RU2813995C1 - Набор праймеров для выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации - Google Patents
Набор праймеров для выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации Download PDFInfo
- Publication number
- RU2813995C1 RU2813995C1 RU2023122512A RU2023122512A RU2813995C1 RU 2813995 C1 RU2813995 C1 RU 2813995C1 RU 2023122512 A RU2023122512 A RU 2023122512A RU 2023122512 A RU2023122512 A RU 2023122512A RU 2813995 C1 RU2813995 C1 RU 2813995C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- insdqualifier
- insdfeature
- insdseq
- name
- value
- Prior art date
Links
- 244000052769 pathogen Species 0.000 title claims abstract description 19
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 title claims abstract description 12
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 title claims abstract description 12
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims description 26
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims description 25
- 201000001178 Bacterial Pneumonia Diseases 0.000 title claims description 17
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 23
- 241000894007 species Species 0.000 abstract description 18
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 7
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 64
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 46
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 11
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 241000589242 Legionella pneumophila Species 0.000 description 7
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 6
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 229940115932 legionella pneumophila Drugs 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 3
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 3
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000013461 design Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229940045505 klebsiella pneumoniae Drugs 0.000 description 2
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000000115 thoracic cavity Anatomy 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003757 Atypical pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010024971 Lower respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 1
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 101710178358 Peptidoglycan-associated lipoprotein Proteins 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 206010035737 Pneumonia viral Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000023852 carbohydrate metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000021256 carbohydrate metabolism Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 101150027335 cpsB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 101150032154 ebpS gene Proteins 0.000 description 1
- 108010064033 elastin-binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 101150015947 fimH gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 101150025078 fucK gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 101150077062 pal gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N reserpine Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@H]2C[C@@H]3C4=C(C5=CC=C(OC)C=C5N4)CCN3C[C@H]2C1)C(=O)OC)OC)C(=O)C1=CC(OC)=C(OC)C(OC)=C1 QEVHRUUCFGRFIF-MDEJGZGSSA-N 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 239000012321 sodium triacetoxyborohydride Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 208000009421 viral pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен набор видоспецифичных праймеров для видовой идентификации шести социально-значимых возбудителей пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной реакции (RPA), состоящий из последовательностей SEQ ID NO: 1-12. Набор праймеров в составе разработанной системы может найти применение в профильных клинических лабораториях для экспресс-анализа образцов от пациентов с подозрением на пневмонию. Аналитическая чувствительность разработанной мультиплексной RPA с применением заявляемого набора праймеров составила 102-103 копий ДНК. Специфичность метода мультиплексной RPA на основе заявляемых праймеров составила 100%. Время выполнения анализа составило менее часа, включая электрофоретический контроль реакции. 1 ил., 2 табл., 4 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к молекулярной биологии, микробиологии и медицине и обеспечивает обнаружение бактерий - возбудителей инфекционной пневмонии человека с помощью видоспецифичных праймеров. Изобретение направлено на применение в клинических лабораториях для ускоренной диагностики бактериальной пневмонии и уточнения диагноза при выявленной пневмонии неясной этиологии.
Уровень техники
Инфекционная пневмония относится к социально-значимым заболеваниям и представляет собой воспаление респираторных отделов легких. Внебольничная пневмония бактериальной природы встречается гораздо чаще грибковой, паразитарной, аллергической, ожоговой и лучевой, однако часто сочетается с вирусной инфекцией (Campigotto А., Mubareka S. (2015) Influenza-associated bacterial pneumonia; managing and controlling infection on two fronts. Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 13, 55-68; Noskin G.A., Glassroth J. (1996) Bacterial pneumonia associated with HIV-1 infection. Clin. Chest. Med. 17, 713-723). Ежегодно бактериальной пневмонией заболевает около 1000 человек на 100 тыс.населения. Следует отметить, что статистические данные сильно варьируют для различных возрастных категорий (Henig О., Кауе K.S. (2017) Bacterial pneumonia in older adults. Infect. Dis. Clin. North. Am. 31, 689-713; Eshwara V.K., Mukhopadhyay C., Rello J. (2020) Community-acquired bacterial pneumonia in adults: An update. Indian. J. Med. Res. 151, 287-302). Бактериальная пневмония характеризуется этиологической неоднородностью и вызывается широким спектром грамположительных и грамотрицательных бактерий. В этой связи крайне важным является своевременное выявление возбудителя, поскольку стратегия лечения для различных патогенных бактерий может отличаться (Harris М, Clark J., Coote N., Fletcher P., Harnden A., McKean M., Thomson A. (2011) British thoracic society standards of care committee. British thoracic society guidelines for the management of community acquired pneumonia in children: update 2011. Thorax. 66 (Suppl. 2), iil-ii23).
Современная клиническая диагностика базируется на классических методах: зачастую просто на определении клинической картины заболевания (Cunha В.А. (2006) The atypical pneumonias: clinical diagnosis and importance. Clin. Microbiol. Infect. 12, Suppl. 3, 12-24), на данных радиологического исследования (Azoulay Е., Russell L., Van de Louw A., Metaxa V., Bauer P., Povoa P., Montero J.G., Loeches I.M., Mehta S., Puxty K., Schellongowski P., Rello J., Mokart D., Lemiale V., Mirouse A. (2020) Diagnosis of severe respiratory infections in immunocompromised patients. Intensive. Care. Med. 46, 298-314; Mabie M., Wunderink R.G. (2003) Use and limitations of clinical and radiologic diagnosis of pneumonia. Semin. Respir. Infect. 18, 72-79) или культуральных методов (Budayanti N.S., Suryawan К., Iswari I.S., Sukrama D.M. (2019) The quality of sputum specimens as a predictor of isolated bacteria from patients with lower respiratory tract infections at a tertiary referral hospital, Denpasar, Bali-Indonesia. Front. Med. (Lausanne). 6, 64), что, с учетом быстрой динамики развития патологии, не является оптимальным. В лучшем случае, используют серологические тесты или ПЦР, которые в своем большинстве ориентированы на определение лишь одного вида возбудителя (Lee N., Rainer Т.Н., Ip М., Zee В., Ng М.Н., Antonio G.E., Chan Е., Lui G., Cockram C.S., Sung J.J., Hui D.S. (2006) Role of laboratory variables in differentiating SARS-coronavirus from other causes of community-acquired pneumonia within the first 72 h of hospitalization. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 25, 765-772; Dorigo-Zetsma J.W., Zaat S.A., Wertheim-van Dillen P.M., Spanjaard L., Rijntjes J., van Waveren G., Jensen J.S., Angulo A.F., Dankert J. (1999) Comparison of PCR, culture, and serological tests for diagnosis of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract infection in children. J. Clin. Microbiol. 37, 14-17).
Изобретение RU 2737829 C1, дата приоритета 12.11.2019, дата публикации 03.12.2020, «Последовательность ДНК-аптамера, связывающаяся с пептидогликан-ассоциированным липопротеином Legionella pneumophila» описывает специфичный аптамер, способный выявлять присутствие в образце возбудителя пневмонии - легионеллы. Описанный алтамер применим для выявления в образце лишь одного бактериального возбудителя.
В изобретении RU 2781014 С1, дата приоритета 06.12.2021, дата публикации 04.10.2022, «Способ и набор праймеров для видоспецифической идентификации возбудителей бактериальной пневмонии человека» применяется мультиплексная ПЦР для выявления возбудителей бактериальной пневмонии. Для осуществления способа требуется наличие термоциклера, что ограничивает применение метода вне специализированных лабораторий (невозможность осуществления анализа в «полевых условиях»).
Изобретение RU 2784653 С1, дата приоритета 06.12.2021, дата публикации 29.11.2022, «Способ обратной транскрипции, совмещенный с мультиплексной ПЦР для видеоспецифической идентификации возбудителей бактериальной и вирусной пневмонии человека с иммобилизованными праймерами и биологический микрочип для его осуществления» требует проведения обратной транскрипции и последующей ПЦР, использует специализированный биологический микрочип и термоциклер для осуществления способа.
Настоящее изобретение описывает набор праймеров для быстрого определения возбудителя бактериальной пневмонии с помощью рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA, от Recombinase Polymerase Amplification) в мультиплексном формате - реакции, которая проходит в изотермическом режиме, характеризуется большей, по сравнению с ПЦР, скоростью накопления продукта и чувствительностью, а также не нуждается в применении термоциклера (Piepenburg О., Williams С.Н., Stemple D.L., Armes N.A. (2006) DNA detection using recombination proteins. PLoS Biol., 4, e204; Lobato I.M., O'Sullivan C.K. (2018) Recombinase polymerase amplification: Basics, applications and recent advances. Trends. Analyt. Chem. 98, 19-35).
Настоящее изобретение выгодно отличается от аналогов низкой восприимчивостью к загрязнениям образца (свойство рекомбиназной полимеразной системы амплификации).
Преимущества RPA, в условиях все большего распространения и доступности реагентов для ее выполнения в профильных клинических лабораториях, могут сделать этот подход привлекательной и эффективной альтернативой другим распространенным методам выявления возбудителей пневмонии. Отсутствие необходимости наличия термоциклера теоретически позволяет осуществлять метод в «полевых условиях» вне специализированных лабораторий.
Раскрытие сущности изобретения
Целью изобретения является создание набора праймеров для видовой идентификации шести социально-значимых возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации.
Изобретением предлагается набор из шести пар праймеров (прямые и обратные) для видоспецифичной идентификации социально-значимых бактериальных возбудителей пневмонии человека, обладающих видоспецифичностью и устойчивых к генетической пластичности благодаря выбору консервативных локусов для анализа, а также (при необходимости) введению вырожденных нуклеотидных позиций в последовательность олигонуклеотидных праймеров. Набор предназначен для применения в составе оригинальной системы мультиплексной RPA.
Набор из шести пар видоспецифичных праймеров включает в себя праймеры для видовой идентификации следующих социально-значимых бактериальных возбудителей пневмонии: Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae и Pseudomonas aeruginosa. Для каждого бактериального возбудителя выбирали фунционально-значимые видоспецифичные участки генов. Ген cpsB S. pneumoniae кодирует тирозин-специфичную протеинфосфатазу В, ген ebpS S. aureus кодирует эластинсвязывающий белок S, ген fucK, применяемый для видовой идентификации H. influenzae, относится к генам углеводного обмена, ген oprL кодирует пептидогликан-ассоциированный белок P. aeruginosa, для видовой идентификации L. pneumophila и K. pneumoniae использовали детерминанты вирулентности этих бактерий - sidA и fimH, соответственно. Выбор генов и функциональные роли кодируемых ими белков со ссылками на первоисточники более подробно описаны в (Лапа С.А., Мифтахов Р.А., Клочихина Е.С., Аммур Ю.И., Благодатских С.А., Шершов В.Е., Заседателев А.С., Чудинов А.В. (2021) Разработка мультиплексной ОТ-ПЦР с иммобилизованными праймерами для идентификации возбудителей инфекционной пневмонии человека Молек. Биол. 55, 944-955).
Основные подходы, примененные в данном изобретении к конструированию праймеров, специфичных к участкам геномов бактериальных возбудителей пневмонии, описаны в (Клочихина Е.С., Шершов В.Е., Кузнецова В.Е., Лапа С.А., Чудинов А.В. (2021) Особенности оптимизации мультипраймерной ПЦР для выявления возбудителей инфекционной пневмонии человека. Тонкие Химические Технологии 16, 225-231), но с той разницей, что для RPA в большинстве случаев требуются праймеры большей длины, по сравнению с ПЦР, а именно 30-35 нт (Инструкция TwistAmp, официальные рекомендации по дизайну праймеров: https://www.twistdx.co.uk/wp-content/uploads/2021/04/twistamp-assay-design-manual-v2-5.pdf). Однако длина праймеров дополнительно увеличена по сравнению с рекомендованной, а именно до 35-40 нт, что повышает воспроизводимость результатов в мультиплексном режиме работы системы.
Последовательности праймеров указаны в Перечне последовательностей (SEQ ID NO: 1 - 12). Кроме того, основные характеристики праймеров, в том числе их последовательности, указаны в Таблице 1, в порядке увеличения длин образующихся продуктов.
Для проверки специфичности праймеров в системе амплификации RPA использовали образцы деконтаминированной геномной ДНК, указанные в Таблице 2. Проверку осуществляли как с использованием ДНК из коллекционных штаммов, так и с использованием выделенной и охарактеризованной ДНК из клинических образцов и природных источников, что повышает доказательную базу и достоверность результатов проверки.
Краткое описание фигур и таблиц
Фигура 1. Визуальная идентификация возбудителя пневмонии по электрофореграмме: а) неизбирательная детекция ДНК с помощью красителя SYBR Green I, b) избирательная идентификация продуктов удлинения праймеров, окрашенных цианиновым красителем Су5. Окрашивание праймеров, специфичных к Н. influenzae, L. pneumophila и S. aureus позволяет надежно дискриминировать соответствующие продукты амплификации от продуктов амплификации, не несущих метку: P. aeruginosa, S. pneumoniae, К. pneumoniae. Обозначения: L - маркер длин ДНК Ladder GeneRuler 50bp ("Thermo", США), Pse -Pseudomonas aeruginosa, Hae - Haemophilus influenzae, Str - Streptococcus pneumoniae, Leg -Legionella pneumophila, Kle - Klebsiella pneumoniae, Sta - Staphylococcus aureus, ТВ -Mycobacterium tuberculosis (контроль специфичности праймеров), NC - отрицательный контроль. Цифрами слева обозначены длины дцДНК (нп), соответствующие полосам маркера длин ДНК (от 50 до 500 нп).
Таблица 1. RPA-праймеры (SEQ ID NO: 1 - 12); нт - нуклеотиды, нп - нуклеотидные пары.
Таблица 2. Штаммы возбудителей бактериальной пневмонии человека, использованные для проверки видоспецифичности сконструированных праймеров.
Осуществление изобретения
Подбор олигонуклеотидных праймеров выполняется на основе систематизации последовательностей ДНК выявляемых бактериальных возбудителей пневмонии. Систематизация и выбор консервативных локусов осуществляется на основе анализа литературных источников и последовательностей генов в базах данных (GenBank, European Nucleotide Archive). Далее проводится множественное выравнивание (Multiplex Alignment) последовательностей отдельных локусов либо полноразмерных генов-мишеней для каждого из возбудителей. Выравнивания проводятся с помощью специализированного программного обеспечения, например BioEdit Sequence Alignment Editor (версия 7.1.9) по алгоритму ClustalW. Далее, используя соответствующее программное обеспечение, например Oligo v. 6. 3 (Molecular Biology Insights Inc., США) или Fast PCR (http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/ Programs/fastpcr.htm), проводится расчет температуры отжига праймеров и, варьируя их длину, добиваются того, чтобы разброс температур отжига праймеров внутри набора не превышал 3-4°С. При подборе праймеров избегают таких последовательностей, которые способны формировать вторичные структуры типа шпильки с высокими температурами плавления. Специфичность подобранных праймеров проверятся путем поиска по базам данных нуклеотидных последовательностей (GenBank, European Nucleotide Archive) с использованием программного обеспечения, поддерживающего алгоритм BLAST (например, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Консервативность участка выбранного гена для сконструированных праймеров доказывается путем множественного анализа последовательностей с помощью алгоритма BLAST (например, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
В качестве образцов для анализа при осуществлении способа используются непосредственно лизаты культур, клинические или природные образцы, предположительно содержащие один или несколько из шести указанных возбудителей пневмонии человека (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae и Pseudomonas aeruginosa), деконтаминированные при помощи СТАВ-метода. Обработка образца перед проведением анализа осуществляется любым из имеющихся методов выделения ДНК из биологических образцов, например с помощью методов, указанных в (Niemz, A., Ferguson, Т.М., & Boyle, D.S. (2011). Point-of-care nucleic acid testing for infectious diseases. Trends in biotechnology, 29(5), 240-250. https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2011.01.007). При разработке набора праймеров и способа идентификации бактериальных возбудителей пневмонии перед выделением ДНК из образцов бактериальных возбудителей пневмонии человека, изоляты из природных источников, а также клинические образцы культивируют на селективных средах. ДНК из культур выделяют и деконтаминируют с использованием СТАВ-метода. Видовую принадлежность штамма доказывают с помощью стандартного секвенирования по Сенгеру.
Продукты амплификации, полученные с помощью рекомбиназной полимеразной реакции с использованием данного набора праймеров, подвергаются разделению путем проведения электрофореза в агарозном геле. Далее, проводится анализ полученных изображений электрофореграмм. По расположению специфических полос для продуктов амплификации проводится интерпретация электрофореграммы и делается вывод о наличии в анализируемых образцах того или иного возбудителя по продукту амплификации участка ДНК. Для облегчения визуального контроля по электрофореграмме продуктов амплификации три из шести прямых праймеров несут флуоресцентную метку Су5. Шесть обратных праймеров не несут флуоресцентную метку.
На Фигуре 1 представлен результат выполнения мультиплексной RPA в одном общем объеме с настоящим набором праймеров и при оптимизированных условиях амплификации.
Из Фигуры 1 видно, что визуальная дискриминация в ряде случаев может быть осложнена, поскольку выбранный интервал теоретических длин продуктов амплификации при конструировании дизайна данной системы RPA был ограничен официальными рекомендациями производителя набора TwistAmp по максимальной длине продуктов амплификации. Кроме того, теоретически при наличии в образце двух и более генетических мишеней возможна конкурентная амплификация в пользу продуктов меньшей длины.
Поэтому для надежной дискриминации предложена двухволновая детекция флуоресценции. Двухцепочечный комплекс ДНК/SYBR Green I характеризуется максимумом поглощения λmax=497 нм и максимумом излучения λmax=520 нм. Окрашивание SYBR Green I применяли после окончания электрофореза для визуализации всех продуктов амплификации. Цианиновый краситель Су5 ковалентно пришивали по 5'-концу к трем прямым праймерам (с возрастанием длин продуктов по схеме «через один») для повышения надежности интерпретации результатов. Этот краситель характеризуется максимумом поглощения λmax=650 нм и максимумом излучения λmax=670 нм, что не приводит к перекрестному возбуждению и удобно для раздельной визуализации SYBR и Су5. Продукты амплификации, полученные с Су5-меченными праймерами, отличаются по цветовому окрасу даже при использовании UV-трансиллюминатора с применением оптического фильтра SYBR photographic filter S7569 ("Molecular Probes", США), но для надежности интерпретации результата в настоящей работе использовали систему гельдокументирования со специализированными источниками возбуждения и светофильтрами для каждого из красителей.
Определение основных параметров системы (аналитическая чувствительность, специфичность, воспроизводимость) в мультиплексном варианте с применением разработанных праймеров проводили с помощью амплификации в реальном времени (в изотермическом режиме) для разных концентраций образцов, с последующим электрофоретическим контролем. Для представленной в Таблице 2 выборки специфичность была 100%, при этом не наблюдали перекрестной амплификации. Кроме того, использовали геномную ДНК штамма М. tuberculosis H37rv в качестве теста на специфичность, поскольку клинические проявления туберкулеза легких могут быть сходны с пневмонией. Чувствительность метода составила от 102 до 103 копий ДНК на реакционный объем.
Таким образом, заявляемый набор праймеров позволяет проводить надежную видовую идентификацию шести социально-значимых возбудителей пневмонии человека.
Далее изобретение будет проиллюстрировано примерами, которые предназначены для обеспечения лучшего понимания сущности заявленного изобретения, но не должны рассматриваться как ограничивающие данное изобретение.
Пример 1. Набор олигонуклеотидных праймеров, специфичных к участкам генов бактерий - возбудителей пневмонии человека Для обеспечения видоспецифичности праймеров выбирают консервативные видоспецифичные участки геномов бактерий-возбудителей пневмонии человека. Список генов-мишеней для разработанных праймеров приведен в Таблице 1.
Нуклеотидные последовательности геномных мишеней выравнивают с помощью алгоритма ClustalW (www.clustal.org). Праймеры для RPA (длиной от 35 до 40 нт) конструируют с использованием сетевого ресурса www.idtdna.com. Проводят тестирование на внутри- и межмолекулярные вторичные структуры. Специфичность анализируют с помощью алгоритма BLAST (NIH, США, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Праймеры конструируют с учетом удобства визуального контроля продуктов амплификации по электрофореграмме (для образования продуктов различной, визуально различимой длины). Кроме того, с целью повышения надежности дискриминации, в праймеры, специфичные к Н. influenzae, L. pneumophila и SI aureus вводят Су5-метку по 5'-концу через аминолинкер.
Твердофазный синтез олигонуклеотидов осуществляют с помощью автоматического синтезатора ABI 394 DNA/RNA ("Applied Biosystems", США) по стандартному регламенту, очистку производят на колонке BDS Hypersil С18 ("Thermo", США).
Список праймеров и их последовательности приведены в Перечне Последовательностей.
Пример 2. Использованные штаммы бактерий - возбудителей пневмонии человека
В работе используют ДНК штаммов из коллекции ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (п.Оболенск), в том числе клинические и природные изоляты. Перед выделением ДНК изоляты из природных источников, а также клинические образцы культивируют на селективных средах. ДНК из культур выделяют и деконтаминируют с использованием СТАВ-метода. Видовую принадлежность штамма доказывают с помощью стандартного секвенирования по Сенгеру.
При создании и оптимизации состава заявляемого набора праймеров, а также для проверки специфичности набора праймеров используют образцы бактерий, указанные в Таблице 2.
Пример 3. Проведение мультиплексной RPA
Рекомбиназную полимеразную реакцию проводят в микропробирке в объеме 50 мкл. Смесь содержит компоненты набора TwistAmp ("TwistDX", Великобритания) в рекомендуемых производителем концентрациях, а также раствор шести пар праймеров (из расчета 10 пмоль на реакцию каждого), заявляемых в настоящем изобретении как набор праймеров. Праймеры специфичны к бактериальным возбудителям пневмонии. Также смесь содержит 1 мкл очищенных полногеномных бактериальных ДНК в концентрации от 101 до 103 копий/мкл (раститровка для определения чувствительности метода). Раствор, содержащий шесть пар праймеров, перед внесением в общий реакционный объем прогревают в течение 5 мин при 95°С и сразу же помещают на лед (-2-0°С). Реагенты набора, за исключением матрицы (образец ДНК) и ацетата магния, входят в общую смесь, которую после аккуратного перемешивания разливают по реакционным пробиркам объемом 200 мкл. Ацетат магния вносят на внутреннюю сторону крышки каждой реакционной пробирки и закрывают крышки пробирок лишь перед окончательным перемешиванием и началом проведения реакции, образец ДНК вводят на верхнюю часть внутренней поверхности пробирки для предотвращения преждевременного контакта с компонентами смеси. Растворы «сбрасывают» коротким центрифугированием, аккуратно перемешивают шестикратным переворачиванием и еще раз «сбрасывают», после чего немедленно помещают в термостат. Реакцию проводят в течение 20 мин при 40°С на лабораторном термостате для микропробирок TDB-120 ("Biosan", Латвия), останавливают реакцию путем смешивания реакционной смеси с компонентами загрузочного буфера для проведения электрофореза либо нагреванием в течение 5 мин при 95°С.
Чувствительность RPA определяют раститровкой ДНК анализируемых образцов в интервале 101-103 копий на реакционный объем (50 мкл). Скорость накопления продукта оценивают при температурном режиме, описанном выше, с добавлением красителя EvaGreen ("Lumiprobe", Россия) на амплификаторе iCycler iQ5 ("Bio-Rad", США). Эксперименты выполняют в трех повторностях для каждого исследуемого образца и рассчитывают среднее значение. Качественный анализ наличия/отсутствия продукта амплификации проводят визуально по электрофореграмме.
Пример 4. Электрофоретическое разделение продуктов RPA
Продукты RPA разделяют в 4%-ном агарозном геле (Agarose LE, "Helicon", Россия) в течение 20 мин при напряженности электрического поля 10 В/см, для окрашивания используют SYBR Green I ("Molecular Probes", США). Визуализацию проводят на трансиллюминаторе ТСР-20.МС 254/312 нм ("Vilber Lourmat", Франция) при длине волны 260 нм, снабженного цифровым фотоаппаратом EOS 60D ("Canon", Япония) - для получения цветного изображения, а также на системе гельдокументирования ChemiScope 6200 Touch ("Clinx Science Instruments", КНР) с помощью входящего в комплект УФ-трансиллюминатора - для общей детекции ДНК по окрашиванию SYBR Green I, и с помощью встроенных LED-светодиодов и светофильтров "Red light excitation/emission", соответствующих характеристикам флуоресцентного красителя Су5 - для избирательной детекции продуктов удлинения меченых праймеров.
Результат видового определения бактерий - возбудителей пневмонии с помощью набора праймеров показан на Фигуре 1.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Набор праймеров
для выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека методом
мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"
productionDate="2023-08-12">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText></ApplicationNumberText>
<FilingDate></FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>27.07.2023</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное
бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А.
Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН)</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Engelhardt Institute of Molecular Biology,
Russian Academy of Sciences</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Набор праймеров для выявления
возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной
рекомбиназной полимеразной амплификации</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>12</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q21">
<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>direct primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q22">
<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>oprL-f1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gtacaacatggctctgggcgagcgtcgtgccaagg</INSDSeq_sequ
ence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q23">
<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>reverse primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q24">
<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>oprL-r1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttctgagcccaggactgctcgtcgtggccggtagc</INSDSeq_sequ
ence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q25">
<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>direct primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q26">
<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>fucK-f1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location><1</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q58">
<INSDQualifier_name>function</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>carries Cy5 through an
aminospacer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgctaacggtaattgggatccatcgattttagcct</INSDSeq_sequ
ence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q14">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q27">
<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>reverse primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q28">
<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>fucK-r1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccwgcaccagacccaaacacagcaaattgggtatc</INSDSeq_sequ
ence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q18">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q19">
<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>direct primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q20">
<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>cpsB-f1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgtagatgacggtcccaagtcaagagaggaaagc</INSDSeq_sequ
ence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q30">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q31">
<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>reverse primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q32">
<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>cpsB-r1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atctctgcgccataagcaatgactaaatcatctgc</INSDSeq_sequ
ence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="7">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q34">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q35">
<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>direct primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q36">
<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>sidA-f1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location><1</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q59">
<INSDQualifier_name>function</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>carries Cy5 through an
aminospacer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gcagcgatcaycctcggtggattggctgccgcaat</INSDSeq_sequ
ence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="8">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q38">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q39">
<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>reverse primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q40">
<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>sidA-r1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>catgttggagttctatggcacgaatttckaataag</INSDSeq_sequ
ence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="9">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q42">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q43">
<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>direct primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q44">
<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>fimH-f1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggtgtgctgtcgagtttttcaggcaccgtgaaatataacg</INSDSeq
_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="10">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>40</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q46">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..40</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q47">
<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>reverse primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q48">
<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>fimH-r1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gttgttggcgtagatgttccagatgaactggaaggagtcg</INSDSeq
_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="11">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q50">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q51">
<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>direct primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q52">
<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>ebpS-f1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location><1</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q57">
<INSDQualifier_name>function</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>carries Cy5 through an
aminospacer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location><1</INSDFeature_location>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccaaatatcgctaatgcaccgataattagtacagc</INSDSeq_sequ
ence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="12">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>35</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q54">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>synthetic construct</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>misc_feature</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..35</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier id="q55">
<INSDQualifier_name>product</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>reverse primer</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q56">
<INSDQualifier_name>standard_name</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>ebpS-r1</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>actcgactgaggataaagcgtctcaagataagtct</INSDSeq_sequ
ence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (1)
- Набор праймеров для выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации, представленных последовательностями SEQ ID NO: 1-12.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2813995C1 true RU2813995C1 (ru) | 2024-02-21 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2557178B1 (en) * | 2010-03-31 | 2014-11-26 | Yamaguchi Technology Licensing Organization, Ltd. | Method for detecting pneumonia causative bacteria using nucleic acid chromatography |
| CN107338315A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-11-10 | 中国人民解放军总医院 | 用于15种肺炎致病菌快速检测的试剂盒 |
| RU2734300C1 (ru) * | 2020-06-16 | 2020-10-14 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени |
| RU2781014C1 (ru) * | 2021-12-06 | 2022-10-04 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Способ и набор праймеров для видоспецифической идентификации возбудителей бактериальной пневмонии человека |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2557178B1 (en) * | 2010-03-31 | 2014-11-26 | Yamaguchi Technology Licensing Organization, Ltd. | Method for detecting pneumonia causative bacteria using nucleic acid chromatography |
| CN107338315A (zh) * | 2017-08-15 | 2017-11-10 | 中国人民解放军总医院 | 用于15种肺炎致病菌快速检测的试剂盒 |
| RU2734300C1 (ru) * | 2020-06-16 | 2020-10-14 | Федеральное государственное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени |
| RU2781014C1 (ru) * | 2021-12-06 | 2022-10-04 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Способ и набор праймеров для видоспецифической идентификации возбудителей бактериальной пневмонии человека |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Лапа С.А., Исследование твердофазной амплификации ДНК в изотермическом режиме для создания закрытой микросистемы анализа нуклеиновых кислот, КАРТОЧКА ПРОЕКТА, ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ, 31.03.2022, весь документ, https://rscf.ru/project/22-14-00257/. * |
| С.А. Лапа и др., Разработка мультиплексной от-пцр с иммобилизованными праймерами для идентификации возбудителей инфекционной пневмонии человека, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2021, том 55, N 6, с. 944-955. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | New tests for syphilis: rational design of a PCR method for detection of Treponema pallidum in clinical specimens using unique regions of the DNA polymerase I gene | |
| Yamasaki et al. | Significance of anaerobes and oral bacteria in community-acquired pneumonia | |
| Gupta et al. | Polymerase spiral reaction (PSR): a novel, visual isothermal amplification method for detection of canine parvovirus 2 genomic DNA | |
| Takahashi et al. | The PCR‐based diagnosis of central nervous system tuberculosis: up to date | |
| Andrade et al. | Advances in the microbiological diagnosis of sepsis | |
| Ma et al. | Development of a lateral flow recombinase polymerase amplification assay for rapid and visual detection of Cryptococcus neoformans/C. gattii in cerebral spinal fluid | |
| Fearnley et al. | The development of a real-time PCR to detect pathogenic Leptospira species in kidney tissue | |
| Ji et al. | Novel polymerase spiral reaction assay for the visible molecular detection of porcine circovirus type 3 | |
| Chen et al. | Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii | |
| US7381547B2 (en) | Methods and compositions to detect bacteria using multiplex PCR | |
| Lapa et al. | Development of multiplex RT-PCR with immobilized primers for identification of infectious human pneumonia pathogens | |
| Hussein et al. | Genetic diversity of Dientamoeba fragilis isolates of irritable bowel syndrome patients by high-resolution melting-curve (HRM) analysis | |
| Wang et al. | Rapid, simple, and highly specific detection of Streptococcus pneumoniae with visualized recombinase polymerase amplification | |
| WO2006076010A2 (en) | Methods and compositions to detect bacteria using multiplex pcr | |
| US20150031038A1 (en) | Sample preparation methods | |
| RU2813995C1 (ru) | Набор праймеров для выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации | |
| CN112592992A (zh) | 一种基于荧光rma法联合检测肺炎支原体和肺炎衣原体的引物探针组、试剂盒 | |
| Arfaatabar et al. | Rapid detection of Mycoplasma pneumoniae by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in clinical respiratory specimens | |
| US20210115505A1 (en) | Method for detecting mycoplasma using mitochondrial dna as internal control sample | |
| Souza et al. | Multiplex real-time PCR using SYBR Green: Unspecific intercalating dye to detect antimicrobial resistance genes of Streptococcus pneumoniae in cerebrospinal fluid | |
| CN110029179B (zh) | 一组核苷酸分子及在纹带棒状杆菌鉴定中的应用 | |
| Lapa et al. | Recombinase polymerase amplification for rapid detection of human bacterial pneumonia pathogens | |
| RU2608651C1 (ru) | Способ идентификации генов клинически значимых семейств β-лактамаз у грамотрицательных микроорганизмов | |
| WO2023021978A1 (ja) | 自己免疫疾患を検査する方法 | |
| US20060177824A1 (en) | Salmonella detection identification |