RU2734300C1 - Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени - Google Patents
Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени Download PDFInfo
- Publication number
- RU2734300C1 RU2734300C1 RU2020120618A RU2020120618A RU2734300C1 RU 2734300 C1 RU2734300 C1 RU 2734300C1 RU 2020120618 A RU2020120618 A RU 2020120618A RU 2020120618 A RU2020120618 A RU 2020120618A RU 2734300 C1 RU2734300 C1 RU 2734300C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- pcr
- ncov
- coronavirus
- samples
- primers
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии, в частности к набору олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда для идентификации коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени. Изобретение обеспечивает высокую чувствительность детекции коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в клинических образцах. 5 ил., 4 табл., 4 пр.
Description
Изобретение создано в рамках государственного задания № 141-00080-20-01 от 13.02.2020 (на 2019 - 2021 гг.) и относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для выявления генетического материала (РНК) коронавируса человека 2019-nCoV в клинических образцах, секционных пробах, образцах окружающей среды, культуральных вируссодержащих жидкостях и прочих биопрепаратах с целью постановки диагноза, коррекции лечения, эпидемиологического расследования, а также для решения научно-исследовательских задач по мониторингу и изучению свойств коронавируса, созданию диагностических, профилактических и лечебных препаратов и может быть использовано в медицине, биотехнологии и эпидемиологии.
Новый вид вируса коронавируса был зафиксирован в декабре прошлого года в Китае в городе Ухань. Штамм 2019-nCoV впервые был обнаружен в результате анализа нуклеиновой кислоты у пациента с пневмонией. 12 января 2020 года в Шанхай приехала жительница Уханя, заболевшая дома 10 января. 15 января она обратилась в амбулаторию, была изолирована, через 6 дней выздоровела и была выписана. Это первый лабораторно-подтвержденный случай инфекции 2019-nCov в Шанхае. Новый коронавирус опасен тем, что адаптировался для передачи между людьми и вызывает быстрое развитие пневмонии. Для него характерны симптомы ОРВИ, в значительном количестве случаев переходящие в тяжелую пневмонию.
Коронавирусов в общей сложности 38. Большинство из них поражает животных. Есть всего несколько коронавирусных инфекций, характерных для людей и они вызывают сравнительно легкие респираторные заболевания типа ОРВИ. Известны, однако, два коронавируса, которые в прошлом вызвали достаточно серьезные заболевания. Одно из них - атипичная пневмония (SARS). Ее вспышка началась также в Китае в 2002 году. В общей сложности заболели ею 8098 человек, 774 из них - с летальным исходом (смертность - 9,6%). В 2012 году был выявлен коронавирус, который регулярно передается человеку от одногорбых верблюдов (дромадеров) и вызывает ближневосточный респираторный синдром (MERS). С тех пор было зафиксировано 2494 случая заражения, в 858 из которых заболевшие погибли (смертность - около 35%).
Отличительная черта коронавируса 2019-nCoV, как утверждают китайские медики, заключается в том, что он может передаваться от человека к человеку уже в инкубационном периоде, до вступления заболевания в активную фазу. Инкубационный период, то есть время, прошедшее от момента заражения до появления первых признаков болезни, составляет от 1 до 14 дней. Больной человек на этом этапе выглядит здоровым, и контакт с ним не представляется опасным, что повышает риск распространения инфекции. На стадии инкубационного периода выявление заболевших тепловизорами неэффективно.
30 января Всемирная Организация Здравоохранения объявила вспышку эпидемии, связанную с 2019-nCoV, чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения международного значения.
С целью контроля и предупреждения завоза и распространения новой коронавирусной инфекции чрезвычайно важным является разработка быстрых и эффективных средств диагностики этого опасного заболевания.
Данная заявка на изобретение посвящена разработке набора реагентов для выявления РНК (кДНК) коронавируса 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.
При помощи разработанных диагностических праймеров и флуоресцентно-меченного зонда возможно выявление генетического материала (РНК) коронавируса 2019-nCoV.
Метод основан на амплификации кДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизационно-флуорецентной детекции продуктов амплификации в режиме реального времени в образцах биоматериала. Амплифицируемый участок кДНК, являясь маркерным, позволяет выявить вирусный агент в исследуемом образце. Для эффективного проведения ПЦР в режиме реального времени необходимы флуоресцентно-меченый ДНК-зонд и ДНК-затравки - праймеры (синтетические олигонуклеотиды) - строго специфичные к кДНК вирусного генома. Сложность выбора праймеров и зонда обусловлена требованием их строгой видоспецифичности. Праймеры должны быть комплементарны нуклеотидным последовательностям кДНК, ограничивая амлифицируемый участок справа и лева таким образом, чтобы синтез ДНК ДНК-полимеразой проходил строго в выбранном регионе. Флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, в свою очередь, должен лежать внутри участка кДНК, ограниченного праймерами. Правильный выбор праймеров позволяет осуществить экспоненциальное увеличение количества копий целевого участка кДНК. Правильный выбор сочетания пары праймеров и ДНК-зонда позволяет осуществлять детекцию накопления продуктов амплификации в режиме реального времени. В целом от правильности выбора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и ДНК-зонда зависит специфичность проводимой ПЦР, а значит и точность диагностики вирусного заболевания.
Ниже приведены аналоги, представляющие собой наборы праймеров и наборы реагентов обеспечивающие детекцию кДНК коронавируса.
Известен патент Китая № CN 101603096 (опубл. 2009 г.), получен на набор реагентов и готовый ПЦР-набор для детекции вируса гриппа типа А субтипов Н5 и Н7, ТОРС ассоциированного коронавируса, хантавируса, чумной палочки (Yersinia pestis), возбудителя сибирской язвы (Bacillus anthracis).
Известна заявка США № US 2009117537 (опубл. 2009 г.), касается набора праймеров и набора реагентов, позволяющего детектировать ТОРС ассоциированный коронавирус, причем, праймеры локализуются в гене РНК-полимеразы коронавируса.
Известен патент Сингапура № SG161740 (опубл. 2010 г.), касается выявления одного и более неизвестных коронавирусов, в том числе и ТОРС ассоциированный коронавирус, причем, праймеры фланкируют участок гена РНК-полимеразы и ген Nspl.
Известна заявка США № US 2004265796 (опубл. 2004 г.), касается набора праймеров фланкирующих участок N-гена и 3'-нетранслируемую область ТОРС ассоциированного коронавируса.
Известен патент Германии № DE 20315159 (опубл. 2004 г.), касается набора реагентов, позволяющего детектировать ТОРС ассоциированный коронавирус методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени.
Известен патент Китая № CN 1570139 (опубл. 2005 г.), касается набора реагентов для выявления ТОРС ассоциированнго коронавируса методом ОТ-ПЦР с электрофоретической и гибридизационно-флуоресцентной детекцией накопления продуктов амплификации.
Известен патент Китая № CN 1514010 (опубл. 2005 г.), касается набора реагентов, позволяющего выявлять ТОРС ассоциированный коронавирус методом ОТ-ПЦР. Праймеры, использующиеся в этом наборе реагентов, фланкируют ген РНК-полимеразы.
Известен патент Китая № CN 1548550 (опубл. 2005 г.), касается набора реагентов позволяющего выявлять ТОРС ассоциированный коронавирус методом ОТ-ПЦР. Заявка США №20040265796 (опубл. 2004 г.) касается набора реагентов, включающего праймеры фланкирующие участок N-гена коронавируса ассоциированного с ТОРС.
Однако, праймеры, используемые в выше приведенных аналогах, имеют недостаточную гомологию к последовательностям генома коронавирусов, циркулирующих в настоящее время в дикой природе. Кроме того, указанные наборы праймеров не позволяют получить продолжительный амплифицированный фрагмент NP-гена (нуклеопротеид), нуклеотидную последовательность которого можно проанализировать и спрогнозировать патогенность и контагеозность выявленного коронавируса. Указанные наборы не могут быть использованы в количественной ПЦР.
Известен «АмплиСенс® SARS-Coronavirus-EPh» (ЦНИИ Эпидемиологии, г. Москва) - набор реагентов, включающий праймеры, для амплификации кДНК коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом, из клинического материала методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле (http://www.pcr.ru/sem_who/shipulin1.pdf).
Однако, указанный набор реагентов был разработан в период вспышки заболеваемости тяжелым острым респираторным синдромом, вызванным коронавирусом, в 2003 году. За прошедшие годы в ходе эпидемиологических исследований учеными были выделены вирусы идентичные вирусу ТОРС человека от пальмовых циветт (Paguma larvata), енотовых собак (Nyctereutes procyonoides), плодоядных летучих мышей (Rousettus, Cynopterus и т.д.). Это говорит о широком распространении в природе коронавирусов, подобных ТОРС-коронавирусу человека, а следовательно возможности перехода геновариантов коронавирусов, подобных ТОРС-коронавирусу человека, из популяций животных в человеческую. Для этих геновариантов вышеназванные наборы праймеров не будет обладать достаточной специфичностью, чтобы обеспечить надежный синтез целевых фрагментов ДНК. Таким образом, праймеры, используемые в выше приведенном прототипе, имеют недостаточную гомологию к последовательностям генома ТОРС подобных коронавирусов, циркулирующих в настоящее время в дикой природе. Кроме того, указанный набор праймеров не позволяет получить продолжительный амплифицированный фрагмент NP-гена (нуклеопротеид), нуклеотидную последовательность которого можно проанализировать и спрогнозировать патогенность и контагеозность выявленного коронавируса. Указанные наборы не могут быть использованы в количественной ПЦР.
Известен набор зондов, праймеров и способ обнаружения для идентификации SARS-CoV и MERS-CoV (Заявка на патент Китая №CN108060266, МПК С12Q1/70, C12N15/11, опубл. 22.05.2018 г.) на основе исследования с помощью рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA). Набор праймерных зондов для идентификации SARS-CoV и MERS-CoV на основе обнаружения RPA включает праймеры и зонд для нуклеотидных последовательностей SARS-CoV:
ctgttaagag ctttgagatt gacaaaggaa ttt
tctcccatgc atagacagaa gggaatttag ta
cagggttgtt ccctcaggag atgttgtgat atttccctaa tattaca,
а также праймеры и зонд для нуклеотидных последовательностей MERS-CoV:
ccgggaatgg aattaagcaa ctggctccca ggt
tcagtggcgc catcttcatg gacccaaacg atg
ctacactgga actggacccg aagcagcact tcctcattcc gggctgtt
Известен набор праймеров и зонд для обнаружения коронавируса ближневосточного респираторного синдрома и способу обнаружения коронавируса ближневосточного респираторного синдрома с его использованием (патент Респ. Корея № KR 101857684, МПК С12Q1/70, опубл. 14.05.2018 г.) В частности, праймер и зонд, содержащие специфическую нуклеотидную последовательность, нацеленную на ген нуклеокапсида, имеют более высокую чувствительность к ОТ-ПЦР, чем ранее использованные наборы ПЦР в реальном времени MERS, нацеленные на гены upE и ORF1a, и наборы праймеров и зондов гена N2. для точного обнаружения MERS-CoV, и, таким образом, набор праймеров и зондов по настоящему изобретению может быть использован для обнаружения и диагностики MERS-CoV.
Известен набор для количественного определения четырехкратной флуоресценции для одновременного обнаружения четырех коронавирусов человека (заявка на патент Китая № CN 110144422, МПК С12Q1/70, опубл. 20.08.2019 г.). Коронавирусами человека являются, в частности, MERS-CoV / HCoV-NL63 / HCoV-OC43 / HCoV-HKUI. Набор для обнаружения, в частности, включает четыре группы пар праймеров и зондов, продукт с положительным контролем качества и продукт с отрицательным контролем качества. Каждая группа пар специфических праймеров и зондов содержит пару специфических праймеров и последовательность зондов; продукт положительного контроля качества представляет собой искусственно синтетическую последовательность-мишень; продукт отрицательного контроля качества - деионизированная вода или стерильная вода. Набор может одновременно обнаруживать четыре коронавируса человека с помощью одного набора, обладает высокой специфичностью обнаружения, высокой чувствительностью обнаружения и быстрым временем обнаружения, а также позволяет избежать проблем, связанных с тем, что обнаружение по одному занимает много времени и стоимость, повышает вероятность перекрестного загрязнения и т. д. В настоящее время на рынке нет аналогичных продуктов. Этот набор имеет широкие возможности для выявления заболеваний, профилактики и борьбы с инфекционными заболеваниями.
Однако все выше перечисленные диагностические наборы-аналоги не позволяют идентифицировать коронавирус человека 2019-nCoV.
Наиболее близким аналогом (прототипом) является анализ нуклеиновой кислоты на коронавирус человека 2019-nCoV (метод флуоресцентной ОТ-ПЦР в реальном времени) с использованием набора праймеров и зондов для областей гена открытой рамки считывания (ORF1ab) и нуклеопротеина (N) нового коронавируса (http://ivdc.chinacdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html).
Набор 1 (ORF1ab):
Прямой праймер (F): CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
Обратный праймер (R): ACGATTGTGCATCAGCTGA
Флуоресцентный зонд (P): 5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
Набор 2 (N):
Прямой праймер (F): GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
Обратный праймер (R): CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
Флуоресцентный зонд (P): 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
Для экстракции нуклеиновых кислот и флуоресцентной RT-PCR реакционной системы в реальном времени необходимо использовать инструкции соответствующего производителя. Оценка результатов. Отрицательный: нет значения Ct или Ct 40. Положительный: значение Ct <37, можно сообщить как положительное. Подозрительно: значение Ct находится между 37-40, рекомендуется повторить эксперимент. Если значение Ct меньше 40, кривая усиления имеет очевидные пики, образец оценивается как положительный, в противном случае он отрицательный.
Однако известный набор-прототип по сравнению с заявляемым набором имеет недостаточную специфичность и выявляет одновременно не только коронавирус человека 2019-nCoV, но и SARS.
Техническим результатом заявленного изобретения является создание такого набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда, который обеспечивал бы при высокой чувствительности более высокую специфичность и детекцию только коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в клинических образцах.
Указанный технический результат достигается разработкой набора олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда для идентификации коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, содержащий одну пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, имеющие следующую первичную последовательность:
прямой (F) SEQ ID NO:1 и обратный (R) SEQ ID NO:2 праймеры
флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z) SEQ ID NO: 3
Следует отметить, что большинство пар праймеров, рассчитанных с использованием программ VectorNTI предназначены для наработки длинных ампликонов, что не совсем удачно для их применения в ПЦР с диагностической целью.
При разработке представленных в заявляемом наборе диагностических праймеров было синтезировано 10 пар праймеров с различной первичной структурой, с каждой из которых были проведены соответствующие исследования. Эмпирическим путем была определена наиболее подходящая пара праймеров, обладающая наибольшей аналитической чувствительностью и 100 %-ной специфичностью на панели заявленных образцов. Надо отметить, что структура данных праймеров отличалась от наиболее оптимальной структуры, рассчитанной с использованием приложения AlignX программного пакета Vector NTI 10 (Informax, США). В результате работы создана не известная ранее консенсусная последовательность гена коронавируса, полученная путем множественного выравнивания с использованием различных алгоритмов, что требует квалифицированных научных исследований.
В работе, помимо дизайна структуры праймеров и олигонуклеотидного зонда, получен положительный контроль, представляющий из себя рекомбинантную плазмиду, несущую вставки ДНК, комплементарные участкам гена 1ab коронавируса 2019 nCoV. С использованием положительного контроля эмпирическим путем подобрана оптимальная температура отжига диагностических праймеров, которая отличается от теоретической, рассчитанной с использованием компьютерных программ. Также эмпирическим путем установлена аналитическая чувствительность данной пары праймеров/зонд для идентификации коронавируса человека 2019-nCoV. Заявленные диагностические праймеры обладают 100 %-ной специфичностью на панели отрицательных образцов. Экспериментальным путем было показано, что выбранные праймеры и ДНК-зонд не имеют гомологии с человеческой ДНК и не взаимодействуют с геномной ДНК человека, летучих мышей и других животных.
На панели положительных образцов, состоящей из образцов, содержащих генетический материал коронавирусов, произведена оценка чувствительности данной пары диагностических праймеров. С использованием положительного контроля определена аналитическая чувствительность заявляемой пары диагностических праймеров, которая составила не менее 50 геном-эквивалентов на реакцию.
Таким образом, из приведенных выше доводов заявителя следует, что заявленный набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации генетического материала риккетсий методом ПЦР в реальном времени соответствует критерию «изобретательский уровень».
Материалы и реактивы. В работе были использованы следующие материалы и реактивы: трис-(оксиметил)-аминометан, диметилсульфоксид (ДМСО), маркеры молекулярных масс белков, 3,3-диаминобензидин тетрагидрохлорид, ФИТЦ (F7250), ФИТЦ меченый стрептоавидин (S2313), N-гудроксисукцинимидный эфир биотина (H1759), EDAC (E7750), натриевая соль MES (M3058), ("Sigma", США); ПЭГ-20000 ("Merck", США); полиэтиленгликоль м.в. 6000 (ПЭГ-6000), этилендиаминтетрауксусная кислота, глицерин, трипановый синий, сахароза, глицин, твин-20, натрия азид, ("Serva", США); набор для определения концентрации белка "Bio-Rad Protein Assay Kit" ("Bio-Rad", США); акриламид, бисакриламид, натрия додецилсульфат, тетраметилэтилендиамин (ТЕМЭД), 2-меркаптоэтанол, бромфеноловый синий, кумасси G-250, амидочерный 10B ("Bio-Rad" США); казеин, бычий сывороточный альбумин (БСА), яичный альбумин, пластиковая культуральная посуда ("Costar", США).
Вирусные штаммы. В работе были использованы вирусы и вируссодержащий материал из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Культуры клеток и среды. Клетки 293 получены из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». В работе использовали питательные среды: среда Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов производства ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Культивирование вирусов. Культивирование вируса проводили в стационарном режиме на монослое клеток 293 в культуральных флаконах объемом 1 л. Множественность заражения монослоя составляла 0,1 ЛД50 или 0,01 ЛД50 на клетку в зависимости от задачи исследования. Адсорбцию вируса проводили в течение 40 мин при температуре 37°С. После этого монослой заливали питательной средой Игла МЕМ с двойным набором ингредиентов, в которую добавляли 0,06 % глутамина и 0,05 %, 0,4 % или 2 % человеческого сывороточного альбумина (в зависимости от условий эксперимента для получения вакцинного препарата) или 2 % эмбриональную сыворотку КРС (для выделения анализа белков вируса) и антибиотиков (бензилпенициллина - 100 ед/мл, стрептомицина - 100 мкг/мл). Объем питательной среды составлял 10-15 % емкости культурального сосуда. Затем клетки инкубировали при температуре 37°С до появления ЦПД. КВЖ использовали для выделения РНК вируса.
Выделение вирусной РНК. РНК коронавируса выделяли из образцов КВЖ при помощи набора «Рибо-ПРЕП» (ЦНИИ Эпидемиологии, Россия) или реагента для выделения суммарной РНК/ДНК «Евроген» (Россия), согласно инструкции по применению.
Оптимизацию ПЦР проводили с использованием амплификаторов Rotor Gene 6000 («Corbett Research», Австралия) и CFX96 («BioRad», США). Электрофоретическую детекцию продуктов амплификации в агарозном геле проводили с использованием электрофоретических камер SE-20 (Хеликон, Россия), источников питания Эльф-8 (ЗАО НПФ ДНК-технология, Россия), системы видеодокументирования Molecular Imager Gel Doc XR System («BioRad», США) с прилагаемым ПО.
После проведения ПЦР полученные фрагменты ДНК очищали с использованием набора QIAEX II Gel Extraction Kit («Qiagen», США), клонировали в плазмиду pCR2.1. ("Invitrogen", США). Определение нуклеотидных последовательностей проводилось на автоматическом секвенаторе ABI Genetic Analyzer 3500xl (ABI, США). Нуклеотидные последовательности анализировались с использованием базы данных NCBI Mega BLAST.
Нуклеотидные последовательности. Нуклеотидные последовательности были взяты из базы данных GenBank [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/].
Статистическая обработка полученного материала проводилась с использованием пакетов программ Microsoft Excel 2003 for Windows и STATISTICA 6.0 for Windows (Stat Soft, USA). При статистической обработке данных для ненормально распределенных признаков использовали непараметрический критерий Манна-Уитни и коэффициент корреляции Спирмена. Сравнение частот встречаемости проводили по критерию χ2. Для показателей, чьи вариационные ряды приближались к нормальному, применяли дисперсионный анализ. При множественном сравнении средних использовали LSD-тест, а при сравнении 2-х средних - t-критерий Стьюдента.
Множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей проводили при помощи приложения AlignX программного пакета Vector NTI 10 (Informax, США). Филогенетический анализ штаммов и изолятов вируса гриппа проводили при помощи программы Mega 4 [17]. Филогенетические деревья строили по методу объединения ближайших соседей на основе матриц генетических расстояний, рассчитанных по модели Юкса-Кантора. Индексы поддержки ветвей определяли перестановочным тестом (bootstrep) для 1000 повторов.
В работе было использовано лицензионное программное обеспечение Microsoft Office 2010, Vector NTI 11.5, Lasergene 7 и MEGA 7.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.
На фиг. 1 представлена флюоресценция продуктов ПЦР в режиме реального времени для оценки чувствительности с 10-кратными разведениями плазмидной ДНК. На фиг. 2 приведена флюоресценция продуктов ПЦР в режиме реального времени. Анализ клинических образцов (мазки из зева и носа) инфицированных коронавирусом 219 nCoV пациентов (образец 39 Ct 33). На фиг. 3 представлены данные флюоресценции продуктов ПЦР в режиме реального времени. Анализ клинических образцов (мазки из зева и носа) инфицированных коронавирусом 219 nCoV пациентов (образец 39, Ct 34) с использованием праймеров рекомендованных ВОЗ для ПЦР диагностики коронавирусом 219 nCoV. На фиг. 4 изображен график, где представлен результат ПЦР (СТ-25,72), который свидетельствует об успешной экстракции РНК и построении кДНК на ее основе. На фиг. 5 изображен график, где представлены результаты проверки аналитической специфичности набора праймеров и реагентов.
Пример 1. Технология получения тест-набора реагентов с заявляемым набором праймеров и зондом для выявления генетического материала РНК коронавируса 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени
После выделения РНК из исследуемого материала проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора реагентов «Реверта-L» (ЦНИИЭ, Россия) в соответствии с инструкцией по применению. ПЦР с кДНК, полученной после реакции обратной транскрипции, проводили с вирусспецифическими праймерами в реакционной смеси следующего состава (на 1 исследование):
Микропробирки помещали в амплификатор и проводили реакцию по программе (таблица 1):
Таблица 1. Программа проведения ПЦР в режиме реального времени.
Температура (°С) |
Время (минуты:секунды) | Измерение флуоресценции | Количество циклов |
95 | 05:00 | 1 | |
94 | 00:10 | 5 | |
56 | 00:30 | ||
72 | 00:25 | ||
94 | 00:10 | 40 | |
56 | 00:30 | FAM/ROX * | |
72 | 00:25 |
*-канал измерения
ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборах CFX96 («Bio-Rad», США) и "Rotor Gene 6000" («Corbet», Австралия) по каналам Green (470 nm/ 510 nm) или Orange (585 nm/ 610 nm).
Для выбора генотип-специфичных праймеров и ДНК-зондов предварительно был проведен анализ всех известных к настоящему моменту последовательностей геномов выбранных вирусов и представленных в базе данных GenBank. С использованием известных последовательностей были построены элайменты, соответствующие как полногеномным последовательностям, так и отдельным участкам генома вируса. На основе полученных данных для каждого из выбранных вирусов были найдены уникальные замены и отобраны пары праймеров, в максимальной степени отвечающие необходимым требованиям.
Последовательности (SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO:2, приложение) праймеров для проведения амплификации с последующей гибридизацией полученных ампликонов с зондом (SEQ ID NO:3, приложение) на поверхности микросфер определенного цвета представлены в таблице 2.
Таблица 2. Праймеры и зонды для детекции РНК коронавируса 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией.
Вирус | Праймеры и зонды | Структура олигонуклеотидной последовательности |
2019 nCoV | Z | ROX-GCTTATAACATGATGATCTCAGCTGGC-BHQ1 |
F | TAGACATCATGCTAATGAGTACAGAT | |
R | TGAAGTCTTGTAAAAGTGTTCCAG |
Подбор и анализ свойств олигонуклеотидных праймеров и зондов проводился с использованием программного обеспечения Vector NTI 8 (InforMax).
Положительные контрольные образцы были получены методом молекулярной трансформации компетентных бактериальных клеток Escherichia coli бактериальными плазмидами pCR 2.1 (Invitrogen, США), включающими вставки ДНК, комплементарные участкам гена 1ab коронавируса 2019 nCoV, с последующим выделением плазмидной ДНК из бактериальных клеток.
Условия проведения амплификации и реамплификации оптимизировались по концентрации праймеров и зондов в реакционной смеси и температуре отжига праймеров.
Подбор праймеров осуществлялся на не транслируемую область 1ab геномной РНК коронавируса 2019 nCoV. При этом праймеры подбирались с наименьшей гомологией к другим коронавирусам человека и животных, а также к геному человека.
В качестве отрицательного контрольного образца в реакционную смесь вместо положительного контрольного образца добавляли ТЕ-буфер.
ПЦР проводили в приборах Rotor Gene 6000 («Corbett Research», Австралия) или CFX96 («BioRad», США).
Для определения аналитической чувствительности моновариантов систем «праймеры-зонд» для детекции вируса из концентрированных растворов положительных контрольных образцов были приготовлены последовательные 10-кратные разведения. Определение концентрации ДНК в разведениях при исследовании чувствительности праймеров осуществляли при помощи коммерческого набора «Quant-iT dsDNA, HS» («Invitrogen», США) и флуориметра QUBIT («Invitrogen», США).
Для контроля повторяемости используют образец СОП ПКО 2019-nCoV разведенный до концентрации 1,0×107 копий/мл (5 образцов). Процедура проводится одним оператором на одном наборе. Коэффициент вариации для повторяемости рассчитывается по формуле: CVp,% = Сt (стандотклон) / Ct (ср.знач.) × 100 % для 5 проб СОП ПКО 2019-nCoV и не должен превышать 3 %.
Для контроля воспроизводимости используют образец СОП ПКО 2019-nCoV разведенный до концентрации 1,0×107 копий/мл (10 образцов). Процедура проводится двумя разными операторами с двумя разными наборами одной серии в разные дни. Коэффициент вариации для воспроизводимости рассчитывается по формуле: CVp,% = Сt (стандотклон) / Ct (ср.знач.) ×100 % для 10 проб СОП ПКО 2019-nCoV и не должен превышать 6 %.
Минимальное количество ДНК-матриц, детектируемое с применением наших праймеров и зондов после оптимизации условий проведения реакции, выраженное в ГЭ (геномных эквивалентах) в 24 мкл реакционной смеси, составило 50 ГЭ (Ct 39,5). На фиг. 1 представлена флюоресценция продуктов ПЦР в режиме реального времени. Оценка чувствительности с 10-кратными разведениями плазмидной ДНК. Прослеживается зависимость накопления флуоресцентного сигнала от концентрации матричной ДНК (кДНК коронавируса 219 nCoV).
Специфичность отжига праймеров и зондов проверяли постановкой ПЦР в режиме реального времени с использованием в качестве детектируемых образцов синтетической последовательности фрагмента гена 219 nCoV и кДНК вируса 219 nCoV соответственно, полученные из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». На фиг. 2 приведена флюоресценция продуктов ПЦР в режиме реального времени. Анализ клинических образцов (мазки из зева и носа) инфицированных коронавирусом 219 nCoV пациентов (образец 39 Ct 33).
Контроль специфичности осуществляли проведением ПЦР с флуоресцентной детекцией, где в качестве исследуемых образцов использовали пробы, содержащие генетический материал коронавируса 2019-nCoV и пробы, содержащие генетический материал гетерологичных вирусов (вирус гриппа типа А, Коронавирус SARS, аденовирус 5 типа, вирус денге, RSV). Не специфических перекрестных реакций отмечено не было.
На фиг. 3 представлены данные по флюоресценции продуктов ПЦР в режиме реального времени клинического образца (мазки из зева и носа) инфицированного коронавирусом 219 nCoV пациента (образец 39, Ct 34) с использованием праймеров рекомендованных ВОЗ для ПЦР диагностики коронавирусом 219 nCoV. Полученные данные свидетельствуют о специфичности выбранных нами праймеров для набора реагентов «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG».
Таким образом, разработан набор реагентов «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» предназначенный для выявления РНК коронавируса 2019-nCoV методом, основанным на амплификации кДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизационно-флуорецентной детекции продуктов амплификации в режиме реального времени.
Пример 2. Исследование возможности использования комплекта реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «РИБО-преп» и комплекта реагентов для получения кДНК на матрице РНК «РЕВЕРТА-L» для выделения РНК и получения кДНК коронавируса SARS (штамм Франкфурт) из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора
Комплект реагентов для выделения «РИБО-преп» (Рег. № ФСР 2008/03147) и комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК «РЕВЕРТА-L» (Рег. № ФСР № ФСР 2008/03994) производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора успешно используются в Наборе реагентов «АмплиСенс® ОРВИ-скрин-FL» для выявления возбудителей острых респираторных вирусных инфекций человека (ОРВИ) РНК респираторносинцитиального вируса (human Respiratory Syncytial virus - hRSv), метапневмовируса (human Metapneumovirus-hMpv), вирусов парагриппа 1, 2, 3 и 4 типов (human Parainfluenza virus-1-4-hPiv), коронавирусов (human Coronavirus - hCov), риновирусов (human Rhinoviru -hRv), ДНК аденовирусов групп B, C и E(human Adenovirus B,C,E- hAdv) и бокавируса (human Bocavirus - hBov) в клиническом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией (Рег. № ФСР 2011/11258 от 26.02.19).
Для определения возможности использования указанных комплектов реагентов для выделения РНК и получения кДНК коронавируса использовали клинический материал - мазки из ротоглотки, контаминированные коронавирусом SARS (штамм Frankfurt 1) из коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
Экстракция РНК проводилась с использованием комплекта реагентов для выделения «РИБО-преп» серия 16.08.19, срок годности до 16.05.2020.
В пробирки с образцами в лизирующем растворе добавляли по 400 мкл раствора для преципитатции, перемешивали на вортексе и центрифугировли на микроцентрифуге в течение 5 мин при 15 тыс. об/мин. Аккуратно удаляли надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
Добавляли в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрывали крышки и осторожно промывали осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз, после чего центрифугировли на микроцентрифуге в течение 2 мин при 13 тыс. об/мин.
Осторожно, не захватывая осадок, отбирали надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы, плотно закрывали крышки и осторожно промывали осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз, после чего центрифугировли на микроцентрифуге в течение 2 мин при 13 тыс. об/мин.
После центрифугирования осторожно, не захватывая осадок, отбирали надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
Открытые пробирки помещали в твердотельный термостат при температуре 65°С на 5 мин. для подсушивания осадка.
Добавляли по 50 мкл РНК-буфера, перемешивании на вортексе и помещали в термостат при температуре 65°С на 5 мин плотно закрытыми, периодически встряхивая на вортексе.
Центрифугировали пробирки при 13 тыс. об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочную жидкость, содержащую РНК, использовали для проведения обратной транскрипции.
Для получения кДНК использовали комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК «РЕВЕРТА-L», серия А11.08.19, срок годности до 11.05.2020. В пробирку, содержащую 10 мкл РНК, добавляли 10 мкл смеси, приготовленной следующим образом: в пробирку c RT-mix вносили 5мкл RT-G-mix-1 и 6 мкл ревертазы (MMlv), и перемешивали на вортексе. Инкубировали пробирки при 37°С 30 мин. Затем отдельным наконечником с аэрозольным барьером добавляли 20 мкл ДНК-буфера.
Надосадочную жидкость, содержащую кДНК использовали для постановки ПЦР с SARS специфическими праймерами и зондами. На фиг. 5 представлен положительный результат ПЦР (СТ-25,72), который свидетельствует об успешной экстракции РНК и построении кДНК на ее основе.
Таким образом, комплект реагентов для выделения «РИБО-преп» и комплект реагентов для получения кДНК на матрице РНК «РЕВЕРТА-L» могут быть использованы для выделения коронавируса.
Пример 3. Проверка аналитической специфичности набора реагентов «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» с заявляемым набором праймеров и зонда при тестировании на вирусе гриппа В, вирусах парагриппа 1-4, риновирусах, человеческих метапневмовирусах
Контроль аналитической специфичности набора реагентов «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» осуществляли проведением ПЦР с флуоресцентной детекцией. где в качестве исследуемых образцов использовали инактивированные образцы культуральной жидкости, содержащие следующие штаммы из Государственной коллекции микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»: коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ) штамм hCoV-EMC/2012); коронавирус SARS (штамм Frankfurt 1), вирус гриппа В/Chita/01/2010, вирус гриппа В/Chita/02/2010, вирус гриппа В/Chita/03/2010, вирус гриппа В/Chita/04/2010, РСВ штамм Long, аденовирус типа 5 штамм AD-GP (АВ_ AD-GP), а также охарактеризованные изоляты риновируса человека С (изолят RhV-NSC-14/2012), риновируса человека А (изолят RhV-NSC-08/2011, изолят RhV-NSC-11/2012) и клинический материал, содержащий вирус парагриппа 1-4 и метапневмовирус человека (см. таблица 3).
Таблица 3.
№ | Поз | Тип | Описание | Ct HEX |
1 | A01 | ИО | СОП ДНК человека | N/A |
2 | B01 | ИО | ОКО | N/A |
3 | C01 | ИО | ПКО | 25,31 |
4 | D01 | ИО | коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ) штамм hCoV-EMC/2012 | N/A |
5 | E01 | ИО | коронавирус SARS (штамм Frankfurt 1) | N/A |
6 | F01 | ИО | вирус парагриппа 1_ 236 | N/A |
7 | G01 | ИО | вирус парагриппа 2_92 | N/A |
8 | H01 | ИО | вирус парагриппа 3_76 | N/A |
9 | A02 | ИО | вирус парагриппа 4_59 | N/A |
10 | B02 | ИО | вирус гриппа В/Chita/01/2010 | N/A |
11 | C02 | ИО | вирус гриппа В/Chita/02/2010 | N/A |
12 | D02 | ИО | вирус гриппа В/Chita/03/2010 | N/A |
13 | E02 | ИО | вирус гриппа В/Chita/04/2010 | N/A |
14 | F02 | ИО | РСВ штамм Long | N/A |
15 | G02 | ИО | РСВ (изолят RSV-NSC-02/11) | N/A |
16 | H02 | ИО | риновирус человека С (изолят RhV-NSC-14/2012) | N/A |
17 | A03 | ИО | риновирус человека А (изолят RhV-NSC-08/2011) | N/A |
18 | B03 | ИО | риновирус человека А (изолят RhV-NSC-11/2012) | N/A |
19 | C03 | ИО | аденовирус типа 5 штамм AD-GP (АВ_ AD-GP) | N/A |
20 | D03 | ИО | метапневмовирус человека_1342 | N/A |
Из представленных данных на фиг. 5 и табл. 3 следует, что набор реагентов «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» не дает положительных результатов с образцами, содержащими гетерологичные вирусы: коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ); коронавирус SARS, вирус гриппа В, РСВ, метапневмовирус человека, аденовирус типа 5, риновируса человека, вирус парагриппа 1-4 и ДНК человека.
Из представленных данных следует, что набор реагентов «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» не дает положительных результатов с образцами, содержащими гетерологичные вирусы: коронавирус ближневосточного респираторного синдрома (БВРС-КоВ); коронавирус SARS, вирус гриппа В, РСВ, метапневмовирус человека, аденовирус типа 5, риновируса человека, вирус парагриппа 1-4 и ДНК человека.
Пример 4. Результаты клинических испытаний медицинского изделия для диагностики ин витро «Набор реагентов для выявления РНК коронавируса 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» с заявляемым набором праймеров и зондом
Клинические испытания медицинского изделия для диагностики ин витро «Набор реагентов для выявления РНК коронавируса 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» по ТУ 21.20.23-088-05664012-2020» проведены сотрудниками Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора) в присутствии сотрудников общества с ограниченной ответственностью «ВЫМПЕЛ-МЕДЦЕНТР».
В связи с отсутствием полного аналога среди зарегистрированных на территории Российской Федерации медицинских изделий для диагностики ин витро - наборов реагентов для выявления РНК коронавируса 2019-nCoV методом ПЦР, в качестве референтного метода использовали секвенирование по Сенгеру.
Подлинность используемых штаммов вирусов из Государственной коллекции микроорганизмов 1-4 групп патогенности ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» ранее подтверждена секвенированием.
Медицинское изделие для ин витро диагностики «Набор реагентов «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» предназначено для выявления РНК коронавируса 2019-nCoV методом, основанным на амплификации кДНК в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гибридизационно-флуорецентной детекции продуктов амплификации в режиме реального времени на приборах CFX96 (BioRad, США), Rotor-Gene 6000/3000 (Corbett Research, Австралия) или аналогичных приборах других производителей.
Диагностическая роль набора реагентов «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» заключается в возможности его использования для ранней диагностики коронавируса 2019-nCoV, индикации патогенных биологических агентов (ПБА); как ускоренного предварительного теста при выполнении культурального и биологического методов исследования и идентификации подозрительных культур; для эпидемиологического мониторинга.
В состав набора входят следующие компоненты (таблица 4):
Таблица 4
№ | Состав набора | Описание | Объем (мл) | Кол-во |
1 | Реагент-1 | прозрачная бесцветная жидкость | 0,70 | 1 пробирка |
2 | Реагент-2 | прозрачная бесцветная жидкость | 1,20 | 1 пробирка |
3 | Положительный контрольный образец, ПКО | прозрачная бесцветная жидкость | 0,20 | 1 пробирка |
4 | Отрицательный контрольный образец, ОКО | прозрачная бесцветная жидкость | 0,20 | 1 пробирка |
Примечание:
Реагент-1 расфасован по 1,90 мл в микропробирку вместимостью 2,0 мл, с завинчивающейся крышкой. Состав: 2х-кратный буфер для ОТ-ПЦР-РВ, олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентный зонд, очищенная вода.
Реагент-2 расфасован по 100 мкл в микропробирку вместимостью 0,5 до 2,0 мл, с завинчивающейся крышкой. Состав: HS-Taq ДНК-полимераза в буферном растворе.
Метод основан на использовании ПЦР, представляющей собой повторяющиеся циклы амплификации специфической области кДНК-мишени в присутствии ДНК-полимеразы, дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, буферного раствора и олигонуклеотидных праймеров, распознающих кДНК-мишень. Для амплификации фрагментов вирусной кДНК подобрана пара специфических олигонуклеотидных праймеров. Для детекции продукта амплификации применяется вирусспецифический флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, и накопление флуоресцентного сигнала соответствует наличию в реакционной смеси специфических продуктов амплификации.
Для проведения клинических испытаний были искусственно контаминированы генетическим материалом коронавируса 2019-nCoV в концентрации 1×104 копий/мл следующий биологический материал: сыворотка крови, смывы из полости носоглотки и ротоглотки.
Клинические испытания МИ проведены с использованием 50 положительных проб (25 проб в 2-х повторах), содержащих содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV в концентрации не менее 1×104 копий/мл, и 200 отрицательных проб (100 проб в 2-х повторах), не содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV, в том числе:
- положительные образцы, содержащие генетический материал коронавируса 2019-nCoV
10 образцов мазков из ротоглотки, содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV
10 образцов мазков из носоглотки, содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV
5 образцов сыворотки крови, содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV
- отрицательные образцы, не содержащие генетический материал коронавируса 2019-nCoV
10 образцов смывов из полости носоглотки, содержащих вирус гриппа типа А субтипа H1, штамм A/17/Калифорния/2009/38 (NOVEL) H1N1 (Flu_A_Н1);
10 образцов смывов из полости носоглотки, содержащих вирус гриппа типа А субтипа H3, штамм A/Novosibirsk/02/2013(H3N2) (Flu_A_Н3);
10 образцов смывов из полости носоглотки, содержащих вирус гриппа типа А субтипа H5, штамм A/chiken/Kurgan/05/2005/ (2005) H5N1 (Flu_A_Н5);
10 образцов смывов из полости носоглотки, содержащих вирус гриппа типа А субтипа H7, штамм A/equine/Detroit/3/1964(H7N7) (Flu_A_Н7);
10 образцов смывов из полости носоглотки, содержащих вирус гриппа типа А субтипа H9, A/chicken/Primorsky Krai/1771/2018 H9N2 (Flu_A_Н9);
10 образцов культуральной суспензии клеток Vero*, содержащей аденовирус типа 5 штамм AD-GP (АВ_AD-GP);
10 образцов культуральной суспензии клеток Vero, содержащей вирус денге штамм DENV-1/RUS/TH-Novosibirsk02/2012(DENV-1);
10 образцов смывов из полости носоглотки;
10 образцов мокроты;
4 образца ДНК человека
2 клинических образца мазков из ротоглотки, для которых клинически подтвержден вирус парагриппа 1 типа
2 клинических образца мазков из ротоглотки, для которых клинически подтвержден вирус гриппа типа А
1 клинический образец мазков из ротоглотки, для которого клинически подтвержден вирус гриппа типа В
1 клинический образец мазков из ротоглотки, для которого клинически подтвержден респираторно-синцитиальный вирус
Подлинность штаммов гетерологичных вирусов из Государственной коллекции микроорганизмов 1-4 групп патогенности ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» ранее подтверждена результатами секвенирования.
Референтный метод. В связи с отсутствием полного аналога среди зарегистрированных на территории Российской Федерации медицинских изделий для диагностики ин витро - наборов реагентов для выявления РНК коронавируса 2019-nCoV методом ПЦР, в качестве референтного метода использовали секвенирование по Сенгеру.
Подлинность используемых штаммов вирусов из Государственной коллекции микроорганизмов 1-4 групп патогенности ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» ранее подтверждена секвенированием. ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора является Референс-центром по мониторингу за зоонозным гриппом, вызванным высокопатогенными штаммами (Приказ Роспотребнадзора № 116, а также Референс - лабораторией ВОЗ по диагностике гриппа Н5.
Методика проведения исследований. Все образцы одновременно исследованы с использованием наборов реагентов «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» двух серий: серии С001а-01-2020, дата изготовления 20.01.2020, С002-01-2020, дата изготовления 29.01.2020.
Подготовка проб. Ампулы с лиофилизированными штаммами вирусов были получены из Государственной коллекции микроорганизмов 1-4 групп патогенности ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Работы по наращиванию вирусов в клеточных культурах, контаминации сыворотки крови, смывов из полости носоглотки и ротоглотки и определению их характеристик были проведены согласно стандартным операционным процедурам, разработанным в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
Исследуемый биологический материал (сыворотка крови, смывы из полости носоглотки и ротоглотки) был контаминирован генетическим материалом коронавируса 2019-nCoV в концентрации 1×104 копий/мл.
Обеззараживание проб. Обеззараживание проб проводили в соответствии с требованиями СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и МУ 1.3.2569 -09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
Пробы, содержащие гетерологичные вирусы в объеме 1 мл переносили в микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 мл, добавляли натрия мертиолят до концентрации 1:10000 (0,01 %) и прогревали при (56±1)°С в течение 30 минут. Затем в отдельные микроцентрифужные пробирки вместимостью 1,5 мл переносили по 100 мкл обработанных мертиолятом натрия вирусосодержащих проб. Во все пробирки, добавляли лизирующий буфер на основе 6М гуанидинизотиоцианата в объеме, указанном в инструкции к набору для выделения РНК, и инкубировали 15 минут при температуре (65±1)°С. После выполнения данного этапа материал считался обеззараженным.
Выделение РНК, получение кДНК. Экстракция РНК проводилась с использованием зарегистрированного набора для выделения «Рибо-преп» (Рег. № ФСР 2008/03147, производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора», Москва), серия 16.08.19.
В пробирки с образцами в лизирующем растворе добавляли по 400 мкл раствора для преципитатции, перемешивали на вортексе и центрифугировли на микроцентрифуге в течение 5 мин при 15 тыс. об/мин. Аккуратно удаляли надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
Добавляли в пробы по 500 мкл раствора для отмывки 3, плотно закрывали крышки и осторожно промывали осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз, после чего центрифугировли на микроцентрифуге в течение 2 мин при 13 тыс. об/мин.
Осторожно, не захватывая осадок, отбирали надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы, плотно закрывали крышки и осторожно промывали осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз, после чего центрифугировли на микроцентрифуге в течение 2 мин при 13 тыс. об/мин.
После центрифугирования осторожно, не захватывая осадок, отбирали надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
Открытые пробирки помещали в твердотельный термостат при температуре 65°С на 5 мин. для подсушивания осадка.
Добавляли по 50 мкл РНК-буфера, перемешивании на вортексе и помещали в термостат при температуре 65°С на 5 мин плотно закрытыми, периодически встряхивая на вортексе.
Центрифугировали пробирки при 13 тыс. об/мин в течение 1 мин. на микроцентрифуге. Надосадочную жидкость, содержащую РНК хранили при -20°С. Для получения кДНК использовали зарегистрированный набор для получения кДНК на матрице РНК "РЕВЕРТА-L" (Рег. № ФСР № ФСР 2008/03994, производства ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора», Москва).
В пробирку содержащую 10 мкл РНК добавляли 10 мкл смеси, приготовленной следующим образом: в пробирку c RT-mix вносили 5мкл RT-G-mix-1 и 6 мкл ревертазы (MMlv), и перемешивали на вортексе.
Инкубировали пробирки при 37°С 30 мин. Затем отдельным наконечником с аэрозольным барьером добавляли 20 мкл ДНК-буфера.
Надосадочную жидкость, содержащую кДНК хранили при -20°С.
Проведение ПЦР. На одно определение расходуются:
- 7 мкл Реагент-1; 12 мкл Реагент-2.
На каждый анализ расходуются:
- 5 мкл ПКО; 5 мкл ОКО;
Последовательность проведения этапов анализа
Общий объем реакционной смеси 24 мкл, объем кДНК-пробы - 5 мкл.
Подготовка пробирок для проведения ПЦР:
Отобрали необходимое количество пробирок объемом 0,2 мл в соответствии с количеством исследуемых и контрольных образцов и промаркировали.
Извлекли из холодильника реактивы для проведения ПЦР, встряхнули пробирки на встряхивателе пробирок и осадили капли на дно пробирок кратковременным центрифугированием.
Все реакционные компоненты добавляли отдельными наконечниками с аэрозольным барьером с помощью дозаторов переменного объема: 0,5-10, 2-20 и 20-200 мкл.
Проведение амплификации:
Приготовили реакционную смесь для проведения ПЦР и внесли в пробирки.
В пробирке объемом 1,5 мл приготовили смесь компонентов следующего состава (из расчета на одну пробу):
Реагент-1 7 мкл
Реагент-2 12 мкл
перемешивали смесь пипетированием.
Внесли по 19 мкл смеси компонентов в заранее промаркированные пробирки.
Внесли в пробирки отдельным наконечником с аэрозольным барьером по 5 мкл препарата кДНК.
Поставили контрольные реакции амплификации:
отрицательный контроль - вместо препарата кДНК в пробирку внесли 5 мкл ОКО.
положительные контроли (вносили в последнюю очередь) - вместо препарата кДНК в пробирки внесли 5 мкл ПКО.
Общий (конечный) объем реакционной смеси в каждой пробирке должен составить 24 мкл.
Поставили пробирки в ячейки амплификатора и задали программу амплификации со следующими параметрами:
Температура (0С) | Время (минуты:секунды) | Измерение флуоресценции | Количество циклов |
95 | 05:00 | 1 | |
94 | 00:10 | 5 | |
56 | 00:30 | ||
72 | 00:25 | ||
94 | 00:10 | 40 | |
56 | 00:30 | ROX | |
72 | 00:25 |
Далее запускали программу амплификации и вносили данные в таблицу исследуемых образцов.
Процедура измерения и оценки результатов анализа. ПЦР в режиме реального времени и регистрацию результатов проводили в приборе CFX 96 (BioRad, США) по каналу ROX.
Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией (что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла "Ct" в соответствующей графе в таблице результатов).
Результат подлежит учету в случае:
а) появления пересечения кривых флуоресценции с пороговой линией на канале FAM/ROX (канал измерения указан во вкладыше к набору) в пробах с положительными контрольными образцами (ПКО);
б) отсутствия положительного сигнала на канале ROX (канал измерения указан во вкладыше к набору) в пробе с отрицательными контрольными образцами (ОКО).
Результат считать положительным в случае, если кривая накопления флуоресценции для соответствующего образца имеет характерную «сигмовидную» форму и пересекает пороговую линию. При этом значение Ct для данного образца должно быть менее 35. Амплитуда сигнала при этом не имеет значения.
Результат считать отрицательным, если значение Ct на канале ROX (канал измерения указан во вкладыше к набору) отсутствует. Если значение Ct больше 35, то ПЦР-РВ необходимо повторить и считать положительным в случае повторения результата или при значении Ct меньше 35.
Чувствительность медицинского изделия (МИ) «Набор реагентов для выявления РНК коронавируса 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» с использованием заявляемых праймеров и зонда по ТУ 21.20.23-088-05664012-2020», при исследовании наборами двух серий 50 проб, содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV в концентрации не менее 1×104 копий/мл, составляет 100%.
Внутрипостановочная, межпостановочная и межсерийная воспроизводимость для всех положительных образцов - 100%.
Специфичность МИ «Набор реагентов для выявления РНК коронавируса 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» с использованием заявляемых праймеров и зонда по ТУ 21.20.23-088-05664012-2020» при исследовании проб, содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV в концентрации не менее 1×104 копий/мл, составляет 100%.
Специфичность МИ «Набор реагентов для выявления РНК коронавируса 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» с использованием заявляемых праймеров и зонда по ТУ 21.20.23-088-05664012-2020» - при исследовании наборами двух серий 200 отрицательных образцов, содержащих НК гетерологичных микроорганизмов (вирус денге, аденовирус 5 типа, вирус гриппа типа А, вирс гриппа типа В, вирус парагриппа 1 типа, респираторно-синцитиальный вирус), 8 отрицательных образцов, содержащих ДНК человека, 20 образцов мокроты и 20 образцов смывов из полости носоглотки, 20 образцов мокроты, 4 клинических образца мазков из ротоглотки, для которых клинически подтвержден вирус парагриппа 1 типа, 4 клинических образца мазков из ротоглотки, для которых клинически подтвержден вирус гриппа типа А, 2 клинических образца мазков из ротоглотки, для которых клинически подтвержден вирус гриппа типа В, 2 клинических образца мазков из ротоглотки, для которых клинически подтвержден респираторно-синцитиальный вирус отрицательный результат в ПЦР получен для 200 образцов. Диагностическая специфичность - не менее 98% с доверительной вероятностью 90%.
Статистическая обработка результатов проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по порядку проведения экспертизы качества, эффективности и безопасности медицинских изделий», утв. ФГБУ «ЦМиКЭЭ» и ФГБУ «ВНИИМТ» 14.11.2013 г.
Статистическую достоверность полученных результатов испытаний оценивали в зависимости от числа параллельных опытов при доверительной вероятности 90 %, используя формулу биноминального распределения Бернулли.
При клинических испытаниях МИ «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» на 50 положительных пробах (2 по 25 проб), содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV в концентрации не менее 1×104 копий/мл был получен положительный результат в 100% случаев (50 проб из 50 заведомо положительных).
При клинических испытаниях МИ «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» на 200 пробах, не содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV в концентрации не менее 1×104 копий/мл (152 пробы, содержащих гетерологичные вирусы, по 20 проб смывов из полости носоглотки и мокроты и 8 содержащих ДНК человека), отрицательный ответ получен в 200 пробах (100 % случаев).
Таким образом, в ходе клинических испытаний с использованием 25 положительных проб, содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV (каждая на 2 сериях набора), и на отрицательных пробах, содержащих ДНК человека (4 проб), смывы из полости носоглотки (10 проб), мокроту (10 проб), мозговую суспензию мышей (10 проб) и НК гетерологичных вирусов (аденовирус 5 типа (10 проб), вирус денге (10 проб), вирус гриппа А (52 пробы), вирус гриппа В (1 проба), вирус парагриппа 1 типа (2 пробы), респираторно-синцитиальный вирус (1 проба)) - суммарно на 100 пробах (каждая на 2 сериях набора), доказана диагностическая эффективность медицинского изделия «Вектор-ПЦРРВ-2019-nCoV-RG» с использованием заявляемого набора праймеров и зонда:
- при исследовании 50 положительных проб (2 по 25 проб, содержащих генетический материал коронавируса 2019-nCoV положительный результат получен в 50 случаях. Диагностическая чувствительность - не менее 95% с доверительной вероятностью 90%;
- при исследовании 200 гетерологичных проб содержащих ДНК человека (8 проб), смывы из полости носоглотки (20 проб), мокроту (20 проб), мозговую суспензию мышей (20 проб) и НК гетерологичных вирусов (аденовирус 5 типа (20 проб), вирус денге (20 проб), вирус гриппа А (104 пробы), вирус гриппа В (2 проба), вирус парагриппа 1 типа (4 пробы), респираторно-синцитиальный вирус (2 проба)) отрицательный результат получен в 200 случаях. Диагностическая специфичность - не менее 98 % с доверительной вероятностью 90%.
Claims (6)
- Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого ДНК-зонда для идентификации коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, содержащий одну пару олигонуклеотидов, обладающих активностью прямого SEQ ID NO: 1 и обратного SEQ ID NO: 2 праймеров в полимеразной цепной реакции, а также флуоресцентно-меченый ДНК-зонд, имеющие следующую первичную последовательность:
- прямой (F) SEQ ID NO: 1 и обратный (R) SEQ ID NO: 2 праймеры
- F: 5'-TAGACATCATGCTAATGAGTACAGAT-3' 26
- R: 5'-TGAAGTCTTGTAAAAGTGTTCCAG-3' 24
- флуоресцентно-меченый ДНК-зонд (Z) SEQ ID NO: 3
- Z: 5'-ROX-GCTTATAACATGATGATCTCAGCTGGC-BHQ1-3' 27
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020120618A RU2734300C1 (ru) | 2020-06-16 | 2020-06-16 | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2020120618A RU2734300C1 (ru) | 2020-06-16 | 2020-06-16 | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2734300C1 true RU2734300C1 (ru) | 2020-10-14 |
Family
ID=72940450
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2020120618A RU2734300C1 (ru) | 2020-06-16 | 2020-06-16 | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2734300C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2813995C1 (ru) * | 2023-08-30 | 2024-02-21 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Набор праймеров для выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2504585C1 (ru) * | 2012-10-22 | 2014-01-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации рнк коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом |
KR101857684B1 (ko) * | 2017-09-12 | 2018-05-14 | 주식회사 코젠바이오텍 | 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법 |
CN110144422A (zh) * | 2019-06-17 | 2019-08-20 | 中华人民共和国无锡海关 | 同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒 |
-
2020
- 2020-06-16 RU RU2020120618A patent/RU2734300C1/ru active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2504585C1 (ru) * | 2012-10-22 | 2014-01-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации рнк коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом |
KR101857684B1 (ko) * | 2017-09-12 | 2018-05-14 | 주식회사 코젠바이오텍 | 중동호흡기증후군 코로나바이러스를 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 중동호흡기증후군 코로나바이러스의 검출방법 |
CN110144422A (zh) * | 2019-06-17 | 2019-08-20 | 中华人民共和国无锡海关 | 同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2813995C1 (ru) * | 2023-08-30 | 2024-02-21 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Набор праймеров для выявления возбудителей бактериальной пневмонии человека методом мультиплексной рекомбиназной полимеразной амплификации |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8097419B2 (en) | Compositions and method for rapid, real-time detection of influenza A virus (H1N1) swine 2009 | |
Piewbang et al. | Development and application of multiplex PCR assays for detection of virus-induced respiratory disease complex in dogs | |
RU2504585C1 (ru) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченного зонда для идентификации рнк коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом | |
Chen et al. | Evaluation of the molecular Xpert Xpress Flu/RSV assay vs. Alere i Influenza A & B assay for rapid detection of influenza viruses | |
JP5976180B2 (ja) | インフルエンザ検出方法およびそのためのキット | |
RU2732608C1 (ru) | Набор реагентов для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, возбудителя нового коронавирусного заболевания COVID-2019, методом обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени | |
Graaf-Rau et al. | Emergence of swine influenza A virus, porcine respirovirus 1 and swine orthopneumovirus in porcine respiratory disease in Germany | |
Chiu et al. | Surveillance of upper respiratory infections using a new multiplex PCR assay compared to conventional methods during the influenza season in Taiwan | |
CN101864494A (zh) | 一种甲型h1n1病毒的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法 | |
RU2733665C1 (ru) | Набор олигодезоксирибонуклетидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавирусов человека SARS и 2019-nCoV методом ОТ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
RU2734300C1 (ru) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавируса человека 2019-nCoV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
He et al. | Development of multiplex PCR for simultaneous detection and differentiation of six DNA and RNA viruses from clinical samples of sheep and goats | |
US11098380B2 (en) | Reagent and method for rapid detection of porcine adenovirus | |
RU2515911C1 (ru) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации рнк и дифференциации вируса парагриппа человека 1, 2, 3 и 4 типов | |
Kumar et al. | Comparative reproducibility of SYBR Green I and TaqMan real-time PCR chemistries for the analysis of matrix and hemagglutinin genes of Influenza A viruses | |
Bakre et al. | Detection of swine influenza virus in nasal specimens by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) | |
JP5205609B2 (ja) | ウイルス検出用オリゴヌクレオチドセット、ebv、cmv及びhhv−6の分析方法及び検出キット | |
RU2818960C1 (ru) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК JMTV методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией | |
RU2778855C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов для идентификации РНК коронавируса человека SARS-CoV-2 методом изотермической ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени | |
KR20120024944A (ko) | 신종 인플루엔자 a형 바이러스 진단용 프라이머, 프로브, 이를 포함하는 키트 및 상기 키트를 이용한 진단 방법 | |
Geng et al. | Triplex qRT-PCR with specific probe for synchronously detecting Bovine parvovirus, bovine coronavirus, bovine parainfluenza virus and its applications | |
RU2756474C1 (ru) | Тест-система для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 в биоматериале от животных, пищевых продуктах и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени | |
Shuryaeva et al. | Development of the kit for diagnostics of covid-19 by real time rt-pcr | |
RU2541772C2 (ru) | Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации днк бокавируса человека | |
Baimukhametova et al. | STUDY ON HERD IMMUNITY AGAINST INFLUENZA VIRUS AMONG THE POPULATION OF ALMATY REGION IN 2017–2018 |