag 28 <210> 21 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP probe LBP (SEB_LBP) for detecting Staphylococcal Enterotoxin B. <400> 21 cgggcccgta caaagggaac acccacactc gtagggtatg aaacgggata tattaaattt 60 atag 64 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP quencher probe 1 (BHQ_Probe_1). <400> 22 gagtgtgggt gttccctttg tacgggcccg 30 <210> 23 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of LAMP quencher probe 2 (BHQ_Probe_2). <400> 23 cctaccctcg tcctaacacg ggagcctgca ctgac 35

Claims

서열번호 1 내지 6의 프라이머를 포함하는, 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 세트.
서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브와 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 포함하는 프로브(제1 프로브 세트)를 포함하는,
리신 독소 검출용 LAMP 프로브 세트.
제2항에 있어서,
상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에
형광발색제로서 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나가 부착된 것을 특징으로 하는,
리신 독소 검출용 LAMP 프로브 세트.
제2항에 있어서,
상기 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에
소광제로서 IABkFQ(Iowa black FQ quencher), IAbRQSp(Iowa black RQ quencher), DABCYL(4-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonyl chloride), BHQ (Black Hole Quencher), EBQ(Excellent Bioneer Quencher), 및 ZEN-IBFQ(ZEN-Iowa Black FQ)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나가 부착된 것을 특징으로 하는,
리신 독소 검출용 LAMP 프로브 세트.
제2항에 있어서,
상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제인 Cy5(indocarbocyanine-5)가 표지되고,
상기 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ1이 표지되거나, 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ2가 표지되는 것을 특징으로 하는,
리신 독소 검출용 LAMP 프로브 세트.
서열번호 1 내지 6의 프라이머 및 서열번호 8 내지 13의 프라이머를 포함하는, 리신 독소 및 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 세트.
서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브와 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 포함하는 프로브(제1 프로브 세트); 및
서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프로브와 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 포함하는 프로브(제2 프로브 세트);를 포함하는,
리신 독소 및 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프로브 세트.
제7항에 있어서,
상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제가 부착되고,
상기 형광발색제는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
리신 독소 및 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프로브 세트.
제7항에 있어서,
상기 제1 프로브 세트 및 제2 프로브 세트의 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제가 부착되고,
상기 소광제는 IABkFQ(Iowa black FQ quencher), IAbRQSp(Iowa black RQ quencher), DABCYL(4-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonyl chloride), BHQ (Black Hole Quencher), EBQ(Excellent Bioneer Quencher), 및 ZEN-IBFQ(ZEN-Iowa Black FQ)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
리신 독소 및 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프로브 세트.
제7항에 있어서,
상기 제1 프로브 세트에서,
서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제인 Cy5(indocarbocyanine-5)가 표지되고,
서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ1이 표지되거나, 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ2가 표지되며;
상기 제2 프로브 세트에서,
서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제인 HEX가 표지되고,
서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ1이 표지되거나, 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ2가 표지되는; 것을 특징으로 하는,
리신 독소 및 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프로브 세트.
서열번호 1 내지 6의 프라이머 및 서열번호 15 내지 20의 프라이머를 포함하는, 리신 독소 및 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 세트.
서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브와 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 포함하는 프로브(제1 프로브 세트); 및
서열번호 21의 염기서열을 포함하는 프로브와 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 포함하는 프로브(제3 프로브 세트);를 포함하는,
리신 독소 및 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프로브 세트.
제12항에 있어서,
상기 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브 및 서열번호 21의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제가 부착되고,
상기 형광발색제는 FAM(6-carboxyfluorescein), 텍사스 레드(texas red), 플루오레신(fluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸 로다민(tetramethyl rhodamine), FITC(fluorescein isothiocyanate), 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(alexa fluor), JOE(6-Carboxy-4',5'-Dichloro-2',7'-Dimethoxyfluorescein), ROX(6-Carboxyl-XRhodamine), TET(Tetrachloro-Fluorescein), TRITC(tertramethylrodamine isothiocyanate), TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), NED(N-(1-Naphthyl) ethylenediamine), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
리신 독소 및 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프로브 세트.
제12항에 있어서,
상기 제1 프로브 세트 및 제3 프로브 세트의 서열번호 22 또는 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제가 부착되고,
상기 소광제는 IABkFQ(Iowa black FQ quencher), IAbRQSp(Iowa black RQ quencher), DABCYL(4-dimethylaminoazobenzene-4'-sulfonyl chloride), BHQ (Black Hole Quencher), EBQ(Excellent Bioneer Quencher), 및 ZEN-IBFQ(ZEN-Iowa Black FQ)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는,
리신 독소 및 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프로브 세트.
제12항에 있어서,
상기 제1 프로브 세트에서,
서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제인 Cy5(indocarbocyanine-5)가 표지되고,
서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ1이 표지되거나, 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ2가 표지되며;
상기 제3 프로브 세트에서,
상기 서열번호 21의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단에 형광발색제인 FAM이 표지되고,
상기 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ1이 표지되거나, 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프로브의 3' 말단에 소광제인 BHQ2가 표지되는; 것을 특징으로 하는,
리신 독소 및 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프로브 세트.
서열번호 1 내지 6의 프라이머, 및 서열번호 7의 프로브와 서열번호 22 또는 23의 프로브를 포함하는 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 및 프로브 세트(A 세트);
서열번호 8 내지 13의 프라이머, 및 서열번호 14의 프로브와 서열번호 22 또는 23의 프로브를 포함하는 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 및 프로브 세트(B 세트); 및
서열번호 15 내지 20의 프라이머, 및 서열번호 21의 프로브와 서열번호 22 또는 23의 프로브를 포함하는 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 및 프로브 세트(C 세트);로 이루어지는 군에서,
A 세트; A 및 B 세트; A 및 C 세트; A, B 및 C 세트; 중 선택되는 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는,
독소작용제 검출용 키트.
서열번호 1 내지 6의 프라이머, 및 서열번호 7의 프로브와 서열번호 22 또는 23의 프로브를 포함하는 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 및 프로브 세트 (A 세트);
서열번호 8 내지 13의 프라이머, 및 서열번호 14의 프로브와 서열번호 22 또는 23의 프로브를 포함하는 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 및 프로브 세트(B 세트); 및
서열번호 15 내지 20의 프라이머, 및 서열번호 21의 프로브와 서열번호 22 또는 23의 프로브를 포함하는 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 및 프로브 세트(C 세트);로 이루어지는 군에서,
A 세트; A 및 B 세트; A 및 C 세트; A, B 및 C 세트; 중 선택되는 어느 하나를 이용하여 고리매개등온증폭법을 수행하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는,
독소작용제의 검출방법.
(a) 생물학적 시료부터 게놈 DNA를 분리하는 단계;
(b) 분리된 게놈 DNA를 주형으로 하고,
서열번호 1 내지 6의 프라이머, 및 서열번호 7의 프로브와 서열번호 22 또는 23의 프로브를 포함하는 리신 독소 검출용 LAMP 프라이머 및 프로브 세트 (A 세트);
서열번호 8 내지 13의 프라이머, 및 서열번호 14의 프로브와 서열번호 22 또는 23의 프로브를 포함하는 보툴리눔 독소 B 검출용 LAMP 프라이머 및 프로브 세트(B 세트); 및
서열번호 15 내지 20의 프라이머, 및 서열번호 21의 프로브와 서열번호 22 또는 23의 프로브를 포함하는 포도상구균 엔테로톡신 B 검출용 LAMP 프라이머 및 프로브 세트(C 세트);로 이루어지는 군에서,
A, B 및 C 세트를 이용하여 고리매개등온증폭법을 수행하는 단계; 및
(c) 리신 독소, 보툴리눔 독소 B 및 포도상구균 엔테로톡신 B를 검출 및 정량하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는,
독소작용제의 검출방법.