CN110029179B

CN110029179B - 一组核苷酸分子及在纹带棒状杆菌鉴定中的应用

Info

Publication number: CN110029179B
Application number: CN201910296406.1A
Authority: CN
Inventors: 邱小彤; 李振军; 周海健; 侯雪新
Original assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Current assignee: National Institute for Communicable Disease Control and Prevention of Chinese Center For Disease Control and Prevention
Priority date: 2019-04-13
Filing date: 2019-04-13
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2039-04-13
Also published as: CN110029179A

Abstract

一组核苷酸分子及在纹带棒状杆菌鉴定中的应用。本发明提供了一组用于多交叉置换恒温扩增引物的核苷酸分子组合，还提供了所述的核苷酸分子组合用于多交叉置换恒温扩增检测纹带棒状杆菌种特异性基因ftr1的方法。本发明提供的核苷酸分子组合在以多交叉置换恒温扩增检测纹带棒状杆菌种特异性基因ftr1时具有高度的特异性，可以将纹带棒状杆菌与其他密切相近的菌种鉴别出来，而且所述方法具有高度的灵敏度，检测下限为10fg的基因组DNA。

Description

一组核苷酸分子及在纹带棒状杆菌鉴定中的应用

技术领域

本发明涉及多交叉置换扩增在细菌检测中的应用，特别是在纹带棒状杆菌鉴别诊断中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。

背景技术

纹带棒状杆菌(Corynebacterium striatum,C.striatum)是一种革兰氏染色阳性，无芽孢，非运动性的短棒状杆菌，通常定殖于人的皮肤和黏膜表面，被认为是一种机会致病菌。然而近几年，由纹带棒状杆菌导致的医院病例甚至暴发逐渐增多。该菌可导致人的肺炎、心内膜炎和败血症等疾病，尤其容易感染患慢性疾病的以及免疫功能低下的患者。一般来说，住院时间长、接受过介入性治疗或长期使用抗生素的患者更容易被其感染。此外，值得注意的是，这种新发的医院感染病原菌多为多重耐药性菌株，因此为临床治疗带来了很大的困难。

目前临床微生物实验室鉴定棒状杆菌属细菌，单纯用痰涂片镜检及生化试验很难将其精确地鉴定到种水平，因此还需要借助其他方法，例如基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MOLDI-TOF MS)和16S rRNA基因测序等。然而这些方法较为昂贵和费时费力，且需要基于细菌的分离培养。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术被用于棒状杆菌的鉴定。Carolina S.Santos等建立了一个普通PCR体系可用于鉴定纹带棒杆菌，其检测的目标靶基因为纹带棒杆菌的种特异基因ftr1，该基因在鉴定时能将纹带棒杆菌与无枝菌酸棒杆菌(Corynebacterium amycolatum)和干燥棒杆菌(Corynebacteriumxerosis)有效地区分开，显示出100％的敏感性和100％的特异性，表明ftr1基因对纹带棒杆菌具有良好的特异性，可作为鉴定纹带棒杆菌的可靠靶基因。然而该方法仍然依赖于繁杂的实验仪器和设备，且需要通过凝胶电泳进行结果的判读，这无疑增加了鉴定的时间和经济成本。此外，PCR检测技术的灵敏度相对较低，因此在应用到临床标本的检验时可能会出现漏检，不利于快速诊断和应急检测。因此，亟需发展一种简单、快速、灵敏、高效的诊断技术用于纹带棒杆菌的快速检测。

多交叉置换扩增(Multiple Cross Displacement Amplification,MCDA)技术是由叶长芸等建立的一种新的恒温核酸扩增技术(CN104946744A)，具有扩增速度快、反应灵敏、特异性高的特点。该技术目前已被广泛用于生物相关领域，实现核酸的快速扩增及分子诊断分析。MCDA针对靶序列设计5对引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，靶序列能够得以高效扩增。MCDA扩增之后，三种主流的检测方法被用于MCDA扩增判读，即可视染料检测、电泳检测和实时浊度检测。

鉴于诸如痰涂片镜检、生化试验等方法将棒状杆菌属鉴定到种水平的困难性和偏差性，以及MOLDI-TOF MS和16S rRNA基因测序等方法存在的检测时间长、受限因素多等缺点，应用MCDA方法进行纹带棒状杆菌的快速诊断成为亟需解决的技术需求。本发明的目的就是提供一种能够用于恒温扩增检测纹带棒状杆菌的核苷酸分子引物的组合，以及能够方便、高效、快速地检测纹带棒状杆菌的基因扩增方法。

发明内容

基于上述目的，本发明首先提供了一组用于多交叉置换扩增引物的核苷酸分子组合，所述组合包括：序列如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1，序列如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2；序列如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1和序列如SEQ ID NO:4所示的交叉引物CP2；序列如SEQ ID NO:5所示的扩增引物C1，和序列如SEQ ID NO:6所示的扩增引物C2，序列如SEQ ID NO:7所示的扩增引物D1，序列如SEQ ID NO:8所示的扩增引物D2，序列如SEQID NO:9所示的扩增引物R1和序列如SEQ ID NO:10所示的扩增引物R2。

其次，本发明还提供了一种基于非诊断目的的应用上述的核苷酸分子组合进行多交叉置换扩增检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组DNA；

(2)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、作为引物的所述核苷酸分子组合存在下，使用待检测样品的基因组DNA作为模板进行恒温扩增反应；

(3)检测步骤(2)的扩增结果。

在一个优选的实施方案中，步骤(1)所述样品为体液、血液、分泌物、排泄物、痰液、或粘膜组织。

在另一个优选的实施方案中，步骤(2)所述恒温扩增是在60-69℃的环境中进行的。

更为优选地，步骤(2)所述恒温扩增是在68℃的环境中进行的。

在一个优选的实施方案中，步骤(2)所述恒温扩增的时间为30-60分钟。

更为优选地，步骤(2)所述恒温扩增的时间为40分钟。

在一个优选的实施方案中，步骤(3)所述的检测为实时浊度仪判读、可视染料法判读或者琼脂糖凝胶电泳判读。

在一个更为优选的实施方案中，步骤(3)所述的检测为可视化检测，在所述多交叉置换恒温扩增体系中还含有核酸染料。

尤为优选地，所述核酸染料为VR，适宜于本方法的可替代的可视核酸染料有很多，例如孔雀绿(Malachite Green,MG)、羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)等等。使用孔雀绿作为可视核酸染料时，阳性反应为亮蓝色，阴性反应为无色；使用羟基萘酚蓝作为可视核酸染料时，阳性反应为蓝色，阴性反应为紫色。

本发明以纹带棒状杆菌的种特异基因ftr1为靶基因设计出适宜于多交叉置换恒温扩增的核苷酸分子组合，以该组合为引物的多交叉置换恒温扩增在检测纹带棒状杆菌种特异性基因ftr1时显示了高度的特异性，可以将纹带棒状杆菌与其他密切相近的菌种鉴别出来，而且所述方法具有高度的灵敏度，检测下限为10fg的基因组DNA，而且扩增仅需要40分钟。与诸如痰涂片和PCR等传统的纹带棒状杆菌检测方法比，所述方法扩增简便、高效，快速、经济、具有优异的实用性。

附图说明

图1：引物设计的位置和方向示意图；

图2：实时浊度仪确认纹带棒杆菌-MCDA-VR引物可用性结果图；

图3：可视染料法确认纹带棒杆菌-MCDA-VR引物可用性结果图；

图4：琼脂糖凝胶电泳确认纹带棒杆菌-MCDA-VR引物可用性结果图；

图5：实时浊度仪对纹带棒杆菌-MCDA-VR反应温度评价结果图；

图6：可视染料法对纹带棒杆菌-MCDA-VR体系特异性评价结果图；

图7：实时浊度仪对纹带棒杆菌-MCDA-VR灵敏度评价结果图；

图8：可视染料法对纹带棒杆菌-MCDA-VR灵敏度评价结果图；

图9：琼脂糖凝胶电泳对纹带棒杆菌-MCDA-VR灵敏度评价结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。

本发明中所使用和涉及的试剂：

艾斯福恒温扩增试剂盒(

Amplification kits)购于北京海泰正元有限公司。可视核酸染料试剂盒(Visual reagent,VR)购于北京甄敏生物科技有限公司(适宜于本方法的可替代的可视核酸染料有很多，例如孔雀绿(Malachite Green,MG)、羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)等等。使用孔雀绿作为可视核酸染料时，阳性反应为亮蓝色，阴性反应为无色；使用羟基萘酚蓝作为可视核酸染料时，阳性反应为蓝色，阴性反应为紫色)。DNA提取试剂盒(

Genomic DNA Purification Kit)购于美国Promega公司。PCR反应体系混合物(2×

PCR SuperMix)购于北京全式金生物科技有限公司。6×Loading Buffer和DL2000DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分析纯级产品。

本发明实验中所使用和涉及的主要仪器：

Loopamp实时浊度仪LA-320C为日本荣研公司产品。PCR仪Veriti 96为美国Life公司产品。分光光度计NanoDrop ND-1000为美国Thermo公司产品。电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品。凝胶成像系统Bio-Rad Gel Dox XR为美国Bio-Rad公司产品。

本发明实验中所使用的菌株和临床标本：

纹带棒杆菌标准菌株ATCC 6940购于美国菌种保藏中心。纹带棒杆菌临床分离株及痰标本来自北京某医院。表2中其他菌株为中国疾病预防控制中心传染病预防控制所各实验室保藏。

本发明的引物序列设计：

根据纹带棒状杆菌种特异性基因ftr1的DNA序列(GenBank序列号：EEI79352.1)设计引物。该基因在纹带棒状杆菌中保守且特异性好，可以将纹带棒状杆菌与其他密切相近的菌种(如模拟棒状杆菌、丙酸棒状杆菌、干燥棒状杆菌、无枝菌酸棒状杆菌等)区分开来。利用引物设计软件PrimerExplorer V4和Primer Premier 5.0设计多交叉置换扩增引物，并将获得的特异性引物利用BLAST序列分析以确证引物的特异性，利用IDT工具分析以确保不形成发夹结构，最终获得优化后的一套恒温多交叉置换扩增引物。引物设计的位置和方向见图1，序列见表1。

表1：纹带棒杆菌-MCDA-VR引物序列

纹带棒杆菌-MCDA-VR反应体系包括10条引物，识别靶基因中段较为连续的10个区域(图1)，因此，相比较普通PCR只识别不相邻的2个区域而言，纹带棒杆菌-MCDA-VR反应体系的引物设计保证了反应的高度特异性。在既定的反应温度下，双链DNA处于半解离和半结合的动态平衡状态，该套引物以靶序列为模板，通过由扩增引物介导的循环扩增和由交叉引物介导的置换扩增的反应过程，不断循环扩增，在短时间内形成了片段大小不一的扩增产物，从而实现了高效、快速地扩增靶序列的目的。

实施例1纹带棒杆菌-MCDA-VR体系检测

提取纹带棒杆菌标准菌株ATCC 6940的基因组DNA，使用提取的DNA作为模板进行多交叉置换扩增反应，然后运用三种检测方法对结果进行判读。

1、基因组提取：细菌基因组的提取使用Promega公司的DNA纯化试剂盒(

Genomic DNA Purification Kit)，按照说明书进行操作。利用NanoDrop ND-1000分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，用TE缓冲液进行倍比稀释(1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL)。

2、纹带棒杆菌-MCDA-VR反应体系：总体积25μL，包含各0.6μM的置换引物F1和F2，各2.4μM的交叉引物CP1和CP2，各1.2μM的扩增引物C1，C2，D1，D2，R1和R2，12.5μL2×反应体系混合物(

amplification kit)，1.25μL Bst 2.0DNA聚合酶(10U)，1μL核酸染料VR(可视核酸染料试剂盒)和1μL的DNA模板(阴性对照以1μL的模拟棒杆菌DNA和1μL的丙酸棒杆菌DNA作为模板，空白对照以1μL的无菌双蒸水代替DNA)。

3、扩增反应

在Loopamp实时浊度仪LA-320C中进行恒温反应，反应温度为68℃(恒温的范围可为60-69℃)，反应时间为40分钟(反应时间的范围可为30-60分钟)。

4、结果判读

(1)实时浊度仪判读：反应过程中通过实时浊度仪进行浊度判读；

(2)可视染料法判读：反应结束后，通过肉眼观察颜色变化进行判读，反应体系呈亮蓝色为扩增阳性，呈无色为扩增阴性；

(3)琼脂糖凝胶电泳判读：取5μL扩增产物与1μL 6×Loading Buffer混合后在浓度为2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，并在凝胶成像系统上观察分析结果。

5.方法体系的评价：

(1)证明设计的纹带棒杆菌-MCDA-VR引物的可用性

如图2所示，MCDA阳性反应体系的浊度随反应时间的延长而显著增加(CH1)，阴性对照(CH2、CH3)和空白对照(CH4)的浊度不发生明显变化。如图3所示，MCDA阳性反应管(管1)仍然为亮蓝色，阴性对照管(管2、管3)和空白对照管(管4)从亮蓝色变为无色。如图4所示，通过琼脂糖凝胶电泳，阳性反应产物显示出独特的阶梯状条带(泳道1)，而阴性对照(泳道2、泳道3)和空白对照(泳道4)不出现任何条带。

(2)扩增温度：本发明建立的方法在60-69℃条件下均可扩增，68℃时扩增效率最高。图5为模板DNA含量为10pg时，在60-69℃恒温条件下实时浊度仪对纹带棒杆菌-MCDA-VR反应扩增产物的检测情况，横坐标为反应时间(分钟)，纵坐标为反应管实时浊度值。如图5所示，纹带棒杆菌-MCDA-VR体系在60-69℃恒温条件下均可发生扩增反应，其中在68℃时反应速度最快，扩增产物量最大，因而68℃为本发明方法的最佳反应温度。

(3)反应时间：反应时间与模板DNA的含量呈负相关。当模板量≥100fg时，反应可在30分钟内获得阳性结果；即使在模板量低至10fg时，也能在40分钟内获得阳性检测结果。因此本发明方法推荐反应时间为40分钟。

实施例2.纹带棒杆菌-MCDA-VR体系检测的特异性

以纹带棒杆菌临床分离株、常见的其他种属致病菌及条件致病菌DNA为模板评价纹带棒杆菌-MCDA-VR反应体系的特异性。

图6中，管1为纹带棒杆菌标准菌株ATCC 6940；管2-26为纹带棒杆菌临床分离株(其余75株临床分离株结果省略)；管27为模拟棒杆菌分离菌株；管28-29为丙酸棒杆菌分离菌株；管30-57分别为Acinetobacter baumannii,Burkholderia cepacia,Citrobacterfreundii(ATCC 43864),Citrobacter freundii(ATCC 8090),Clostridium braakii,Clostridium youngae,Clostridium difficile,Enterococcus faecalis,Escherichiacoli,Klebsiella peneumoniae,Klebsiella rhinoscleromatis,Listeriamonocytogenes,Morganella morganii,Plesimonas shigelloides,Pseudomonasaeruginosa,Salmonella enteritidis,Serratia marcesens,Shigella dysenteriae,Shigella flexneri,Staphylococcus aureus,Staphylococcus epidermidis,Staphylococcus haemolyticus,Streptococcus bovic,Streptococcus pneumoniae,Streptococcus pyogenes,Streptococcus sanguis,Streptococcus suis,Yersiniaenterocolitica分离株。管58为空白对照。

如图6所示，纹带棒杆菌-MCDA-VR体系检测纹带棒杆菌标准菌株ATCC 6940(管1)和其他25株纹带棒杆菌临床分离株(管2-26)均呈阳性反应，检测29种常见的其他种属致病菌及条件致病菌(管27-57)和空白对照(管58)时均呈阴性，说明该检测体系的特异性良好。菌株背景信息见表2。

表2：用于检测的菌株背景情况一览表

注：ATCC：美国菌种保藏中心；ICDC：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。

实施例3.纹带棒杆菌-MCDA-VR体系检测的灵敏度

运用连续稀释的纹带棒状杆菌标准菌株ATCC 6940的基因组DNA进行MCDA反应扩增后结果显示，纹带棒杆菌-MCDA-VR体系的检测下限为10fg的基因组DNA。当反应体系中基因组模板量降低至10fg以下时，MCDA反应不出现阳性扩增。

图7为运用实时浊度仪读取MCDA的扩增结果。图7横轴为反应时间(分钟)，纵轴为反应管累计浊度值。图中曲线CH1-CH8依次对应分别含有1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、1fg基因组DNA和不含基因组DNA(空白对照)的反应管。反应开始后60分钟内，曲线CH1-CH6均发生明显上升，即对应浊度显著增加，为阳性反应；曲线CH7和CH8未发生明显变化，即对应浊度未显著增加，为阴性反应。浊度发生显著增加的时间与基因组DNA含量呈负相关。

图8为运用可视法读取MCDA的扩增结果。图中管1-6(依次分别含有1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg基因组DNA)为阳性反应，呈亮蓝色；管7含有1fg基因组DNA，管8为空白对照，不含纹带棒杆菌基因组DNA，为阴性反应，呈无色。

图9为运用2％的琼脂糖凝胶电泳读取MCDA的扩增结果。图中泳道M为DNA分子量Marker DL2000；泳道1-7依次分别为模板量为1ng～1fg的纹带棒杆菌基因组DNA；泳道8为空白对照。泳道1-6显示出独特的阶梯状条带，为阳性反应；泳道7-8不出现任何条带，为阴性反应。

实施例4、纹带棒杆菌-MCDA-VR体系应用于临床痰标本检测时与普通PCR和痰涂片镜检方法的比较

(1)临床痰标本的处理：

从北京某医院收集了88份临床痰标本，每份痰标本被分成2份，其中一份直接用于涂片镜检，另一份经4％的氢氧化钠溶液预处理后，使用DNA纯化试剂盒(

GenomicDNA Purification Kit)提取核酸，操作按说明书进行。提取后的核酸用于进行MCDA检测和普通PCR检测。

(2)普通PCR：

根据Carolina S.Santos等建立的PCR体系，引物Cst_1-F：5’-CTTCGAAGAACATGAAGGCA-3’；Cst_1-R：5’-CCGTAGTACATCGCTACGGC-3’被用于鉴定纹带棒杆菌。PCR反应体系总体积为20μL，包含10μL 2×

PCR SuperMix，每条引物0.4μM，以及1μL DNA模板。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，63℃退火40s，72℃延伸50s，以上步骤循环30次；72℃终末延伸5min。PCR反应结束后，以浓度为1.5％的琼脂糖凝胶电泳进行产物检测。其检测下限为15ng纹带棒杆菌基因组DNA。与本发明建立的纹带棒杆菌-MCDA-VR检测体系相比较，MCDA检测的灵敏度为普通PCR的10⁶倍。

(3)检测临床痰标本时，三种方法的比较：

纹带棒杆菌-MCDA-VR与痰涂片镜检方法比较时灵敏度为90％，特异度为78.6％，见表3。纹带棒杆菌-MCDA-VR与普通PCR方法比较时灵敏度为100％，特异度为75.7％，见表4。以上数据统计检验使用软件Rv3.5.2。

表3：纹带棒杆菌-MCDA-VR与痰涂片方法用于临床痰标本时的比较

表4：纹带棒杆菌-MCDA-VR与普通PCR方法用于临床痰标本时的比较

由于MOLDI-TOF MS技术和16S rRNA基因测序需要基于分离培养且费时费力的特点，目前临床上普遍使用传统的痰涂片镜检来快速发现纹带棒状杆菌，但该方法需要检验医师有丰富的形态学经验，否则容易造成误判或漏检。本发明建立的MCDA检测方法与传统痰涂片镜检方法比较，检验结果的一致性较好，优点在于无需进行分离培养即可发现纹带棒杆菌，操作更简便、快速，且对形态学经验的要求低，可作为替代痰涂片镜检的一种快速检验方法。

本发明建立的MCDA检测方法与普通PCR相比，优点在于无需专业的仪器设备(如PCR仪和电泳仪)，只需要较为便宜的恒温加热器(如金属浴或水浴锅)即可进行实验，且无需进行电泳即可根据反应管颜色的变化对结果进行判读，操作步骤更少，过程更为简单、快捷。此外，本方法有较普通PCR方法更高的灵敏度，对于菌量较低的样本可达到较高的检出率，避免假阴性结果的出现而造成漏检。

综上所述，本发明建立的MCDA检测方法以其方便、快捷、经济、实用的特点，适合对临床标本中的纹带棒杆菌进行快速发现和鉴定，尤其适合设备条件不完善的基层医院和实验室使用。

序列表

<110> 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

<120> 一组核苷酸分子及在纹带棒状杆菌鉴定中的应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213> Corynebacterium striatum

<400> 1

ggctccacca tgacgc 16

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Corynebacterium striatum

<400> 2

cgcaatgacg ttagagatgt 20

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> Corynebacterium striatum

<400> 3

ttgatgcgca ctgcgccgta gctttcccta ggcatcctca 40

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> Corynebacterium striatum

<400> 4

gtcgtggctg cgggcacgaa ggcgagtgtg tg 32

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> Corynebacterium striatum

<400> 5

ttgatgcgca ctgcgccgta g 21

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> Corynebacterium striatum

<400> 6

gtcgtggctg cgggca 16

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> Corynebacterium striatum

<400> 7

tacatcgcta cggctac 17

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Corynebacterium striatum

<400> 8

acggacttgc aggaagct 18

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> Corynebacterium striatum

<400> 9

gtgactttaa agaaggtgc 19

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213> Corynebacterium striatum

<400> 10

cggcatcttg ctggtc 16

Claims

1.一组用于多交叉置换恒温扩增引物的核苷酸分子组合，所述组合包括：序列如SEQID NO:1所示的置换引物F1，序列如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2；序列如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1和序列如SEQ ID NO:4所示的交叉引物CP2；序列如SEQ ID NO:5所示的扩增引物C1，和序列如SEQ ID NO:6所示的扩增引物C2，序列如SEQ ID NO:7所示的扩增引物D1，序列如SEQ ID NO:8所示的扩增引物D2，序列如SEQ ID NO:9所示的扩增引物R1和序列如SEQ ID NO:10所示的扩增引物R2。

2.一种基于非诊断目的的应用权利要求1所述的核苷酸分子组合进行多交叉置换恒温扩增检测目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)提取待检测样品的基因组DNA；

(3)检测步骤(2)的扩增结果。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述样品为体液、血液、分泌物、排泄物、痰液或粘膜组织。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)所述恒温扩增是在60-69℃的环境中进行的。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述恒温扩增是在68℃的环境中进行的。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述恒温扩增的时间为30-60分钟。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述恒温扩增的时间为40分钟。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的检测为实时浊度仪判读、可视染料法判读或者琼脂糖凝胶电泳判读。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的检测为可视化检测，在所述多交叉置换恒温扩增体系中还含有核酸染料。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述核酸染料为VR。